Le cprier

Caractrisation et multiplication
A. Ghorbel1
A. Ben Salem-Fnayou1
S. Khouildi1
H. Skouri1
F. Chibanl1
Introduction
La cpriculture connat un essor l'chelle mondiale travers la
cration de cprires modernes haut rendement. Cette culture est
base sur la production de boutons floraux ou cpres, condiment trs
apprci pour diverses prparations culinaires et jouissant de pro
prits antiscorbutiques (Chervin, 1897). Les cpres sont consid
res comme ayant une action synergique de la vitamine C, elles sont
riches en rutinoside et en ferments (Schauenberg et Paris, 1977)
et sont souvent prconises contre les maladies rhumatismales.
En Tunisie, le cprier se dveloppe dans des conditions particuli
rement favorables. Cet arbrisseau y croit spontanment dans les sols
les plus dfavoriss, jouant ainsi un rle socio-conomique capital
dans plusieurs rgions semi-arides et arides. La cpriculture offre
l'avantage d'tre peu exigente en eau, en investissement, et d'tre
tolrante aux conditions daphiques les plus svres (tempratures
extrmes, vents forts, sols pauvres, manque d'eau...).
1 Laboratoire d'Adaptation et d'amlioration des plantes, INRST, BP 95,
2050 Hammam-Lif, Tunisie.
1 58 T Des modles biologiques l'amlioration des plantes
Cependant, plusieurs difficults relatives la caractrisation de
cette espce d'une part et son mode de multiplication d'autre part
freinent son extension. En effet, l'absence d'une taxonomie prcise
du cprier tunisien et la grande diversit des varits existantes
posent un problme pour l'intensification de la cpriculture. Ceci
d'autant plus que le mode de multiplication traditionnel essentielle
ment par semis donne un faible pourcentage de germination et une
htrognit tant en termes de productivit qu'en termes de qualit
des cpres (Barbera, 1991). Le bouturage ligneux, bas sur l'utili
sation d'un matriel lignifi, en priode de dormance (Khaldi et Ben
M'hamed, 1996), ne semble pas donner de meilleurs rsultats. C'est
pourquoi, des travaux bass sur le polymorphisme des protines
enzymatiques et des marqueurs molculaires ont t entrepris dans
le cadre de cette tude. Paralllement, des essais de multiplication
herbace et de micropropagation du cprier ont t abords avec
deux objectifs : 1) de rechercher et d'valuer la variabilit gntique
du cprier tunisien et 2) d'amliorer les pourcentages d'enracine
ment et de reprise afin d'augmenter donc le taux de production de
plants de cprier.
I Matriel et mthodes
Caractrisation isoenzymatique
Des prospections effectues sur tout le territoire tunisien (fig. 1) ont
permis d'tablir une collection de cprier renfermant de nombreux
morphotypes : inermes pubescents, glabres, pineux avec pines
crochues et persistantes, pines fines, dresses et caduques et
pubescents pines fines. Des jeunes pousses ont t prleves le
jour mme de l'analyse lectrophortique afin d'obtenir une activit
enzymatique maximale.
Afin d'tudier la variabilit gntique du cprier par voie biochi
mique, l'lctrophorse sur gel d'amidon 13 % a t employe.
Les protines enzymatiques ont t extraites dans un tampon Ascor-
bate (0,42 M, pH 7), aprs centrifugation du broyt 30 000 g pen-
A. GHORBEL el al. - Le cprier .." 159
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1 1
1
ALGERIE
1Figure 1
Carte de distribution des cotypes de cprier en Tunisie.
dant 25 mn 4 oc. Le surnageant rcupr, contenant l'extrait enzy-
matique, peut tre conserv -20 "C ou utili s immdiatement. La
sparation des protines a t faite en systme continu, utili sant le
tampon Histidine (0,065 M Histidine et 0,007 M Acide citrique,
pH 6,5) . La migration est conduite courant constant de 25 mA et
avec un voltage limit 150 V durant 16 h.
