Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

METODOLOGIA PARA DETERMINAO DE DIGLUCONATO DE CLORHEXIDINA EM CARCAAS DE FRANGO UTILIZANDO CLAE PAR INICO E AVALIAO DE RESDUOS DURANTE A REFRIGERAO E CONGELAMENTO1
Eduardo VICENTE2,*, Maria Ceclia de Figueiredo TOLEDO3 RESUMO
O uso do digluconato de clorhexidina (DGCH) na higienizao de equipamentos e instalaes na indstria de alimentos e o interesse de aplicao deste produto como sanitizante em carcaas de frango indicam a necessidade da avaliao de resduos no alimento. Um mtodo por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com pareamento de ons, incluindo extrao com ter etlico em meio alcalino, foi desenvolvido para determinao de clorhexidina em carne de frango. O limite de quantificao do mtodo (0,6g/g) e a recuperao mdia em carcaa (75% CV 10%), em pele (72% CV 7%) e na musculatura (82% CV 8%) foram considerados adequados aos propsitos do mtodo. As anlises de carcaas e pele tratadas, mantidas refrigeradas ou congeladas, permitiu constatar que ocorreu uma pequena reduo nos nveis residuais de DGCH durante o perodo de armazenamento. Como provveis causas desta diminuio devem ser considerados a interao com componentes polares da matriz, a perda juntamente com os fluidos liberados dos tecidos durante o armazenamento refrigerado ou no descongelamento de carcaas inteiras e a degradao da clorhexidina. A ausncia deste sanitizante na musculatura aps o armazenamento refrigerado indica que nas condies empregadas, o DGCH no atravessa a barreira da pele. Palavras-chave: digluconato de clorhexidina; cromatografia lquida; carcaas; frangos.

SUMMARY
HPLC ION PAIRING DETERMINATION OF CHLORHEXIDINE DIGLUCONATE IN TREATED POULTRY CARCASSES. ANALYSIS DURING REFRIGERATION AND FREEZING. The use of the antimicrobial agent chlorhexidine digluconate in the sanitization of food industry equipment and installations, and the interest on its application to decontaminate poultry carcasses indicates the need to determine its residue in food. An ion pairing HPLC UV analytical method including an ethyl ether extraction in alkaline medium was developed to measure clorhexidine residue in poultry meat. The limit of analytical quantitation (0,6g/g) and recoveries in carcasses (75% CV 10%), skin (72% CV 7%), and muscular tissue (82% CV 8%) were appropriate to the purposes of the method application. The analysis of treated carcasses and skin, maintained refrigerated or frozen showed a slight decrease of the initial levels during storage. The interaction with polar components of matrix, the elimination with tissues fluid during refrigerated storage, the unfreezing step of the whole carcasses, and the degradation of the added chlorhexidine can be considered as the most probable cause for the decrease. The absence of residue in muscular tissue after refrigerated storage showed that the molecule practically did not cross the skin barrier. Keywords: chlorhexidine digluconate; HPLC; poultry; carcasses.

1 INTRODUO
A clorhexidina, uma bis-guanida com propriedades antimicrobianas, foi introduzida na dcada de 50 e tem sido amplamente utilizada na odontologia e nas reas mdica e veterinria [4, 13, 14, 19]. Nas indstrias que manipulam produtos de origem animal ela tem sido empregada como desinfetante de mos, equipamentos e superfcies [2, 8]. As evidncias da baixa toxicidade [9, 12], aliadas eficincia antimicrobiana, levaram ao desenvolvimento de estudos para avaliar a aplicao da clorhexidina para o controle de microrganismos em diferentes alimentos. Resultados preliminares foram favorveis ao emprego direto do digluconato de clorhexidina (DGCH) durante a maturao de queijos, ps-colheita em mas [10, 22] e para descontaminao de carcaas de frangos [24]. Em
1. Recebido para publicao em 23/11/2001. Aceito para publicao em 23/04/2003 (000780). 2 Centro de Qumica, Instituto de Tecnologia de Alimentos ITAL. Av. Brasil, 2880 Campinas-SP. CEP 13073-001 Fone: (0XX19)37431771. E-mail: evicente@ital.org.br 3 Departamento de Cincia de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos-FEA UNICAMP. Cidade Universitria Campus Zeferino Vaz. CEP 13001-970. Fone: (19) 3289-2168 Fax: 3788-7890. E-mail: macecil@fea.unicamp. br * A quem a correspondncia deve ser enviada.

