Autarquia Belemita de Cultura, Desportos e Educao - ABCDE Centro de Ensino Superior do Vale do So Francisco - CESVASF Licenciatura Plena em Cincias

Biolgicas

Prof. Joo Paulo de Santana Vieira

Fundamentos de Laboratrio

Belm de So Francisco PE 2012

NOES BSICAS DE BIOSSEGURANA Orientaes gerais sobre comportamento em um laboratrio

1. Ao entramos em um laboratrio (de biologia, qumica, microbiologia, etc) devemos sempre colocar o jaleco (avental, guarda p, etc). Este procedimento IMPRESCINDVEL. No devemos tolerar que pessoas circulem pelo laboratrio sem a vestimenta adequada. Obviamente, o jaleco deve ser limpo e adequado para a funo. 2. No coloque lanches, cigarros e outros materiais sobre as mesas do laboratrio, pois elas podem estar contaminadas com produtos corrosivos ou txicos . 3. Mantenha seu lugar de trabalho em perfeito estado de limpeza e evite obstculos inteis na sua bancada de trabalho. 4. expressamente proibido fumar no ambiente de laboratrio. 5. Nunca use tubos de vidro com as bordas cortantes, mesmo em caso de urgncia. Vidro trincados jamais devem ser usados. 6. No faa fora sobre o vidro. 7. Lubrifique os tubos de vidro para introduzi-los nas rolhas. No caso de rolhas de borracha, use glicerina como lubrificante. 7. Proteja suas mos com luvas de couro ao colocar rolhas em um tubo. 8. Os frascos com amostras contaminadas com soluo cida, soda custica ou outros materiais corrosivos devem ser lavados com gua aps serem usados. 9. Vidros quebrados devem ser jogados em recipientes prprios e nunca despejados no lixo comum. 10. Ao sifonar ou pipetar lquidos, NUNCA FAA ISSO COM A BOCA, use pipetadores e/ou equipamentos auxiliares apropriados. 11. Materiais txicos ou volteis devem ser manipulados em local apropriado (capela de exausto). Na falta desta, fazer esse procedimento ao ar livre, fora do laboratrio, tomando as devidas precaues. 12. Amostras e produtos qumicos em recipientes sem rtulos no devem ser usados. Para evitar uso de materiais inadequados ao procedimento indicado identificar o recipientes com seus respectivos contedos e data de preparo. 13. Amostras quentes devem ser identificadas como tal. 14. Roupas contaminadas devem ser trocadas imediatamente. 15. O bico de Bunsen deve ser usado somente em lugares isentos de inflamveis ou explosivos. 16. Coloque os recipientes contendo produtos em seus lugares apropriados, isso evitar erros na anlise e possveis acidentes. 17. Jogue o lixo nos locais adequados. 18. No caso de diluies, DERRAME SEMPRE O CIDO NA GUA E NO a gua no cido. 19. Evite tocar em produtos que no conhece. 20. No procure, com fins recreativos, misturar reativos e produtos sem saber o que vai acontecer. 21. Evite respirar vapores e fumaas. 22. Rotule os recipientes antes de ench-los. 23. No beba gua, caf, leite, refrigerantes, etc, em locais que sejam apropriados (bqueres, por exemplo). 24. No jogue na pia lquidos corrosivos ou inflamveis que no tenham sido previamente diludos. 25. Se, por acaso, quebrar um frasco de vidro, no apanhe os estilhaos com as mos. Use uma escova ou vassoura.

Acidentes com substncias qumicas e primeiro socorros

Vale a pena lembra que dever de todos o conhecimento dos riscos dos produtos qumicos que esto sendo manipulados no laboratrio. Os procedimentos gerais, em caso de acidentes, esto listados a seguir: Derramamento de cidos e bases: CIDOS: antes de lavar com gua correto adicionar Ca(OH)2 (hidrxido de clcio). BASES: adicionar NAHSO4 (bissulfato de sdio). Respingos de produtos qumicos sobre a pele e mucosas: 1. Lavar com gua corrente em abundncia, sem esfregar a superfcie afetada, at que seja removido o componente qumico em contato com a pele ou a mucosa. 2. Retirar as roupas da pessoa e tomar cuidado para no se contaminar neste processo. Lavar as roupas separadamente, antes de usar. 3. Procurar atendimento mdico, se necessrio. Respingos sobre os olhos 1. Lavar os olhos com gua corrente em abundncia, forando levemente as plpebras, assegurando que a gua banhe-os totalmente. 2. Todos os acidentes causados por agentes qumicos que envolvam os olhos devem receber cuidados mdicos. Inalao de gases 1. Remover imediatamente a pessoa do local e afrouxar as roupas. 2. Se a vtima estiver inconsciente, deite-a e verifique a respirao. Se a respirao estiver parada, inicie respirao artificial. 3. Procure assistncia mdica. Ingesto 1. Se o ocorrer o contato de qualquer produto qumico com a boca, enxge com bastante gua, tomando cuidado para no engolir. Se o composto qumico foi ingerido, beber gua para dilu-lo no estmago. 2. No induzir vmito. 3. Transportar a vtima para o centro mdico mais prximo. O tratamento dos diferentes tipos de intoxicao baseia-se, fundamentalmente, em terminar a exposio do organismo substncia, promover a excreo, empregar antdotos ou antagonistas da substncia qumica e, se esta for ingerida, aplicar medidas de sustentao. A seguir esto apresentados alguns antdotos e suas aplicaes.