1 60 T Des modles biologiques l'amlioration des plantes
Les systmes enzymatiques tudis sont : l'isocitrate dshydro-
gnase (ICD), la malate dshydrognase (MDH), la 6-phospho-
gluconate dshydrognase (6-PGD), la phosphoglucomutase
(PGM), la glucose phosphate isomrase (GPI) et la glutamate
oxaloactate transaminase (GOT). Pour la rvlation des sys
tmes enzymatiques, les gels ont t incubs 37 C pendant
30 mn dans des tampons contenant les substrats spcifiques. Les
techniques de rvlation sont celles dcrites par Pasteur et al
(1987) et Arulsezar et Parfitt (1986). Parmi les six systmes rv
ls, seuls la GPI, la PGM, la 6-PGD et l'ICD ont t retenues en
raison de leur bonne rsolution, leur reproductibilit et surtout
leur polymorphisme.
Caractrisation molculaire
L'analyse a t effectue sur 72 plants de cprier dont 53 collects
sur tout le territoire tunisien et 19 prospects en Italie centrale
(fig. 2). L'ADN a t extrait partir de feuilles fraches de chaque
plante selon la mthode de Dellaporta (Dellaporta et al, 1983). Les
feuilles peuvent aussi tre conserves au conglateur.
Afin de choisir les amorces les plus adquates aux ractions RAPD,
une srie de PCR a t ralise avec 60 amorces Operon (sries B,
R et S). Deux gnotypes diffrents (tunisien et italien) ont t choi
sis pour ces ractions de criblage (Khouildi et al, 2000). Parmi les
60 amorces utilises, 10 ont t cibles suivant 3 critres : a) le
polymorphisme rvl chez les deux populations, b) la reproducti
bilit de la raction et c) la qualit du profil lctrophortique. Ces
amorces sont ensuite appliques aux 72 gnotypes collects. Un
total de 54 bandes polymorphes a t dtect sachant que chaque
raction a t rpte au moins deux fois et seules les bandes poly
morphes et stables ont t retenues.
Les bandes rvles ont t converties en une matrice compose de
0 (absence) et de 1 (prsence) pour les 54 marqueurs RAPD rete
nus. Afin d'tablir les analyses statistiques, le logiciel GDA a t
utilis ; chaque marqueur a t considr comme tant un locus
individuel.
A. Ghorbel et al. Le cprier 161
I Figure 2.
Carte de distribution des cotypes de cprier
en Tunisie et en Italie.
Multiplication herbace
Les essais ont concern aussi bien des varits inermes qu'pineuses
de cpriers tunisiens. Des pousses herbaces ont t prleves par
tir de pied-mres obtenus in vitro et/ou ex-vitro et conduits sur pains
de laine de roche, dans une serre contrle. Les pousses sont aussi-
1 62 T Des modles biologiques l'amlioration des plantes
tt dboutures en portions 2 yeux , en borgnant l'nil basai.
Les boutures herbaces sont ensuite imprgnes leur base d'AIB
(exubrone) et insres dans des mini-blocs de laine de roche imbi
bs de solution nutritive pH 6 et CE 2 mS.cnr1. L'ensemble tant
trait par un fongicide (Thyrame, 3 g.H)> est install dans des condi
tions d'humidit saturante sous mini-serres 24 C, sous 25 Wnr2
d'nergie lumineuse et 16 h de photopriode. Le sjour des boutures
dure 5 8 semaines au bout desquelles il y a dveloppement des
pousses axillaires et mission des racines. L'acclimatation progres
sive des plants commence alors avec l'ouverture progressive de la
mini-serre. Au bout d'une semaine, les plants sont prts la trans
plantation en pots.
Micropropagation
Le matriel vgtal a t prlev sur des plantes de Capparis spinosa L.
cultives dans la parcelle d'exprimentation et dans la serre contr
le. Il s'agit de rameaux semi-lignifis gs de deux semaines. Ces
rameaux sont rincs avec une solution concentre de benlate puis
fragments en boutures de 2,0 cmuni ou binodales. Les boutures sont
ensuite trempes dans une solution d'hypochlorite de calcium con
centre (1 10 g.H) pendant 20 mn. Aprs trois rinages l'eau distil
le strile, les explants sont cultivs dans des tubes essai (200 x 20)
contenant 20 ml de milieu de culture. Ce dernier est compos du
milieu de base MS (1962) additionn de 3 % de saccharose. Les
rgulateurs de croissance utiliss sont la BAP (1,0 mg.H) pour la
multiplication, l'ANA (0-0,5-1,0-1,5-2,0), l'AIB (0-0,5-1,0-1,5-2,0)
et l'AIA (0- 1 ,0- 1 ,5-2,0) pour l'enracinement. Le pH du milieu de cul
ture est ajust 5,6 avant l'autoclavage 116 C pendant 24 mn.