um estudo comparativo foi constatado que o DGCH foi um dos produtos mais eficientes, aumentando a vidatil de carcaas de frango refrigeradas para 9 dias, ao passo que carcaas tratadas com outros sanificantes possibilitaram o armazenamento por no mximo 8 dias [17]. A aplicao do DGCH para a pulverizao direta de carcaas de frango, sunos e bovinos foi permitida no Brasil, atravs da Autorizao de Uso de Produto (AUP) No 184/93 [1]. Esta AUP foi revogada posteriormente e o pedido de registro indeferido [3], tendo em vista a possibilidade de resduos no produto final, ausncia de informaes toxicolgicas e a possibilidade de mascarar falhas no processo tecnolgico, no que se refere aos valores microbiolgicos. Mtodos analticos foram desenvolvidos para determinao de DGCH em produtos farmacuticos [7, 13, 23]. HUSTON et al. [14] efetuaram anlises de DGCH em sangue e urina fazendo a extrao com ter etlico em meio alcalino. BROUGHAM et al. [5] optaram pela partio com clorofrmio-2% isopropanol em meio alcalino, seguido da extrao para um meio aquoso fracamente cido. Para anlise em urina, a amostra foi percolada em cartucho de C18 e o DGCH eludo com metanol [11]. Um mtodo para avaliao do nvel residual de DGCH em saliva foi desenvolvido por PESONEN et al. [18], onde pequenos volumes de saliva alcalinizada foram extrados com acetonitrila, posteriormente separada da frao

370

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

aquosa por centrifugao. Devido ao carter fortemente inico do DGCH, a maioria dos mtodos utilizou cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em fase reversa, com par inico. Foram avaliadas fases mveis contendo os cidos pentadecafluorooctanico, tolueno-4-sulfnico, heptanossulfnico ou o heptanossulfonato de sdio como contra-on [14]. A deteco foi feita em comprimento de onda de 260nm, ou em 220-230nm quando o DGCH foi determinado simultaneamente com o produto de degradao, 4-cloroanilina [11, 18, 20, 23]. A possibilidade da introduo do DGCH na descontaminao de carcaas torna necessrio o estudo dos nveis residuais deste sanificante no alimento. Apesar das informaes disponveis indicarem a baixa toxicidade do DGCH, importante conhecer a contribuio desta fonte adicional do xenobitico e obter informaes para uma adequada avaliao toxicolgica do produto. Todavia, no existem mtodos apropriados para a determinao de DGCH em tecidos animais. O presente trabalho tem como objetivos o desenvolvimento de metodologia para quantificao de DGCH em carcaas de frangos e tambm a avaliao de resduos do antimicrobiano em carcaas tratadas com o sanitizante, durante a refrigerao e o congelamento.

o comercial do DGCH a 20%, foi preparada uma diluio aquosa na proporo 1:500, resultando numa concentrao final de 0,4g/L. Um volume total de 350L dessa soluo foi utilizado para tratar 38 carcaas, com um peso unitrio mdio de 1501g 20g. As carcaas utilizadas foram separadas da linha de produo antes da etapa de embalagem. O tratamento foi feito pela imerso total das mesmas na soluo, por cerca de 2 segundos. Em seguida, estas foram colocadas em caixas plsticas vazadas, ali permanecendo durante 20 minutos, para que o excesso da soluo fosse eliminado. As carcaas foram aleatoriamente reunidas em grupos compostos por cinco unidades, cujos pesos variaram entre 7380 a 7680g e depois embaladas em sacos plsticos. Paralelamente, cinco carcaas sem qualquer tratamento foram embaladas da mesma forma para servir como amostra controle. Para a avaliao dos nveis residuais de clorhexidina em pele, foram separados da linha de produo vinte e um cortes de peito com pele. As amostras foram, a seguir, tratadas com a mesma soluo de clorhexidina 0,4g/L, tambm utilizando imerso por 2 segundos. Destes cortes foram separadas as peles, incluindo seus anexos lipdicos, cujo peso unitrio mdio era de 92g 9g. A seguir, as peles foram embaladas em sacos plsticos, formando grupos de trs unidades, que apresentaram pesos na faixa de 240g a 314g. As peles de outros trs cortes de peito, sem qualquer tratamento, foram embaladas da mesma forma, para utilizao como amostra testemunha. 2.4 Homogeneizao das amostras Anteriormente homogeneizao das carcaas foi efetuada a remoo manual dos ossos e apenas foram mantidas a musculatura e pele. Na etapa seguinte a amostra foi passada duas vezes em moedor de carne e processada por 10 minutos em cutter (Hobart), at a obteno de um pasta homognea. 2.5 Armazenamento 2.5.1 Amostras refrigeradas Parte das amostras de carcaas e peles foram tratadas no abatedouro e em seguida homogeneizadas. O acompanhamento dos resduos foi feito aps 0, 2, 4, 6, 8 e 12 dias, a contar do dia do tratamento. Durante este perodo as amostras foram mantidas em temperatura de 5oC 2oC. As anlises em carcaa foram efetuadas em triplicata e na pele em duplicata, utilizando o mtodo desenvolvido. Amostras de carcaa e pele tratadas foram armazenadas inteiras e analisadas aps 6 e 11 dias de refrigerao (5oC 2oC). A homogeneizao ocorreu somente no momento da anlise. Outras 3 carcaas tratadas foram armazenadas inteiras por 12 dias a 5 oC 2oC. Em seguida a musculatura do peito foi separada da pele e dos ossos, homogeneizada e analisada em triplicata, a fim de verificar a migrao da clorhexidina aplicada na superfcie.

