Universidad de Concepcin Direccin de Postgrado Facultad de Ciencias Forestales-Programa de Doctorado

Pretratamiento de maderas de Pinus radiata y Pinus caribaea por hidrlisis con cido diluido y por deslignificacin sulfito alcalino/antraquinona para la produccin de bioetanol

HERIBERTO FRANCO VILA CONCEPCIN-CHILE 2011

Profesor Gua: Regis Marcelo Teixeira Mendonca Dpto. de Manejo de Bosques y Medio Ambiente Facultad de Ciencias Forestales

Universidad de Concepcin

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Pretratamiento de maderas de Pinus radiata y Pinus caribaea por hidrlisis con cido diluido y por deslignificacin sulfito alcalino/antraquinona bioetanol. para la produccin de

Comisin Evaluadora:

Regis Teixeira Mendona (Profesor gua) Ingeniero Qumico, Dr.

___________________________

Juanita Freer Caldern (Profesor co-gua) Qumico, Dra.

___________________________

Jaime Gregorio Baeza Hernndez (Comisin evaluacin) Qumico Farmacutico, Dr.

___________________________

Germn Aroca Arcaya (Comisin evaluacin) Ingeniero Civil Bioqumico, Dr.

___________________________

Director de Postgrado: Eugenio Sanfuentes VS. Ingeniero Forestal, Dr. Decano Facultad de Ciencias Forestales: Manuel Snchez Olate Ingeniero Forestal, Dr. ___________________________ ____________________________

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A MIS PADRES: Heriberto y Adalitza A MIS HERMANAS Liriet y Magda

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AGRADECIMIENTOS

A los profesores: Dra. Juanita Freer, Dr. Jaime Baeza, Dr. Regis Teixeira Mendona, Dr. Germn Aroca, Dr. Andr Luis Ferraz, Dra. Adriane Milagres, Dr. Nelson Durn y Dr. Walter Carvalho por su colaboracin en el desarrollo de este trabajo. A la Secretara Nacional de Ciencia, Tecnologa e Innovacin de Panam (SENACYT) y al Instituto Para la Formacin y Aprovechamiento de los Recursos Humanos (IFARHU) por la beca doctoral otorgada. Al programa MECESUP-UCO 702 y a la Direccin de Postgrado de la Universidad de Concepcin por el financiamiento de una beca de pasanta. Al personal del Laboratorio de Recursos Renovables del Centro de Biotecnologa de la UDEC por su cooperacin. A los compaeros y amigos del Centro de Biotecnologa: Claudio Pozo, Claudia Baeza, Ronald Sez, Oscar Mayorga, Glenda Maldonado, Susana Muoz, Mara G. Aguayo, Pilar Castillo, Pablo Reyes, Giralda Mena, Samuel Flores y Dr. Jos Ruiz. A los amigos de la Escola de Engenharia de Lorena EEL USP-Brasil: Germano Siqueira, Fernando Masarn, Jos Moreira, Joseana Rocha, Gina Seabra, Fernanda Mendes, Daniela Cortez, Paula Esteves, Srgio Moreira y Jos Carlos. A mis amigos: Rodrigo Palominos, Andrea Mora, Angela Montoya, Fabiola Salcedo, Michael San Martn, Silvia Abada y Mara Abdal.

NDICE GENERAL NDICE DE TABLAS NDICE DE FIGURAS NDICE DE ANEXOS RESUMEN ABSTRACT

v viii ix xi xii xiv

I. INTRODUCCIN 1.1 Etanol como combustible.............. 1.2 El concepto de una biorefinera. 1.2.1 Procesos de biorefinera en desarrollo. 1.3 Pretratamientos de la biomasa lignocelulsica para su conversin a etanol......... 1.3.1. Produccin de etanol a partir de material lignocelulsico. 1.4 Hidrlisis con cido diluido... 1.5 Pretramiento alcalino con sulfito/antraquinona (ASA).. 1.6 Hidrlisis enzimtica. 1.7 Tecnologas para la fermentacin de materiales lignocelulsicos. 1.8 Materias primas lignocelulsicas: P. radiata y P. caribaea.. 1.9 Propuesta del proyecto... 1.10 Hiptesis... 6 8 10 11 13 15 18 18 1 2 3 5

1.11. Objetivos... 19 1.11.1 Objetivo general......... 1.11.2 Objetivos especficos......... 19 19

vi

II. Pretratamiento con cido diluido de Pinus radiata para produccin de bioetanol utilizando Saccharomyces cerevisiae IR2-9 inmovilizada y un proceso de fermentacin y sacarificacin simultneas 2.1 Resumen.............. 2.2 Introduccin 2.3 Experimental... 2.3.1 Cultivo de levaduras........ 2.3.2 Cultivo de levadura en medio suplementado con CaCl2. 2.3.3 Inmovilizacin de levaduras.... 2.3.4 Pretratamiento de astillas de madera de P. radiata con cido sulfrico diluido. 2.3.5 Fermentacin de P. radiata pretratado con cido usando levadura inmovilizada... 20 21 24 24 24 25 26 27

2.3.6 Microscopa electrnica de levaduras encapsuladas..................................................... 28 2.4 Resultados y discusin.... 2.4.1 Inmovilizacin de S. cerevisiae en alginato de calcio.......... 2.4.2 Pretratamiento con cido diluido y SSF de P. radiata pretratado utilizando S. cerevisiae inmovilizada.. 2.4.3 SSF de P. radiata pretratado utilizando S. cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio......... 2.4.4 Microscopa electrnica de barrido (SEM) de las cpsulas de alginato con levadura inmovilizada............................................ 37 2.5 Conclusiones... 39 33 30 28 28

vii

III. Pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona y refinamiento en disco de astillas de madera de Pinus radiata y Pinus caribaea para la produccin de bioetanol 3.1 Resumen. 3.2 Introduccin 3.3 Materiales y Mtodos. 3.3.1 Materia prima.. 41 43 46 46

3.3.2 Pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona (ASA) 46 3.3.3 Caracterizacin qumica de madera y pulpas ASA...... 48 3.3.4 Hidrlisis enzimtica.... 3.3.5 Hidrlisis y fermentacin separadas (SHF) y sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF). 50 3.4 Resultados y Discusin 3.4.1 Pulpaje ASA y refinamiento en disco 51 3.4.2 Hidrlisis enzimtica.. 53 3.4.3 SHF Y SSF. 57 3.4.4 Fermentacin de pulpa de Pinus caribaea proveniente del proceso ASA/refinamiento en disco. 59 3.5 Conclusiones. 60 IV. DISCUSIN GENERAL....... 62
viii

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V. CONCLUSIONES 69 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS........ 70 ANEXOS 86

NDICE DE TABLAS Tabla N

1.1

Ttulo de la tabla Composicin qumica de materiales lignocelulsicos y rendimiento de etanol estimado.

Pgina 7

2.1.

Clulas viables de S. cerevisiae despus de 24 h de crecimiento en medio de cultivo suplementado con CaCl2.

30

2.2

Composicin del residuo insoluble en agua e hidrolizado del pretratamiento con cido de astillas de madera de P. radiata.

31

3.1.

Condiciones de coccin del pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona de astillas de madera de pino.

47

3.2

Composicin qumica (en base a madera) de astillas de madera de pino y pulpas ASA.

52

3.3

Etanol producido en SSF de pulpas ASA de P. radiata (P-4 refinado a 750 Wh) despus de pre hidrlisis con diferentes tiempos y cargas enzimticas.

59

4.1

Produccin de etanol obtenida utilizando S. cerevisiae IR2-9

63
ix

inmovilizada en alginato de calcio. 4.2 Produccin de etanol obtenida en procesos SSF y SHF de P. radiata y P. caribaea pretratada con ASA/ refinamiento en disco con S. cerevisiae comercial. 68

NDICE DE FIGURAS

Figura N

Ttulo de la figura

Pgina

2.1.

Superficie de respuesta descrito por el modelo del diseo experimental, el cual representa la retencin de glucanos en el residuo insoluble en agua de astillas de madera de P. radiata en funcin de la temperatura y el tiempo de reaccin.

33

2.2

Rendimiento de etanol obtenido de un medio sinttico fermentado por levaduras precultivadas por 24 h e inmovilizadas en 3,5% y 8,0% de alginato de calcio.

34

2.3

Produccin de etanol obtenida de madera de P. radiata pretratadas con cido diluido.

35

2.4 2.5

Micrografas SEM de partculas de alginato antes del proceso de fermentacin. Micrografas SEM de partculas de alginato con levaduras despus del proceso de fermentacin. 39

38

3.1

Drenabilidad de pulpas ASA de P. radiata a diferentes consumos de

53
x

energa durante el refinamiento en disco. 3.2 Hidrlisis enzimtica de pulpas ASA (P-1, P-2, P-3 Y P-4) obtenidas despus de refinamiento en disco a diferentes consumos de energa (250, 750 y 1600 Wh). 3.3 Efecto de la remocin de lignina despus de la coccin ASA en la hidrlisis enzimtica de pulpas de P. radiata producidas a diferentes consumos de energa en refinamiento en disco. 3.4 Etanol y glucosa residual durante la fermentacin (SHF) del hidrolizado de pulpa ASA P-4 (750 Wh de energa de refinamiento). A.1 Licuadora industrial de 10 L de capacidad utilizada para desfibrar las astillas de P. radiata pretratadas con ASA y posteriormente refinar en refinador de disco. A.2 A.3 Refinador de disco Bauer MD-3000 (REGMED, Brasil). Astillas de P. radita pretratadas con cido sulfrico diluido a 170C por 30 min y molidas. A.4 Microscopa electrnica de barrido (SEM) de pulpa ASA de P. radiata (P-4) refinada. A.5 Fermentacin de medio sinttico (50 g/L de glucosa) utilizando levaduras inmovilizadas en membrana de alginato de calcio A.6. Hidrlisis enzimtica (24 h) de pulpa ASA P-4 refinada a 750 Wh en reactor de 1 L con carga de Celluclast de 20 FPU/ g de pulpa y 40 UI de -glucosidasa. A.7 Procesos de fermentacin del hidrolizado obtenido de pulpa ASA (P-4) 92
xi

54

55

57

87

87 89

89

91

91

de P. radiata en hidrlisis enzimtica por 24, 48 y 72 h en reactor de 1.0 L y proceso SSF de pulpa ASA (P-4).

NDICE DE ANEXOS

Anexos N

Ttulo del Anexo

Pgina

Equipo utilizado en el refinamiento de astillas de madera de P. radiata y P. caribaea pretratadas con ASA.

86

2 3

Estado fsico de las muestras pretratadas con cido diluido y ASA Proceso de hidrlisis enzimtica y fermentacin

88 90

xii

RESUMEN

La creciente demanda por combustibles fsiles, su alto costo, la escasa disponibilidad a mediano plazo y factores ambientales han incrementado el inters por las investigaciones para desarrollar procesos de produccin de bioetanol a partir de materiales lignocelulsicos. En el presente trabajo se evalo la bioconversin de astillas de madera de Pinus radiata y Pinus caribaea para la produccin de etanol celulsico. La utilizacin de estas dos especies forestales se fundamenta en el hecho de que son especies de inters comercial en zonas de clima templado y tropical, respectivamente, y que en el futuro pueden utilizarse como materia prima para la produccin de bioetanol. Astillas de madera de P. radiata fueron sometidas a dos tipos de pretratamientos distintos, uno con cido sulfrico diluido y el otro con sulfito alcalino antraquinona (ASA) seguido de refinamiento en disco, en un rango de temperatura entre 120 y 170C y en intervalos de tiempo entre 1 a 120 min. La muestra que present una mayor cantidad de glucano residual en el material slido pretratado con cido diluido fue sometida a una molienda y a un proceso de sacarificacin y fermentacin simultnea (SSF), al 10% de consistencia y con una carga enzimtica de 20 FPU de Celluclast y 40 UI de Novozyme por gramo de material. En el proceso se utiliz Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en una membrana de alginato de calcio. La produccin de etanol a partir de la fraccin slida del pretratamiento fue de 153 L/ton y de la fraccin lquida de 18 L/ton, para una produccin total de etanol del proceso de 171 L/ton. La mejor condicin de pretratamiento ASA fue obtenida a 170C, 45 min de tiempo de reaccin, 17,5 g de Na2SO3, 7,5 g de NaOH y una energa de refinamiento de 1705 Wh/kg. La mxima conversin de celulosa a glucano para el pretratamiento ASA en hidrlisis enzimtica fue de 71% obtenida para la pulpa de P. radiata. El rendimiento de etanol para procesos de hidrlisis y
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fermentacin por separado (SHF) y SSF fue de aproximadamente 262 L/ton de madera para P. radiata, siendo an mayor (284 L/ton) cuando se utiliz un sistema multienzimtico en donde se adicion mananasa. Para P. caribaea se obtuvo una produccin mxima de etanol de 137 L/ton. En una comparacin entre los dos pretratamiento utilizados, el que presenta mejor resultado para la produccin de etanol a partir de estas dos especies de maderas blandas es el ASA con refinamiento en disco, mientras que se encontr que el P. cariabaea es una madera con poca factibilidad para la produccin de etanol por cualquier pretratamiento debido a su alto contenido de extractivos y una menor cantidad de glucanos en comparacin con P. radiata.