INSTRUMENTOS E MATERIAIS DE LABORATRIO

- Agarradores: Utilizados para segurar buretas, bales, erlenmeyers, condensadores e funis nos suportes. - Argola: Suporte para funil de separao, funil simples, tela de amianto e frascos que so coletados sobre a tela de amianto quando aquecidos. - Balana analtica: Instrumento usado para determinao de massas de reagentes. As balanas analticas possuem preciso de 0,0001 g. - Balo de fundo chato: Empregado para aquecimento ou armazenamento de lquidos ou soluo. - Balo volumtrico: Balo de fundo chato e gargalo comprido, calibrado para conter determinados volumes lquidos. Possui um trao de referncia, que marca o volume exato. Utilizado na preparao de solues de concentraes conhecidas. - Basto de vidro: um basto de vidro macio utilizado para agitaes e para auxiliar na transferncia de lquidos de um recipiente para outro (direcionador de fluxo). - Bquer (becker): Recipiente de vidro utilizado para aquecer substncias, recolher filtrados, fazer decantaes, misturar reagentes, preparar solues e realizar reaes. - Bico de Bunsen: Bico de gs especialmente construdo para usos em laboratrios. Utilizado para aquecimento at temperaturas de 800C. Alm deste, utilizam-se outros mtodos de aquecimento em laboratrio: banho-maria e banho de leo.

Como utilizar o bico de bunsen: 1. abrir a chave geral de gs do laboratrio. 2. abrir a vlvula do registro de gs individual de cada bico (ele est localizado, geralmente, prximo do bico). 3. verificar se a entrada de ar do bico est aberta. Com ela fechada no possvel ligar o bico. 4. girar a vlvula que liga efetivamente o bico e, com auxlio de um isqueiro ou de palitos de fsforo, acender o bico. A altura da chama pode ser controlada atravs do controle da entrada de ar. Para desligar: desligar a vlvula do registro de gs (item 2), desligar o bico (item 4). - Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variveis de lquidos. No deve ser aquecida. constituda de tubo de vidro uniformemente calibrado, graduado em dcimos de mililitro. Na parte inferior possui uma torneira. utilizada para titulaes.

- Erlenmeyer: Recipiente de vidro utilizado para aquecer e cristalizar substncias, especialmente quando estas precisarem ser agitadas. utilizado tambm em titulaes e para recolher filtrados. Alm dessas aplicaes amplamente utilizado em microbiologia, para o crescimento de microrganismos e para o preparo de meios de cultura. - Esptula: Utilizada para retirar reagentes slidos de frascos. Pode ser de porcelana, plstico ou metal. - Estantes para tubos de vidro: Suporte de madeira ou metal, de vrios tamanhos, para tubos de ensaios.

- Frasco lavador (pisseta): Frasco de plstico com tampa. So utilizados para lavagem de precipitados, cristais, gases, etc. Pode conter gua destilada, gua acidificada, etanol, acetona, hidrxido de sdio. - Funil de separao: Recipiente de vidro, em forma de pra, que possui uma torneira e tampa esmerilhada. Utilizado para fazer extraes por meio de solventes e para a separao em lquidos imiscveis. - Funil de vidro simples: um funil ao qual se adapta o papel filtro, l de vidro, algodo simples, etc. Usado para filtraes.

- Gral de porcelana ou vidro: Empregado para pulverizaes de substncias slidas. - Kitassato - Usado em conjunto com o funil de Bchner na filtrao a vcuo. - Lminas: So vidros retangulares, em geral, no formato de 76 x 26, brancos, transparentes e com espessura no superior a 1,5 mm. Obs: Lminas e lamnulas nuca se seguram na face do vidro, mas sempre apenas pelas bordas. - Lamnulas: So vidros quadradas (18 x 18) ou retangulares (24 x50), com espessura entre 0,10,2 mm. Servem juntamente com as lminas para a incluso temporria ou permanente do objeto. - Papel filtro: Papel poroso, que retm partculas slidas, deixando passar apenas a fase lquida. Quando o lquido corrosivo se substitui o papel por l de vidro ou amianto. Depois de colocado no funil o papel filtro deve ser umedecido, de forma que fique retido junto parede. - Pra - Usada para pipetar solues. - Pipeta graduada: Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 ml. usada para medir pequenos volumes variveis de lquidos. Encontra pouca aplicao sempre que se deseja medir volumes lquidos com maior preciso. No deve ser aquecida.