2 MATERIAL E MTODOS
2.1 Reagentes Alacalase Food Grade atividade 2,4L (Novo Nordisk), hexano, acetonitrila, metanol grau CLAE (Mallinckodt), ter etlico P. A. estabilizado com BHT (Carlo Erba), trietilamina, heptanossulfonato de sdio (Aldrich), cido fosfrico 85%, hidrogeno fosfato dissdico, cido frmico 98% PA (Merck) e gua desmineralizada em sistema Milli Q (Millipore). Digluconato de clorhexidina soluo comercial a 20% (Laboratrio Enila) e soluo padro 20% (Aldrich). 2.2 Instrumentao O equipamento utilizado foi um cromatgrafo lquido (Varian LC Star), equipado com bomba isocrtica modelo 9002, detector UV varivel ( 260nm) modelo 9050 e injetor Rheodyne com loop de 120L. As separaes foram efetuadas em uma coluna Rainin Microsorb MV RP18 (250mm x 4,6mm di; com partculas de 5m, silanizada), sendo a temperatura mantida a 30oC com o auxlio do aquecedor de coluna (Pharmacia s 5/20). A fase mvel foi constituda de acetonitrila-tampo (0,1 M Na2HPO4-0,005M heptanossulfonato de sdio-0,05M trietilamina-cido fosfrico pH 2,5), na proporo 33:67, com fluxo 1,0mL/min. 2.3 Tratamento das amostras Para conhecimento dos nveis residuais de clorhexidina aps tratamento nas condies reais de operao nos abatedouros, desenvolveu-se um experimento sob condies controladas. Utilizando uma solu-