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ABSTRACT

The growing demand for fossil fuels, the high cost, the limited availability in the medium term, and environmental factors, have increased the interest in research to develop processes for producing bioethanol from lignocellulosic materials. This work evaluated the bioconversion of wood chips of Pinus radiata and Pinus caribaea to produce cellulosic ethanol. The use of these two forest species is based on the fact that they are commercially important species in temperate and tropical zones, respectively, and in the future could be used as feedstock for bioethanol production. P. radiata wood chips were subjected to two types of different pretreatments, one with dilute sulfuric acid and the other with alkaline sulphite/anthraquinone (ASA) in a temperature range between 120 and 170C and time between 1 to 120 min, followed by disk refining. The sample pretreated with dilute acid that presented a higher amount of residual glucans in the solid fraction was subjected to a grinding process and simultaneous saccharification and fermentation (SSF) at 10% consistency of solids and an enzyme loading of 20 FPU Celluclast and 40 IU of Novozyme per gram of material. In this process, it was used Saccharomyces cerevisiae immobilized in calcium alginate membrane. The ethanol yield from the solid fraction of pretreatment was 153 L/ton and from the liquid fraction was 18 L/ton, for a total ethanol yield of 171 L/ton. Best ASA pre-treatment condition was obtained at 170C, 45 min reaction time, 17.5 g of Na2SO3, 7.5 g NaOH and refining energy consumption of 1705 Wh/kg. The maximum conversion of glucans to glucose for enzymatic hydrolysis of ASA pretreatment was 71% for the pulp obtained from P. radiata. The ethanol yield by separate hydrolysis and fermentation processes (SHF) and SSF was approximately 262 L/ton wood for P. radiata, being even higher (284 L/ton) when using a multienzymatic system where mannanase was added. For P. caribaea a maximum ethanol yield of 137 L/ton was obtained. From the two pre-treatment used, the one with best results for ethanol production from these two softwoods species was ASA with disk refining, whereas it was found that P. cariabaea wood has a low feasibility for ethanol production due to its high content of extractives and a low glucans content as compared with P. radiata.

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CAPITULO I: INTRODUCCIN

1.1 Etanol como combustible Razones ambientales, econmicas y de independencia energtica han motivado la realizacin de investigaciones en los ltimos aos en fuentes de energa renovables (Mosier et al., 2005). El 82% de la energa que se consume en el mundo es proveniente de los combustibles de origen fsil como el petrleo, gas natural y carbn, sin embargo, estas fuentes son finitas y se proyecta que el petrleo puede estar agotado dentro de 50 aos, el gas natural dentro de 45 aos y el carbn cerca de 200 aos, si se sigue consumiendo al nivel actual (Soetaert et al., 2009). La produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica es una opcin para reducir la dependencia de la sociedad del uso de combustibles fsiles como el petrleo y reducir la contaminacin ambiental. El etanol puede ser producido sintticamente desde el etileno o por conversin microbial de biomasa a travs de la fermentacin (Jasnick et al., 2002). Brasil ha desarrollado a partir de 1975 el programa PROALCOOL con el propsito de reducir la importacin de petrleo por la produccin de etanol de la caa de azcar y ha tenido aspectos positivos tanto ambientales, como econmicos y sociales. El PROALCOOL es considerado como el ms importante programa de energa de biomasa en el mundo (Goldemberg et al., 2004). El etanol tambin puede ser producido de materias primas celulsicas, como: madera, residuos forestales y papeleros, slidos municipales y residuos de cultivos agrcolas (Demirbas, 2005). La produccin estimada de etanol para el ao 2011 es de 88.7 billones de litros, de los cuales 79 billones son producidos en Amrica, principalmente de maz (49%) y caa de azcar (33%) (GRFA, 2011). Para la produccin de etanol de biomasa se han obtenido avances en el pretratamiento por hidrlisis catalizada por cidos y en el uso de enzimas para la sacarificacin de celulosa, adems de la utilizacin de bacterias genticamente modificadas para la fermentacin de azcares de 5 y 6 tomos de carbono a etanol, con lo cual se ha logrado aumentar el rendimiento y reducir los costos de produccin (Wyman, 1999). Sin embargo, se requiere de avances en el fraccionamiento de la biomasa para su mximo aprovechamiento y en la reduccin del costo de

produccin de etanol hasta un punto de ser competitivo con los combustibles fsiles, sin la necesidad de subsidiar su produccin.

1.2. El concepto de una biorefinera El incremento en los precios del petrleo y las proyecciones sobre la disponibilidad del mismo en las prximas dcadas hace necesario el establecimiento de alternativas que reduzcan el rpido consumo de fuentes de energa fsiles, como lo son el petrleo, gas natural, carbn, entre otros. La sustitucin de la dependencia de la economa global, basada en el consumo de petrleo a una economa basada en la obtencin de energas limpias a partir de materias primas renovables como residuos agrcolas, cultivos energticos y madera, requiere de sistema de produccin seguros, sustentables econmica y ecolgicamente, y que sean duraderos. En ese sentido surge como una alternativa y, en forma anloga a la refinera de petrleo, el concepto de biorefinera, que es una planta que produce una amplia variedad de productos finales que puede incluir energa (en varias formas), materias primas de qumicos (como por ejemplo precursores de plsticos), ingredientes de alimentos y compuestos farmacuticos. El valor total de los productos puede hacer el proceso econmica y ambientalmente viable (Harris, 2005). Las biorefineras de primera generacin son las plantas que utilizan como materia prima caa de azcar, remolacha azucarera y granos que contienen almidn, tienen una capacidad de procesamiento fija y producen etanol, co-productos alimenticios y CO2 (Kamm et al., 2006; Cherubini, 2010). Las biorefineras de segunda generacin utilizan como materia prima materiales lignocelulsicos, como los residuos agrcolas, forestales y de la industria, y plantaciones de lignocelulsicos dedicadas al uso bioenergtico. Pueden ser convertidos a biocombustibles y otros sub-productos por diferentes rutas (termoqumica, bioqumicas, combinadas) y producen una variedad de productos finales dependiendo de la demanda. Las biorefineras basadas en materia prima lignocelulsica todava requieren el desarrollo y optimizacin de las tecnologas principalmente en el campo del fraccionamiento de la biomasa y la utilizacin industrial de la celulosa, hemicelulosa y lignina. Los elementos esenciales para el xito en el establecimiento de una biorefinera son: capacidad de disponer de mltiples materias primas, procesamiento de la materia prima por enzimas para transformarlas a azcares fermentables y sub-productos, biotransformacin la cual convierta las azcares a productos deseados y co-productos los cuales
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son usados en el proceso, reciclados a travs del proceso o comercializados (Dean et al., 2006). Los beneficios del uso de biomasa en comparacin con el petrleo en la produccin de combustibles lquidos y compuestos qumicos orgnicos, resulta en beneficios ambientales como: las fuentes de biomasa son renovables con perodos de rotacin cortos, lo cual permite que el carbono enviado a la atmsfera por la combustin del combustible sea reciclado por el crecimiento de las plantas en la siguiente produccin de biomasa; las fuentes de biomasa pueden ser obtenidas localmente sin necesidad de importacin; la creacin de fuentes de trabajo para la produccin y refinamiento de la biomasa, la produccin y conversin de biomasa a combustibles lquidos y qumicos orgnicos involucra pasos de procesamiento que generalmente reducen los txicos asociados con la produccin petroqumica (Pimentel, 2003; Hill et al., 2006). El punto de partida para el establecimiento de biorefineras que se ha propuesto en pases de Norteamrica y Europa consiste en expandir plantas de produccin de pulpa para produccin de bioetanol y productos de valor agregado. Un ejemplo de este proceso sera la extraccin de hemicelulosas antes de que las astillas de madera sean pulpeadas en el digestor y convertir esas azcares a cido actico o etanol; en la misma va se podra manufacturar bio-productos a partir de los licores del pulpaje. Un factor clave en este punto es la conversin del licor negro del pulpaje a syngas a travs de procesos de gasificacin y la conversin de syngas a combustibles lquidos, productos qumicos y otros materiales de alto valor agregado (Agenda 2020 Technology Alliance; 2006). La tecnologa para producir etanol a partir de granos es madura y avanzada, pero a partir de madera est menos desarrollada. Muchos estudios se han centrado en estudiar las maderas duras, blandas y residuos agrcolas para la produccin de etanol. 1.2.1 Procesos de biorefinera en desarrollo Existen varios procesos de produccin de etanol, en su mayora a nivel de laboratorios y plantas piloto, como: -Iogen se utilizan residuos agrcolas y de maderas duras; se basa en un proceso enzimtico de hidrlisis con altos costos asociados a los niveles de enzimas requeridos, al costo de produccin y capital altos. Sin embargo, esta compaa adems de produccin de etanol, comercializa enzimas para varias aplicaciones y en su planta demostrativa ha producido a partir del pretratamiento a explosin de vapor e hidrlisis enzimtica de paja de trigo: 1.628.407 L de etanol entre 2004-2011 (http://iogen.ca).
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-BC Internacional: utiliza microorganismos modificados genticamente (Zimomonas sp.), para fermentacin simultnea de hexosas y pentosas; dos pasos de hidrlisis cida pueden ser utilizado para maderas blandas, evitando la degradacin de las hemicelulosas a furfural y su posterior fermentacin a etanol. Los dos pasos de hidrlisis aumentan el costo de capital y operacin de la planta. -Arkenol : se basa en la hidrlisis de la madera con H2SO4 concentrado; la reaccin es rpida y es llevada a bajas temperaturas y presiones, resultando en una menor degradacin de los productos; sus desventajas son los altos costos de construccin de la planta, debido a la utilizacin de H2SO4 concentrado, mltiples pasos en el proceso, prdidas de cido, altos niveles de residuos y altos costos de operacin. -ACOS: involucra la solubilizacin de todos los componentes lignocelulsicos, usando una solucin acuosa de acetona con una pequea cantidad de cido, la reaccin es llevada a temperaturas cercanas a los 200C y presiones de 40 bar, tiempos de reaccin de 0,5 horas. Las ventajas de este proceso implican la posibilidad de utilizar una amplia variedad de materias primas: maderas duras, blandas, residuos agrcolas y granos, que pueden ser procesados con las mismas condiciones, bajos costos de capital y operacin de la planta, pero se encuentra todava en estado de laboratorio. Investigaciones y desarrollos en el campo de la biorefinera son necesarios emprender para incrementar el conocimiento cientfico de las fuentes de biomasa, mejorar sistemas sustentables de desarrollo, cosecha y procesamiento de la biomasa; mejorar la eficiencia y rendimiento en la conversin y procesos de distribucin y tecnologas para el desarrollo de nuevos materiales; crear la regulacin ambiental necesaria para incrementar el desarrollo y uso de los nuevos productos obtenidos a travs de estos procesos (Kamm et al., 2004). -LIGNOL: (http://www.lignol.ca/) es una tecnologa de biorefinera que integra la combinacin de dos procesos genricos, en la que primero se realiza un paso de pretratamiento organosolv basado en etanol, que incluye la separacin de la lignina, hemicelulosas y extractivos de la fraccin celulsica de biomasa maderera y la recuperacin de mltiples co-productos (furfural, cido actico, extractivos, hemicelulosas, lignina de baja masa molecular), mientras que en un segundo paso se realiza la sacarificacin enzimtica y fermentacin que convierte la celulosa a etanol, o potencialmente cualquier otra plataforma qumica azucarera. La fraccin celulsica es
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altamente susceptible a hidrlisis enzimtica con rendimientos de azcar superiores a 90% en 12-24 h y con cargas de enzimas de 10-20 FPU (Arato et al., 2005). Este proceso usa una mezcla de etanol y agua en una relacin de 50:50 (p/p) a 200C y 400 psi para extraer la lignina de las astillas de madera o cualquier otra biomasa lignocelulsica (Pan et al., 2005). -ZeaChem: (http://www.zeachem.com/) utiliza un proceso hbrido de procesamiento termomecnico para fraccionar la biomasa y la utilizacin de un proceso bioqumico (acetognico) altamente eficaz para fermentar xilosa y glucosa, sin generacin de CO2