Les cultures sont incubes sous une temprature de 25 2 C le jour
et 19 2 C la nuit, une lumire de 12 Wnr2 et une photopriode
de 12 h. Les vitropousses utilises dans l'essai d'enracinement pro
viennent : 1) d'implants ayant subi deux subcultures seulement. Ils
sont souvent trs vigoureux avec des tiges vigoureuses ; 2) d'im
plants obtenus aprs deux subcultures et tioles ; 3) d'implants
obtenus aprs plus de cinq subcultures avec alternance des milieux
de culture MS (1962) et MS (1962) dilu au quart, et ce, afin d'ob
tenir des cultures puises avec des pousses vert jauntre et fili-
A. Ghorbel et al. Le cprier T 1 63
formes. Les trois lots sont ensuite cultivs sur les milieux de culture
composs du milieu de base MS (1962) additionn de diffrentes
auxines des concentrations variables tel que indiqu antrieure
ment. Au cours de la phase d'enracinement, qu'il s'agisse du milieu
de culture MS liquide, solidifi par 0,8 % d'agar ou employant un
pont de papier filtre, les implants sont soit cultivs en position cou
che soit plants dans le milieu de culture.
1
1 Rsultats et discussion
Caractrisation isoenzymatique
L'analyse des profils lectrophortiques obtenus avec les quatre
systmes enzymatiques rvls a montr une trs grande diversit
du cprier tunisien : sept profils diffrents ont t identifis pour la
GPI, six pour la PGM, quatre pour l'ICD et quatre pour la 6-PGD.
Parmi ces quatre systmes, seule la GPI a prsent des bandes
caractrisant certains cotypes. En effet, les cotypes pineux du
site Nahli ainsi que ceux du site Nebber du Kef (fig. 1) prsentent
tous des pines crochues et persistantes, et sont caractriss par trois
bandes manifestant la plus grande mobilit lectrophortique.
Les cotypes collects sur un mme site ont t assimils des popu
lations distinctes afin d'analyser la diversit inter-populations. Pour
ce faire, le programme Biosys (Sowfford et Selander, 1981) a t uti
lis pour calculer les distances gntiques entre les huit populations
tudies. Ces distances ont t tablies partir des frquences all-
liques calcules partir des quatres systmes enzymatiques utiliss.
Les matrices des distances obtenues partir de la distance gntique
de Nei (1978) ont t reproduites sous forme de dendrogramme
(fig. 3) grce un algorithme WGPMA (Sokal et Senath, 1963).
L'analyse du dendrogramme obtenu montre la structuration nette en
trois groupes diffrents comme suit.
1) Un premier groupe est form de deux populations : Sidi Bouzid
et Bouhedma, auxquelles se rattachent les populations de Matmata
164' Des modles biologiques l'amlioration des plantes
40
Distance
33 27 20 13 07 00
+ ---- + ---- + + --.- + .. .. + ..-- + -.-- + -. .. + -.. . + -..- +
- Kecham
* Sidibouzid
Bouhedma
, * Matmata
Dyr
. Melh
,. Nahli
, . Nebber
+.--. + .. .. + ... . + ..._ + + ---. + . ... + .. .. + .... + --.. + -.. . + ....+
40 33 27 20 13 07 00
I Figure 3
Dendrogramme obtenu partir de la matrice de distances :
distance non biaise de Nei (1978).
( une distance de 0,05) et de Kecham (0,18). Ces populations,
toutes originaires du sud tunisien, prsentent des caractres morpho
logiques communs : cotypes pines fines, dresses et caduques.