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

371

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

2.5.2 Amostras congeladas As amostras de carcaa tratadas foram congeladas (-20 oC 2 oC) inteiras no mesmo dia do tratamento e analisadas aps 15, 30, 60 e 90 dias. As amostras correspondentes a 15 dias de armazenamento foram mantidas congeladas depois da homogeneizao, para posterior anlise aps 30, 60 e 90 dias. As demais amostras permaneceram inteiras at o momento da anlise. 2.6 Mtodo analtico Foram pesados 5g de amostra homogeneizada em um tubo de centrfuga com capacidade para 50mL e com tampa de polietileno. Adicionaram-se sobre a amostra 200L de alcalase, mantendo-se o tubo a 45oC por 30min, com agitao intermitente, at a liquefao da amostra. Aps a digesto enzimtica foram acrescentados 2g de cloreto de sdio, 15mL de hidrxido de sdio 1N e 25mL de ter etlico. O tubo foi mantido sob agitao por 1h, em agitador modelo Wagner (30 ciclos/min). A seguir, foi feita a centrifugao a 2000rpm/10min e a frao superior foi recolhida em outro tubo de 50mL. Seqencialmente, foram adicionados outros 20mL de ter etlico ao primeiro tubo, que foi agitado por 1 minuto e centrifugado a 2000rpm/10min. A frao superior foi ento separada e reunida com a anterior, descartandose o tubo com a frao aquosa inferior. O ter recolhido nas duas centrifugaes foi totalmente evaporado em fluxo de ar comprimido/50oC, permanecendo apenas o extrato lipdico. Ao tubo foram adicionados 20mL de hexano, 30mL de metanol e 200L de cido frmico. O tubo foi vigorosamente agitado por 1 minuto e deixado em repouso durante 10 minutos em freezer (20 oC). O hexano que permaneceu na fase superior foi descartado e a frao inferior mantida. Este processo foi repetido outras 2 vezes, utilizando 10mL de hexano em cada partio. A frao inferior foi evaporada at a secura, com fluxo de ar comprimido/50oC. O resduo foi dissolvido em 5mL de fase mvel, filtrado em membrana de 0,45m e a seguir injetado em cromatgrafo lquido com detector UV (260nm). Para amostras de pele, cujo teor de protena baixo e o contedo lipdico elevado, no foi necessria a digesto com alcalase. O ter etlico, cloreto de sdio e o hidrxido de sdio foram diretamente adicionados amostra e o procedimento seguido sem qualquer outra modificao. A separao cromatogrfica foi efetuada em coluna de fase reversa C18 silanizada (partculas de 5, 250mm x 4mm di), com fase mvel composta de acetonitrila-tampo (0,1 M Na2HPO4-0,005M heptanossulfonato de sdio-0,05M trietilamina pH 2,5 corrigido com cido orto-fosfrico P. A.), na proporo 33:67, com fluxo 1,0mL/min. A confirmao da identidade foi possvel pela anlise por CLAE detector de arranjo de diodos (bomba LC10AD, forno de colunas CTO 10 A, detector SPD M10A fabricados pela Shimadzu), atravs da comparao dos espectros de absorbncia (190-400nm) de picos com tempo de reteno equivalente ao padro de clorhexidina.

Foram utilizadas a mesma coluna, fase mvel e condies cromatogrficas descritas no mtodo analtico. 2.7 Avaliao do desempenho do mtodo Para avaliao da metodologia foram feitas fortificaes de amostras no tratadas, utilizando-se solues aquosas de DGCH. Amostras homogeneizadas de musculatura do peito foram fortificadas com 1, 2, 4, 6, 8 e 10g/g de clorhexidina. Amostras de carcaas inteiras homogeneizadas (musculatura e pele) foram fortificadas com 1, 2, 4, 5, 10 e 20g/g de clorhexidina. A avaliao do mtodo em pele do peito foi feita com fortificaes de 2, 4, 8, 10, 20, 40 e 80g/g de clorhexidina. Para a avaliao estatstica dos dados foram utilizados anlise de varincia e o teste de Tukey Diferena Mnima Significativa, ao nvel de significncia 5%. 2.8 Limites de deteco, quantificao e preciso do mtodo O limite de deteco do mtodo (LD) foi determinado pela anlise de 8 repeties de amostras fortificadas com 1,0g/g de DGCH, de acordo com procedimento descrito por DE BRUIN et al. [6]. O desvio padro da mdia dos resultados foi multiplicado pelo valor de t de Student para uma confiabilidade de 99% segundo os graus de liberdade apropriados. Para 8 repeties e sete graus de liberdade o valor t de Student tabelado de 2,998. O limite de quantificao do mtodo (LQM) foi estabelecido com base em KEITH et al. [15] e LONG & WINEFORDNER [16], que o definem como 10 vezes o valor do desvio padro. A preciso do mtodo foi calculada pelo coeficiente de variao (CV%), calculado a partir das determinaes de amostras de pele, carcaa homogeneizada ou musculatura do peito, fortificadas em diferentes nveis com quatro repeties em cada nvel. A quantificao foi feita por calibrao externa.

3 RESULTADOS E DISCUSSO
3.1 Desenvolvimento do mtodo Um dos maiores obstculos para o desenvolvimento de um mtodo apropriado para analisar resduos de DGCH em tecidos animais o fato dos mesmos serem slidos e ricos em lipdios. As diversas metodologias que so descritas na literatura [5, 11, 14, 18] foram desenvolvidas em matrizes lquidas ou fluidas, onde a extrao se inicia com uma partio lquido-lquido em meio alcalino. Devido ao carter inico da clorhexidina, que interage com estruturas polares da amostra slida, a extrao da molcula na forma de digluconato exigiu o emprego de solventes aquosos. A digesto com a alcalase, uma endopeptidase, foi capaz de promover a desnaturao das protenas, tornando a amostra mais fluida e com uma pequena quantidade de slidos de tamanho reduzido. Esta enzima foi selecionada por sua eficincia, atividade em ampla faixa de pH e temperatura, alm de ser disponvel comercialmente. Na etapa seguinte, a utiliza-

