UNIVERSITATEA DE TIIN E AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR BUCURE TI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

UREAZA
DISCIPLINA: ENZIMOLOGIE

CADRU DIDACTIC: Coord. Asist. Univ. Dr. SIMION VASILICA STUDENT: Grigora Alexandra Grupa 6203

BUCURE TI 2010

Cuprins

Introducere 1. Denumire sistematic 2. Sinonime 3. Codul 4. Caracteristici 5. Ureaza microbian : semnifica ie 6. Curba de titrare 7. Coeficient de sedimentare 8. Sinteza pH sc zut 8.1 Testul Helicobacter pylori i activitatea ureazei din Helicobacter pylori i caracterizare molecular

3 4 4 4 4 6 6 7 i cataliza la 8

8 9 10

9. Concluzie Bibliografie

Introducere
Enzimele sunt proteine specializate n cataliza reac iilor biologice. Ele se afla printre cele mai remarcabile biomolecule datorit specificit cele ale catalizatorilor sintetiza i de om. Denumirea de enzim s-a folosit abia n 1877, iar prima teorie general a catalizei chimice con inea i un exemplu de enzim (diastaza din mal ), subliniindu-se c hidroliza amidonului este mai eficient catalizat de diastaz dect de acid sulfuric. De i Louis Pasteur recuno tea c fermenta ia este catalizat de enzime, el presupunea, n 1860, c acestea sunt indisolubil legate de structura i via a celulei de drojdie. n 1897, Eduard Buchner a extras din celulele de drojdie enzimele care catalizeaz fermenta ia alcoolic . Apoi s-a demonstrat c aceste enzime importante, care catalizeaz o cale metabolic major , furnizoare de energie, pot func iona independent de structura celular . Mul i ani mai trziu s-a izolat o enzim n stare pur , cristalin . Acest lucru a fost realizat de J.B. Sumner, care, in 1926, a izolat ureaza din extractele de fasole jack (Canavalia ensiformis). Sumner a dovedit c cristalele con in o protein a tras concluzia c enzimele sunt proteine. P rerea sa nu a fost imediat acceptat cnd J. Northrop a cristalizat enzimele pepsin , tripsin proteic a enzimelor. n 1950 apare tehnica difrac iei n raze X ce demonstreaz structura enzimelor, care a ramas valabil pn ast zi. n 1956 a ap rut un organism ce trebuie s uneasc toate enzimele g site clasifice. n 1974 enzimele s-au mp r it n 6 mari clase: Oxidoreductaze, Transferaze, Hidrolaze, Liaze, Izomeraze si Ligaze (Sintetaze). Ast zi se cunosc aproape 2000 de enzime diferite. Multe au fost izolate n stare pur , omogen cel pu in 200 au fost cristalizate. De i majoritatea enzimelor implicate n c ile metabolice de baz ale celulei au fost identificate, r mn nc de rezolvat numeroase probleme importante, printre care controlul genetic al sintezei activitatea enzimatic i rolul formelor i diferen iere; iar cel mai important lucru, care r mne de enzimelor, mecanismele moleculare prin care este reglat multiple ale anumitor enzime n dezvoltare eficien , precizie i specificitate. i i s le i i abia n 1930-1936 ii i puterii lor catalitice extraordinare, mult mai mari dect

i chimotripsin , s-a acceptat definitiv natura

explicat n termeni moleculari, este cum reu esc enzimele s catalizeze reac iile chimice cu o astfel de

1. Denumirea sistematic
Ureaza are ca denumire sistematic : Urea amidohidrolaz .

2. Sinonime
Ca i sinonime, ureaza are mai multe denumiri: Ureaz acid , Cationul arthritogenic 19kDa antigen, BPU, Canatoxin , JBU, JBURE-II.

3. Codul
Codul Ureazei este: E.C. 3.5.1.5.

o E.C. 3. clasa Hidrolaze; catalizeaz scindarea hidrolitic a diferitelor leg turi sau grup ri; o E.C. 3.5. ac ioneaz asupra unor leg turi C-N altele dect cele peptidice; o E.C. 3.5.1. din amide lineare; o E.C. 3.5.1.5. este a V-a enzim din subsubclas .

4. Caracteristici
Ureaza (E.C.3.5.1.5.) este o metaloenzim dependent de Ni care catalizeaz hidroliza ureei la amoniac i dioxid de carbon. Este produs de plante, fungi i bacterii, dar nu i de animale; ureazele prezint omologii semnificative i mecanisme similare de catalizare, dar i fungi sunt proteine

difer n structurile cuaternare. n timp ce ureazele produse de plante

homo-oligomerice de 90 kDa, cele produse de bacterii sunt multimere de dou (ex. Helicobacter
4

