Prcticqa1. Preparacin de disoluciones y medios fisiolgicos I.

Introduccin El objetivo de esta prctica es crear una disolucin tampn de unas determinadas caractersticas y comprobar su capacidad tamponadora. Un tampn permite que el pH de una disolucin se mantenga estable, haciendo que necesarias grandes cantidades de cidos o bases para modificar el pH. Esto tiene gran utilidad en los seres vivos permitiendo que los procesos metablicos se puedan realizar sin que den lugar a cambios bruscos de pH que resultara fatal para el organismo. Bibliografa consultada: Guin de prcticas II. Parte experimental Para esta prctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Preparacin del tampn Comprobacin de la capacidad tamponadora KH2PO4 (fosfato monopotsico) Tampn fosfato 0,1 M, pH 7,0 K2HPO4 (fosfato bipotsico) Agua destilada Agua destilada HCl 0,2 N Papel de pesar NaOH 0,2 N Vaso de precipitado Naranja de metilo Barra magntica Fenolftaleina Probeta graduado matraz Soporte con pinzas Pipetas Pasteur Pipetas graduada de vidrio (Trimex VQI) + Pera cido clorhdrico y potasa concentrada Bureta recta Esptula Vaso de precipitado Barra magntica Instrumentos: Granatorio (Precisa 310M) pHmetro (Basic20T Crisun) Magnetoagitador (SBS A06) Procedimiento:

a) Preparacin del tampn: Pesamos en el granatorio (colocando previamente un papel de pesar y tarando el granatorio una vez colocado el papel) 0,605 g de K2HPO4 y 0,835 g de KH2PO4. Ponemos en un vaso de precipitado 80 ml de agua destilada y aadimos las cantidades anteriormente pesadas de K2HPO4 y KH2PO4. Metemos la barra magntica en la mezcla y ponemos el vaso de precipitado encima del magnetoagitador para que se mezcle todo bien Mientras se mezcla la disolucin, calibramos el pHmetro con las dos disoluciones patrn. Una vez calibrado, usamos el pHmetro en nuestra disolucin y anotamos el pH marcado (6,67) En funcin del pH obtenido aadimos cido clorhdrico o potasa concentrada gota a gota y mientras se sigue mezclando con la barra magntica. Vamos aadiendo hasta conseguir el pH pretendido (7,0) Introducimos la disolucin en una probeta graduada y enrasamos con agua destilada hasta 100 ml. b) Comprobacin de la capacidad tamponadora: Aadimos 5 gotas de naranja de metilo a 20 ml de tampn en un vaso de precipitados que colocaremos con la barra magntica en el agitador magntico. En una bureta colocamos HCl 0,2 N y abrimos para que vaya cayendo gota a gota hasta observar que la disolucin cambia de color. En cuanto cambia de color cerramos la llave reguladora y medimos el volumen que hemos usado. Repetimos el mismo proceso con 5 gotas de naranja de metilo y 20 ml de agua destilada Tambin repetimos el mismo proceso con NaOH 0,2 N en el agua y el tampn junto con las 5 gotas de naranja de metilo. Utilizaremos tambin el procedimiento anterior con 5 gotas de Fenolftaleina en vez de naranja de metilo Resumiendo, tendremos que hacer 8 veces el mismo proceso: HCl + Agua destilada + Naranja de metilo NaOH + Agua destilada + Naranja de metilo HCl + Tampn + Naranja de metilo NaOH + Tampn + Naranja de metilo HCl + Agua + Fenolftaleina NaOH + Agua destilada + Fenolftaleina HCl + Tampn + Fenolftaleina NaOH + Tampn + Fenolftaleina III. Datos y clculos Pm K2HPO4 = 174,18 g/mol Pm KH2PO4 = 136,09 g/mol

pKa = 7,21

! [K2HPO4] = 0,038 moles/l Pm (K2HPO4) =174,18 g/mol 100 ml ! m= 0,6048g [KH2PO4] = 0,062 moles/l Pm (KH2PO4) =136,09 g/mol 100 ml ! m = 0,8338 g Volmenes obtenidos en la comprobacin de la capacidad tamponadora: HCl para tampn + naranja de metilo = 7,7 ml HCl para agua destila + naranja de metilo = 0,2 ml NaOH para tampn + Fenolftaleina = 4,4 ml NaOH para agua destilada + Fenolftaleina = 0,1 ml Con los 4 compuestos restantes, HCl + Fenolftaleina y NaOH + naranja de metilo por mucho que aadamos no produce cambio. Los datos parecen correctos ya que se adecuan a lo que suponamos que ira a pasar segn los conocimientos tericos. En la comprobacin de la capacidad tamponadora hemos observado lo siguiente: HCl + naranja de metilo: El tampn ha necesitado mucho mayor volumen de cido que con el agua destilada para que la disolucin cambiara a color rojo, esto se debe a la capacidad tamponadora del tampn. HCl + Fenolftaleina: La disolucin es incolora, y al pasarla a forma cida conserva su "incoloridad", por lo que no observaremos cambio en el color de la disolucin por mucho HCl que aadamos. NaOH + naranja de metilo: Pasa lo mismo que en el punto anterior, tanto el tampn como el agua no cambian de color por mucho NaOH que aadamos. Esto se debe a que en su forma bsica la muestra ya es amarilla y aadiendo ms base, no se modificara el color NaOH + Fenolftaleina: Ocurre los mismo que en el primer punto, mientras que el tampn ha necesitado una cantidad considerable de NaOH para cambiar a color rosa, el agua solo ha necesitado una gota. Podemos concluir que, tras comprobar la capacidad del tampn, este es efectivo y tampona. Prctica 2. Diluciones seriadas de muestras y posterior cuantificacin I. Introduccin 3