- Pipeta volumtrica: constituda por um tubo de vidro com um bulbo na parte central. O trao de referncia gravado na parte do tubo acima do bulbo. usada para medir volumes nicos de lquidos com elevada preciso. No deve ser aquecida.

- Placa de Petri: Recipiente de vidro que pode se apresentar em vrios tamanhos, sua utilidade muito variada. Tem grande emprego nas culturas de bactrias, culturas de fungos, protozorios, etc. - Provetas: Recipiente de vidro, de capacidade varivel geralmente indicada em mL. Utilizada para medir volumes de lquidos, para preparar solues de concentrao aproximada ou no conhecida. - Suporte universal: Suporte de ferro utilizado como meio de prender argolas e agarradores. - Termmetro: Usado para medir a temperatura durante o aquecimento em operaes como: destilao simples, fracionada, etc. - Tringulo de porcelana: Tringulo construdo de arame coberto por tubos de porcelana ou outro material refratrio. Utilizado como suporte para cadinhos e cpsulas durante a calcinao. - Trip e tela de amianto: O trip o suporte para a tela de amianto. A tela tem a propriedade de distribuir o calor, evitando que os frascos quebrem quando aquecido no fogo. - Tubo de ensaio: Tubos de vidro, cilndricos, com tamanhos variados, usados em vrios experimentos. Nele, efetuam-se reaes simples. Podem sofre variaes de temperatura. - Vidro de relgio: Pea de vidro de forma cncava. usado para cobrir bqueres, em evaporaes, pesagens de diversos fins. No pode ser aquecido diretamente na chama do bico de Bunsen.

Equipamentos de proteo individual (EPIs) recomendados

- Proteo para os olhos: para se proteger contra respingos, aerossis, combustveis ou cacos de vidro, USE CULOS DE PROTEO. - Mscara: algumas substncias, especialmente volteis, podem exigir o uso de mscaras respi ratrias. - Luvas: o manuseio de algumas substncias txicas exige o uso de luvas. Na maioria dos casos, uma luva de ltex j suficiente.

Dimenses em microscopia
As dimenses das estruturas biolgicas podem ser agrupadas em dois grandes grupos, macroscpicas, i. e., visvel ao olho humano e microscpicas, i. e., invisveis ao olho humano, tendo como fronteira o poder de resoluo do olho humano. As unidades de medidas usadas nessas dimenses, assim adaptadas sendo as mais freqentes utilizadas o micrometro ( m) para microscopia ptica e o nanmetro (nm) e o Angstron () para microscopia eletrnica. A sua relao com a unidade fundamental do sistema mtrico, o metro (m) e com o milmetro(mm) a seguinte: 1 m = 10-6 m = 10-3mm (0,001mm) 1 nm = 10-9 m = 10-6mm (0,000001mm) 1 = 10-10 m = 10-7mm (0,0000001mm) Em termos de formao de imagem fundamental a percepo do significado de trs conceitos muito importantes, que so o poder de ampliao (capacidade de um aparelho aumentar n vezes uma imagem), o poder de resoluo (capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos distintos) e o limite de resoluo (distncia mnima que dois pontos podem estar para o aparelho os mostrar individualizado). O que determina a riqueza dos detalhes da imagem fornecida por um sistema de formao de imagens o seu poder de resoluo no o seu poder de ampliao, pois este ltimo s tem valor prtico se for acompanhado de um aumento do poder de resoluo. Em microscopia tica esse limite de resoluo depende essencialmente do conjunto de lentes objetivas, uma vez que as lentes oculares no podem acrescentar detalhes a imagem, pois sua funo aumentar a imagem , que projetada no seu plano de focagem pela objetiva, como ser visto adiante).

MICROSCOPIA
Trata-se de um importante mtodo no estudo das clulas. Muitas caractersticas importantes de interesse nos sistemas biolgicos so demasiadas pequenas para serem vistas a olho nu, s podendo, portanto, serem vistas ao microscpio. Em anos recentes, tem-se notado um grande desenvolvimento em microscpios e todo o material que auxilia no trabalho de pesquisadores visando esclarecer melhor a estrutura e funo das clulas, tais como, corantes, protocolos de colorao, preparo das amostras biolgicas, etc. O olho humano s consegue formar imagens de objetos com dimenses superiores a cerca de 0,2mm. Com isso, a observao de imagens menores, como as estruturas celulares, faz-se necessrio o uso de aparelhos que tenham a capacidade de ampliar a imagem de tais estruturas, como o microscpio. O microscpio um instrumento tico de ampliao utilizado para observao de objetos prximos, to pequenos (0,1 a 10um) que no podem ser vistos nitidamente pelo olho humano desarmado (dimetro inferior a 0,1 mm, a uma distncia de 25 cm). Em 1674, o holands Antonie van LEEUWENHOEK descreveu pela primeira vez os microrganismos, observado atravs de lentes polidas por ele. Os microscpios so classificados em pticos e eletrnicos, dependendo do princpio no qual a ampliao baseada. O microscpio eletrnico emprega um feixe de eltrons eu colide com os tomos da amostra para produzir uma imagem ampliada. O microscpio ptico ou luminoso (emprega ondas luminosas) comumente usado composto, porque apresenta dois sistemas de lentes (ocular, que fica