pylori) sau trei complexe de subunit implicate n ob inerea azotului

i. S-a emis teoria cum c n plante aceste enzime sunt

i n protec ia impotriva factorilor patogeni. i

Studii anterioare relevau faptul c ureazele din plante au chiar o activitate insecticid . Unele teste au demonstrat c : ureaza din soia, ureaza major din Canavalia ensiformis o ureaz recombinat din Helicobacter pylori obstruc ioneaz cre terea fungilor fitopatogenici la concentra ii sub-micromolare. Aceast proprietate antifungic a ureazei nu este afectat de tratarea proteinelor cu un inhibitor ireversibil al activit celular. Multe organisme con in enzime pentru transformarea ureei n amoniac carbon. Aceasta conversie poate avea loc in doua moduri diferite: a. catalizat de ureaz ; b. prin carboxilarea ureei. a. Ureaza catalizeaz ATP-ul independent din leg turile amidice ale ureei, rezultnd amoniac i dioxid de carbon intr-o singur etap . i dioxid de ii ureolitice. Scanarea la microscopul i distrugerea peretelui electronic a fungilor a c ror ureaz a fost tratat , indic plasmoliz

b. Carboxilarea ureei ( amidoliaze) enzimele au fost descoperite de ceva timp n ciuperci i alge, recent i n bacterii (Kanamori 04). Tuturor acestor organisme le lipse te o i acid i intermediar. Reac ia final const din doua reac ii ureaz . Urea amidoliaza catalizeaz hidroliza dependent de ATP a ureei, la amoniac carbonic, cu urea-1-carboxilat ca si dioxid de carbon. Ureaza poate oferi la Actinomyces naeslundii avantaje importante asupra organismelor nonureolitice.

enzimatice independente: carboxilarea ureei, urmat de hidroliza ureei-1-carboxilat la amoniac

5. Ureaza microbian : semnifica ie

i caracterizare molecular

Activitatea ureazei asupra unui microorganism infec ios poate contribui la dezvoltarea pietrelor urinare, ulcerelor gastrice microbului ct i a altor disfunc ii. Dincolo de aceste efecte negative, activitatea ureazei asupra microorganismelor gastrointestinale poate aduce un beneficiu att i gazdei prin reciclarea azotului din uree. Ureaza microbian mai joac un rol i a ngr mintelor pe baz de uree. important n utilizareacomponentelor azotului natural 482700. Microorganismele eucariote au o ureaz homopolimeric , similar cu enzima din plante foarte studiat , compus din ase subunit i identice. i distincte cu forme de: 65000Bacteriile Gram+ pot avea 73000(alfa); 10000-12000(beta) i ele ureaz homopolimeric , dar dovezile pentru ele nu sunt i 8000-10000(gama). Trei gene structurale din ureaz sunt

Ureaza este o enzim ce con ine nichel, este multimeric si are o mas molecular mare:

conclusive. Ureaza din bacteriile Gram- con ine trei subunit

transcrise pe un singur ARNm si transmise in ordinea: gama, beta, alfa. Acestea pot avea rol n transportul ureei, a nichelului si in procesarea nichelului.

6. Curba de titrare
Curba de titrate a ribonucleazei indic , de asemenea, pH-ul izoelectric, la care molecula nu prezint nici un fel de nc rcare electric izoelectric este determinat de num rul i nu migreaz ntr-un cmp electric. PH-ul i de valoarea pK-ului grupelor R ionizabile. El va fi

relativ mare, peste pH 7, dac proteina are un con inut relativ mare de aminoacizi bazici (lizin , arginin ), ca n cazul ribonucleazei, care are un pH izoelectric de 9,6. PH-ul izoelectric va fi
6

relativ mic dac n protein predomin resturile acide (ac. aspartic Curba de titrare a unei proteine indic , de asemenea, semnul negativ

i glutamic), ca n cazul i m rimea nc rc rii sale

pepsinei. Majoritatea proteinelor globulare au puncte izoelectrice ntre pH 4,5-6,5. electrice la un anumit pH. La orice pH deasupra punctului izoelectric, o protein are o nc rcare i se va deplasa spre anod. Sarcina sa negativa cre te o dat cu cre terea pH-ului, Att aspectul curbei de titrare ct i pH-ul izoelectric al unei proteine se pot modifica i Mg2+ sau anioni ca Clurm rind aspectul curbei de titrare; iar la orice nc rcare pozitiv se va deplasa spre catod. semnificativ n prezen a s rurilor neutre, care inluen eaz gradul de ionizare a diferitelor tipuri de grupe R. Proteinele pot, de asemenea, sa lege cationi cun sunt Ca2+ sau HPO43-. De aceea, valorile pH-ului izoelectric al proteinelor depind ntr-o oarecare m sur de natura mediului n care este dizolvat proteina; punctul izoionic este o constant caracteristic pentru fiecare protein .

