4.

5- Sensibilidade da tcnica A espectroscopia de fluorescncia cerca de 1000 vezes mais sensvel do que a espectroscopia de absoro UV-Vis, permitindo trabalhar com amostras muito diludas (til para amostras biolgicas, concentrao 0.01 M). Sensibilidade ambiental da fluorescncia O espectro de fluorescncia e o respectivo rendimento quntico so muito mais dependentes de condies ambientais do que o respectivo espectro de absoro e absortividade molar. Por exemplo, a ligao de uma molcula de fluorescena (altamente fluorescente na forma isolada) a uma protena vai resultar numa diminuio do cerca de 60% enquanto que o apenas diminui cerca de 10%. As interaces entre dois fluorforos adjacentes ou entre um fluorforo e qualquer outra espcie presente no ambiente que rodeia o fluorforo vai original um espectro de fluorescncia dependente de factores ambientais como: - pH do meio - polaridade do solvente (neste contexto mais lato, solvente inclui a regio interior das clulas, proteins, membranas e outras estruturas biomoleculares) - proximidade e concentrao de espcies desactivantes da fluorescncia (quenchers)
F

de

20

A sensibilidade limitada por: - luz dispersa (problema nas amostras do tipo suspenso) - fluorescncia de fundo ou residual (fluorescncia intrnseca das amostras biolgicas; autofluorescncia das clulas; impurezas presentes em soluo - usar reagentes ultra-puros).

4.6 - Limitaes da tcnica de fluorescncia - Photobleaching Os instrumentos de fluorescncia normalmente utilizam fontes de energia muito intensas (lasers ou lmpadas de Xnon) que podem causar a destruio irreversvel ou photocleaching do fluorforo no estado excitado, com as bvias implicaes na detectabilidade da fluorescncia. A tendncia para sofrer photobleaching depende da

intensidade da radiao usada mas tambm (e muito) da prpria estrutura molecular do fluorforo. O photobleaching acontece frequentemente quando a molcula no estado excitado singleto passa para o estado tripleto. Uma forma de diminuir este problema passa por maximizar a sensibilidade de deteco de forma a poder reduzir a intensidade da radiao excitante (a nvel da instrumentao) ou por alteraes estruturais na molcula de fluorforo que o tornem mais fotoestvel.
21

- Efeito do filtro interno, Inner filter effect A intensidade da fluorescncia linearmente dependente da concentrao do composto, dentro duma gama de concentraes bastante baixa (absorvncia menor do que 0.05).

Em solues no to diludas, a intensidade da fluorescncia pode comear a diminuir devido ao efeito do filtro interno porque havendo muitas molculas de fluorforo em soluo pode acontecer que: - a radiao de excitao fortemente absorvida pela soluo de fluorforo; - a radiao emitida pelo fluorforo reabsorvida pela soluo.

22

4.7 Exemplos de fluorforos A molcula fluorescente ideal deve apresentar as seguintes caractersticas: - elevado (garante uma boa absoro da radiao de excitao) F

elevado (processo de absoro e emisso eficiente)

- Desvio de Stokes elevado (permite detectar os fotes da emisso isoladamente dos fotes da absoro) em

elevado (compatibilidade com amostras biolgicas)

- em termos de estrutura molecular, normalmente so sistemas pi altamente conjugados de estrutura rgida. Exemplos clssicos de fluorforos
O O HO2C

HO

OH

HO

fluoresceina
O O HO2C

H2N

NH2

H2N

NH

rodamina

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N O O N X X

cumarina

acridina

X = S (benzo)tiazola X = O (benz)oxazola X = NH (benz)imidazola

X = S tiofeno X = O furano X = NH pirrole

N F

B F

N
+

criseno

pireno

BODIPY 4,4-difluoro-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno

4.8 - Transferncia por ressonncia de energia de fluorescncia, FRET (Fluorescence Ressonance Energy Transfer) A transferncia por ressonncia de energia de fluorescncia uma interaco entre os estados electrnicos excitados de dois fluorforos (um designado por dador e outro designado por aceitador) em que a excitao transferida do dador para o aceitador sem emisso de fotes. O mecanismo FRET depende da distncia de separao intermolecular (distncia entre o dador e o aceitador) e muito usado para estudar fenmenos biolgicos que provoquem alteraes na proximidade molecular (por exemplo, enrolamento de protenas). Condies para que se verifique FRET - o dador e o aceitador devem estar prximos um do outro (10-100 ). - o espectro de absoro do aceitador deve sobrepor-se ao espectro de emisso do dador. - a orientao dos momentos dipolares de transio do dador e aceitador deve ser paralela.
24

O mecanismo FRET pode ser detectado quer pelo aparecimento da fluorescncia induzida do aceitador ou pela extino da fluorescncia do dador.