2) Un deuxime groupe est compos de la population Melh et Dyr,
prospectes au nord du pays : les cotypes formant ces populations
sont tous inermes.
3) Un troisime groupe renferme deux populations : Nahli et Nebber,
du nord du pays : il s'agit d'cotypes pineux pines persistantes
et crochues.
Les populations pineuses et inermes sont gntiquement trs loi
gnes (distance gntique moyenne de 1,5) mme si leur origine
gographique est commune.
Caractrisation molculaire
Le polymorphisme des diffrentes populations tunisiennes et ita
liennes (fig. 2) est rapport dans le tableau 1. Le pourcentage de loci
A. Ghorbel et al. Le cprier T 165
Populations
Kef (Nebeur)
Bizerte
Sidi Bouzid
Matmata
Ariana
Kef (Dyr)
Bouhedma
Kebili
Ben Arous
Gabs
Bj
Nombre de plants
4
7
7
3
3
2
1
9
2
8
2
Frquence de bandes
polymorphes
* Moyenne des bandes polymorphes des populations tunisiennes
Viterbo
Cantaloupo
Siena
St-Stefano
Porto-Ercole
Bracciano
Caracalla
Ostiense
6
2
2
2
2
1
2
2
* Moyenne des bandes polymorphes des populations italiennes
0,74
0,88
0,83
0,51
0,64
0,62
0,57
0,81
0,37
0,92
0,40
0,70
0,61
0,31
0,35
0,37
0,44
0,25
0,50
0,42
0,40
I Tableau 1
Degr de polymorphisme existant au sein des populations
de cprier (RAPD).
polymorphes pour les gnotypes d'une mme population semble
assez lev mais proportionnel la taille de la population.
Paralllement, le degr de polymorphisme entre les individus des
populations tunisiennes est plus lev que celui existant entre ceux
des populations italiennes. En effet, la moyenne des loci poly
morphes tunisiens est de 0,7 alors que celui des italiens est de 0,4.
Ce rsultat confirme l'efficacit des marqueurs RAPD pour la
caractrisation de cette espce (Dan et Stephens, 1997).
La distance gntique entre les populations calcule selon Nei
(1972) (tabl. 2) ne montre pas de corrlation avec la distance go
graphique. Ceci signifie qu'il est trs difficile d'avoir une distinc
tion nette entre les populations suivant leur site gographique. La
distance gntique entre les diffrentes populations tunisiennes
varie de 0,1 1,1 ; alors que celle existant entre les diffrentes
166' Des modles biologiques l'amlioration des plantes
Bizerte
Ariana
BenAiDus
Beja
Kef1
Kef2
SidiBouzid
Gabes
Kebili
Matmata
Bouhedma
Siena
StStefano
Porto Erccte
Cantalupo
Bracciano
Vterbo
Caracalla
2
0,33
3
020
0,35
4
021
0,36
0,48
5
0,35
0,19
0,50
0.34
6
028
0,62
0,52
0,54
0,48
7
0,10
0,42
025
0,33
0,44
0,32
8
0,13
0,32
0^0
025
0,32
035
0,15
g
0,15
0,35
022
026
0,33
0,37
0,14
0,13
10
021
0,52
0,35
0,43
0,50
0,39
0,14
0,26
023
11
0,84
0,99
0,96
122
0,99
0,66
0,98
0,98
0,83
1,07
12
0,19
0,45
0,31
0,25
0,40
0,43
021
0,23
0,19
024
1,03
13
027
0,44
027
0,37
0,46
0,40
0,35
0,13
023
0,46
1,04
029
14
0,30
0,73
0,57
0,35
0,66
0,44
0,32
0,39
0,30
0,32
0,94
027
0,49
15
020
0,72
028
0,39
0,55
0,51
0,32
026
027
0,45
125
0,37
028
0,43
16
0.36
0,65
0,53
0,36
0,48
0,54
0,36
0,39
0,32
0,32
1,18
022
0,39
023
029
17
0,16
0,39
0,30
023
0,38
0,47
0,23
022
022
028
1,12
025
0,31
0,39
025
0,30
18
0,35
0,70
0,56
0,49
0,51
0,39
0,37
0,44
028
0,39
0,84
0,35
0,44
025
0,40
027
0,50
19
022
0,64
0,41
0,39
0,45
0,34
0,30
0,38
026
0,41
0,92
051
0,37
024
028
0,26
0,37
021
I Tableau 2
Distance gntique entre les diffrentes populations
selon Nei (1972) - Marqueurs RAPD.
populations italiennes varie entre 0,2 et 0,5, ce qui prouve que les
populations italiennes sont plus proches les unes des autres, alors
que les tunisiennes demeurent trs htrognes.
