Introduccin Trabajo Prctico N 4 Objetivo Fundamento Procedimiento Resultados Instrucciones para el uso del Sistema Anaerbico Gaspak Bibliografa

INTRODUCCIN En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros. Un cultivo puro es aquel en el que todos los microorganismos provienen de una sola clula. La obtencin de un cultivo puro, a partir de una poblacin mixta, se lleva a cabo en dos etapas: 1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo slido, de manera que luego de la incubacin ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la poblacin original.

OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS

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__________________________________________________________________ 2. Luego de tener las colonias aisladas, stas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como transplante. Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerar que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas caractersticas. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento depender, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus caractersticas y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtencin del microorganismo objeto del aislamiento. En este ltimo caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de grmenes contaminantes. La temperatura y otras condiciones de incubacin, variarn segn los microorganismos, usualmente la temperatura ptima de los microorganismos patgenos para el hombre oscila entre 30 y 40C. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaerbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxgeno en el ambiente donde se desarrollar el mismo. Basndose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudar en la seleccin del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los sntomas de la enfermedad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra analizada. OBJETIVO Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de: Ejecutar las tcnicas bsicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo puro, a partir de una muestra que contiene una poblacin mixta. FUNDAMENTO Al diseminar sobre un medio de cultivo slido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las clulas individuales quedarn lo suficientemente separadas unas de otras y crecern en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro.

4.2

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__________________________________________________________________ PROCEDIMIENTO Preparacin de las placas de aislamiento (Cada estudiante preparar dos placas) 1. Marcar la tapa de cada placa estril con su nmero de equipo y la fecha. 2. Fundir en un bao de agua hirviendo los tubos con 20 mL de agar nutritivo1, luego de que estn completamente fundidos, colocar en un bao de agua a 50C. 3. Tomar el tubo con los 20 mL de agar fundido y enfriado a 50C, secarlo bien por fuera, flamear la boca del tubo y verter en la placa de Petri.

4. Despus de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente para distribuir el agar en forma homognea, teniendo cuidado de no salpicar la tapa. 5. Dejar solidificar, lo cual ocurre en aproximadamente 10 minutos y proceder a secar las placas abiertas y en posicin invertida en la estufa.

Con fines didcticos y por razones de ndole econmica, las muestras suministradas a los alumnos han sido contaminadas con grmenes que se desarrollan bien en agar nutritivo, por tal motivo, ste ser el medio de cultivo que utilizarn para el trabajo de aislamiento. Sin embargo, debe recordarse que, el o los medios de cultivo a utilizar para el aislamiento, se seleccionarn basndose en los requerimientos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en la muestra analizada.

4.3

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__________________________________________________________________ Aislamiento 1. Tomar una gota de la suspensin microbiana con el asa de platino estril y fra, y colocarla sobre el agar en el sitio marcado con una X en la figura siguiente.
X

2. Diseminar la muestra haciendo estras con el asa sobre el agar en la direccin indicada en la figura siguiente.

3. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estras en direccin perpendicular a las estras anteriores como se indica en la figura siguiente.

4. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estras en direccin perpendicular a las estras anteriores como se indica en la figura siguiente.

4.4

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__________________________________________________________________

5. Incubar una de las placas en posicin invertida y en condiciones aerbicas a 32,5 +/- 2,5C por 24 h. 6. Introducir la otra placa en posicin invertida en una jarra para cultivo de anaerobios (sistema Gaspak e incubar a 32,5 +/- 2,5C por 24h, siguiendo las instrucciones para el uso de las jarras que se suministran en la pgina 3.8). 7. Observar el crecimiento obtenido en las placas. RESULTADOS Anotar lo observado

Dibujar lo observado

Estudio de la morfologa de la colonia Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo slidos, las clulas aisladas se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonia, las caractersticas de estas colonias son estudiadas y se usan en la identificacin de las especies.
4.5

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__________________________________________________________________ Las caractersticas que se le estudian a las colonias son: Tamao Pigmentacin Forma Borde Elevacin Apariencia general Superficie

Forma de las colonias

ENTERO

ONDULADO

LOBULADO

EROSIONADO

RAMIFICADO

RIZADO

Borde de las colonias

PLANA

ELEVADA

CONVEXA

PULVINADA

UMBILICADA

Elevacin de las colonias Elevacin de las colonias

4.6

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__________________________________________________________________ Observar a simple vista y con la ayuda de la lupa, las colonias de las placas que le suministre el profesor, para determinar las caractersticas de las mismas. RESULTADOS Anotar lo observado

Dibujar lo observado

Transplante 1. Usando el filamento, trasplantar a un tubo con agar nutritivo inclinado, la colonia que le indic el profesor, de la que ya anot las caractersticas de acuerdo con lo indicado en el aparte anterior.

4.7

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__________________________________________________________________ 2. Incubar a 32,5 +/- 2,5C por 24 horas. RESULTADOS Anotar lo observado

Dibujar lo observado

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL SISTEMA ANAERBICO GASPAK 1. Colocar las placas o los tubos en la jarra Gaspak. 2. Tomar un sobre indicador anaerbico, abrirlo hasta la mitad y colocarlo como se indica en la figura siguiente, de manera que la tira de papel sea visible desde el exterior de la jarra. En condiciones anaerbicas, el indicador se mantiene incoloro, en condiciones aerbicas se torna azul. 3. Cortar la esquina de un sobre generador de Hidrgeno + CO2 Gaspak y colocarlo en la jarra como indica la figura siguiente.

4.8

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__________________________________________________________________ 4. Medir con una pipeta 10 mL de agua en el sobre, por el extremo abierto. No introducir la pipeta o algn otro objeto en el interior del sobre. 5. Colocar la tapa de la jarra, luego la pinza y asegurarla con el tornillo apretndolo a mano. No usar ninguna herramienta para apretar la tapa porque puede daarla. No usar grasa en el borde de la jarra, la empacadura proporciona un sello efectivo. 6. Colocar el sistema Gaspak en la estufa a 32,5 +/- 2,5C.

BIBLIOGRAFA BBL Manual of products and laboratories procedures. 1973 Fifth edition. BBL division of Beckton, Dickinson and Co. Benson H. J. 1979. Microbiological Application. A Laboratory Manual in General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, Iowa Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales. Segunda edicin. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Seeley, H.W.I, Jr and P.J. Van Demark. 1972. Microbes in action. W.H. Freeman and Company.

Prof. Magaly Pedrique de Aulacio Prof. Sofa Gutirrez de Gamboa Noviembre 2001 Revisin 2008

4.9