Estudos em que se pode aplicar o FRET: - estrutura e conformao de protenas e cidos nucleicos - distribuio espacial e organizao de complexos proteicos - interaces receptor-ligando - sondagem de interaco entre molculas simples - distribuio e transporte de lpidos - determinao de potenciais de membrana - substratos fluorognicos de proteases

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Raio de Fster A distncia qual existe 50% de eficincia no processo de transferncia de energia (ou seja 50% dos dadores no estado excitado so desactivados pelo FRET) define-se como o raio de Fster (R0). O valor de R0 (em angstrom) depende das propriedades espectrais do dador e do aceitador e a expresso R0 = [8.8 x 1023 . k2 . n4 . onde k = factor de orientao dos momentos dipolares do dador e aceitador n = ndice de refraco do meio
D D

. J( )]1/6

= rendimento quntico de fluorescncia do dador na ausncia do

aceitador J( ) = integral (rea) da sobreposio espectral da emisso do dador e da absoro do aceitador

Tabela: Valores tpicos de R0 para alguns pares dador/aceitador Dador fluorescena IAEDANS EDANS BODIPY Aceitador tetrametilrodamina fluorescena Dabcyl BODIPY FL R0 () 55 46 33 57

Nota: IAEDANS e EDANS- derivados do naftaleno sulfonado; Dabcylderivado de um corante azo

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4.9- Polarizao da fluorescncia ou Anisotropia de fluorescncia Pode obter-se informao sobre movimento ao nvel molecular usando radiao polarizada. Quando se faz incidir luz polarizada num dado plano num conjunto de molculas de fluorforo, verifica-se que so preferencialmente excitadas as molculas com momentos dipolares paralelos ao plano da polarizao da luz. A emisso de fluorescncia tambm ser polarizada desde que o fluorforo permanea imvel durante o estado excitado. Se ocorrer movimento das molculas excitadas, a polarizao da luz emitida diminuir.

As molculas fluorescentes com os seus vectores alinhados paralelamente selectivamente. Os fluorforos que estejam livres ou ligados a outras molculas pequenas e movimento rpido, perdem rapidamente a orientao antes de comearem a emitir, o que resulta numa baixa polarizao de fluorescncia (parte superior da figura).
27

ao

vector

da

luz

polarizada

so

excitadas

Se por outro lado, se os fluorforos estiverem ligados a outras molculas grandes imveis ou de movimento lento, vo reter um certo grau de polarizao da fluorescncia (parte inferior da figura). Assim sendo, a polarizao da fluorescncia depende da polarizao da radiao incidente, do tempo de vida do estado excitado e da mobilidade do fluorforo. A polarizao de fluorescncia: - aumenta com o aumento do peso molecular; - aumenta com o aumento da viscosidade do meio; - diminui com o aumento de tempo de vida do estado excitado da molcula. Esta tcnica actualmente muito usada para estudar o movimento de estruturas moleculares mais complexas como as protenas em estudos de actividade ou ligao de ligandos, em cidos nucleicos e outros biopolmeros. A polarizao (P) ou anisotropia (r) de fluorescncia pode ser expressa por P = (F - F )/( F + F ) em que
F = intensidade de fluorescncia paralela ao plano de polarizao da luz de excitao F = intensidade de fluorescncia perpendicular ao plano de polarizao da luz de excitao
28

r = (F - F )/( F + 2F )

4.10 Fluorescncia aplicada s protenas 4.10.1- Estrutura das protenas Os pptidos e protenas so polmeros de aminocidos ligados entre si por ligaes amida.

Os 20 aminocidos naturais diferem entre si na cadeia lateral.

29

A sequncia de aminocidos ligados numa protena designa-se por estrutura primria da protena.
30

A estrutura secundria descreve a conformao dos vrios segmentos da cadeia principal (estrutura local) e determinada por trs factores: - a conformao em cada ligao amida; - a maximizao do n de grupos que estabelecem ligaes de hidrognio; - a separao adequada das cadeias laterais de aminocidos adjacentes.