Multiplication herbace
Un taux de russite au bouturage de 90 % a t enregistr dbut mai
pour le cprier inerme ; les plants issus de bouturage herbac sont
homognes et vigoureux (fig. 4) ; ce rsultat confirme celui de
Barbera (1991) qui a rapport un taux d'enracinement lev en cas
d'utilisation de boutures herbaces prleves au dbut de la germi
nation (avril).
Nos travaux montrent que pendant la priode s'talant entre juillet
et octobre, les pourcentages de russite du bouturage varient entre
50 et 70 % pour le cprier inerme (fig. 5). Quant au cprier pineux,
le bouturage herbac ralis au printemps et en t a engendr des
taux d'enracinement faibles (10 et 5 % respectivement).
A. GHOABEL et al. - Le cprier
1Figure 4
Boutures herbaces de cprier inerme en acclimatation.
.167
100
90
~ 80
~
:g, 70
[l;!
~ 60
:;
..8 50
iij 40
~ 30
gj 20
. ~
10
o -+0----'---
cprier
inerme
cprier
pineux
1Figure 5
Pourcentage de russite au bouturage herbac
du cprier inerme et pineux.
Le cprier pineux semble donc tre beaucoup plus difficile enra-
ciner que le cprier inerme. La technique de bouturage herbac
applique en mai ou en t n'a pas priori permis d'atteindre les
rsultats escompts.
168 '"
Des modles biologiques l'amliora/ion des plan/es
Micropropagation
L'utilisation du milieu de culture MS (1962) additionn de 1,0 rng.l!
de BAP pour la multiplication du cprier (Capparis spinosa L.) a per-
mis d'obtenir un taux de propagation considrable (de l'ordre de 15).
Les vitropousses noformes sont extrmement vigoureuses (fig. 6).
1Figure 6
Vitropousse vigoureuse
de cprier inerme.
La bonne vigueur des cultures reprsente souvent un critre essentiel
pour la russite de la rhizogense chez un grand nombre d'espces
vgtales (Navatel, 1981 ; Ghorbel et al., 1995 ; Chatibi et al.,
1995). Toutefois, il s'est avr que cette vigueur reprsente un
inconvnient majeur pour la rhizogense du cprier, le diamtre de
la tige tant inversement proportionnel au taux d'enracinement et
directement proportionnel au taux de vitrification. Afin de rsoudre
ce problme dans la culture in vitro du cprier, l'tiolement des
implants a t induit. Toutefois, ces pousses tioles se ncrosent
trs rapidement. C'est pourquoi, nous avons procd l'puisement
des implants par des subcultures frquentes. Cette procdure a per-
mis d'obtenir des cultures ayant une grande capacit d'enracine-
ment sans risque de vitrification ou de ncrose. D'autres facteurs
ont t galement tudis, notamment l'effet de la nature et de la
concentration de l'auxine, le milieu de culture et la position des
implants dans le milieu.
A. Ghorbel et al. Le cprier 169
Les rgulateurs de croissance utiliss pour l'enracinement sont
l' AIB, l'AIA et l' ANA. Ceux-ci ont t galement tests auparavant
pour le cprier (Rodriguez et al, 1990 ; Deora et Shekhawat, 1995).
L'analyse des rsultats obtenus a rvl une multitude de rponses
en fonction du traitement. Les rsultats les plus intressants, quant
au taux d'enracinement (80 %), sont obtenus en prsence d'AIA
(1,5 mg.H) avec des implants puiss. Quant l'AIB ou l'ANA, les
difficults d'enracinement sont lies principalement au problme de
vitrification et de callogense excessives. La lignification occasion
ne par une concentration croissante en AIB rduit considrable
ment le taux d'enracinement. Concernant les implants tiols, le
problme crucial rside dans la ncrose apicale des cultures quelle
que soit la nature ou la concentration des auxines.