372

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

o de hidrxido de sdio 1N, elevando o pH acima do valor de pKa 10,3, [14], converteu a clorhexidina a sua forma neutra, solvel em solventes orgnicos. Para a extrao da amostra digerida e alcalinizada foram avaliados o clorofrmio, cloreto de metileno, acetato de etila e o ter etlico, sendo que apenas o ltimo favoreceu a partio e a evaporao que seria necessria na etapa posterior. A centrifugao foi imprescindvel para separar as partculas slidas da amostra e quebrar a emulso formada durante a agitao. O cloreto de sdio adicionado nesta etapa teve como funo auxiliar a quebra da emulso e diminuir a afinidade do ter etlico pela gua. A estabilidade da clorhexidina permitiu a evaporao do solvente com aquecimento e com fluxo de ar comprimido. Os componentes lipdicos dos tecidos foram extrados pelo ter e permaneceram aps a evaporao. A partio metanol/hexano foi introduzida para a remoo desta gordura. Foi necessrio empregar a baixa temperatura para reduzir a miscibilidade do hexano no metanol. Os lipdios foram eliminados juntamente com o hexano, permanecendo a clorhexidina na fase metanlica. O cido frmico nesta etapa teve a funo de eliminar possveis resduos de hidrxido de sdio transferidos juntamente com o ter. Aps a evaporao do metanol, o extrato foi solubilizado na fase mvel, onde o pH 2,5 permitiu que a molcula retornasse sua forma ionizada. O heptanossulfonato de sdio presente na fase mvel atuou como contra-on e permitiu a separao cromatogrfica em coluna de fase reversa C18. 3.2 Avaliao do desempenho do mtodo A resposta do detector UV (260nm) ao DGCH foi linear na faixa de 0,5 a 20g/mL (Figura 1).

O LD calculado foi de 0,2g/g, enquanto o LQM foi de 0,6g/g. As recuperaes de amostras de pele, carcaa total e musculatura fortificadas so apresentadas na Tabela 1. Os resultados indicaram que no houve diferena significativa nas recuperaes entre os diferentes nveis adicionados pele, com mdia de 72% e CV de 7,38% Em carcaas, a diferena somente foi significativa entre os nveis de 1g/g e 10g/g, com valor mdio de 75% e CV 10,08%. Nas anlises em musculatura ocorreu diferena significativa entre os nveis mais baixos (1,2,4 e 6g/g) e os nveis mais altos (8 e 10g/g), com recuperao mdia de 83% e CV 8,0%.
TABELA 1. Recuperao de digluconato de clorhexidina adicionado a diferentes tecidos de frangos.
Musculatura1 Pele2 Carcaa total 1 Nvel de Recuperao Nvel de Recuperao Nvel de Recuperao Fortificao (%) Fortificao (%) Fortificao (%) (g/g) (g/g) (g/g) 1 80 1 2 66 6 1 67 6 2 4 6 8 10 ---1

738 793 831 902 904 -----

4 8 10 20 40 80

67 8 73 3 76 4 72 7 75 1 75 2

2 4 5 10 20 ----

75 10 73 9 74 5 79 5 80 4 ---

Anlise de amostras pelo mtodo desenvolvido incluindo a digesto enzimtica. Mdia de 4 repeties. 2 Anlise de amostras pelo mtodo desenvolvido sem a digesto enzimtica. Mdia de 4 repeties.

3.3 Anlises em amostras tratadas no abatedouro Os resduos de clorhexidina foram determinados nas carcaas e peles tratadas com DGCH, armazenadas inteiras ou previamente homogeneizadas, sob refrigerao (5 2oC) ou congelamento (20oC). As Tabelas 2 e 3 apresentam os resultados das anlises efetuadas durante 12 dias nas amostras refrigeradas e a Tabela 4 mostra os nveis de DGCH encontrados nas amostras congeladas durante os 90 dias de armazenamento. Os resultados da Tabela 2 indicam que tanto nas carcaas inteiras como nas amostras homogeneizadas os resduos de DGCH diminuram durante o armazenamento a 5oC. No caso das carcaas inteiras a reduo foi bem mais acentuada, chegando a cerca de 50% no final dos 12 dias.