1.3. Pretratamientos de la biomasa lignocelulsica para su conversin a etanol El objetivo principal del fraccionamiento de biomasa lignocelulsica desde el punto de vista de una biorefinera es obtener cada uno de sus componentes principales (celulosa, hemicelulosas y lignina) en su mxima produccin y pureza, y obtener la mayor cantidad de ingresos de ellos. La eficiencia en el proceso debe evitar la degradacin y prdida de valor de sus componentes, permitiendo el mximo aprovechamiento de la celulosa, mediante substituciones qumicas, aplicaciones termoplsticas y de otros polmeros a partir de la lignina y aplicaciones sucroqumicas de las hemicelulosas (Overend et al., 1987). La solubilizacin de azcares que son convertidos a productos de valor por microorganismos y en combinacin con procesos qumicos, en los cuales se obtienen tambin algunas pentosas derivadas de las hemicelulosas, tiene un alto valor por s mismo (Kim, 2005). Varias tecnologas de pretratamiento, que incluyen mtodos fsicos como la molienda que se realiza para disminuir el tamao de partcula de la biomasa e incrementar el rea superficial de la misma; pretratamientos qumicos con lcali, cidos, gases, agentes oxidantes, solventes orgnicos, con el objetivo de deliginificar y solubilizar hemicelulosas; pretratamientos biolgicos con hongos de pudricin blanca (Pycnoporus cinnabarinus), Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Ganoderma asutrale. y Phellinus sp. SKM2102), con la finalidad de delignificar y reducir el grado de polimerizacin de los carbohidratos, pretratamientos combinados como el pulpaje alcalino asociado con explosin a vapor, molienda seguido de tratamientos cidos o alcalinos han sido evaluadas (Bjerre et al., 1996; Sczodrak et al., 1996; Tabka et al., 2006; Muoz et al., 2007; Hendriks et al., 2008; Hayes, 2009; Baba et al., 2011). Algunos pretratamientos fisicoqumicos de biomasa son
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considerados como opciones en un corto plazo: utilizando explosin a vapor para fraccionar residuos agrcolas (Ballesteros et al., 2002), gasificacin de aserrn de madera blanda por H2O supercrtica (Yoshida et al., 2004), hidrlisis con H2SO4 (Kim et al., 2000, Ferrerira et al., 2011), explosin a vapor catalizada por H2SO4 (Emmel et al., 2003, Kumar et al., 2010; Won-Lee et al., 2011), pretratamiento con cido diluido en dos etapas de madera blanda (Sderstrm et al., 2003). Recientemente, se ha reportado que el pretratamiento al sulfito cido (llamado pretratamiento al sulfito para superar la recalcitrancia de lignocelulsicos, SPORL) con reduccin de tamao en refinador de disco de astillas de madera de Picea mejora significativamente la conversin de celulosa a glucosa, alcanzndose un 90% de conversin y un bajo consumo de energa en la reduccin de tamao del material pretratado de 19 kJ/kg de madera no tratada (Zhu et al., 2010). 1.3.1. Produccin de etanol a partir de material lignocelulsico Las materias primas para produccin de bioetanol pueden ser clasificadas dentro de tres tipos: 1) materia prima que contiene sacarosa (caa de azcar, sorgo dulce y remolacha), 2) materiales que contienen almidn (maz, trigo, cebada) y 3) biomasa lignocelulsica: madera, paja y gramneas (Balat et al., 2007). En la tabla 1.1 se presenta la composicin qumica y etanol estimado de algunas materias primas lignocelulsicas (Chandel et al., 2007). La produccin de etanol de materiales lignocelulsicos consiste de varias etapas de fraccionamiento, conversin y recuperacin: hidrlisis enzimtica, fermentacin, separacin de productos y post pretratamiento de la fraccin lquida (Hendriks et al., 2008). El bioetanol puede ser producido a partir de materia prima lignocelulsica por ser la materia prima ms promisoria por su bajo costo, pero la produccin a escala comercial todava no ha sido implementada; su fortaleza en comparacin con el etanol obtenido a partir de maz, azcar de caa, trigo o gramneas, es que no estara en conflicto con el hecho de estas materias primas se utilizan como alimentos para el ser humano. Adems, el costo ambiental asociado a la produccin de etanol a partir de maz es de 23 centsimos de dlar por galn, debido a la erosin del suelo que causa el cultivo intensivo, al uso de fertilizantes nitrogenados, insecticidas y herbicidas, que ayudan a aumentar la contaminacin de las fuentes de agua (Pimentel et al., 2003; Balat et al., 2007).

Tabla 1.1. Composicin qumica de materiales lignocelulsicos y rendimiento de etanol estimado. Material prima Celulosas/ Hexosanos (%) 33 30 33 36 38 45 44 48 40 37 Hemicelulosas/ pentonsanos (%) 30 24 18 15 13 12 26 27 23 23 Lignina (%) 29 18 15 19 37 25 29 19 21 21 Produccin de etanol kg/kg de materia seca 0,279 0,239 0,240 0,265 0,225 0,252 0,310 0,332 0,305 0,305

Bagazo de caa de azcar Paja de trigo Paja de sorgo Cscara de arroz Eucalyptus grandis Eucalyptus saligna Pino lamo Abedul Sauce

La biomasa lignocelulsica como residuos agrcolas, madera y cultivos energticos es un material de inters en la produccin de bioetanol debido a ser las fuentes ms abundantes en la Tierra. La produccin global de biomasa es de aproximadamente 200 x 109 t por ao; esta cantidad de biomasa lignocelulsica puede producir hasta 442 billones de litros/ao de etanol. La produccin potencial de etanol a partir de residuos de cosechas puede producir 491 millones de litros de etanol/ao, que puede reemplazar a 335 x 109 L de gasolina (32% del consumo global de gasolina), cuando se utiliza mezcla con 85% de gasolina y 15% de etanol (E85) (Szczodrak et al., 1996). Por otra parte, los residuos de la fermentacin ricos en lignina, los cuales son un subproducto del proceso de produccin de etanol, pueden generar 458 TWh de electricidad (cerca de 3,6% de la produccin mundial de electricidad) y 291 x 109L/ao de vapor (Kim et al., 2004). Cultivos lignocelulsicos perennes como especies de corta rotacin y gramneas, son interesantes fuentes de materia prima debido a sus bajos costos de produccin, alto rendimiento, buena sustentabilidad para terrenos de baja calidad y bajo impacto ambiental (Balat et al., 2007). A pesar de las numerosas investigaciones que se realizan para la produccin de bioetanol de biomasa lignocelulsica, muchos de los procesos ensayados, todava se encuentran a escala de laboratorio o piloto. La primera planta para producir etanol de biomasa lignocelulsica basada en el proceso SSF fue puesta en operacin en Pittsburg en 1976, con una produccin de 567,8 L/da; otras plantas pilotos se han construido en asociacin con el National
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Renewable Energy Laboratory: New Energy Company Inc (Golden, USA), Amoco Corporation, Tenessee Valley Authority. En 1983 en Japn inici operaciones planta piloto para procesar 720 kg de material diariamente. En 1988 en Soustons, Francia se construy una planta para procesar 4 t/h de madera de chopo y producir entre 160-190 kg de etanol a partir de 1000 kg de madera seca (Szczodrak et al., 1996). Otros proyectos de produccin de etanol a escala demostrativa y comercial se encuentran en proyeccin entre ellos la construccin de una planta a escala comercial por el Grupo Mossi & Ghisolfi en Crescentino, Italia con capacidad de producir 50 millones de litros/ao utilizando enzimas Novozymes y con tecnologa para convertir una amplia variedad de materias primas lignocelulsicas, se espera que la planta inicie operaciones en 2012; Abengoa 2G Etanol opera desde septiembre de 2009 una planta demostrativa en Salamanca, Espaa con capacidad de procesar 70 toneladas diarias de lignocelulsicos y producir 5 millones de litros de etanol por ao. En USA, Japn y algunos pases de Europa tambin desarrollan un gran nmero de proyectos de plantas de etanol celulsico (http://www.biofuelstp.eu/cell_ethanol.html).

1.4. Hidrlisis con cido diluido La hidrlisis con cido diluido ha sido desarrollada para el pretratamiento de materiales lignocelulsicos, especficamente de residuos agrcolas como rastrojo de maz, paja de arroz y de trigo (Zhu et al., 2008; Balat, 2011). El pretratamiento de biomasa lignocelulsica con H2SO4 a temperaturas superiores a 180C, puede alcanzar altas tasas de reaccin, mejora significativamente la hidrlisis de la celulosa y los xilanos pueden disolverse en un 90% en los primeros minutos del perodo de reaccin (Esteghlalian et al., 1997; Mosier et al., 2005). La hidrlisis con cido diluido puede ser aplicada en un paso a temperaturas menores de 200C, con produccin de un 80% de hemicelulosa, pero la mayor produccin de glucosa se obtiene a temperaturas ms altas de 220C, teniendo el inconveniente de que se forman compuestos inhibidores de la fermentacin como furfural, 5-hydroximetilfurfural, cido levulnico, cido actico, cido frmico, cido urnico. Para hidrlisis de sacarosa a una temperatura de 160C, 0,1% (m/m) de H2SO4 y 12 min de tiempo de reaccin se obtiene un 90% de glucosa residual, pero para temperaturas de 200C, 2.0% de cido y 8 min de tiempo de reaccin slo 10% de glucosa residual se obtiene del tratamiento, con la consecuencia del aumento de inhibidores
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(Bower et al., 2007). Se ha demostrado la inhibicin de un 20% de la hidrlisis enzimtica de material slido prehidrolizado de abeto al cual se le ha adicionado prehidrolizado debido a la presencia de cidos alifticos, derivados furanos y compuestos fenlicos (Tenborg et al., 2001). Es preferible realizar el pretatamiento con cido diluido en dos pasos utilizando temperaturas de 120-170C, teniendo como ventajas las siguientes: alta produccin de azcares prevaleciendo la alta solubilizacin de hemicelulosas en el primer paso y de glucosa en el segundo paso de hidrlisis, el consumo de energa puede ser minimizado, la solucin de azcares resultante puede ser ms concentrada, menos degradacin de azcares y formacin de pocos compuestos inhibidores de la fermentacin en la segunda etapa de hidrlisis; la recuperacin de pentosas y hexosas provenientes de las hemicelulosas alcanza entre el 80-95% del total de azcares disponibles, mientras que la produccin de glucosa alcanza entre el 40-60% del total disponible (Taherzadeh et al., 2007). Se ha reportado hidrlisis con cido para los cuales se ha utilizado rangos de temperatura de reaccin entre 100 y 210C, concentraciones de H2SO4 entre 0,5 y 80% (p/p) y tiempos de reaccin entre 2 y 30 min, para la produccin de etanol de Picea glauca (Kim et al. 2005), mezcla de madera de Quercus humilis, Betula pendula y Acer rubrum (Iranmahboob et al., 2002), Pupulus spp. (Yat et al., 2008) y Abies alba (Larsson et al., 1999). Pretratamiento con 0.8% de cido sulfrico diluido, 180C y 15 min de Acacia dealbata molida con un tamao de partcula de 0.8-1.0 mm produce para un proceso de sacarificacin y fermentacin separadas (SHF), 10.31 g de etanol/L con 72 h de hidrlisis enzimtica a 50C y 24 h de fermentacin a 30C, y 7.53 g de etanol/L para 48 h de un proceso de sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF) suplementado con el surfactante polietilenglicol 4000 (Ferreira et al., 2011). Tratamientos con cido sulfrico diluido (3% v/v) de madera de Prosopis juliflora combinado con un proceso de delignificacin con Na2SO3 (5% p/v) y NaClO2 (3% p/v) e hidrlisis enzimtica, produce despus de la hidrlisis enzimtica un hidrolizado con 37.47 g/L de azcares y una produccin mxima de etanol con S. cerevisiae de 18.52 g/L y un rendimiento de etanol de 0.49 g por g de material pretratado, equivalente a 0.21 g de etanol/ g de biomasa (Gupta et al., 2009). Para los materiales lignocelulsicos de P. juliflora y Lantara camara se obtuvo una sacarificacin entre 39.5 y 48%, cuando se aplic un pretratamiento con cido sulfrico diluido al 3% (v/v), 45 min y 121C (Gupta et al., 2011).