prximo ao olho do observador e aquele que fica prximo preparao a ser observada, objetiva). A microscopia ptica inclui a M. luminosa (uso do microscpio tico comum), M. de campo escuro, M. de fase, M. de fluorescncia, entre outros. Na microscopia luminosa, o campo microscpico ou rea observada aparece brilhantemente iluminado e os objetos estudados se apresentam mais escuros. No microscpio ptico a luz emitida pela fonte e concentradas pelas lentes condensadoras, atravessa a mostra e penetra na lente objetiva. A objetiva forma a imagem real, ampliada do objeto, e as oculares formam uma imagem virtual, tambm ampliada da imagem real produzida pela objetiva. A ampliao total do o produto (multiplicao) dos fatores de ampliao da objetiva e das oculares, podendo existir outros dispositivos no trajeto da luz que introduzam fatores multiplicativos adicionais. O feixe luminoso que atravessa a amostra modificado por interaes com esta, que consistem na absoro de certos comprimentos de onda produzindo cor,, difrao, refrao, reflexo, diferena de fase, etc. Estas interaes vo-se traduzir na produo de diferenas de cor ou de intensidade ou de intensidade luminosa na imagem do objeto, que podem percebidas pelo olho humano. O desenvolvimento da microscopia eletrnica e sua aplicao na Biologia Celular comearam no final do sculo XIX, quando em 1897 J. J. Thomson anunciou a existncia de partculas carregadas negativamente que mais tarde foram denominadas eltrons. Em 1924, de Broglie prope que um eltron em movimento tem propriedades semelhantes a ondas e Bush, em 1926 prova que possvel focar um feixe de eltrons com uma lente magntica cilndrica, lanando os fundamentos da ptica eletrnica. Em 1935, Knoll demonstra a viabilidade do microscpio eletrnico de varredura (MEV) e trs anos mais tarde um instrumento prottipo foi construdo por Von Ardene. Logo, em 1939, Siemens produz o primeiro microscpio eletrnico de transmisso (MET). A resoluo entre o limite de resoluo e o comprimento de onda de uma radiao luminosa verdadeira para qualquer forma de radiao, seja ela um feixe de luz ou um feixe de eltrons. Com eltrons entretanto, o limite de resoluo pode ser muito pequeno o que permite uma resoluo 100 vezes melhor que a do microscpio de luz. O microscpio eletrnico de transmisso em princpio similar, a um microscpio de luz, apesar de usar um feixe de eltrons em vez de feixe de luz, e uma bobina magntica para focar esse feixe em vez de lentes de vidro. O tecido observado, depois de quimicamente fixado, colocado em plstico e cortado em vrias seces finas que foram revestidas com sais de urnio e chumbo, colocado sob o vcuo do microscpio. Geralmente obtido um contraste pelo uso de corantes baseados em metais eltron-densos que absorvem ou espalham eltrons, removendo-os do feixe medida que passam atravs do espcime. O MET possui um poder de aumento til de at um milho de vezes e uma resoluo, com espcimes biolgicas, de cerca de 2 nm.

Para obteno de imagens tridimencionais utiliza-se o microscpio eletrnico de varredura. A amostra a ser examinada fixada, desidratada e coberta com uma fina camada de metal pesado para ser varrida por um feixe de eltrons focalizados no espcime por uma bobina eletromagntica e a quantidade de eltrons espalhados ou emitidos, quando o feixe varre cada ponto sucessivo na superfcie da espcime, medido pelo detector e usada para controlar a intensidade de ponto sucessivos em uma imagem projetada em tela de vdeo. O MEV propicia uma profundidade de foco e uma resoluo entre 3 nm e 20 nm.

PARTES DO MICROSCPIO
Mecnicas a) Base ou p (1): feito de ligas de metais pesados para impedir que o aparelho tombe. b) Estativo ou brao (4): haste ou suporte que se articula com o p, sustenta o tubo, a platina, o condensador, o aparelho e os mecanismos macromicromtricos. c) Platina ou mesa (6): de forma redonda ou retangular, fixa, mvel ou giratria no plano horizontal ou ento apresenta uma parte inferior fixa ao estativo e outra superior, deslizante. As platinas fixas geralmente compensam sua imobilidade por meio de peas deslizantes, chamadas charriot (7).