FIGURA 1. Linearidade de resposta a diferentes concentraes de digluconato de clorhexidina determinadas por CLAEdetector UV (260nm).

TABELA 2. Resduos de digluconato de clorhexidina em carcaas armazenadas a 5oC.

Dias aps o tratamento Clorhexidina ( g/g) Homogeneizadas1 Mdia 0 2 4 6 8 12
3 4

A linearidade da resposta do detector pode ser expressa pela equao: Y = 12978 X 685 onde: Y = rea do pico; X = Concentrao (g/g) Coeficiente de Correlao (r ) = 0,999
2

Inteiras2 Mdia3 14,20,9 NR4 NR 8,00,5 NR 7,00,7

14,20,9 14,90,7 14,10,9 14,10,4 13,20,5 12,30,7

(1)

Mdia de 3 determinaes No Realizado

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

373

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

Em relao s carcaas congeladas (Tabela 3), as variaes observadas nos teores de DGCH no indicam uma tendncia definida e podem ter ocorrido devido homogeneizao irregular das amostras e/ou heterogeneidade das carcaas inteiras em relao ao nvel residual de clorhexidina. Os resultados obtidos sugerem que no houve diminuio dos nveis residuais de DGCH durante o armazenamento, pelo menos para as amostras homogeneizadas.
TABELA 3. Resduos de digluconato de clorhexidina em carcaas de frango armazenadas a 20oC.
Dias aps o tratamento Clorhexidina ( g/g) Homogeneizadas Mdia1 15 30 60 90
1

visivelmente menor que a observada durante o perodo de armazenamento sob refrigerao, o que pode explicar a maior reduo dos nveis de DGCH nas amostras refrigeradas relativamente quelas mantidas congeladas. A possibilidade de ocorrncia de interaes entre o DGCH e estruturas dos tecidos est de acordo com resultados relatados por GELINAS & GOULET [12]. Estes autores avaliaram a neutralizao de desinfetantes por matria orgnica e constataram que a atividade do acetato de clorhexidina era moderadamente afetada na presena de leite em p, sangue bovino desidratado e farinha de peixe. Em todas as situaes avaliadas importante considerar que, apesar de as amostras terem apresentado pesos semelhantes, as quantidades de DGCH que foram retidas nas mesmas podem ter variado em funo de caractersticas peculiares a cada unidade utilizada para compor a amostra. Este fato pode ter sido parcialmente responsvel pela inconsistncia de alguns resultados, impedindo uma melhor caracterizao do comportamento dos resduos durante o armazenamento de carcaas e peles inteiras. A anlise seqencial de alquotas da mesma amostra previamente homogeneizada minimizou esta varivel, permitindo uma melhor avaliao dos resultados. Atravs da anlise da musculatura do peito (n=3), separada de carcaas tratadas aps o armazenamento por 12 dias a 5oC, constatou-se que os nveis residuais de DGCH estavam abaixo do limite de quantificao do mtodo (0,6g/g), o que indica que a migrao do sanitizante atravs da pele foi mnima. O mtodo desenvolvido permitiu a quantificao dos resduos nos diferentes tecidos. Os cromatogramas caractersticos de amostras de pele (Figura 2) e carcaa (Figura 3) tratadas com DGCH, assim como os respectivos controles, mostram que existem poucos interferentes com tempo de reteno prximo clorhexidina. A partir do 8o dia de armazenamento sob refrigerao, percebeu-se nas amostras no tratadas o desenvolvimento de odores decorrentes de decomposio. Nas amostras tratadas, nenhum odor estranho foi notado at o final do experimento, o que um indicativo da eficincia do sanitizante, muito embora a avaliao microbiolgica no tenha sido objeto deste estudo.

