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Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ
Visão da Apresentação
PCR
Bibliotecas genômica e de expressão
Fragmentação - digestão
Separação - eletroforese
Clonagem molecular
Sequênciamento
Southern, Northern e Western blotting
By Diamar
Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas,
pois a maioria dos cromossomo já estão
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratório clínico.
By Diamar
Procurar um gene dentro de um genoma
humano é comparável a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereço
em uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.
Solange Farah
By Diamar
Enzimas de Restrição
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
Palíndrome:
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
By Diamar
By Diamar
Vídeo de Enzima de
Restrição
By Diamar
Eletroforese
By Diamar
Eletroforese
Fonte de eletroforese
Vertical
- +
Visualização do gel de agarose
-
Horizontal
+ By Diamar
Eletroforese
By Diamar
Vídeo de Eletroforese
By Diamar
Clonagem Molecular
By Diamar
By Diamar
Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um
gene específico, com uma característica desejada, e transfere este
gene para outro organismo vivo
DNA
Plasmídeo
Transformação
DNA da bactéria
Digestão Enzima de restrição
Tesoura genética
rDNA
Clonagem
By Diamar
O DNA recombinante
By Diamar
Vídeo de Clonagem
Molecular
By Diamar
Vetor
By Diamar
Vetor
(continuação)
Características gerais
Região promotora
Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker
Gene de resistência a antibióticos
Origem de replicação
Gene repórter
By Diamar
Vetor
(continuação)
PLASMÍDEOS:
By Diamar
Vetor
(continuação)
FAGOS
Vírus de bactérias
Fago λ é o mais utilizado
Fita dupla linear
Recirculariza durante a infecção na bactéria
Aceita até 20 mil pb
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Vetor
(continuação)
COSMÍDEOS
Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria
Possuem seqüências cos
Aceitam insertos de até 50 mil pb
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COSMÍDEOS
By Diamar
Vetor
(continuação)
By Diamar
Engenharia Genética – Produção em série
- Hormônio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormônio sexuais
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Sequenciamento
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Sequenciamento
(continuação)
P A P A
C
P P C
C5 BN G C5 BN G
C4 C1 T C4 C1 T
U
Ribose Pentose
C3 C2 C3 C2
OH OH OH OH
By Diamar
Estuda a integridade da sequência de um DNA
molde. Analisa diferentes tamanhos de
fragmentos formados a partir de um primer e da
inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e
A C G T
DNA molde
Primer
DNA polimerase
T G C A
Fragmento 1
ddNTP dNTP dNTP dNTP
C A
Fragmento 2
ddNTP dNTP
G C A
Fragmento 3
ddNTP dNTP dNTP
By Diamar
Sequenciamento automatizado
Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)
By Diamar
Southern Blotting
E. M. Southern (1975)
Fragmentos de DNA são separados em gel de
agarose
Transferidos para membranas por ação capilar
DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência
Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
By Diamar
Southern blot
Descrição:
- Digestão do DNA em teste com enzimas
de restrição;
- Resolução dos fragmentos com
eletroforese em gel de agarose;
- Transferência do DNA para membrana de
nylon;
- Hibridação com uma sonda de DNA ou
RNA marcada com radioatividade ou
quimioluminescentes
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Southern blot
By Diamar
Northern blotting
(Continuação)
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Northern blotting
Marcadores
rRNA
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Western blotting
(continuação)
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Western blotting
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Western blotting
Análise de proteínas por anticorpos específicos após
eletroforese e transferência para membrana.
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Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
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PCR - RFLP
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RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
DNAs genômico de
Arabidopis é digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul e
verde.
F1 é heterogênio
possui fragmentos de
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo
diferentes: C-
Colombia, N-
Niederzenzes e H –
Heterozigoto.
Oligonucleotídeo alelo-
específico (ASO)
Descrição:
- Hibridação preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composição
de bases complenmentar única.
Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.
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FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
By Diamar
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FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
Relação evolutiva
entre cromossomos.
DNA de gibão
Hylobates lar
sondado com DNA
Humano.
Setas indicam
cromossomo 8 do
gibão.
Cromossomo
humano 4 hibrida
com cromossomo
(laranja) do macaco
verde africano.
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SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Heterozigoto
) Fragmentos até
200 pb – 90% de
sensibilidade.
) Fragmentos
maiores que 400 pb
- 80% de
sensibilidade.
(digestão )
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina
Chips de genes
Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Microdisposição de oligo ou de sondas
- Microssíntese de oligos in situ (no chip)
- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
fabricadas
- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA
Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
Leitura por scanners
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Microarray
Microarranjos de DNA – Chips de DNA
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Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Descrição:
- Hibridação do DNA em
teste com disposições
ordenadas de nucleotídeos
em chip de silicone.
Aplicação:
- Detecção de DNA em
teste com composição
conhecida.
By Diamar
Referências Bibliográficas:
MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array
of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65.
SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.
Mol. Biol. 98:503-517.
By Diamar
Obrigada!
By Diamar