Hlices alfa

vista de lado

vista longitudinal

So estabilizadas por ligaes de hidrognio entre o NH de uma das ligaes e o C=O de outra ligao a uma determinada distncia.
31

Folhas beta Podem formar-se num arranjo paralelo ou anitiparalelo.

Ao longo de uma cadeia peptdica existem segmentos diferenciados e zonas de estrutura indefinida.

32

Estrutura secundria da carboxipeptidase A (a seta aponta na direco do terminal carboxilo da cadeia peptdica).

A estrutura terciria o arranjo tridimensional da totalidade da protena (topologia) e resulta de interaces estabilizadores como as ligaes de hidrognio, ligaes covalentes (pontes dissulfureto), atraco electrosttica e interaces hidrofbicas.
Estrutura terciria da carboxipeptidase A

33

4.10.2 Fluorescncia intrnseca ou natural de pptidos e protenas A fluorescncia intrnseca das protenas deve-se existncia de 3 aminocidos aromticos com propriedades fluoescentes: a fenilalanina (Phe), a tirosina (Tyr) e o triptofano (Trp). Estes 3 aminocidos tm comprimentos de onda de absoro e emisso diferentes, bem como os respectivos rendimentos qunticos de fluorescncia. Dados de absoro e fluorescncia (no estado livre em etanol)
Tempo de vida triptofano tirosina fenilalanina 2.6 3.6 6.4 Absoro Fluorescncia

280 274 257

5,600 1,400 200

348 303 282

0.20 0.14 0.04

A fluorescncia de uma protena enrolada a combinao da fluorescncia dos aminocidos individuais. No entanto, devido s diferenas nos parmetros de fluorescncia (indicados na tabela anterior) e a fenmenos de FRET devido proximidade destes aminocidos em estruturas proteicas enroladas, muitas vezes o espectro de fluorescncia da protena contendo estes aminocidos muito semelhante ao espectro de fluorescncia do triptofano, sendo que a emisso total maioritariamente devida aos resduos de triptofano com uma pequena contribuio da tirosina e da fenilalanina.
34

Triptofano A fluorescncia do triptofano fortemente dependente do carcter do solvente (meio). O comprimento de

NH

onda de emisso diminui e a intensidade da fluorescncia aumenta com a diminuio da polaridade do solvente.

H2N

OH

Por exemplo, o

max

da emisso de um Trp numa posio mais interna da emisso de um Trp superfcie da

da protena (zona hidrofbica, menos polar) anda volta dos 340-350 nm enquanto que o
max

protena, mais exposto ao solvente (usualmente gua), ser 330 nm. Tirosina
OH

Emite com menos intensidade do que o Trp e muitas vezes a sua emisso suprimida por resduos vizinhos de Trp atravs de FRET. A Tyr no estado excitado

pode sofrer ionizao (perda do proto do grupo hidroxilo) que resulta na perda de emisso.

H2N

OH

Fenilalanina um fluorforo fraco e quando numa protena, a sua fluorescncia s observvel se no existirem resduos
O

de Trp e Tyr. A sua estrutura simples demonstra o efeito das modificaes estruturais na fluorescncia: se adicionarmos um grupo OH (= Tyr) h um aumento de

H2N

OH

20 vezes na emisso; se substituirmos o benzeno por um ndole (=Trp) a fluorescncia relativa aumenta cerca de 200 vezes.
35

O rendimento quntico de fluorescncia dos 3 aminocidos considerados diminui quando so incorporados numa cadeia peptdica. Na tabela seguinte apresenta-se as caractersticas da fluorescncia no estado livre e num pptido, bem como dados que permitem avaliar a sensibilidade destes resduos polaridade do meio.

Solvente fenilalanina tirosina tirosina triptofano triptofano DMSO* DMSO H20 DMSO H20

Aminocido

Pptido

282 306 303 340 340

0.02 0.27 0.21 0.81 0.19

284 309 -333 333.

0.006 0.06 -0.67 0.02

* DMSO= dimetilsulfxido, solvente orgnico menos polar do que a gua.

4.10.3 - Fluorforos extrnsecos No sentido de aumentar ou modificar a fluorescncia das protenas, pode fazer-se reagir a protena com fluorforos (tais como cumarina, pireno, etc) produzindo conjugados fluorescentes. O fluoroforo uasdo designa-se por marcador e o processo por marcao fluorescente (fluorescent labelling). Os marcadores dividem-se de acordo com o tipo de grupo presente na protena com que vo reagir:
36