El objetivo de esta prctica es el de mediante diluciones seriadas y anlisis de absorbancias, crear una recta de calibrado a partir de la cual, conocer la concentracin una muestra problema La disolucin seriada en una serie de diluciones que se preparan una a partir de la anterior. Conociendo la absorbancia de de un determinado compuesto podemos saber su concentracin ya que existe una relacin entre ellos segn la Ley de LambertBeer: Interpolando el valor de la absorbancia de la muestra problema en la recta de calibrado obtenida a partir de las diluciones seriadas, conoceremos la concentracin de la muestra problema Bibliografa consultada: Guin de prcticas II. Parte experimental Para esta prctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Azul de Coomassie (0,1 mg/ml) Agua destilada Tubos de ensayo Pipeta graduada de vidrio + pera Gradilla Cubeta espectrofotomtrica Instrumentos: Vortex (HeidolpH reax 2000) Espectrofotmetro (Spectro 22, LaboMed, inc.) Procedimiento: Completar la tabla del guin de prcticas N tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Dilucin 0 2 5 10 20 50 100 Blanco Agua (ml) 3 3,6 3 3 3,6 3 6 Azul (ml) 6 3 2,4 3 3 2,4 3 mg/ml 0,1 0,05 0,02 0,01 0,005 0,002 0,001 0 Absorbancia a 580 0,74 / 0,775 0,747 / 0,763 0,542 / 0,644 0,347 / 0,376 0,183 / 0,212 0,109 / 0,102 0,053 / 0,057 0 Absor. Media 0,758 0,755 0,593 0,362 0,198 0,106 0,055 0

De momento, y con los datos iniciales dados, podemos hallar todos los datos menos los de las columnas de absorbancias.

 Todos los tubos se rellenaran por duplicado con la ayuda de una pipeta graduada de vidrio. Todas deben tener un total de 6 ml, siguiendo los datos obtenidos en la tabla. El hecho de que hagamos todos los tubos por duplicado (excepto el de agua sola) es para contrarrestar un posible error en la realizacin del experimento; teniendo dos resultados, si uno de ellos nos da exageradamente lejano de lo que nos venia dando hasta el momento, podemos descartar ese resultado como errneo Una vez mezclados en el tubo, los terminaremos de mezclar en el vortex. A continuacin tenemos que calibrar el espectrofotmetro, esto lo hacemos metiendo la cubeta vaca, y el resultado que nos de, lo calibramos como 0. Una vez calibrado, empezamos a medir las absorbancias de todas nuestras preparaciones y la de la muestra problema, y anotamos los resultados. Una vez tenemos los datos, hacemos la media y en funcin de esta podemos ya construir la recta de calibrado en funcin de la cual vamos a hallar la concentracin de la muestra problema, extrapolando su absorbancia en la recta de calibrado Absorbancia muestra problema: 0,748 y a partir de este valor interpolaramos y obtendramos su concentracin en protena. III. Datos y clculos Para completar las columnas seguiremos los siguientes mtodos: Columna de concentraciones mg/ml: Dividiremos la concentracin inicial entre los valores de la columna dilucin Columna de azul (mg): Usaremos la formula MV = MVfinal 0,1V = 0,056 ! V azul = 3 0,05V = 0,026 ! V azul = 2,4 0,02V = 0,016 ! V azul = 3 0,01V = 0,0056 ! V azul = 3 0,005V = 0,0026 ! V azul = 2,4 0,002V = 0,0016 ! V azul = 3 Columna de agua: Restamos el Vfinal los resultados de la columna Azul Columna absorbancia media: Hacemos la media aritmtica de los valores obtenidos en el espectrofotmetro. El resultado de absorbancia de la muestra problema nos ha dado un valor que si lo interpolamos a la grafica, nos da en la zona curva, con lo que no seria muy fiable hacer la medida. Para obtener un resultado con menos error, deberamos diluir la muestra problema para conseguir situarla en la zona recta y luego en funcin de cuantas veces la hallamos diluido, multiplicar para obtener el resultado real de la concentracin den protena la disolucin, as habramos alcanzado el objetivo propuesto.

