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Plan du chapitre Contexte clinique Objectifs Prlvements Mthodes de dtection Interprtation des rsultats

1 Contexte clinique
Spcialits Ophtalmologie C. trachomatis srovars A, B, Ba, C trachome srovars D-K conjonctivite de ladulte C. pneumoniae C. psittaci

ORL Pneumologie

otite, sinusite pneumopathie atypique trachobronchite asthme srovars D - K Infection gnitale basse : F : cervicite H : urtrite Infection gnitale haute : F : endomtrite, salpingite, pri-hpatite H : pididymite Nouveau n : conjonctivite srovars L1-L3 F et H : ulcration gnitale (LGV)* srovars D - K pneumopathie srovars D-K arthrite ractionnelle Syndrome Fiessenger Leroy Reiter (FSL)

pneumopathie

Gyncologie Obsttrique

Pdiatrie Rhumatologie Cardiologie

arthrite ractionnelle coronaropathie

* LGV = lymphogranulomatose vnrienne

2 Objectifs
La recherche de C. trachomatis sinscrit dans le cadre : du diagnostic tiologique dune infection gnitale symptomatique, haute ou basse, chez lhomme ou la femme, du diagnostic tiologique dune conjonctivite ou dune pneumopathie nonatale, du dpistage des infections gnitales asymptomatiques chez lhomme ou la femme dans des circonstances particulires :

dpistage systmatique (loi Calmat, 1990) dpistage des personnes risque (ge compris entre 15 et 20 ans, ayant un comportement risque, consultant les centres de dpistage anonyme et gratuit des porteurs du VIH) bilan dhypofertilit

du diagnostic tiologique des arthrites ractionnelles, syndrome de Reiter, du suivi defficacit thrapeutique. Pour les infections C. pneumoniae et C. psittaci, le diagnostic repose en gnral sur un srodiagnostic.

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La place de C. pneumoniae dans les infections respiratoires est difficile prciser. Elle varie selon les tudes, les patients et les pays. C. pneumoniae pourrait tre lorigine de 10 20% des pneumopathies communautaires.

2- Site de prlvements

Les muqueuses respiratoires : couvillonnage de gorge, LBA, brosse. Les muqueuses gnitales : chez la femme, le prlvement de lendocol est ralis aprs mise en place dun spculum et aprs avoir limin la glaire cervicale. Un prlvement urtral associ est conseill, les 2 couvillons pouvant tre dposs dans le mme milieu de transport. Avec les techniques damplification gnique certains prlvements non conventionnels comme les prlvements vulvaires ou les pertes vaginales ont t utiliss pour la dtection de C. tra chomatis et ont donn daussi bons rsultats que les prlvements endocervicaux correspondants. Dans les infections gnitales hautes il est possible : - de raliser une biopsie dendomtre laide dune pince protge par un cathter travers le col - de pratiquer au cours dune coelioscopie des prlvements tubaires (pus, brossage, adhrences) et du liquide dans le cul de sac de Douglas. Chez lhomme, le prlvement durtre ncessite un couvillonnage 3-4 cm du mat. Dans un bilan dhypofertilit, C. trachomatis peut tre recherch dans le sperme. Chez lhomme et la femme, l'urine du premier jet (< 10 ml) peut tre utilise. Chez la femme, il ne faut pas faire la toilette du mat urinaire et ne pas protger lorifice vaginal de manire souiller les urines par les scrtions vaginales. Dans le cas de LGV, on effectue un prlvement dulcrations gnitales ou une ponction de ladnopathie inguinale. les conjonctives : le prlvement est ralis laide dun couvillon extra fin par un grattage appuy sur les conjonctives aprs avoir limin les exsudats purulents avec une gaze strile. les aspirations doreille moyenne les liquides articulaires et biopsies synoviales les plaques dathrome
3- Transport

3 Prlvements
1- Recueil

Conditions gnrales Les caractristiques bactriologiques de ces bactries expliquent les prcautions particulires quil convient de prendre pour leur mise en vidence dans un produit pathologique. Le prlvement doit : - contenir des cellules - tre mis dans un milieu de transport adquat - tre fait en dehors de toute antibiothrapie Matriel - Ecouvillons pour les prlvements sur les muqueuses : les couvillons doivent tre adapts la technique utilise. Pour la culture cellulaire, viter lcouvillon de coton cytotoxique, prfrer les couvillons olive plastique pour les femmes et les couvillons fins en dacron tige mtallique pour les hommes et les prlvements conjonctivaux. Les cytobrosses peuvent tre utilises pour le prlvement endocervical. Elles prsentent lavantage dtre abrasives donc de ramener beaucoup de cellules mais prsentent linconvnient de provoquer des saignements, viter chez la femme enceinte et dun effet nfaste pour la culture cellulaire. Les couvillons doivent tre dchargs dans un milieu de transport pour les cultures cellulaires ou le diagnostic par les techniques de biologie molculaire. Pour lexamen direct des frottis devant tre colors par des anticorps monoclonaux fluorescents, lcouvillon doit tre droul sur une lame et le frottis fix au mthanol ou lactone. - Un rcipient strile contenant du milieu de transport pour les liquides de ponction (pritonaux, articulaires) ou les pices opratoires, - Un pot strile pour les urines du premier jet dont la quantit ne doit pas excder 10 ml,