1.5. Pretramiento alcalino con sulfito/antraquinona (ASA) El pulpaje kraft es el proceso de pulpaje qumico predominante en el mundo, en el cual se utiliza Na2S y NaOH para degradar la lignina en la madera (Chakar et al., 2004). Como alternativas al pulpaje kraft existen procesos como soda/antraquinona (AQ), sulfito/AQ y sulfito alcalino/AQ (Dimmel, 1996). El pulpaje a la soda es un proceso bien comprendido el cual permite procesar diferentes materiales lignocelulsicos, pero tiene la desventaja de que los licores de coccin fuertemente alcalinos descomponen los carbohidratos mediante reacciones de peeling e hidrlisis alcalina. El NaOH disuelve los compuestos fenlicos de la lignina, mientras que en las estructuras no fenlicas de la lignina se produce el rompimiento de enlaces -ter. En investigaciones de pulpaje de alto rendimiento, las tecnologas del pulpaje semiqumico al sulfito han sido desarrolladas en combinacin con procesos de refinamiento presurizado o atmosfrico; tpicamente el tratamiento al sulfito extensivo (cargas de sulfito >10%) es acoplada con refinamiento atmosfrico y se refiere como pulpaje al sulfito quimiomecnico (SCMP o CMP), mientras que pretratamientos con baja carga de sulfito (< 6%), normalmente acoplado con refinamiento presurizado es referido como pulpaje quimiotermomecnico CMTP (Xu, 2003). Comparando el pulpaje kraft utilizado a escala industrial para la obtencin de pulpa y pasta papelera con otros procesos a la soda, como por ejemplo con el pulpaje kraft/AQ se obtiene para el ltimo proceso una disminucin en los rechazos, un descenso en el nmero kappa a la misma carga de lcali activo. Los procesos soda-AQ resultan en el mismo o en un mayor rendimiento de pulpa clasificada que las pulpas kraft de referencia, manteniendo los mismos porcentajes de rechazo y nmero kappa, pero con una disminucin en las propiedades mecnicas de la pulpa y en su viscosidad. En los procesos de pulpaje ASAM, el licor de coccin contiene Na2SO3, NaOH y antraquinona en metanol acuoso, el cual es un excelente solvente de la lignina y de sus productos de degradacin, suprimiendo la condensacin de la lignina por metilacin de sus grupos reactivos (Patt et al., 1991; Khristova et al., 2006). La utilizacin de licor de coccin con soluciones de NaOH y Na2SO3 a las cuales se les agrega pequeas cantidades de antraquinona (C14H8O2) ha demostrado ser muy efectiva para promover la estabilizacin oxidativa de los polisacridos , antes que ocurran las reacciones de peeling y al mismo tiempo lograr una tasa de delignificacin alta, han dado como resultado rendimientos de pulpa altos, con bajo contenido de lignina y la presencia de azcares poco degradados (Huang et al., 2007; Patt et al., 2006). La utilizacin de una concentracin de lcali baja y una
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concentracin de sulfito relativamente alta (pero mucho ms baja que la utilizada en los procesos de pulpaje kraft), son indispensables en las fases iniciales del proceso de delignificacin (Santiago et al., 2007; Shatalov et al., 2007; Abrantes et al., 2007). Bajo condiciones similares de coccin se ha reportado un rendimiento de pulpa de 47,0 y 49,3 %, nmero kappa de 20,9 y 19,6 para pulpaje kraft y ASA, respectivamente, de Eucalyptus citriodora (Khristova et al., 2006). Al obtenerse en el proceso ASA un alto rendimiento de pulpa y una alta tasa de delignificacin, representara una opcin a ser evaluada desde el punto de vista tcnico y econmico para ser utilizado como pretratamiento para materiales lignocelulsicos destinados a lograr una alta produccin de etanol durante la sacarificacin y fermentacin simultneas.

1.6. Hidrlisis Enzimtica La hidrlisis enzimtica es realizada por enzimas celulasas que tienen una alta especificidad por el sustrato. Los productos de la hidrlisis completa es la glucosa. La hidrlisis enzimtica de substratos lignocelulsicos generalmente se efecta a pH 4.8 y temperaturas de 45-50C. Tanto bacterias como hongos pueden producir celulasas para la hidrlisis de materiales lignocelulsicos, estos microorganismos pueden ser aerbicos o anaerbicos, mesoflicos o termoflicos, entre los cuales se puede mencionar las especies: Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Trichoderma, Aspergillus, Sclerotium. Los factores que afectan la hidrlisis enzimtica de celulosa incluyen el tipo de substrato, actividad de las celulasas, cristalinidad de la celulosa, accesibilidad al rea superficial, proteccin de la celulosa por la lignina, la heterogeneidad de las partculas de biomasa, la proteccin de la celulosa por las hemicelulosas y las condiciones de operacin: temperatura y pH (Sun et al., 2002; Sczordrak et al., 1996). Las celulasas comprenden tres tipos de enzimas: 1) endoglucanasas EG, endo 1,4 Dglucanohidrolasa (EC 3.2.1.4,), la cual rompe los enlaces internos -1,4-glucosdicos de la celulosa, 2) exoglucanasas o celobiohidrolasas: 1,4--D-glucano celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) la cual degrada los oligomeros de celulosa promoviendo la remocin de unidades de celobiosa de los extremos finales libres (extremos reductores y no reductores de las cadenas de celulosa); y 3) -glucosidasas (EC 3.2.1.21), las cuales hidrolizan los celo-oligosacridos (celobiosa) a glucosa. Se ha comprobado que la accesibilidad a la celulosa es incrementada con celulasas y
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endoglucansas mediante el incremento de la actividad qumica de la celulosa porque las enzimas hidrolticas decrecen el grado de polimerizacin de la celulosas y rompen una porcin de enlaces de hidrgeno en la celulosa (Cao et al., 2006). La tasa de hidrlisis de celulosa tambin es incrementada por una disminucin de la cristalinidad de la celulosa, por la remocin de hemicelulosas que cubren algunos sitios del substrato susceptibles a la celulasa en la celulosa y la delignificacin de materiales lignocelulsicos (Yoshida et al., 2008). La hidrlisis enzimtica en presencia de 10 mg/L de la fraccin de lignina soluble aislada de Pseudotsuga menziesii puede inhibir hasta 84% la actividad de -1,4-endoglucanase III recombinante de un complejo enzimtico de Penicillium sp., hasta 39% de la actividad enzimtica de xilanasa recombinante y hasta 11% de la actividad de preparaciones de glucosidasa, sugirindose que los mecanismos de inhibicin enzimtica involucran la absorcin de la enzima en los componentes particulados mayores de la lignina e interacciones de tipo inico por la presencia de grupos funcionales (COOH, OH y CO), parcialmente cargados en la superficie de las enzimas y en la lignina (Berlin et al., 2006). El tamao de partcula de los substratos lignocelulsicos afecta la hidrlisis enzimtica porque para substratos como pulpa kraft de abeto refinada, se ha reportado una mejor absorcin de enzimas por gramo de substrato en comparacin con pulpa no refinada debido al incremento en el rea superficial especfica por la presencia de finos, los cuales tienen un volumen de poro menor que las fibras gruesas, permitiendo una mayor eficiencia en los estados iniciales de hidrlisis enzimtica (Mooney et al., 1999). En hidrlisis enzimtica de materiales lignocelulsica, se ha reportado una relacin lineal (incremento de 5 a 30% de contenido de slidos) entre la concentracin de slidos y el descenso en la conversin de celulosas, atribuyndose dicho efecto de inhibicin del producto principalmente al incremento en la concentracin de glucosa y celobiosa en el medio de hidrlisis, sin entenderse claramente el mecanismo que la causa, y descartndose problemas de mezcla del substrato insoluble o por el contenido de lignina o hemicelulosas (Kristensen et al., 2009). Por otra parte tambin se ha reportado que la xilosa, xilooligmeros y xilano son inhibidores ms fuertes de las celulasas, en la misma concentracin molar que la glucosa o celobiosa (Qing et al., 2010).

1.7. Tecnologas para la fermentacin de materiales lignocelulsicos

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Es ampliamente conocido que la levadura S. cerevisiae ha sido el microorganismo ms ampliamente utilizado para la fermentacin de hexosas. S. cerevisiae puede producir etanol de glucosa y manosa si la concentracin de azcares es alta en el medio de fermentacin y cuando la levadura crece bajo condiciones anaerbicas. S. cerevisiae es un organismo muy eficiente en la fermentacin y ha sido empleada por largo tiempo en la produccin industrial de etanol. Otros microorganismos estudiados para la produccin de etanol son: Pichia stipitis, Z. mobillis, Candida Shehatae, Klebsiella planticola y Zygosaccharomyces (Martn et al., 2003; Tolan et al., 1987; Delgenes et al., 1996). En general el desarrollo de la fermentacin a gran escala incluye: 1) la seleccin del organismo: basada en las caractersticas del substrato, caractersticas de formacin de subproductos, viabilidad para su reciclaje, caractersticas fisiolgicas; 2) ingeniera celular y metablica con el objetivo de mejorar las propiedades existentes del microorganismo y para permitir que la fermentacin ocurra bajo ciertas condiciones y 3) desarrollo del proceso de fermentacin: incluye la optimizacin de los parmetros de cultivo (Van Hoek et al., 2003). Existen tecnologas de sacarificacin y fermentacin que difieren en la configuracin o etapas en las que se realizan, dentro de ellas est la sacarificacin y fermentacin simultnea (SSF), cuando la hidrlisis enzimtica y la fermentacin se realiza en forma secuencial recibe el nombre de sacarificacin y fermentacin por separado (SHF), la sacarificacin y cofermentacin de hexosas y pentosas (SSCF) y el bioprocesamiento consolidado de biomasa (CBP). En el proceso SSF se integra la hidrlisis enzimtica de celulosa a glucosa, catalizada por la accin sinrgica de celulasas y -glucosidasa, con la sntesis fermentativa de etanol. La hidrlisis enzimtica y la fermentacin se realizan en un mismo reactor, lo que disminuye el costo del proceso, adems tiene la ventaja de evitar la inhibicin de las enzimas por productos finales del proceso (Philippidis et al., 1992; Olofsson et al., 2008). Una dificultad del proceso SSF es que la temperatura ptima para la hidrlisis enzimtica siempre es superior a la temperatura ptima a la cual se realiza la fermentacin por microorganismos, por lo que es necesario buscar una condicin ptima de temperatura para ambos procesos de hidrlisis enzimtica y fermentacin que se realizan al mismo tiempo. Una opcin para superar esta dificultad es realizar una prehidrlisis a una temperatura ptima para las enzimas y posteriormente disminuir la temperatura y adicionar la levadura (hgren et al., 2007). Al comparar procesos de SHF y SSF se ha reportado para paja de trigo pretratada con explosin a vapor que el rendimiento de etanol, obtenido con S. cerevisiae para el proceso SSF (72 h) es dos
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veces ms alta que para el proceso SHF en el que se utiliz 48 h de sacarificacin y 72 h de fermentacin (Chen et al., 2007). Una de las ventjas del proceso SHF es que cada paso puede ser realizado a sus condiciones ptimas de operacin (Snchez et al., 2008). Una ruta alternativa para la produccin de bioetanol es la utilizacin de microorganismos que pueden convertir la biomasa a azcares fermentables y fermentar las azcares resultantes a etanol en un proceso conocido como CBP. El CBP combina sacarificacin simultnea de lignocelulosa con la fermentacin de los azcares resultantes, en un proceso de un solo paso mediado por un microorganismo o un consorcio microbial, que pueden ser levaduras, bacterias u hongos que han sido mejorados genticamente para producir celulasas y ser etanolognicos, dentro de los microorganismos propuestos se encuentra S. cerevisiae (levadura), Clostridium thermocellum y Zimomonas mobilis (bacterias) y el hongo Trichoderma reesei (Xu et al., 2009). Los microorganismos candidatos a ser utilizados en el proceso deben tener caractersticas especficas que incluyen produccin/estabilidad de enzimas, crecimiento balanceado en hexosas y pentosas, tolerancia a los inhibidores del pretratamiento, mximo rendimiento del producto y tasas de produccin, y tolerancia a solventes; la estrategia dominante para la ingeniera de una eficiente biocatlisis para la produccin de etanol por CBP es la de expresar mltiples componentes de un sistema celuloltico de un hongo o bacteria en S. cerevisiae (Elkins et al., 2010; La Grange et al., 2010, Xu et al., 2010). Fermentacin continua de hidrolizado de residuos forestales de abeto con levaduras floculantes S. cerevisiae CBS 8066 alcanz una concentracin de 0,34 g/L de etanol (Purdwadi et al., 2007). Para fermentacin fed-batch de hidrolizado de abeto con S. cerevisiae TMB 3000 se ha reportado una produccin de etanol de 0,46 g/L (Peterssonet al., 2007). Produccin de etanol por un proceso de sacarificacin y fermentacin simultnea (SSF), tomando en consideracin la fermentacin por S. cerevisiae de glucosa y manosa con pretatramiento de explosin a vapor catalizado con SO2 de Salix (madera dura), abeto (madera blanda) y residuo de la cosecha de maz ha sido reportada en 239; 292 y 215 L/ t mtrica, respectivamente, correspondiendo a 69,2; 71,4 y 68,6% del valor terico, basado en el contenido de hexosas en la materia prima (Sassner et al., 2007). Se ha reportado la produccin de etanol de diversos materiales lignocelulsicos a partir de tratamiento de explosin a vapor catalizado con H2SO4 por el mtodo de sacarificacin y fermentacin simultnea (SSF), utilizando levadura Kluyveromyces marxianus CECT 10875,
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con rendimientos de etanol para chopo, eucalyptus, paja de trigo y bagazo de sorgo dulce de: 19,0; 17,0; 18,1 y 16,2 g/L, para un perodo de 72-82 h de fermentacin (Ballesteros et al., 2004). Para madera pretratada con hongos de pudricin blanca y etanlisis de madera blanda Cryptomeria japonica, se ha reportado en procesos de SSF a 35C con S. cerevisiae AM12 y por 72 h de fermentacin, una produccin de etanol de 9,82 g/L (3,11% de rendimiento en base al mximo terico) y 8,94 g/L (28.3% en base al mximo rendimiento terico), para la pulpa de la madera pretratada con Ceriporiopsis subvermispora FP-90031-sp y Phellinus sp. por 8 semanas y etanlisis a 200C por 60 min en una solucin acuosa al 60% de etanol (Baba et al., 2011). En un proceso de SHF de madera pretratada con cido sulfrico diluido y delignificada con 5% (p/v) de Na2SO3 y 3% (p/v) de NaClO2 de Prosopis juliflora se report una produccin de etanol de 18,52 g/L despus de 16 horas de fermentacin de la mezcla del licor cido y el hidrolizado enzimtico que contena una concentracin inicial de glucosa de 37,47 g/L (Gupta et al., 2009).