Entre as garras do ltimo se encaixa a lmina com o material a ser estudado: pode ser deslocado para frente, para trs, direita ou esquerda, sempre no mesmo plano, por meio de cremalheiras laterais. No centro h uma abertura para a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho, e dirigidos pelo condensador e o diafragma sobre a preparao entre lmina e a lamnula, projetando da atravs do tubo e da ocular at a retina do observador. d) Tubo (10): no microscpio monocular o tubo representa um cilindro metlico, com um encaixe posterior, da preciso para sua adaptao a outro encaixe, porm de corte investido na cremalheira. e) Dispositivos macro e micromtrico (3): pea deslizante em sentido vertical, acionada por dois tipos de "botes" os "macromtricos" e "micro-mtricos". Com o mecanismo macromtrico obtm-se focalizao tica grosseira da pea a ser examinada, enquanto que, com o dispositivo micromtrico obtm-se deslocamentos do tubo at de dois milsimos de milmetro ou menos ainda, dando desta forma nitidez imagem. f) Revlver (9): colocado na extremidade inferior do tubo nos modelos mais antigos ou dos dispositivos macro e micromtricos nos instrumentos modernos de tubo bipartido. munido de 3 ou 4 vos circulares, providos de matrizes para roscas. Nestas matrizes se enroscam as 3 ou 4 objetivas, sempre na ordem de seu aumento progressivo. Basta, ento, durante os trabalhos microscpicos, fazer girar mecanismos de cmbio de objetivas ou revlver em um s sentido, para obter-se aumentos sucessivos ou vice-versa, j focalizados, pelo menos, macrometricamente. ticas a) Oculares (11): so encaixadas nas extremidades superiores do tubo. Podem ser retiradas e substitudas facilmente segundo a necessidade do momento. importante saber que as oculares ampliam apenas a imagem formada pela objetiva. No tornam mais ntidas as estruturas do objeto a ser estudado. Seria ilgico, portanto, empregarem-se nos trabalhos microscpicos objetivas de pouco aumento prprio e oculares de grande poder de ampliao. Tambm no se pode aconselhar o uso simultneo de objetivas e oculares de forte aumento. O campo visual seria pouco ntido nas estruturas das clulas. Por exemplo, se apresentariam apagadas, quase no haveria luminosidade e o campo tico seria mnimo. No estudo geral das clulas ou dos tecidos e no controle dos processos de colorao e diferenciao dos cortes so suficientes oculares com aumento prprio pequeno ou mdio. H, assim, satisfatria nitidez das estruturas, campo visual grande bem uniformemente iluminado e poupana de nossa vida. Na escolha das oculares para um microscpio h um princpio importante a observar: que as qualidades ticas das mesmas somente atingem seu grau mximo de aproveitamento quando esto combinadas com as objetivas certas. b) Objetivas (8): so sistemas ticos, construdos com 4 a 6 ou mais lentes superpostas. Alm de fornecerem uma imagem ampliada de um objeto qualquer, procuram corrigir tambm os defeitos cromticos dos raios luminosos e de esfericidade. c) Condensador com diafragma (5): o condensador est colocado por baixo da platina. Sua funo fornecer bastante luz. Para tanto provido de um sistema de lentes convergentes, que

concentram e jogam o maior nmero de feixes luminosos pela lente frontal da objetiva. indispensvel quando se empregam grandes aumentos. O condensador, idealizado por Abee e aperfeioado cada vez mais, permite ao pesquisador obter a iluminao desejvel para cada caso. H condensadores para o "campo claro" e contrastes de fases para campo escuro. No campo claro a lente frontal geralmente "desvivel", o que permite iluminarem-se rapidamente grandes campos claros, quando os trabalhos so executados com aumentos pequenos. Todos os condensadores para o campo claro e contrastes de fases esto equipados com um diafragma do sistema ris, cuja abertura regulvel para perfeito ajuste a cada caso. Alm disso, h uma cremalheira, que permite o afastamento total do diafragma. Fecha-se o diafragma, quando se usa objetivas de pouco aumento, para eliminar os raios laterais. Abre-se o diafragma na medida em que se vo aumentando as ampliaes. d) Espelho: encaixado por baixo do condensador, num vo do p do microscpio. redondo e articula-se entre duas laterais. Uma de suas faces plana e a outra cncava.A primeira colhe e projeta os raios paralelos e divergentes e a segunda os convergentes. O espelho cncavo usado nas ampliaes pequenas; o plano, juntamente com o condensador, nas grandes e nas imerses.

