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FUNDACIN UNIVERSITARIA DE CIENCIAS DE LA SALUD HOSPITAL DE SAN JOS - INFANTIL FACULTAD DE INSTRUMENTACION QUIRRGICA

LABORATORIO 3 DE BIOQUMICA EXTRACCIN DE DNA.


El xito no se logra slo con cualidades especiales; es sobre todo un trabajo de constancia, de mtodo y de organizacin J.P. Sergent

1. OBJETIVO: Extraer cido desoxirribonucleico (DNA) a partir de una muestra de tejido vegetal y aproximarse a las tcnicas de extraccin y purificacin realizadas en los laboratorios de biologa molecular. 2. TIEMPO: 3 horas (7:00am a 10:00am) MATERIALES:1 gradilla, 3 tubos de ensayo, 1 mortero, 1 licuadora, 2 vaso de precipitado de 250ml, 1 erlenmeyer de 100ml, 1 agitador, 1 pipeta, 1 pipeteador, 2 papel filtro, 1 embudo, cuadros pequeos de papel aluminio o de plstico, cinta pegante delgada, 1 vidrio de reloj. REACTIVOS: 100g de muestra de tejido vegetal (tomate), 200mlde agua destilada, 30g de cloruro de sodio, 70g de bicarbonato de sodio, 100ml detergente SDS, alcohol etlico o isopropanol absolutos fros (dejar el alcohol en hielo, sin que este se congele). 3. INTRODUCCIN: La funcin principal del DNA es mantener a travs de un sistema de claves (cdigo gentico) la informacin para que sta se exprese en una clula y se transmita a la descendencia durante el proceso de reproduccin celular, por medio de la replicacin para formar dos nuevas dobles hlices hijas. La informacin biolgica de los organismos se almacena en la secuencia especfica de nucletidos de adenina, guanina, citosina y timina del DNA, que actan como plantilla para la transcripcin de RNA; una vez que se ha trascrito un RNA mensajero, los ribosomas se encargan de sintetizar una determinada protena. El flujo de informacin desde el DNA hasta las protenas es, de acuerdo con Francis Crick, dogma central de la biologa molecular. La estructura del DNA presenta las siguientes caractersticas: 1. La molcula de DNA est formada por dos cadenas de polinucletidos enrolladas alrededor de un mismo eje, formando una doble hlice. Esta estructura tiene semejanza a una escalera de caracol. 2. Las dos cadenas complementarias de polinucletidos en el DNA son antiparalelas, ya que una de las cadenas empieza por el extremo donde se encuentra el residuo 5', mientras que la otra lo hace por el extremo donde se encuentra el residuo 3' (3significa que en ese extremo, la desoxirribosa tiene el OH del carbono 3 libre y 5 se refiere al carbono 5de la desoxirribosa que llevar el fosfato).

FUNDACIN UNIVERSITARIA DE CIENCIAS DE LA SALUD HOSPITAL DE SAN JOS - INFANTIL FACULTAD DE INSTRUMENTACION QUIRRGICA 3. Las bases nitrogenadas de los nucletidos se orientan hacia el interior de la doble hlice, mientras que los grupos fosfato y las molculas de azcar se orientan hacia el exterior conformando un esqueleto azcar-fosfato. 4. Las bases de ambas cadenas estn unas frente a otras y se unen a travs de puentes de hidrgeno: dos entre la adenina y la timina (A=T) y tres entre la guanina y la citosina (G = C). 5. La longitud de cada vuelta en la hlice es de 3.4 m un nanmetro es igual a 10-9 m). 6. La distancia entre un par de nucletidos y otro es de 0.34 m, por lo tanto, en cada vuelta debe haber 10 pares de nucletidos1,2.

4. PROCEDIMIENTO: 4.1 Preparacin de la muestra: tome el tomate crtelo en trozos pequeos, luego adicione de 100ml a 150ml de agua destilada, colquelos en la licuadora y pngala a funcionar en 3 intervalos de 10 segundos cada uno. Filtre la solucin obtenida con cuidado de no dejar caer residuos en el filtrado. Por otro lado, coloque el alcohol etlico o el isopropanol en hielo o djelo en la nevera para ser utilizado frio. 4.2 Preparacin del Buffer de lisis: tome 200ml de agua destilada, adicinele 20g de cloruro de sodio, 120g de bicarbonato de sodio, agite vigorosamente esta solucin, luego adicione 10ml de detergente SDS. 4.3 Solubilizacin de las membranas: tome 10ml de la muestra de tomate y adicinele 20ml del buffer de lisis, tape bien el erlenmeyer para agitar la mezcla durante 2minutos. Luego filtre muy bien esta solucin. 4.4 Extraccin del DNA: del filtrado anterior (paso 4.3) tome 5ml y adicinele despacio y suavemente 10ml de alcohol etlico o isopropanol absoluto (al 96%), deje en reposo la muestra por 1minuto o hasta que observe que entre la muestra y el alcohol se forma una fase o zona de color blanquesino. 4.5 Recogida del DNA: ahora tome el agitador de vidrio y con cuidado introdzcalo hasta llegar a la zona blanquesina e intente enrrollar el DNA para ser sacado y colocado sobre un vidrio de reloj.

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Recurso on-Line [febrero-2011]: http://www.encolombia.com/medicina//Menovol151-09/Endocrinologia1.htm. Laboratorio de Evolucin, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Qumica.

FUNDACIN UNIVERSITARIA DE CIENCIAS DE LA SALUD HOSPITAL DE SAN JOS - INFANTIL FACULTAD DE INSTRUMENTACION QUIRRGICA 5. PREGUNTAS BASICAS: 1. Para realizar su marco terico describa la cadena de DNA y sus caractersticas qumicas, explique cmo se empaqueta el DNA para permitir la formacin de genes y cromosomas, investigue sobre cmo se realiza en un laboratorio de biologa molecular la extraccin del DNA. 2. Para plantear la pregunta y la respectiva hiptesis identifique la variable independiente y la variable dependiente. 3. Registre el resultado obtenido e intente identificar las causas de error. 4. En el anlisis de resultados explique: de dnde proviene (organelo) el DNA obtenido y es solamente nuclear? cul es la importancia de cada uno de los pasos realizados (con especial nfasis en la accin del buffer de lisis)?. 5. Explique en los anlisis de resultados la reaccin qumica o en su caso el efecto qumico de cada reactivo con la clula en: las membranas celulares y el DNA. 6. Compare los procedimientos tanto el realizado en la prctica como el que se realiza en un laboratorio de biologa molecular. 7. Investigue qu es un gel de electroforesis de DNA y cmo se relaciona esta prueba con la extraccin y purificacin del DNA? 8. Indague y explique 2 enfermedades relacionadas con mutaciones de la cadena de DNA. 9. Consulte dos tcnicas de anlisis que utilicen el DNA para el diagnostico de enfermedades.

NURY ESPERANZA VARGAS A. MSc CIENCIAS BSICAS. PUJ LICENCIADA EN QUMICA. UD