1.8. Materias primas lignocelulsicas: P. radiata y P. caribaea Los requerimientos de materias primas para el desarrollo del concepto de biorefinera plantea una problemtica entre la utilizacin de algunos cultivos agrcolas que hasta hace algunos aos slo fueron utilizados para la alimentacin de las personas y animales para producir biocombustibles y con esta medida disminuir la produccin destinada al fin alimenticio y al existir poca disponibilidad en el mercado internacional los precios de estos cultivos como el maz, trigo, caa de azcar, remolacha azucarera, entre otros, van a aumentar considerablemente provocando el desabastecimiento y con ello el surgimiento del dilema tico de biocombustibles o alimentos. La opcin ms viable es la de utilizar especies forestales como materia prima para las biorefineras. Una especie forestal importante que se ha cultivado a escala comercial con xito en Nueva Zelanda, Chile, Australia, Sur frica, Argentina, Espaa, Grecia e India es el P. radiata D. Don, una especie originaria del Sur de California, USA y que crece en un intervalo de temperatura de -5 a 41C (http.//www.ag-network-chile.net). P. radiata puede sobrevivir en reas con poca lluvia y en suelos pobres. En Chile, el rea donde se ubican las plantaciones son entre Constitucin (Regin del Maule) y Valdivia (Regin de Los Ros), donde las temperaturas mnimas alcanzan -5C y el promedio anual de lluvias es de 1000 a 2000 mm, alcanzando tasas de crecimiento de 20 m3/h y densidad de la madera de 450 kg/m3 (McDonald et al., 2008). En
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Chile, el consumo industrial de P. radiata fue de 3,7 millones de m3 en 1970, en 2003 fue de 22,1 millones de m3 y se prev una expansin en su consumo hasta alcanzar los 45 millones de m3 en el ao 2030. La superficie de P. radiata plantada en Chile es de 1 457.224 h. (http://www.corma.cl/corma_info.asp?idq=426). Los principales usos de la madera de P. radiata son la produccin de pulpa qumica y madera aserrada (Prez et al., 2003). Representa una oportunidad para Chile darle el mayor uso posible a la biomasa lignocelulsica y poder destinar algunas reas degradadas o que no tienen uso agrcola para expandir las plantaciones forestales de P. radiata con fines energticos, aprovechando las condiciones climticas y el conocimiento silvicultura acumulado a travs de dcadas de establecimiento de plantaciones con fines comerciales. En regiones semiridas del sur de Australia con precipitaciones anuales entre 300-600 mm de lluvia y alta salinidad, se han estudiado plantaciones de P. radiata de corta rotacin (3-5 aos) con fines bioenergticos obtenindose un rendimiento mximo a los 3 aos con una produccin de biomasa de 15,4 t/h para una densidad inicial de plantacin de 4000 rboles/h (Sochacki et al., 2007). Pinus caribaea Morelet es una especie que ha tenido gran inters mundial debido a su rpido crecimiento que alcanza una altura de 6 a 8 m en 3 aos, 35 m en 40 aos y 40 cm de dimetro a los 25 aos, con rendimientos de 21 a 43 m3/h (hasta los 13 aos). Tiene la ventaja de crecer en suelos someros, arcillosos o arenosos, con mal drenaje, con gran cantidad de grava, infrtiles, cidos, suelos con abundante hierro y en sitios con exposicin constante al viento. P. caribaea variedad hondurensis es un rbol originario de la zona tropical de Centroamrica y es el pino tropical de ms amplia distribucin geogrfica, encontrndose en Quintana Roo y Yucatn en Mxico, Nicaragua, Honduras, Belices, Islas Bahamas y Cuba, se ha introducido en ms de 50 pases. Las temperaturas medias en donde crece oscilan entre los 22-28C, con mximas de 37C y mnimas espordicas de 5C. La precipitacin flucta entre los 1000 y 1800 mm y puede tolerar hasta 3900 mm (Barret et al., 1962; Macario et al., 1998). P. caribaea ha experimentado una buena adaptabilidad y tasas iniciales de crecimiento mejores que especies nativas en Centroamrica en suelos degradados y con contenido de materia orgnica menores a 1% (CalvoAlvarado et al., 2007). La acumulacin de humus en suelos con plantaciones de P. caribaea Morelet incrementa la habilidad de almacenar nitrgeno, carbono, fsforo y azufre en el suelo hasta los 2 m de profundidad, mediante el enlace de nutrientes orgnicamente, incrementando la fertilidad del suelo y permitiendo reemplazar estas plantaciones para usos agrcolas o de
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pastoreo si fuera necesario en el futuro (Lilienfein et al., 2001). Una desventaja de la especie es su caracterstica de presentar un volumen de corteza considerablemente alto, lo cual puede afectar su aprovechamiento, aunque sus rendimientos sean altos se ha informado en plantaciones de 6 aos ubicadas en Turrialba, Costa Rica de un volumen de corteza de 32%, para rboles con 12 m de altura, 18 cm de dimetro altura pecho (dap) y un incremento medio anual en volumen total con corteza de 43 m3/h./ao (Salazar, 1985). La densidad bsica de madera de P. caribaea Morelet en rboles de 5 aos de edad ha sido de 407 kg/ m3 y para rboles de 25 aos de 488 kg/m3; rendimiento total de pulpa kraft de 55,1% (rboles de 5 aos) y 50,4% (rboles de 25 aos), con rechazos de 8,2 y 1,1 %, respectivamente, ha sido informada en plantaciones establecidas en la sabana de Afaka, Kaduna Nigeria (Oluwafemi, 2007).

1.9 Propuesta del proyecto En esta investigacin se propuso la obtencin de etanol a partir de materiales lignocelulsicos como lo son las especies de maderas blandas que crecen en distintas zonas climticas: P. radiata y P. caribaea, mediante el desarrollo de tecnologas de pretratamiento con cido diluido y sulfito alcalino/antraquinona, que sirvan de base para la futura optimizacin y escalamiento de dichos procesos. La sacharificacin del material pretratado obtenido fue realizada enzimticamente y la fermentacin se realiz con la levadura S. cerevisiae libre o inmovilizada en alginato de calcio.

1.10 Hiptesis Dos hiptesis distintas e independientes fueron planteadas en funcin del tipo de pretratamiento utilizado.

Hipteis 1:
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El uso de Saccharomyces cerevisiae IR2-9a inmovilizadas en alginato de calcio permite la obtencin de mayores rendimientos de bioetanol desde madera de P. radiata pretratada con cido diluido en comparacin con el uso de clulas libres. Hiptesis 2: El proceso de pretratamiento con sulfito alcalino/antraquinona y refinamiento en disco de maderas de P. radiata y P. caribaea conducen a la obtencin de un material con menor contenido de lignina y altamente fibrilado que genera altos rendimientos de conversin en la hidrlisis enzimtica y fermentacin para produccin de bioetanol.

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1.11 OBJETIVOS

1.11.1 Objetivo general Evaluar procesos de pretratamiento con cido diluido de P. radiata y al sulfito alcalino/antraquinona de P. radiata y P. caribaea que permitan recuperar y convertir la mayor cantidad de azcares para la produccin de etanol por sacarificacin enzimtica y fermentacin.

1.11.2 Objetivos especficos

Determinar condiciones de pretratamiento con H2SO4 diluido de madera de P. radiata que permitan alta recuperacin de azcares fermentables en el residuo slido y la fraccin lquida. Evaluar el uso de Saccaromyces cerevisiae IR2-9a inmovilizada en membranas de alginato-calcio en el proceso SSF de la fraccin lquida y slida de P. radiata pretratado con H2SO4 diluido. Evaluar el pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona (ASA) seguido de refinamiento en disco en astillas de P. radiata y P. caribaea como forma de obtener un material altamente fibrilado apto para la sacarificacin enzimtica y fermentacin. Evaluar el rendimiento de etanol de P. radiata y P. caribaea en funcin de los procesos de pretratamiento aplicados.

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CAPTULO II: Pretratamiento con cido diluido de Pinus radiata para produccin de bioetanol utilizando Saccharomyces cerevisiae IR2-9a inmovilizada y un proceso de fermentacin y sacarificacin simultneas*

2.1 Resumen La produccin de bioetanol a partir de materiales lignocelulsicos requiere la utilizacin de microorganismos adaptados para fermentar en condiciones donde la alta consistencia del substrato, temperatura y concentracin de inhibidores son comnmente encontradas. La inmovilizacin de levaduras en cpsulas de alginato de calcio ha sido reportada que mejora la proteccin de las levaduras e incrementa la eficiencia en los procesos de fermentacin. En este trabajo fue investigado el uso de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio y su comportamiento en la sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF) de astillas de Pinus radiata pretratadas con cido diluido. Los resultados demuestran que cuando las levaduras inmovilizadas son utilizadas, la produccin de bioetanol de la madera pretratada fue ms alta que cuando se utilizaron levaduras libres durante el proceso SSF. Se obtuvo una produccin mxima de etanol a partir de astillas de madera pretratadas con cido diluido y molidas de 153 L/ton de madera. La sumatoria del etanol producido de P. radiata pretratado con cido diluido de la fraccin lquida y slida del pretratamiento fue de 171 L/ton de madera de un valor mximo terico de 236 L/ton de madera pretratada. Palabras claves: Pinus radiata, bioetanol, pretratamiento con cido diluido, levadura inmovilizada, sacarificacin y fermentacin simultneas.

* El contenido del captulo fue aceptado para su publicacin como artculo en el Journal of The Chilean Chemical Society con el ttulo: Diluted acid pretreatment of Pinus radiata for bioethanol production using immobilized Saccharomyces cerevisiae IR2-9 in a simultaneous saccharification and fermentation process. Autores: Heriberto Franco, Regis Teixeira Mendona, Priscyla D. Marcato, Nelson Durn, Juanita Freer y Jaime Baeza.