MANEJO DO MICROSCPIO PTICO

Para manejar corretamente um microscpio devem-se obedecer alguns passos. Antes de mais nada, Identifique o microscpio que voc est trabalhando. Faa-o atravs do nmero de srie fixado em uma placa a base do aparelho (fique atento tambm a voltagem de operao do aparelho, evitando provocar danos ao mesmo). Agora, aps o devido reconhecimento do aparelho, escolha uma lmina, leve ao microscpio e observe nos trs menores aumentos, segundo o procedimento abaixo: 1. Prenda a lmina a platina, com auxlio das presilhas. Acenda a luz (Regule o espelho em direo fonte de luz, observando com a ocular e a objetiva de menor aumento, mover espelho de tal forma que o campo fique uniformemente iluminado e regule a quantidade de luz do diafragma); 2. Aproxime a lmina da objetiva de menor alcance o mximo possvel, tendo o cuidado de no toc-la. Isso possvel de se fazer olhando-se lateralmente, isto , no olhando apenas pelas oculares. Faa-o movendo o parafuso macromtrico. 3. Agora olhe pelas oculares e mova o parafuso macromtrico no sentido inverso. Focalize. (a imagem deve aparecer um pouco embaada). Voc fez o foco primrio. 4. Com o auxlio do parafuso micromtrico ajuste at o momento em que se formar uma imagem mais ntida. Voc fez o foco secundrio. Para uma ampliao maior, gire o revlver e utilize imediatamente uma mais poderosa. Corrija o foco com o micromtrico. Cada vez que mudar a objetiva, repita essa operao. 5. Com auxlio do charriot desloque a lmina vasculhando o campo de pesquisa. CUIDADOS COM O MICROSCPIO Alguns cuidados devem ser tomados com o aparelho, dentre eles:  no deve ficar exposto luz ou ao calor;  aps o uso limpar as objetivas com um papel prprio ou pano macio;  s girar os parafusos macromtrico e micromtrico quando houver real necessidade;

 o microscpio, quando no estiver em uso dever ser resguardado da poeira;  para transport-lo use as duas mos, uma segurando o brao do microscpio e a outra sustentando-o pela base.  nunca carregue o aparelho usando apenas uma das mos;  no gire o micromtrico indefinidamente para mover o canho, pois poder estragar o seu delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observaes de profundidade;  no passe os dedos nas lentes para limp-las. O vidro das lentes facilmente arranhvel, por isso s podemos usar um papel especial bem macio, para limp-las;  evite molhar o microscpio quando estiver trabalhando, se isto ocorrer, seque-o com um paninho macio;  no desmonte qualquer parte do microscpio. Este um instrumento muito caro, portanto, todo cuidado pouco. PRTICA 1 - MICROSCOPIA Material: microscpio; lminas; lamnulas; lpis marcador; iluminadores; conta-gotas; gua; jornal. Procedimento: Atividade (1) - Inverso de imagens 1 - Com auxlio de um lpis marcador faa um F na lmina; 2 - Observar no microscpio deslocando lentamente a lmina de uma extremidade a outra. Use a objetiva de menos aumento. OBS.: Esta prtica pode ser realizada com recorte de jornais (umedea o recorte com gua e faa uso da lamnula). PRTICA 2 - OBSERVAO DAS CLULAS ANIMAIS Material: microscpio; lmina; lamnulas; iluminadores; lpis-marcador (identificao da lmina); conta-gotas, gua; palito de fsforo; corante (azul de metileno ou tinta de caneta); papel filtro; mucosa bucal. Procedimento: I - Com a ponta mais grossa de um palito, raspe, cuidadosamente, a parte interna de sua boca (bochecha); 2 - Coloque a massa esbranquiada que est na ponta do palito numa lmina e cubra com uma lamnula; 3 - Observe ao microscpio e procure identificar as clulas; 4 - Se voc no conseguir identificar as clulas, coloque junto lamnula uma gotinha de um corante (azul- de-metileno, ou mesmo tinta de caneta, no lado 'oposto da lmina encoste um pedao de papel filtro para chupar a gua que esta sob a lamnula). PRTICA 3 - OBSERVAO DE CLULAS VEGETAIS Material: microscpio; lminas e lamnulas; iluminadores; pinas; lmina de barbear; corante: azul-de-metileno; Vermelho neutro (corante vital); cebola.

Procedimento: 1 - Com o auxlio de uma lmina de barbear (ou estilete) corte uma cebola (sentido longitudinal), em 4 pores; 2 - Pegue uma das escamas e faa na parte cncava um leve cor te transversal e com o auxlio de uma pina, ou mesmo a unha, tente retirar uma finssima pelcula, que reveste internamente a escama (epiderme de escama); 3 - Com o pedacinho da epiderme, prepare uma lmina para observar ao microscpio (como no procedimento anterior); 4 - Se voc tiver dificuldades em observar as estruturas das clulas, poder usar um dos corantes. OBS.: Se usar o vermelho neutro, corar as clulas sem mat-las. Procure observar o ncleo e o nuclolo. Tente localizar o citoplasma e o vacolo. Observe que as clulas esto limitadas por paredes bem ntidas e definidas. TIPOS DE MICROSCPIOS/MICROSCOPIA Hoje h diversos tipos de microscpios que permitem uma moderna e detalhada compreenso da arquitetura celular bsica, entretanto todos tm as suas especificidades e limitaes na forma de visualizao das imagens celulares. Assim, ser feita uma breve descrio de alguns microscpios ilustrando a viso de cada um deles.