Un milieu de transport adapt doit tre imprativement utilis. Les couvillons doivent tre dchargs dans un milieu : - permettant la survie de la bactrie pour la culture cellulaire, comme le 2SP (0,2 M saccharose, 15 mM K2HPO4, 6 mM KH2PO4) contenant 5 % de srum de veau ftal,

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ou permettant lextraction des antignes ou des acides nucliques pour les autres techniques. Le dlai et la temprature de transport vont dpendrent de la qualit du milieu. dans le 2SP, le dlai de mise en culture ne doit pas excder 48 h + 4C (pour un dlai plus long, congeler 80C). Les autres milieux de transport supportent une temprature ambiante pendant 24 48 h et une semaine + 4C.

Il peut tre additionn dantibiotiques et dantifongiques si ncessaire. Pour la culture des Chlamydia, ce milieu dentretien est additionn de glucose (facteur de croissance) et de cycloheximide (bloquant le mtabolisme cellulaire). Les conditions opratoires : aprs ensemencement sur les cellules du milieu 2SP contenant le prlvement, 3 tapes sont importantes : la centrifugation : une vitesse de centrifugation comprise entre 2500 et 3000 g 35-37C pendant 1 heure permet ladsorption des corps bactriens sur les cellules lincubation des cellules en milieu de culture pendant 48 72 heures 37C sous 5% CO2 la rvlation des inclusions par des anticorps monoclonaux marqus spcifiques de genre ou despce. La prsence dune seule inclusion permet daffirmer l'infection Chlamydia. Il est recommand de pratiquer des subcultures pour augmenter les chances de succs (2 pour C. trachomatis, jusqu 5 pour C. pneumoniae).
2- Mthode de dtection des antignes

4 Mthodes de dtection
A ct de la culture cellulaire, il existe des mthodes rapides de dtection des antignes ou des acides nucliques. Toutes les mthodes ne sont pas adaptes tous les types de prlvements. La culture cellulaire peut tre envisage quel que soit le prlvement mais avec des chances de succs variables dpendantes de nombreux paramtres tels que la viabilit de la bactrie dans le prlvement, la nature du prlvement, la qualit des cellules rceptrices, la qualit de la rvlation. La plupart des tests rapides n'autorise que la recherche de C. trachomatis dans certains prlvements. Ils sont tous adapts aux prlvements endocervicaux, certains galement aux prlvements urtraux masculins. Peu sont adapts aux prlvements conjonctivaux et seules les trousses de biologie molculaire dtectant les acides nucliques aprs amplification permettent de dtecter C. trachomatis dans les urines avec une sensibilit correcte. Pour C. pneumoniae et C. psittaci, il nexiste pas de mthodes commercialises de dtection spcifique despces. En dehors de la culture et de lIFD (immunofluorescence directe) sur frottis, lamplification gnique in vitro est ralise par quelques laboratoires spcialiss.
1- Culture cellulaire

Les cellules : les plus couramment utilises sont les cellules McCoy (ligne issue dune synoviale humaine) et HeLa 229 (ligne issue dun carcinome du col utrin) pour C. trachomatis et C. psittaci et les cellules HL (issues de poumon humain) et HEp2 pour C. pneumoniae. Le support : plaque pour culture cellulaire 24 ou 96 puits ou mieux tube individuel contenant une lamelle Les milieux : MEM (milieu essentiel minimum) convient lentretien des cellules, supplment en glutamine et srum de veau ftal.

Immunofluorescence directe = IFD LIFD est ralise sur frottis ou sur talements obtenus par cytocentrifugation. En thorie, elle est possible sur tous les types de prlvements mais son interprtation est difficile et tient compte de la qualit des anticorps et de lexprience de lexaminateur. Elle permet de visualiser les corps lmentaires (CE) extracellulaires sur un fond cellulaire. Les performances du test dpendent du ractif utilis : les anticorps monoclonaux donnent de meilleures caractristiques morphologiques, les anticorps dirigs contre la MOMP(Major Outer Membrane Protein), spcifiques de lespce C. trachomatis, produisent une fluorescence nette et donnent moins de fluorescences non spcifiques que ceux dirigs contre le LPS, spcifiques du genre Chlamydia. Le seuil de positivit gnralement admis est de 10 CE par frottis. LIFD est le seul test capable de vrifier la qualit du prlvement (richesse en cellules). Les techniques immunoenzymatiques EIA et apparentes Les techniques EIApermettent la dtection dantignes chlamydiens extraits des prlvements. Les trousses autorises sont valides sur prlvements endocervicaux, certaines sur les prlve-