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2.2 Introduccin Los altos precios y la escasez inevitable del petrleo, el impacto ambiental causado por emisiones de CO2 y la expansin progresiva de la civilizacin han dado lugar a una intensa investigacin para el desarrollo de fuentes de energas alternativas, incluyendo el etanol a partir de biomasa renovable, como lo son la madera o residuos forestales y agrcolas. La biomasa lignocelulsica puede ser transformada por procesos qumicos o biolgicos con el objetivo de romper los enlaces fsicos y qumicos de las fibras vegetales y sus componentes para producir biocombustibles y biomateriales como el bioetanol, metano, bioplsticos, entre otros (Mosier et al., 2005). El pretratamiento hidroltico con cidos minerales diluidos es uno de los principales procesos usados para fraccionar la biomasa forestal, con el propsito de mejorar la digestibilidad enzimtica y solubilizar azcares para su posterior fermentacin. Los principales objetivos de los pretratamientos son la solubilizacin de la lignina y hemicelulosas, reduccin de la cristalinidad de la celulosa y el incremento del rea superficial disponible y el volumen de poros del substrato para permitir la subsecuente hidrlisis enzimtica con alta produccin de azcares fermentables (Sun et. al, 2002; Esteghlalian et al., 1996). En el pretratamiento con cido diluido, las hemicelulosas son hidrolizadas primero, seguido por la solubilizacin de celulosa y lignina. La celulosa presente en el residuo slido puede ser posteriormente hidrolizada por medio de procesos con cidos o enzimas. La relacin entre las variables del proceso como la temperatura, tiempo de reaccin, concentracin de cido y composicin del substrato son esenciales en la determinacin de las condiciones ptimas del pretratamiento de una materia prima especfica para incrementar la liberacin de monmeros y disminuir la formacin de inhibidores (Martnez et al., 1995; Kim et al., 2005). La hidrlisis enzimtica puede ser realizada por separado del proceso de fermentacin y recibe el nombre de hidrlisis y fermentacin separadas (SHF), la hidrlisis enzimtica de la celulosa realizada junto con los microorganismos fermentativos se refiere a la sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF), la sacarificacin simultnea de celulosa y hemicelulosas y la co-fermentacin de glucosa y xilosa es conocida como proceso de sacarificacin y cofermentacin simultneas (SSCF) (Almeida et al., 2004).
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El desarrollo de procesos continuos para la fermentacin alcohlica, para reducir los costos e incrementar la produccin de etanol, condujo la investigacin de procesos de fermentacin en la cual se utilizan clulas libres, floculantes o levaduras inmovilizadas. La fermentacin con clulas libres ofrece algunas ventajas en comparacin con las clulas inmovilizadas, como la gran rea de contacto entre las clulas y el substrato, y el manejo de tecnologa existente en los procesos industriales. Entre las desventajas estn el alto costo del reciclaje microbial, alto riesgo de contaminacin y susceptibilidad de los microorganismos a las variaciones ambientales (Vasconcelos et al., 2004). El uso de polmeros sintticos o naturales para inmovilizar levaduras, como alginato de calcio, carragenina-oligoquitosano, quitosano-carboximetilcelulosa, poliamida, entre otros, permite la proteccin de las clulas de los inhibidores manteniendo una alta concentracin de clulas en las cpsulas, mejorando la estabilidad trmica, manteniendo un largo perodo de estabilidad operacional de la levadura encapsulada y obteniendo una alta produccin de etanol que en las fermentaciones con clulas de levaduras libres (Blazejak et al., 2002; Talebnia et al., 2005). S. cerevisiae es la levadura de uso frecuente en la industria del alcohol (vino, bebidas alcohlicas y combustibles) para la fermentacin de azcares de diferentes tipos de materias primas tales como las uvas y otras frutas, cereales, caa de azcar, y materiales lignocelulsicos. La levadura se utiliza tambin en investigaciones de enlaces de bio-elementos (por ejemplo, cadmio, magnesio y calcio) en los microorganismos debido a la facilidad de su cultivo y produccin de biomasa en un tiempo relativamente corto (Bekatorou et al., 2001; Almeida et al., 2004). Para la conservacin de colonias de levaduras o su inmovilizacin para usar en procesos de fermentacin es necesario mantener una alta viabilidad y estabilidad gentica del microorganismo para disminuir contaminaciones. La liofilizacin (secado por congelamiento o sublimacin es un proceso que permite la conservacin de clulas de levaduras a temperatura ambiente (18-20C). Sin embargo, un decrecimiento en la viabilidad de las levaduras ha sido observado y agentes crio protectores (azcares, albmina, leche, polioles, miel y amino cidos) son usados con el objetivo de evitar el dao celular en el proceso liofilizacin (Kierstan et al., 1977; Abadias et al., 2001).
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El encapsulamiento de clulas en geles de alginato es frecuente por las condiciones suaves utilizadas y la simplicidad del procedimiento para preparar las cpsulas, y varios reportes empleando este compuesto estn disponibles (Kierstan et al., 1977; Willaert et al., 1999). Existen varios estudios en relacin a la composicin de alginato y su estabilidad para la inmovilizacin celular (Martinsen et al., 1989; Cheong et al., 1993). Yamagiwa et al. (1993; 2004) prob el procedimiento de preparacin en dos pasos por recubrimiento de las esferas de alginato de calcio con clulas por alginato simple como una doble capa para mejorar la estabilidad del gel. Ruggeri et al. (1991) han realizado goteo de poliacrilamida sobre las esferas de alginato con clulas para mejorar la estabilidad estructural. Se observ que Eudragit RL 100 (un copolmero de resina acrlica) recubriendo las esferas de alginato con clulas encapsuladas, resulta en un 15% de mayor difusin del substrato y la fuga de clulas fue considerablemente reducida. Nagashima et al. (1984) operaron una planta piloto de 40.000 L de capacidad, utilizando clulas de levadura encapsuladas en alginato, con una tasa de produccin constante de alcohol de 8.5 a 9.0% por volumen. Usando clulas de S. cerevisiae encapsuladas en Caalginato, Iamuna et al. (2004) reportaron una rpida fermentacin de una solucin con alta concentracin de azcar, obteniendo 20% (peso/volumen) de alcohol en 30 h. Una alta produccin de etanol ha sido reportada para procesos SSF de hidrolizado de residuos de maz y maderas blandas con S. cerevisiae inmovilizadas en alginato (Hoyer et al., 2009; Zhao et al., 2009). Para S. cerevisiae ha sido encontrado que las clulas libres o inmovilizadas alcanzan una completa fermentacin al mismo tiempo, pero la tasa de crecimiento de las clulas suspendidas es ms bajo que el de las clulas inmovilizadas cuando la concentracin de etanol es mayor a 0.42 M (Jamai et al., 2001). Basado en los antecedentes presentados, el objetivo de este estudio fue evaluar el uso de clulas de S. cerevisiae liofilizadas e inmovilizadas en alginato de calcio en la produccin de bioetanol por SSF de astillas de madera de P. radiata pretratadas con cido sulfrico diluido.

2.3 Experimental
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2.3.1 Cultivo de levaduras S. cerevisiae (cepa IR2-9a) fue obtenida de la coleccin del Laboratorio de Recursos Renovables del Centro de Biotecnologa de la Universidad de Concepcin, Chile (Araque et al., 2008). La levadura fue previamente seleccionada y adaptada para el crecimiento a temperaturas de 4042C y fue mantenida en placas Petri con medio slido compuesto por: 50 g/L de glucosa (Sigma Aldrich, Alemania), 5 g/L de extracto de levadura (Himedia RM 0227, India), 5 g/L de peptona de soya (Becton Dicjinson and Company, USA), 1 g/L de KH2PO4 (Sigma-Aldrich, Alemania), 0,5 g/L de MgSO4.7H2O (Fluka-Chemika Suiza), 1 g/L NH4Cl (Sigma-Aldrich, Alemania) y 20 g/L de agar (Merck KGaA, Alemania) (Liu et al., 2009).Todos los medios de cultivo usados en este estudio fueron autoclavados a 121C por 20 min. Cinco colonias del cultivo fueron usadas para inocular 10 mL de medio lquido e incubado en un agitador por 24 h a 40 C y 150 rpm. Las clulas precultivadas (10 mL) fueron usadas para inocular 50 mL de medio de cultivo y fueron incubadas por 24, 48, 72 y 96 h, con el objetivo de evaluar la produccin de biomasa a diferentes periodos de cultivo. Despus del periodo de incubacin, las muestras fueron centrifugadas a 3500 rpm por 15 min. El sobrenadante fue eliminado y la biomasa fue lavada dos veces con 50 mL de una solucin de 0.9% NaCl. La biomasa de levadura fue transferida a un matraz de fondo redondo de 250 mL, congelada por 12 h y liofilizada hasta la eliminacin completa de agua (aproximadamente 18 h). La levadura liofilizada fue almacenada en tubos plsticos de centrfuga a temperatura ambiente hasta su uso posterior.

2.3.2 Cultivo de levadura en medio suplementado con CaCl2 El medio lquido tamponado de citrato de sodio 0.05 M pH 4.8 conteniendo 50 g/L de glucosa, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de peptona de soya, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de MgSO4.7H2O, 1 g/L de NH4Cl, fue suplementado con CaCl2.H2O (Sigma-Aldrich, Alemania).en concentraciones de 3,5, 5,8 y 8,0% (p/v), equivalentes a 1,3, 2,1 y 2,9% de Ca 2+. Para cada concentracin de Ca2+ se realiz ensayos por triplicado en matraces Erlenmeyer de 125 mL que contenan 10 mL de medio suplementado con CaCl2 y 40 mg de levadura liofilizada precultivada por 24, 48, 72 o 96 h. Los matraces fueron sellados e incubados a 40C, 150 rpm por 24 h.
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Alcuotas de 1 mL de medio de cultivo fueron tomadas al final del ensayo para el conteo de clulas viables. El ensayo se realiz para observar si el tiempo de precultivo de la levadura y la exposicin a concentraciones de CaCl2 similares a los utilizados para la formacin de las cpsulas tienen alguna influencia en la viabilidad de las clulas de levaduras.

2.3.3 Inmovilizacin de levaduras La inmovilizacin de levaduras fue realizada de la siguiente manera: se prepar alginato de sodio (3%) por dilucin de 1,5 g de alginato de sodio (Sigma-Aldrich, Alemania) en 50 mL de agua bajo agitacin. Soluciones de calcio fueron preparadas disolviendo 3,5 g y 8,0 g de CaCl2.H2O en 100 mL de agua destilada. Se adicion 100 mg de levadura liofilizada a 20 mL de solucin de alginato en un vaso de 100 mL. La solucin de levadura fue bombeada a travs de una bomba peristltica (2 mL/min) a la solucin de calcio (3,5 g o 8,0 g/100 mL) bajo agitacin. Las cpsulas de alginato formadas fueron almacenadas en 40 mL de una solucin de CaCl2 en un frasco plstico de 100 mL con tapn de rosca y mantenido en refrigeracin a 4C hasta su uso. La cantidad de clulas viables encapsuladas en cada partcula fue determinada por disolucin de dos partculas en 10 mL de una solucin de citrato de sodio 0,1 M a pH 4,8 seguido por diluciones seriales, plaqueo y conteo de colonias de clulas viables. La cantidad de clulas totales y viables de levadura, fue determinada por el mtodo de diluciones seriales y conteo en el hemocitmetro. La cantidad de clulas viables por medio de plaqueo en platos Petri con medio slido fueron realizados por el siguiente proceso: 1 mL de muestra fue adicionada a 9 mL de agua nanopure en tubos de ensayo. La solucin fue homogenizada y diluciones sucesivas en una relacin 1/10 fueron realizadas. Una alcuota de 0,1 mL de la muestra con microorganismos fue adicionada dentro de un plato Petri conteniendo medio de cultivo slido y fueron propagadas con una varilla de vidrio. El conteo de colonias fue realizado despus de 24 h de crecimiento a 40C. El conteo de clulas totales fue realizado por distribucin de 0,1 mL de solucin con microorganismos en una cmara de Neubauer. El nmero de microorganismos presentes en la muestra fue contado. Las lecturas fueron realizadas en triplicado para cada muestra.