7. Coeficientul de sedimentare
Proteinele au coeficien i de sedimentare ( nota i S20,w, unde temperatura este de 20C, iar mediul este apa water) cuprin i n intervalul 1*10-13 i 200*10-13secunde. Coeficientul de sedimentare de 1*10-13 se nume te unitate Svedberg sau simplu Svedberg (S). De i coeficientul de sedimentare cre te cu masa molecular el nu este propor ional cu aceasta deoarece este influen at de rezisten a de frecare a solventului proteinei poate fi calculat sedimentare este constant , i se forma proteinei. Masa molecular a ecua ie provine din cu ajutorul ecua iei Svedberg. Aceast i se exprim astfel:

condi ia de echilibru a for ei centrifuge cu for a de frecare opus , n situa ia cnd viteza de

Ureaza are

coeficientul de difuzie D20,w*107 cm2*s-1 = 3,46;

i coeficientul de

sedimentare S20,w*1013 s = 18,6.

8. Sinteza

i activitatea ureazei din Helicobacter pylori sc zut

i cataliza la pH

Se consider c Helicobacter pylori produce catit preg tit c reia H. pylori e sensibil la acid

i uria e de ureaz pentru a fi

n cazurile rare de expunere brusc la acid. S-a f cut un studiu asupra ipotezei conform i produc ia de proteine este inhibat de pH-ul sc zut.

8.1.

Testul Helicobacter pylori

H. pylori sau enzimele sale solubile au fost incubate cu sau f r solu ii tampon la un pH ntre 2-7 n prezen a a 5mM de uree timp de 30 de minute. Dup expunere, ureaza activit ile catalitice ale tuturor celulelor, supernatan ilor au fost masurate la un pH de 6,8. Noua enzim sintetizat a fost cuantificat de imunoprecipitatul unei proteine cunoscute: [35S]-metionina. y Rezultate: expunerea la o solu ie tampon sub pH 4 a avut ca rezultat pierderea activit ii i i i preparatele solubile ale enzimelor

ureazei la nivel intracelular. Dup incubarea la un pH< 5 a preparatelor solubile ale enzimei celulele, supernatantul

ale supernatantului nu a mai fost detectat nici o activitate a ureazei. n schimb, cataliza in toate i preparatele solubile ale enzimei a ramas activ dup expunerea la un i cataliza 1,5%. pH > sau =3. La pH 6-7, ureaza reprezint 10% din totalul proteic neutralizare imediat ; activit y embrionare, cataliza ile si sintezele ureazei

Expunerea H. pylori la HCl f r solu ie tampon la pH >2 a avut ca rezultat o i catalizei r mnnd neschimbate. i sinteza ureazei Concluzie: Un mediu cu pH sc zut reduce activitatea ureazei i posibil multor altor proteine.

Acest lucru demonstreaz c H. pylori nu este acidofil de i tolereaz expunerea pe o perioad de timp scurt la un pH sc zut. H. pylori nu se gase te la organismele animale dect dac sunt infectate.

Ac iune terapeutic Substan a activ con inut de Helicobacter Test, ureea marcat cu 13C, este substan a chimic natural denumit uree care a fost marcat cu carbon-13 (13C). Acest lucru nseamn c medicamentul con ine 13C, o form rar a atomului de carbon, n loc de carbon-12 (12C), forma cea mai frecvent sub care se g se te n natur . H. pylori con ine enzime numite ureaze care permit metabolizarea ureei n dioxid de carbon care este apoi eliminat la nivel respirator. Dup ce pacientul prime te Helicobacter Test, ureea marcat cu 13C con inut de test este metabolizat de H. Pylori n dioxid de carbon care de asemenea con ine13C. Aceast form de dioxid de carbon marcat poate fi m surat n laboratoare specializate cu ajutorul unei metode denumit spectrometrie de mas . Dac n proba respiratorie recoltat dup 30 de minute exist dioxid de carbon marcat (test pozitiv), nseamn c pacientul este infectat cu H. pylori. Dac n proba respiratorie nu exist dioxid de carbon marcat, nseamn c n stomac sau duoden nu exist bacterii.

Concluzie
Informa iile observate n timpul testelor demonstreaz c ureeaza contribuie la arsenalul componentelor de ap rare al plantelor mpotriva pr d torilor i fitopatogenilor. De asemenea, testele au dovedit c mecanismul de ap rare dezvoltat de ureaz este independent de amoniacul eliberat din uree.

Bibliografie
1. Biochimie vegetal Didactic Gavril Neam u, Ghe. Cmpeanu, Carmen Socaciu, Editura

i Pedagogic , R.A. Bucure ti.

2. Biochimie - Albert L. Lehninger Universitatea Johns Hopkins, Facultatea de medicin , vol.1, Editura Tehnic , pag. 126, 162, 163, 172, 173, 179, 180, 213. 3. Biochimie - Albert L. Lehninger Universitatea Johns Hopkins, Facultatea de medicin , vol.2, Editura Tehnic , pag. 127, 213, 224. 4. Biochimie alimentar Gavril Neam u, Editura Ceres, Bucure ti 1997, pag. 205. 5. http://www.brenda-enzymes.info/php/result_flat.php4?ecno=3.5.1.5. 6. http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:3.5.1.5. 7. http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/database/egibin/enzymes/Getfage.p/?ec_number=3.5.1.5. 8. http://gut.bmj.com/content/40/1/25.abstract

10