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Diffrents tests de diagnostic direct dune infection Chlamydia Mthodes Culture cellulaire Dlai de rponse 48 72 h Avantages Inconvnients Adaptes la recherche de C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci

spcificit sensibilit variable isolement de la souche caractrisation sensibilit aux antibiotiques contrle de la qualit du prlvement automatisation lecture subjective

Mthodes antigniques IFD

<1h

Elisa et apparents

24h

EIA sur membrane Mthodes molculaires Hybridation simple commercialise Amplification - laboratoire spcialis

30 min

rapidit

sensibilit 80 % spcificit 95 % test de confirmation limits aux endocervicaux

C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci C. trachomatis

C. trachomatis

2h

automatisation sensibilit, spcificit 95 %

48 72 h

- commercialises

24h

automatisation

sensibilit, spcificit C. trachomatis Elisa sensibilit aux inhibiteurs des enzymes (faux ngatifs) problme de contamination C. trachomatis lourdeur de la technique C. pneumoniae C. psittaci cot C. trachomatis

ments urtraux et aucune sur les urines. Lautomatisation de ces techniques et labsence de subjectivit de lecture constituent un avantage sur lIFD et les rendent accessibles tout laboratoire. Les techniques de dtection des acides nucliques Les techniques de biologie molculaire permettent la dtection des acides nucliques C. tracho matis par hybridation ou par amplification gnique (PCR : polymrase chain reaction, LCR : ligase chain reaction, TMA: transcription mediated amplification) Les tests damplification gnique commercialises sont automatiss (PCR, LCR), ou manuels (TMA) et sont capables de dtecter C. tracho matis dans les prlvements gnitaux, les urines et le sperme. Ces tests commercialiss ont lavantage de prsenter des qualits de reproductibilit et de scurit. Ils doivent cependant tre raliss dans les conditions rigoureuses dorganisation. Certains laboratoires dveloppent leur propre mthode de PCR. Cest actuellement la seule possibilit de diagnostic gnotypique pour C. pneumoniae.

5 Interprtation des rsultats

1- Interprtation dun rsultat positif

Pour C. trachomatis, la prsence de la bactrie authentifie linfection causale et entrane la mise en route dun traitement adapt. Cependant, il faut connatre les limites de spcificit et les possibilits de faux positifs des mthodes choisies. Pour lIFD, il faut tre exigeant sur la qualit de la fluorescence des CE extracellulaires et retenir le seuil dau moins de 10 CE par frottis. Pour l'EIA,un test de blocage est indispensable pour confirmer tout rsultat positif. Pour les tests damplification, il faut sentourer de contrles ngatifs. La signification clinique dun seul rsultat positif par amplification gnique nest pas tablie. Pour C. pneumoniae, la relation de cause effet est encore plus discutable, si le diagnostic repose uniquement sur un rsultat de PCR. Dautres arguments cliniques et srologiques sont ncessaires. Aprs une infection des voies respiratoires parfois inapparente, un portage long terme pourrait expliquer la possibilit de rinfection et la dissmination lentourage, comme le prouve une forte sroprvalence dans la population gnrale. Les tests dIFD sont particulirement difficiles interprter en raison de nombreux

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artefacts de fluorescence ds la non spcificit des anticorps dirigs contre le LPS du genre Chlamydia. La mise en vidence de C. psittaci dans un contexte clinique vocateur permet de poser le diagnostic.
2- Interprtation dun rsultat ngatif

Bibliographie DE BARBEYRAC B., BBAR C. Chlamydia. Md. Mal. Infect. 1997, 27 : 71-83. ORFILA J. Chlamydiales. Manuel de Bactriologie Clinique. (Elsevier, Paris) J. Freney, F. Renaud, W. Hansen, C. Bollet. Volume 3, 1731-1748, 1994. BLACK C.M. Current methods of laboratory Diagnosis of C. trachomatis infections. Clin. Microbiol. Rev. 1997, 10 : 160-184. SAIKKU P. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis - An Update. Scand. J. Infect. Dis. 1997, Suppl 104 : 53-56.

Pour C. trachomatis, un rsultat ngatif nexclut pas le diagnostic, surtout si lexamen a t pratiqu chez une personne symptomatique et haut risque de MST. Il conviendra en premier lieu de vrifier la qualit du prlvement et de le refaire pour affirmer ou infirmer le diagnostic. Aucune technique ne possde une sensibilit de 100% mme si les techniques damplification tentent de sen rapprocher. Avec ces dernires, la possibilit de faux ngatif nest jamais exclue du fait de la prsence dinhibiteurs des enzymes de lamplification dans le prlvement. Lutilisation dun contrle interne capable de vrifier les tapes de prparation de lchantillon et damplification est indispensable.

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