2.3.4 Pretratamiento de astillas de madera de P. radiata con cido sulfrico diluido

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Astillas de madera de P. radiata D. Don (tamao promedio de 2,5 x 2,0 x 0,7 cm) fueron provistas por una planta de celulosa ubicada en la Regin del Bo Bo. El pretratamiento con cido fue realizado en un reactor Parr de 3,78 L con cido sulfrico de acuerdo al diseo factorial de puntos estrellas conformado por 17 experimentos. El punto estrella fue distribuido a una distancia de 1 del punto central y el valor de las variables temperatura, tiempo y pH fueron codificadas como: -1 (valor bajo), +1 (valor alto) y 0 (punto central). La influencia de las variables fue determinada por medio de la metodologa de superficie de respuesta y la validacin estadstica fue realizada por test de ANOVA con 95% de intervalo de confianza. Las condiciones del pretratamiento fueron las siguientes: 50 g de astillas de madera (base seca), relacin licor/madera: 4/1 (v/p), temperatura de 120C (nivel -1) y 170C (nivel +1), tiempo de pretratamiento de 1 min (nivel -1) y 60 min (nivel +1), pH del licor de 1,0 (nivel -1) y 2,5 (nivel +1). El diseo corresponde a un cuboidal circunscripto central compuesto (CCC). Un diseo CCC proporciona predicciones de alta calidad en el espacio del diseo, pero requiere ajuste de los factores que se encuentran fuera del rango en la parte factorial (Muhammad et al., 2002; NIST/SEMATECH, 2011). Previo al pretratamiento, las astillas fueron pesadas y colocadas en un vaso de 500 mL con 200 mL de agua nanopure por 24 h. Posteriormente, el agua fue drenada y las astillas fueron pesadas para determinar la cantidad de agua absorbida y determinar la cantidad de solucin cida que debera ser adicionada para alcanzar el pH del pretratamiento. Despus de la reaccin, el reactor fue enfriado, abierto y el licor fue filtrado. Los slidos fueron sumergidos en 200 mL de agua destilada por 60 min y filtrados. La fraccin lquida (hidrolizado ms lavado de astillas) fue combinada, aforada a 500 mL con agua destilada y caracterizada qumicamente por HPLC para la determinacin de azcares. Las astillas pretratadas fueron secadas al aire para la determinacin del rendimiento y una fraccin fue molida y caracterizada para el contenido de carbohidratos y lignina por hidrlisis cida con 72% de cido sulfrico siguiendo la metodologa publicada anteriormente (Ferraz et al., 2000).

2.3.5 Fermentacin de P. radiata pretratado con cido usando levadura inmovilizada

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La eficiencia de la levadura inmovilizada en la fermentacin primero fue evaluada en un medio sinttico compuesto por 50 g/L de glucosa, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de peptona de soya, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de MgSO4.7H2O, 1 g/L de NH4Cl, tamponado con 0,05 M de solucin de citrato de sodio pH 4.8. En matraces Erlenmeyer de 250 mL se adicion 30 mL de medio y 300 mg de levadura encapsulada. Los matraces fueron sellados y la fermentacin fue realizada en un agitador a 40C, 150 rpm por 72 h. P. radiata pretratado fue bioconvertido a bioetanol por un proceso de sacarificacin y fermentacin simultnea usando enzimas celulasas y levaduras inmovilizadas. Aproximadamente 3 g (peso seco) del residuo slido (40/60 mesh) (muestra nmero 6 del diseo experimental) fueron pesados y colocados en un matraz Erlenmeyer con 30 mL de medio tamponado (suplementado con sales pero sin la adicin de una fuente adicional de glucosa). A esta suspensin se le adicion una carga de enzima de 20 FPU de Celluclast (80 FPU/mL) y 40 UI de Novozymes -glucosidasa (234 UI) por gramo de material en base. La levadura inmovilizada que se adicion al medio de fermentacin fue equivalente a 100 mg de levadura/g de material slido y el nmero de clulas viables fue de aproximadamente 1 x 10 7. El etanol producido fue medido a las 6, 24, 48 y 72 h de fermentacin por cromatografa gaseosa en un equipo Perkin Elmer autosystem XL-Head space, con detector FID y una columna HPS-MS de 30 m. Se supuso para la produccin de etanol terico mxima una produccin de 0,51 g de etanol/g glucosa, considerando que toda la glucosa presente en el material pretratado estaba disponible para la fermentacin. La fraccin lquida del pretratamiento con cido de la muestra nmero 6 del diseo experimental (licor enriquecido de hemicelulosas) tambin fue fermentado. Una alcuota de 30 mL fue ajustada a pH 4.5 con una solucin 4 M de KOH y tamponada con 0,05 M de citrato de sodio a pH 4,8. El hidrolizado fue suplementado con una carga de 10 FPU de Celluclast y 10 UI de Novozyme -glucosidasa. Las condiciones de fermentacin, muestreo y anlisis fueron hechos como se describi previamente. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

2.3.6 Microscopa electrnica de levaduras encapsuladas

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La morfologa de las levaduras encapsuladas en alginato fue estudiada utilizando un Microscopio Electrnico de Barrido (SEM) Jeol-JSM-6360 LV) y se llev a cabo a un voltaje de 20 kV y las muestras fueron previamente cubiertas con oro/paladio al vaco por pulverizacin usando un aparato BAL-TECs. Imgenes de electrones secundarios fueron obtenidas. Este mtodo permite la visualizacin de posibles cambios superficiales en las macrocpsulas despus del proceso de fermentacin (Wen-tao et al., 2005; Jamai et al., 2001).

2.4 Resultados y discusin

2.4.1 Inmovilizacin de S. cerevisiae en alginato de calcio S. cerevisiae cultivada por 24 a 96 h report un contenido de clulas totales de 2,8-7,8 x 1010 clulas/mL de las cuales 1,5-3,8 x 108 fue determinada como clulas viables. Despus de la liofilizacin, el nmero de clulas viables se redujo a un valor promedio de 4,0 x 106 clulas/mL. Como es bien conocido, la liofilizacin es un proceso ampliamente utilizado para preservar alimentos y microorganismos, sin embargo, la tasa de congelamiento y el uso de agentes de proteccin son tambin factores crticos involucrados en el proceso que afectan la viabilidad y estabilidad de microorganismos (Bekatorou et al., 2001; Abadias et al., 2001). Los resultados demuestran que el cultivo de levaduras por un periodo entre 24 a 48 h provee suficiente cantidad de clulas viables para futuros procesos de inmovilizacin y para la formacin de cpsulas con un dimetro ms uniforme que cuando se utilizan clulas libres sin liofilizar. Para la optimizacin del cultivo de S. cerevisiae en microcpsulas de alginatoquitosano-alginato y fermentacin de glucosa, fue reportada la mejor densidad inicial de clulas de 3 x 106 clulas/mL para la proliferacin, metabolismo y produccin de etanol (Wen-tao et al., 2005). Cuando la determinacin de clulas viables se realiz en las levaduras encapsuladas, se observ que la levadura encapsulada en alginato de calcio produce menor nmero de colonias de levadura que las levaduras libres que fueron crecidas sin estar en contacto con soluciones de calcio. Por lo tanto, fue necesario determinar si el uso de soluciones de ciertas concentraciones
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de CaCl2 para la formacin de las cpsulas con alginato puede tener algn efecto negativo en el futuro crecimiento de la levadura y en el nmero de clulas viables despus del encapsulamiento. Para evaluar esto, algunos ensayos fueron desarrollados en medio lquido suplementado con CaCl2 y utilizando levadura liofilizada obtenida despus de 24 a 96 h de precultivo. El tiempo de incubacin fue de 24 h, despus de lo cual las clulas viables fueron contadas (Tabla 2.1). Se observ que a bajas concentraciones de CaCl2.2H2O en el medio de cultivo (3,5%) la levadura precultivada por 24 h tiene un nmero similar de clulas viables que las levaduras precultivadas a 48, 72 y 96 h. A altas concentraciones de CaCl2.2H2O (5,8 y 8,0%), el nmero de clulas viables decrece notoriamente, indicando que la cantidad de calcio puede inhibir el crecimiento de las levaduras, sin embargo, no hay ninguna indicacin de si afectara la produccin de etanol durante el proceso de fermentacin. Este resultado puede ser explicado porque el nmero de clulas viables en las cpsulas es del orden de 106 y se ha informado de que una poblacin inicial de aproximadamente 105 se recomienda para la inmovilizacin de S. cerevisiae en alginato de calcio y que el 70% del Ca2+ liberado de las cpsulas se encuentra en el medio de fermentacin a las 24 h del proceso de fermentacin, despus de 72 h no es detectado calcio liberado de las cpsulas, una preincubacin de las cpsulas en el medio nutriente antes de la fermentacin, puede reducir significativamente la cantidad de Ca2+ en el caldo de fermentacin (Ogbonna et al., 1989).

Tabla 2.1. Clulas viables de S. cerevisiae despus de 24 h de crecimiento en medio de cultivo suplementado con CaCl2. Clulas viables CaCl2.2H2O Levadura precultivada por 24 h 6,9x1010 Levadura precultivada por 48 h 4,8x1010 Levadura precultivada por 72 h 3,5x1010 Levadura precultivada por 96 h 1,8x1010
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3,5%

5,8% 8,0%

2,0x108 7,5x105

2,9x106 9,0x105

1,3x106 8,5x106

9,1x109 1,4x107

2.4.2 Pretratamiento con cido diluido y SSF de P. radiata pretratado utilizando S. cerevisiae inmovilizada La composicin qumica de P. radiata utilizada en este estudio fue de 44,1+0,7% glucanos, 21,4+0,9 hemicelulosas, 29,1+0,1 lignina y 2,8+0,1% extractivos solubles en etanol/tolueno. Pretratamiento con cido diluido de astillas de madera de P. radiata se realiz siguiendo el diseo experimental donde las respuestas a los parmetros evaluados (temperatura, tiempo y pH) fue la concentracin de glucosa en el material pretratado (fraccin slida). Los resultados fueron evaluados mediante la metodologa de superficie de respuesta. En la Tabla 2.2 se muestran los resultados obtenidos para los 17 experimentos generados por el diseo experimental.

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Tabla 2.2 Composicin del residuo insoluble en agua e hidrolizado del pretratamiento con cido de astillas de madera de P. radiata. Composicin fraccin slida (%)
Muestra Temperatura (C) pH Tiempo (min) 0 30 30 30 0 30 30 60 60 0 60 30 60 30 60 0 0 Slidos Lignina Glucanos Hemicelulosas

Composicin fraccin lquida (%)

Glucanos Hemicelulosas cido actico 0,2 0,1 0,2 0,2 0,0 0,6 0,6 0,0 0,0 0,1 0,3 0,0 0,0 0,1 1,0 0,1 1,1 cido frmico 0,0 0,1 0,2 0,2 0,0 0,4 0,5 0,0 0,0 0,1 0,3 0,0 0,0 0,1 0,4 0,0 1,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

120 145 145 145 120 170 145 170 170 170 145 145 120 120 120 145 170

1 1,75 1,75 1,75 2,5 1,75 1 1 2,5 2,5 1,75 2,5 2,5 1,75 1 1,75 1

86,7 84,4 81,2 81,5 92,6 71,6 69,1 68,9 76,5 63,6 84,9 86,4 89,2 89,1 86,5 88,3 68,1

28,3 27,6 26,7 26,7 24,4 26,1 26,8 24,4 27,2 21,8 27,8 26,6 25,7 27,5 26,5 27,4 26,3

38,2 37,9 38,5 36,9 39,8 37,4 36,6 31,4 34,6 39,7 35,2 36,0 35,3 38,4 37,2 39,4 39,1

12,6 11,7 8,2 8,9 18,6 2,4 1,3 0,0 4,8 7,1 8,8 12,8 15,7 13,3 9,8 5,9 0

0,2 0,2 0,3 0,2 0,0 1,1 1,6 1,0 1,3 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 1,5 0,0 3,2

1,8 2,0 2,9 2,9 0,8 7,4 6,0 0,6 3,0 1,1 0,0 0,0 0,0 0,6 10,0 0,9 4,6

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La Ecuacin 1 demuestra una relacin lineal entre la glucosa en el material pretratado que fue validado por un test ANOVA al 95% de nivel de confianza, donde Y es la glucosa (%) en el residuo slido despus de la prehidrlisis con cido. T es el temperatura de reaccin (C) y t es el tiempo de residencia en el reactor (min). Y (%) = 22,02+0,11 + 0,01+0,15 T 1,24+0,15 t (Eq. 1)

Los valores del test de ANOVA que dan validez estadstica al modelo fueron R2= 0,85, Q2= 0,78, validacin del modelo 0,91 y reproducibilidad del modelo 0,77. Un R2 (coeficiente de correlacin mltiple) con valores ms altos de 0,75 indican un modelo ptimo (Chauhan et al., 2004). El valor F del modelo es de 33,16 y el valor de la falta de ajuste F es 0,74. Altos valores de F y una falta de ajuste no significativa indican que el modelo tiene un buen ajuste. El modelo puede explicar el 85% de variacin en la respuesta. El anlisis estadstico demuestra que el pH de la solucin cida utilizada (pH 1 a 2,5) no es una variable que tiene influencia directa en el proceso de acuerdo al modelo estadstico. Este resultado es similar al reportado para el modelamiento y optimizacin del pretratamiento con cido diluido de lamo en la cual la temperatura y la concentracin de cido son los principales factores que afectan la recuperacin de azcares del pretratamiento. Slo a altas temperaturas (180C) es cuando el incremento en la concentracin de cido tiene algn efecto en la concentracin de azcares recuperados del pretratamiento (Esteghlalian et al., 1996). En la Figura 2.1 se muestra la superficie de respuesta para la concentracin de glucosa en el residuo slido pretratado en funcin del tiempo y la temperatura de reaccin. No se obtuv una respuesta mximizada, debido a las condiciones no severas a la que se realizaron los experimentos y produjo un residuo slido con poca variacin en el contenido de glucano que fue la respuesta evaluada. La cantidad de glucosa retenida en la fraccin slida vara entre 31,4 a 39,7 % la cual representa de 70 a 90% de la glucosa presente en la madera. La produccin de slidos despus del pretratamiento vari entre 63-89%. El contenido de lignina en las astillas pretratadas vari entre 21 a 28% (Tabla 2.2). Estos resultados son similares a los obtenidos para madera de lamo molida y pretratada en una unidad de pretratamiento al vapor usando altas temperaturas de vapor con 3% de SO2, 190C y 2 min de tiempo de reaccin donde la glucosa recuperada en el slido insoluble en agua fue de 87% (Monavari et al., 2009). La fraccin lquida fue compuesta principalmente por hemicelulosas, lo cual es consistente con el hecho de que la prehidrlisis cida a temperaturas entre 120-170C permite hidrolizar mayoritariamente hemicelulosas con poca
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solubilizacin

de

lignina

celulosa(Taherzadeh

et

al.,

2007).