Inteiras Mdia1 6,60,1 6,70,2 7,70,5 5,00,5

6,60,1 6,80,3 8,30,2 6,90,2

Mdia de 3 determinaes

Um teor relativamente maior de DGCH foi determinado em peles de frango (Tabela 4) relativamente s carcaas inteiras, o que era esperado tendo em vista a aplicao superficial do sanitizante. Tanto nas amostras homogeneizadas quanto nas peles inteiras a quantidade de resduos diminuiu gradualmente durante o armazenamento refrigerado.
TABELA 4. Resduos de digluconato de clorhexidina em peles de frango armazenadas a 5oC.
Dias aps tratamento Clorhexidina ( g/g) Homogeneizadas Mdia1 0 2 4 6 8 12
1 2

Inteiras Mdia1 32,10,8 NR2 NR 29,83,0 NR 20,00,5

32,10,8 27,40,4 29,90,0 28,31,0 27,41,2 24,20,4

Mdia de 2 determinaes No Realizado

4 CONCLUSES
A proposta inicial de desenvolvimento de mtodo analtico para determinao do DGCH foi plenamente atingida. O procedimento desenvolvido proporcionou recuperao e sensibilidade adequadas aos nveis encontrados nas amostras e permitiu analisar resduos em tecidos com diferentes teores de gordura. O consumo de solventes e reagentes pequeno e os equipamentos exigidos so relativamente simples. Tendo em vista a simplicidade da vidraria utilizada, vrias extraes podem ser feitas simultaneamente. Os resduos de DGCH permaneceram nas carcaas aps o tratamento com o sanificante e persistiram durante a refrigerao ou congelamento.

A reduo dos nveis do sanitizante nos tecidos armazenados inteiros ou homogeneizados pode ser atribuda, entre outros, a interaes irreversveis do DGCH com grupos polares e/ou inicos da matriz e/ou sua solubilizao nos fluidos liberados pelos tecidos durante o armazenamento a 5oC ou descongelamento. Uma possvel degradao do composto tambm no deve ser descartada, muito embora acredite-se que esta seja pequena, tendo em vista a estabilidade do DGCH e as baixas temperaturas empregadas. importante ressaltar que a perda de lquidos durante o processo de descongelamento das carcaas foi

374

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

mVolts-

[A]
clorhexidina

mVolts-

[A]
clorhexidina
Tempo (min)

Tempo (min)

mVolts-

[B]

mVolts-

[B]

Tempo (min)

Urv

FIGURA 2. Cromatogramas por CLAE tpicos de pele de frango. Diluio final das amostras 5g/10mL. Condies cromatogrficas: coluna C18 silanizada (250mm x 4,6mm di); fluxo 1,0mL/min; fase mvel acetonitrila-tampo fosfato(0,1 M Na 2HPO 4-0,005M heptanossulfonato de sdio-0,05M trietilamina- c. fosfrico pH 2,5) na proporo 67:33. [A] Amostra tratada com soluo de digluconato de clorhexidina com o pico equivalente a 16,1g/mL, tR = 6,73 min. [B] Amostra no tratada.

FIGURA 3. Cromatogramas por CLAE tpicos de carcaa de frango. Diluio final das amostras 5g/5mL. Condies cromatogrficas: coluna C18 silanizada (250mm x 4,6mm di); fluxo 1,0mL/min; fase mvel acetonitrila-tampo fosfato (0,1 M Na 2 HPO 4-0,005M heptanossulfonato de sdio-0,05M trietilamina- c. fosfrico pH 2,5) na proporo 67:33. [A] Amostra tratada com soluo de digluconato de clorhexidina com o pico equivalente a 14,2g/mL, tR = 6,69min. [B] Amostra no tratada.

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003

375

Digluconato de clorhexidrina em carcaas de frango, Vicente et al.

Considerando que a degradao trmica do sanitizante pode formar a 4-cloroanilina, potencialmente carcinognica, sugere-se que sejam feitos estudos complementares para a determinao do produto de degradao em carcaas tratadas com DGCH e submetidas a processamento trmico.