L'auxine qui semble donc tre la plus intressante pour le cprier est
l'AIA une concentration de 1,5 mg.H. Cependant, la qualit des
racines et leur nombre par vitroplant sont relativement faibles et les
racines sont fragiles. Ceci pose un norme problme lors de l'acclimata
tion des vitroplants. C'est ainsi que diffrents milieux de culture (solide
et liquide) ont t tests. Diffrentes positions des implants dans le
milieu de culture ont t aussi considres : position couche ou plante.
Les rsultats du tableau 3 montrent que la rponse la plus intres
sante, quant au taux d'enracinement (100 %) et le nombre moyen de
racines par vitroplant (10), est obtenue lorsque les implants puiss
sont cultivs en position couche sur le milieu de culture riche en
Milieu de culture
Position
des implants
% enracinement
Nombre racines
par vitroplant
Qualit
des racines
Qualit
des plantules
Liquide
couche
0
0
/
Trs faible
plante
10
2
Trs faible
Faible
Agar
couche
100
10
Trs bonne
Trs bonne
plante
71
4
Faible
Moyenne
Pont de papier filtre
couche
13
6
Moyenne
Faible
plante
87.
6
Bonne
Moyenne
300 implants puiss par traitement.
I Tableau 3
Effet du milieu de culture et de la position des implants
sur l'enracinement in vitro du cprier.
170 T Des modles biologiques l'amlioration des plantes
AlA (1,5 mg.lI) et solidifi par 0,8 % d'agar. La qualit des racines
et des vitroplants est trs intressante. Ainsi, le taux d'acclimatation
obtenu dans ces conditions a dpass 90 % (fig. 7). Quant aux
implants plants, bien que le taux d'enracinement soit relativement
lev (71 %), les racines sont vite oxydes et les vitroplants prsen-
tent un aspect snescent. En revanche, l'utilisation du pont en
papier filtre, imbib de milieu de culture, a permis d'obtenir un taux
d'enracinement de 87 % (tab!. 3) avec des racines vigoureuses.
1Figure 7
Acclimatation de vitroplants
de cprier inerme.
1Conclusion
Ces rsultats nous confirment la grande diversit du cprier tuni-
sien . Un polymorphisme trs intressant, drivant d'une variabilit
gntique considrable des cotypes autochtones est dcelable
grce au grand pouvoir discriminant des systmes enzymatiques
A. Ghorbel et al. Le cprier 171
employs et la bonne rsolution des bandes lectrophortiques a
t mis en vidence. La prsence de trois groupes gntiquement
bien distincts - inerme, pineux et pubescent - parmi les diffrents
cotypes collects, dnote l'existence d'une variabilit gntique
intra-populations. La caractrisation molculaire par RAPD a
confirm ces rsultats en insistant sur la variabilit gntique diff
rente dcele entre les populations tunisiennes et italiennes. Par
RAPD, la diversit gntique s'avre plus intressante au niveau
des accessions tunisiennes.
L'exploitation de cette grande diversit gntique du cprier ne peut
tre effectue sans la matrise de sa multiplication. Dans ce
contexte, le bouturage herbac s'est rvl avantageux lorsqu'on
considre l'homognit des plants obtenus, la rapidit et la simpli
cit d'excution. Cependant, la russite de cette technique demeure
tributaire de l'origine du matriel initial, de la priode de prlve
ment des pousses herbaces, et de la varit (inerme ou pineuse).
La culture in vitro semble pallier ces inconvnients, puisque l'en
semencement de pousses puises de cprier (obtenues aprs deux
ou trois subcultures), en position couche, sur le milieu MS (1962)
solidifi par l'agar et additionn de 1,5 mg.H d'AIA, favorise un
taux d'enracinement avoisinant les 90 %. Dans ces conditions, les
racines apparaissent 4 5 jours aprs la mise en culture et l'accli
matation des plants est assure.
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