Prctica 4. Liofilizacin y Dilisis Liofilizacin I. Introduccin El objetivo concreto de esta prctica es el de obtener leche en polvo a partir de de leche en estado lquido. Utilizaremos un liofilizador que nos permite pasar una muestra congelada a estado slido sin que pase antes por estado lquido. Bibliografa consulta: Guin de prcticas II. Parte experimental Para esta prctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Solucin proteica (40 mg/ml) (leche) Tubos de ensayos especiales para liofilizacin Nitrgeno lquido Micropipeta Parafilm Aguja Vaso de liofilizacin Instrumentos: Liofilizador (Teslar Lioalfa 6) Procedimiento: Tomamos con una micropipeta los volmenes de leche indicados en el guin y los introducimos en los tubos de ensayo especiales para liofilizar. Tapamos los tubos con Parafilm y perforamos el mismo con una aguja una par de veces. Metemos el tubo en nitrgeno lquido para congelarlo Una vez congelados, colocamos los tubos en el vaso liofilizador y lo dejamos el tiempo necesario. III. Datos y clculos Concentracin de la solucin proteica 40 mg/ml Para 30 mg ! Tubo 1 40 mg ! 1 ml 30 mg ! x ml 6

Tubo 1 = 0,75 ml = 750 l Para 10 mg ! Tubo 2 40 mg ! 1 ml 10 mg ! x ml Tubo 2 = 0,25 ml = 250 l Al sacar los tubos al da siguiente observamos que no nos ha dado el mismo resultado el mismo resultado. En el que se congelo correctamente, observamos un polvillo blanco en el fondo. En el otro que no se congelo correctamente, observamos una capa de polvos adherida a la pared y unas fibrillas en la zona central del tubo. Dilisis I. Introduccin El objetivo de esta prctica es el de separar los componentes de una disolucin (protenas) de diferente tamao mediante un proceso de dilisis. La dilisis es un proceso que permite separar molculas segn su tamao, hacindolas pasar a trabes de una membrana porosa. Si tenemos la muestra en una bolsa de dilisis, al introducirla en un medio lquido, por osmosis ciertas molculas son capaces de atravesar la bolsa y salir de ella, entrando en la bolsa molculas de agua. Bibliografa consultada: Guin de prcticas II. Parte experimental Para esta prctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Disolucin acuosa de azul de dextrano y ferricianuro potsico (3 mg/ml) Bolsas de dilisis (Medicell International) Vaso de precipitados de 5 litros Barra magntica Goma elstica Agua destilada Pipeta graduada de vidrio (Trimex VQI) + Pera Pipeta Pasteur Cinta adhesiva Instrumentos: Agitador magntico (SBS A 06)

Procedimiento: Echar agua destilada en un vaso de precipitados grande e introducir la bolsa de dilisis para que se vaya abriendo. Una vez abierta hacer un nudo en uno de los extremos de la bolsa Pipetear 2 ml de la mezcla en un tubo de ensayo, y a continuacin introducirlos en la bolsa mediante una pipeta Pasteur por el extremo abierto Cerrar el extremo abierto de la bolsa haciendo un nudo, y atndolo con la goma elstica; y con la precaucin de que quede un poco de aire dentro de la bolsa para que esta flote, y que haya espacio para que pueda entrar el agua. Introducir la bolsa atada con la goma en el vaso de precipitados con agua y sujetar la goma al borde del vaso de precipitados con cinta adhesiva Introducir la barra magntica y colocar el vaso en el agitador magntico Cambiar el agua del vaso varias veces y dejarlo hasta el da siguiente. III. Datos y clculos Observamos que nuestra muestra, inicialmente, es de un color verde azulado. Tras un cierto tiempo de estar la bolsa dentro del agua se observa que al agua se torna de un color amarillento, y al da siguiente el contenido de la bolsa es de color azul. Viendo este cambio de color nos indica que los componentes de la mezcla inicial se has separado ya que el azul de dextrano es azul y el ferricianuro potsico es amarillo. Prctica 5. Precipitacin de protenas I. Introduccin El objetivo de esta prctica es observar la precipitacin de protenas mediante el mtodo de la centrifugacin y la precipitacin por salado. La centrifugacin es un proceso que nos permite precipitar sustancias dependiendo del campo centrfugo aplicado y del coeficiente de sedimentacin de dichas molculas El sulfato amnico ayuda a formar agregados de protenas que posteriormente precipitaran. Bibliografa consultada: Guin de prcticas II. Parte experimental Para esta prctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Hemoglobina (sigma) disuelta en agua a 2 mg/ml Sulfato amnico (NH4)2 SO4 Esptula