Microscpio de luz
Os microscpios de luz so os mais comumente usados em pesquisa biolgica e contribuem como um papel fundamental nesta funo. Compe-se de uma parte mecnica que serve de suporte e uma parte ptica que constituda de trs lentes: condensador, a objetiva e a ocular (Esquema abaixo). O aumento total de ampliao dada por um microscpio igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular, est ultima aumenta o material enquanto a objetiva aumenta o poder de resoluo que capacidade de diferenciar entre dois objetos muito prximos. A visualizao das imagens nas lminas observadas ao microscpio ptico podem ser de diversas coloraes apresentadas pelos diversos tipos de corantes existentes que so usados cada qual oportunamente, afim de evidenciar a estrutura de estudo em questo, desde uma simples diferena entre o ncleo e o citoplasma bem como das organelas. O material da clula tem necessariamente que possuir micrmetros de espessura. para que a visualizao ser o mais eficiente possvel.

Corte histolgica de uma clula vegetal - Microscopia de Luz Foto de Angelo Cortelazzo (Unicamp)

Corte histolgico de uma clula animal - Microscopia de Luz Foto da Prof Adelina Ferreira (UFMT)

MICROSCPIO DE FLUORESCNCIA Certas substancias gozam da propriedade de emitir luz quando excitadas por radiaes de certos comprimentos de ondas (normalmente ultravioleta),podendo combinar-se a certas substancias presentes nas clulas permitindo a localizao de determinadas estruturas. A aplicao destas substancias como corantes esto hoje, esto fortemente ligados com mtodos imunocitoquimicos, os quais permitem localizar e quantificar o caminho percorrido de molculas especficas dentro do tecido em questo. Exemplo quando injeta-se no tecido animal antgeno com colorao influorescente, este se ligar no rgo em questo ao seu anticorpo especfico, assim o local de ao de onde se encontra o anticorpo d para ser encontrado. A tcnica usa agentes qumicos que emitem luz visvel que pode ser verde, laranjada ou vermelho. Uma vantagem da microscopia de fluorescncia que podem ser aplicados a clulas vivas para se determinar a concentrao intracelular de ons de Ca+ e H+ podendo ser utilizado como forma de monitoria do pH de clulas vivas.

Foto de Shirlei Pimentel (Unicamp) Imagens de microscopia de fluorescncia comum

Foto da Prof Adelina Ferreira (UFMT)

MICROSCPIO DE CONTRASTE DE FASE E INTERFERNCIA A microscopia de contraste de fase especialmente til no exame da estrutura e de movimento de organelas maiores como o ncleo e mitocondrias de tecidos vivos, transparentes e no-corados. Ela gera uma imagem com diferentes graus de obscuridade ou luminosidade.

A microscopia de interferncia de Nomarski, ou diferencial evidencia apenas os contornos de grandes organelas como o ncleo e o vacolo. As duas tcnicas utiliza ndices de refrao e difrao para formar uma imagem. Observe que a microscopia de interferncia ou diferencial gera uma imagem parecendo que o espcime est projetando uma sombra para um dos lados: a sombra basicamente representa uma diferena no ndice de refrao.
Imagem de Microscopia de Contraste de Fase

Tanto a microscopia de contraste de fase como a microscopia de interferncia podem ser utilizadas na microscopia de lapso de tempo em que a mesma clula fotografada a intervalos regulares ao longo de perodos que duram vrias horas. Esse procedimento permite ao observador estudar o movimento celular, desde que a platina do microscpio possa controlar a temperatura do espcime e o ambiente. MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO Enquanto o microscpio de luz utiliza ftons como a radiao visvel para observao do material celular, o microscpio eletrnico, por sua vez emprega feixes de eltrons. Estes aps atravessarem a clula chegam a uma tela fluorescentes onde formam uma imagem visvel sobre uma chapa fotografica que depois sero reveladas podendo ser ampliadas 2 a 4 vezes, sendo chamadas de micrografias. Os eltrons desviados por certas estruturas da clula no contribuiro para formar a imagem e aparecem escuras e so chamadas de eltron-densas. Os componentes celulares que desviam uma pequena percentagem de eltrons aparecero em diversas tonalidades de cinza. As tcnicas de colorao empregadas para observao nestes tipos de microscpio so metais pesados como o ouro, o smio, urnio e chumbo. Hoje limite de resoluo de um microscpio eletrnico de transmisso 40.000 vezes melhor do que a resoluo do microscpio ptico e 2 milhes de vezes melhor que a resoluo do olho humano. No entanto no se possvel ainda aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscpios eletrnicos assim ele passa somente a ter 2.000 vezes melhor resoluo dos microscpios pticos.