5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] BRASIL. Ministrio da Agricultura, Abastecimento e Reforma Agrria DOI/DIPOA. Autorizao de uso de produto (AUP) No 184/93. Braslia, DF, 25 out. 1993. [2] BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento DOI/ DIPOA. Autorizao de uso de produto (AUP) No 255/ 99. Braslia, DF, 07 jul. 1999. [3] BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria N o 264 de 13 de Outubro. Dirio Oficial da Unio, Braslia, DF, 19 out. seo 1, n. 201, p. 16564, 1995. [4] BRITISH PHARMACOPOEIA. Office of the British Pharmacopoeia. London: Her Majestys Stationery Office. v. 1. 398p., 1993. [5] BROUGHAM, L.R., CHENG, H., PITTMAN, K.A. Sensitive highperformance liquid chromatographic method for the determination of chlorhexidine in human serum and urine. Journal of Chromatography v. 383, p. 365-373, 1986. [6] De BRUIN, L.S., JOSEPHY, P. D., PAWLISZYN, J.B. 1998. Solid Phase Microextraction of monocyclic Aromatic Amines from Biological Fluids. Analytical Chemistry v. 70, n. 9, p. 1986-1992, 1998. [7] DOUB, W.H., RUHL, D.D., HART, B., MEHELIC, P. R., REVELLE, L.K. Gradient liquid chromatographic method for the determination of chlorhexidine and its degradation products in bulk material. Journal of Association of Official Analytical Chemists International v. 79, n. 3, p. 636-639, 1996. [8] FINZI, M, COSTA, C. Microbiological contamination in food processing plants. Preventive measures. Rivista della Societa Italiana di Scienza dell Alimentazione, v. 8, n. 4, p. 258-261, 1979. [9] FOULKES, D.M. Some toxicological observations on chlorhexidine. Journal of Periodontal Research v. 8, p. 55-60, 1973. [10] FURTADO, M.M., SAMPAIO, M.H.D., NUNES, L.G. Avaliao do uso da clorhexidina no tratamento da salmoura e da casca do queijo curado: Relatrio tcnico. UFV, Viosa. 10p., 1989. [11] GAFFNEY, M., COOKE, M., SIMPSON, R. Improved method for the determination of chlorhexidine in urine. Journal of Chromatography v. 306, p. 303-313, 1984. [12] GELINAS, P. , GOULET, J. Neutralization of the activity of eight disinfectants by organic matter. Journal of Applied Microbiology v. 54, p. 243-247, 1983.

[13] HARBISON, M., HAMMER, S.M. Inactivation of human immunodeficiency virus by betadine products and chlorhexidine. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndomes v. 2, p. 16-20, 1989. [14] HUSTON, C.E., WAINWRIGHT, P. , COOKE, M., SIMPSON, R. High-performance liquid chromatographic method for the determination of chlorhexidine. Journal of Chromatography v. 237, p. 457-464, 1982. [15] KEITH, L.H., CRUMMETT,W., DEEGAN Jr., J., LIBBY, R.A., TAYLOR, J.K., WENTLER, G. Principles of environmental analysis. Analytical Chemistry v. 55, p. 2210-2218, 1983. [16] LONG, G.L., WINEFORDNER, J.D. Limit of detection. A closer look at the IUPAC definition. Analytical Chemistry v. 55, p. 712A-724A, 1983. [17] MACHADO, R.A. Microbiota bacteriana no processamento industrial de frangos e sua influncia na vida til de carcaas refrigeradas. 166p., 1992. Dissertao de Doutorado, Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo, So Paulo. [18] PESONEN, T., HOLMALAHTI, J., POHJOLA, J. Determination of chlorhexidine in saliva using highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography B Biomedical Applications v. 10, p. 222-225, 1995. [19] REYNOLDS, J.E.F., PRASAD, A.B., editors. Martindale. The Extra Pharmacopoeia. London: The Pharmaceutical Press. 555p. 1982. [20] RICHARD, A., ELBAZ, M., ANDERMANN, G. Determination of 4-chloroaniline and chlorhexidine digluconate by ion-pair reversed-phase highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography CHROM v. 16, n. 870, p. 356359, 1984. [21] RINDOM-SCHIOTT, C., LE, H., BRINER, W.W. Two year oral use of chlorhexidine in man. IV. Effect on various medical parameters. Journal of Periodontal Research v. 11, p. 158-164, 1976. [22] SANHUEZA, R.M.V. Efeito do digluconato de clorhexidina e tiabendazlio no controle da podrido causada por Penicillium expansum em mas CV. Fuji e Golden Delicious. Relatrio tcnico. EmbrapaCNPFT, Pelotas. 6p., 1991. [23] STEVENS, L.E., DURRWACHTER, J.R., HELTON, D.O. Analysis of chlorhexidine sorption in soft contact lenses by catalytic oxidation of [14C] chlorhexidine and by liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical Sciences v. 75, n. 1, p. 83-86, 1986. [24] TERRA, N. N. , LENZ, G., GARCIA, S. Avaliao do uso do digluconato de clorhexidina na conservao de carcaas resfriadas de frango. Relatrio tcnico confidencial. Centro de Cincias Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria. 8p., 1989.

376

Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23(3): 370-376, set.-dez. 2003