Papel de pesar Agua destilada Barra magntica Vaso de precipitados Tubo de centrifuga Pipeta Pasteur Pipeta graduada de vidrio (Trimex VQI) + pera Barreo con hielo Instrumentos: Granatorio (Precisa 310M) Magnetoagitador (SBS A06) Centrfuga (P. Selecta) Procedimiento: Pipetear con una pipeta de vidrio 5 ml de la disolucin de hemoglobina en un vaso de precipitado y colocarlo en un barreo con hielo Pesar 0,57 g de sulfato amnico en el granatorio, previa taracin (con un papel de aluminio) Introducir la barra magntica en el vaso de precipitados y colocar el barreo encima del agitador magntico Aadir poco a poco con la esptula el sulfato amnico en el vaso con la hemoglobina Cuando este todo bien disuelto, pipetas con una pipeta Pasteur en un tubo de centrfuga Tarar en el granatorio un vaso de precipitados y pesar el tubo de centrifuga con la disolucin Colocar un tubo de centrifuga en el granatorio e ir introduciendo agua hasta que peso lo mismo que el que contiene la disolucin Introducir los dos tubos enfrentados en la centrfuga y centrifugar durante 10 min. a 5000 rpm. Al terminar el centrifugado, recoger el sobrenadante y medir su volumen. Calcular la cantidad de sal que hay que aadir para obtener el 85 % de saturacin pedido en el guin. Repetir el mismo proceso antes descrito: mezclarlo bien, pesarlo, coger otro tubo con el mismo peso y centrifugar. III. Datos y clculos Porcentaje de saturacin obtenido con los 0,57 g de sal: 9

0,57 g ! 5 ml x g ! 1000 ml x = 114 g/l ! S2 = 20,099 % Sobrenadante obtenido tras la primera centrifugacin: 4,3 ml Cantidad de sal para un porcentaje de saturacin del 85 % ! g = 464, 32 g/l 464,32 g ! 1 litro x g ! 4,3 ml x = 1,997 g En los resultados podemos observar que dependiendo del porcentaje de saturacin que se quiera obtener la cantidad de sal que hay que aadir vara; a mayor porcentaje, ms sal. A medida que vamos centrifugando la muestra va perdiendo color que se queda en las protenas. La muestra inicial tiene un tono ocre, tras la primera centrifugacin tiene un color rojo oscuro; tras la segunda centrifugacin el sobrenadante tiene un color rojo mucho ms suave Gracias a la precipitacin por salado y a la centrifugacin hemos conseguido precipitar las protenas de la muestra biolgica dada. Actividades complementarias 1. Usara como compuestos de la disolucin el NaHCO3 y el Na2CO3 ya que son los que tienen el pKa ms cercano al pH que nos pide el ejercicio. Para hallar las masas de cada compuesto usara el siguiente sistema de ecuaciones: !!! [AH] = 0,282 moles/l Pm (NaHCO3) =83,99 g/mol 250 ml ! m = 5,921 g [A] = 0,017 moles/l Pm (Na2CO3) =105,99 g/mol 250 ml ! m = 0,450 g Meteramos estas cantidades en 220 ml de disolvente aprox., e iramos aadiendo cido o base en funcin del pH que nos resultara de la mezcla inicial, y cuando tuviramos el pH que buscbamos (9,0) aadiramos el disolvente necesario para llegar a los 250 ml. 2. Elegira la opcin a. cido actico y acetato sdico, ya que son los que tienen el pKa ms cercano al pH que nos piden. Para hallar la proporcin usara la siguiente formula:

10

g/l ! g para 10 ml de disolucin = 4,3 g 9. Separara el Citocromo C de las otras dos protenas mediante dilisis. Y la Albmina de la Hemoglobina mediante precipitacin por sales y centrifugacin. Las concentrara mediante liofilizacin, ya que al quitar el disolvente quedaran totalmente concentradas. El volumen de tampn fosfato que debera aadir para tenerlas a una concentracin de 12 mg/ml es: Para Albmina Para Hemoglobina Para Citocromo C La concentracin (12 mg/ml) en moles es la siguiente 12 mg = 0,012g Para Albmina: 0,012/68,5 = 1,75104 moles/ml *1000 ml/l = 0,175 moles/l Para Hemoglobina: 0,012/64,5 = 1,86104 moles/ml *1000 ml/l = 0,186 moles/l Para Citocromo C: 0,012/12,5 = 9,6104 moles/ml *1000 ml/l = 0,96 moles/l La tcnica que utilizara para eliminar las sales de sulfato amnico que precipitan junto con las protenas sera, echar suficiente sales para que precipitaran todos los compuestos, centrifugar y quitar el sobrenadante, donde estn las sales. 1

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