Foto de Karina Mancini (Unicamp)

Foto de Heidi Dolder (Unicamp)

Foto de Heidi Dolder (Unicamp) Imagens de Microscopia Eletrnica de Transmisso

Foto da Prof Adelina Ferreira (UFMT)

Microscopia Eletrnico de Transmisso

MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA uma tcnica que permite a visualizao das superfcies de espcimes no seccionados. A amostra fixada, dessecada e revestida com a camada fina de um metal pesado. A micrografia obtida tem um aspecto tridimensional. O poder de resoluo dos microscpios eletrnicos de varredura limitado pela espessura do revestimento metlico utilizado e muito menor que o poder de resoluo dos instrumentos de transmisso.

Imagens de M. E.V (coloridas em photoshop)

PRTICA 4 - Movimento da gua atravs membrana Material: Ramo de Elodea, gua destilada, 5g de sal em 100 ml de gua (5%), lmina, lamnula, papel de filtro, microscpio. Procedimento: 1. Retire uma folha jovem de Elodea (da ponta onde h crescimento). 2. Coloque sobre uma lmina com uma gota de gua e cubra com a lamnula. 3. Observe a folha com aumento de 40x, focalizando prximo a nervura central, coloque em 400x e desenha a clula. 4. Pingue uma gota de soluo salina a 5% em um dos lados da lamnula e absorva com papel filtro no lado oposto. Observe pela ocular o que acontece com s clulas. Aguarde alguns minutos e desenhe a clula nessa situao. 5. Repita a operao usando gua destilada no lugar da soluo salina. 6. Aguarde e desenhe. Responda: 1. Quando a folha de Elodea est em soluo salina, qual o movimento da gua? 2. Quando em gua destilada, qual o sentido do movimento da gua? PRTICA 5 - Observao de mitocndrias em clulas vivas Material: leveduras (fermento de po), lminas, lamnulas, verde janus, conta-gotas, leo de imerso, MOC.

Procedimento: 1. Preparar uma soluo de leveduras e colocar uma cota sobre a lmina. 2. Colocar uma gota de verde janus. 3. Cobrir com a lamnula. Esquematizar e desenhar co conjunto de clulas, observe no aumento de 1000x. Observaes: As mitocndrias so organelas citoplasmticas importantssimas. Esta observao feita com corante vital (no mata a clula) especfico (verde janus). As mitocndrias so muito pequenas e a observao da tais orgnulos relativamente difcil e vai precisar de muito empenho e boa vontade. PRTICA 6 - Observao de bactrias do iogurte 1. 2. 3. 4. 5. 6. Coloque um pouco de iogurte sobre a lmina com o auxilio de uma vareta de vidro. Passe a lmina trs a quatro vezes sobre a chama de uma lampariana. Deixe arrefecer. Deite uma ou duas gotas de azul de metileno e deixe atuar durante alguns minutos. Lave a lmina com gua destilada e deixe secar. Coloque ua gota de leo de imerso e cubra com a lamnula. Observe e registre (utilize a objetiva de imerso 100x colocando uma gota de leo de imerso sobre a lamnula)

Interpretao de rtulos de reagentes

Os rtulos de reagentes fornecem algumas informaes que orientam o biotecnologista no preparo do reagente. Fornecem uma quantidade menor de informaes que o catlogo, mas na falta dele oferece informaes bsicas importantes (frmula, peso molecular e densidade). Alm disso, observando-se o rtulo pode-se ter uma idia da toxicidade e dos cuidados que se deve ter ao manusear o reagente. seguir, alguns pictogramas normalmente encontrados em rtulos de reagente

Armazenamento de produtos qumicos

Para armazenamento de produtos qumicos, deve-se considerar as caractersticas de todas as substncias, prevenindo, desta forma, a ocorrncia de eventuais acidentes no laboratrio. Estes produtos devem ser agrupados por espcies qumicas e no por ordem alfabtica. Assim, possvel separ-los em categorias: - inflamveis, - txicos, - explosivos, - corrosivos, - oxidantes, - gases. Dicas gerais: - os solventes perigosos (clorofrmio ou teres no estabilizados) ou inflamveis (teres, cetonas, steres) no devem ser estocados em grandes quantidades. - anotar a data de chegada de todos os reagentes e deixar apenas a quantidade mnima destas substncias no laboratrio, verificando a data de validade de cada substncia. - armazenar sempre nos recipientes ou frascos originais. - armazenar os agentes corrosivos em uma prateleira baixa ou em armrios especialmente separados para tais substncias. - Os produtos qumicos devem ser armazenados em rea fria, seca e ventilada. - No transformar as bancadas em armrios!!