Figura 2.1. Superficie de respuesta descrito por el modelo del diseo experimental, el cual representa la retencin de glucanos en el residuo insoluble en agua de astillas de madera de P. radiata en funcin de la temperatura y el tiempo de reaccin.

2.4.3 SSF de P. radiata pretratado utilizando S. cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio Levaduras precultivadas por 24 h e inmovilizadas en alginato de calcio, utilizando soluciones a un 3,5% y 8,0% de CaCl2 y 3% (p/v) de alginato de sodio fueron primero evaluadas en el medio de fermentacin sinttico conteniendo 50 g /L de glucosa (Figura A.5, Anexo III). La mxima produccin de etanol fue 64% y 74% del valor terico para las levaduras inmovilizadas en 3,5% y 8,0% en alginato de calcio, respectivamente (Figura 2.2).

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80 70 60 50 40 30 20

l a o t m i d n e R ) c t r a v o i x m l e d % (

10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tiempo de fermentacin (h)

Figura 2.2 Rendimiento de etanol obtenido de un medio sinttico fermentado por levaduras precultivadas por 24 h e inmovilizadas en 3,5% (tringulos) y 8,0% (cuadrados) de alginato de calcio. No se encontr glucosa residual en el medio al final del proceso de fermentacin indicando que adems de su bioconversin a etanol, la glucosa es tambin utilizada por la levadura para el crecimiento celular y mantencin. Una fase de retardo fue observada para la SSF con levaduras inmovilizadas en 3,5% de alginato de calcio despus de 24 h de fermentacin. En el caso de las levaduras encapsuladas en 8,0% de alginato de calcio se observ una baja produccin de etanol al inicio de la fermentacin, pero despus de 36 h la produccin de etanol fue ms alta que para las levaduras encapsuladas en 3,5% de alginato de calcio. Esta diferencia en el rendimiento de etanol puede ser explicada por las diferencias en la permeabilidad de la matriz de inmovilizacin con diferentes concentraciones de calcio, implicando un comportamiento diferente en la adsorcin de glucosa y la excrecin de etanol. La resistencia a la difusin de las estructuras de clulas inmovilizadas puede ser beneficiosa para el crecimiento del microorganismo y su actividad limitando la concentracin local de algn producto de inhibicin (Junter et al., 2002). Considerando que la levadura inmovilizada fue adecuada para su uso en la fermentacin, la muestra nmero 6 del prehidrolizado de astillas de madera de P. radiata (Figura A.3, Anexo 2) que contena 37% de glucano, 26% de lignina y 2% de hemicelulosas (en base madera), segn lo informado en la Tabla 2.2, fue usado para produccin de bioetanol por SSF utilizando levadura inmovilizada. Una consistencia de 10% (3 g de madera pretratada y
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molida en 30 mL de medio) fue utilizada. La cantidad de etanol mxima posible de obtener de la muestra considerando la conversin completa de glucosa en etanol con una produccin de 51% es de 238 L/ton de madera pretratada. La madera pretratada fue fermentada por un proceso SSF utilizando un medio suplementado con celulasas y con levadura inmovilizada. Cuando la madera pretratada y molida fue sometida a SSF con clulas de levaduras libres una produccin de etanol de 22% del valor terico fue obtenida (52 L de etanol/ton de madera pretratada). Por otra parte, cuando la fermentacin fue realizada con levadura inmovilizada en alginato de calcio (precultivada por 24 h, liofilizada e inmovilizada en 3,5% o 8,0% de alginato de calcio) la produccin de etanol fue significativamente incrementada (Figura 2.3). Los resultados demuestran que el resultado de la fermentacin en levadura inmovilizada en 3,5% de alginato de calcio fue ligeramente superior comparado con las clulas libres y una produccin de etanol de 29% fue obtenida despus de 48 h de SSF. Cuando el proceso SSF de astillas de P. radiata hidrolizadas y molidas fue realizado con levaduras inmovilizadas en 8,0% de alginato de calcio, la produccin de etanol fue significativamente incrementada alcanzando 65% (153 L/ton de madera pretratada) del valor mximo terico.

80 70 60 50 40 30

l o a t e n i c u d r P ) c t r a v o i x m l e d % (

20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tiem SSF (h) po

Figura 2.3. Produccin de etanol obtenida de madera de P. radiata pretratadas con cido diluido utilizando levaduras libres (cuadrados) y levaduras precultivadas por 24 h e inmovilizadas en 3,5% (crculos) y 8,0% (tringulos) de alginato de calcio.

La diferencia en el mejor rendimiento de a fermentacin en las cpsulas formadas con 8% de CaCl2 comparado con las cpsulas formadas con 3,5% de CaCl2 puede ser explicado por la
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diferencia en las caractersticas de difusin de la membrana que pueden ofrecer mayor proteccin a las levaduras inmovilizadas a la presencia de etanol exgeno producido en el medio de fermentacin y a inhibidores como la lignina contenida en el prehidrolizado utilizado para el proceso SSF. El resultado obtenido es comparable al obtenido en donde Picea abies (una madera blanda) fue pretratada en dos etapas con cido diluido (180-200C por 10-2 min con 0,5-2% de H2SO4) seguido por SSF a un 2% de consistencia de substrato y una produccin e etanol del 65% (Sderstrm et al., 2003). La fraccin lquida del material prehidrolizado con cido (enriquecido de hemicelulosas) usado previamente en el proceso SSF, tambin fue fermentado con levaduras inmovilizadas para evaluar la factibilidad del glucano y hemicelulosas C-6 de ser fermentadas a etanol. La cantidad de azcares C-6 en este hidrolizado fue de 8% aproximadamente la cual puede generar 50 L de etanol/ton de madera. La fermentacin de la fraccin lquida con levadura inmovilizada produce una conversin mxima de azcares en etanol de 36% o 18 L/ton de madera. El cido actico en el hidrolizado est presente en una concentracin de 0,6% (0,6 g de cido actico/100 g de madera base seca) y el cido frmico en una concentracin de 0,4%. Estas concentraciones de inhibidores de la fermentacin son bajas en comparacin con los reportados para la fermentacin de la fraccin lquida del pretratamiento con H2SO4 de madera blanda Picea abies, con concentraciones (g/100 g de materia en base seca) de cido actico, furfural e hidroximetilfurfural de 1,6, 0,3 y 0,6, respectivamente. Bajo estas condiciones de concentracin de inhibidores la produccin despus de la fermentacin de la fraccin lquida del pretratamiento fue de 94% del la produccin de etanol terica, indicando que no ocurre inhibicin (Sderstrm et al., 2003). La suma del etanol producido del pretratamiento con cido de P. radiata para la fraccin slida y lquida fue de 171 L/ton de madera. La produccin de etanol de madera pretratada por autohidrlisis con 1% de cido sulfrico seguido por hidrlisis enzimtica y fermentacin fue reportada en un rango de 202-240 L/ton de madera (Szczodrak et al., 1996; Demirbas, 2005). La bacteria Zymomonas mobilis la cual permite fermentar azcares C-5 y C-6, fue considerada para evaluar un proceso conceptual de produccin de etanol a travs del software BioRefinOpt. Considerando un 75% de conversin de carbohidratos a monmeros del pretratamiento con cido de P. taeda, la mxima produccin de etanol fue estimada en 300 L/ton de madera (Frederick et al., 2008). Para madera blanda de Picea abies pretratada con SO2 a 215C por 5 min y SSF con una carga enzimtica de 28 UI/g de celulosa de Novozyme 188 -glucosidasa y 32 FPU/g de celulosa de Celluclast y concentracin de
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substrato de 5% ha sido reportada una produccin mxima de etanol de 68% del terico basado en la glucosa y manosa presente en la madera original (Stenberg et al., 2000). Nuestros resultados demuestran que las levaduras inmovilizadas presentan potencial para ser utilizadas en la fermentacin de materiales lignocelulsicos pretratados, algunas variables en el proceso (severidad del pretratamiento, carga de enzimas y levaduras, relacin slido/lquido en el proceso SSF, entre otros) deben ser optimizados para incrementar la produccin de etanol y hacer viable la tcnica. Por otra parte, en experimentos preliminares de fermentacin de medio sinttico conteniendo concentraciones de glucosa de 50 g/L fue observado que la levadura inmovilizada en alginato de calcio puede ser reutilizada hasta 3 veces, manteniendo una produccin de etanol de aproximadamente 70% de la produccin mxima de etanol. Esto representa una ventaja del proceso que permite abaratar los costos comparados con procesos en donde se utilizan clulas libres.

2.4.4 Microscopa electrnica de barrido (SEM) de las cpsulas de alginato con levadura inmovilizada La morfologa de las cpsulas con levadura inmovilizada fue analizada por microscopia electrnica de barrido. El encapsulamiento de las levaduras cambia la superficie de las partculas incrementando su rugosidad como se demuestra en la Figura 2.4. Adems, el encapsulamiento de las levaduras incrementa el tamao de las partculas de 1540 m a 1970 m indicando lo que demuestra que la levadura efectivamente fue encapsulada.

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Figura 2.4. Micrografas SEM de partculas de alginato antes del proceso de fermentacin: A) x45, B) x150, C) x700, D) x4500. Microscopa electrnica A y B muestran la superficie lisa de las partculas de alginato de calcio sin levadura. SEM C y D demuestran la rugosidad de la superficie de las cpsulas con S. cerevisiae inmovilizada. Despus del proceso de fermentacin, las partculas con levadura fueron tambin analizadas por SEM. Este proceso cambia la superficie de las partculas, pero no cambia el tamao de la partcula (aproximadamente 1567 m) como se muestra en la Figura 2.5. Probablemente, debido a la produccin de etanol y a la permeacin por la pared de las partculas, pequeas cavidades (40 m) aparecen en la superficie de las cpsulas.

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Figura 2.5. Micrografas SEM de partculas de alginato con levaduras despus del proceso de fermentacin: A) x45, B) x150, C) x700, D) x4500. Microscopa electrnica de barrido A y D muestran una alta porosidad en la superficie de la cpsula con levadura inmovilizada despus de la fermentacin.

2.5 Conclusiones El uso de S. cerevisiae IR2-9a inmovilizada en alginato de calcio, demostr una buena produccin de etanol para un medio sinttico de fermentacin (glucosa) y para la fraccin lquida y slida del pretratamiento con cido diluido de astillas de madera de P. radiata. La mejor produccin de etanol fue obtenida con levaduras encapsuladas en 8% de CaCl2 y 3% de alginato. Despus de la fermentacin, las cpsulas no muestran una variacin del tamao, lo cual indica una baja tasa de crecimiento de la levadura inmovilizada. La produccin de etanol de la fraccin lquida y slida del pretratamiento con cido diluido fue del 65% del valor mximo terico en relacin a las hexosas presentes en las astillas de madera de P. radiata, esta produccin es buena para un proceso de pretratamiento con cido diluido en una etapa. Para futuras investigaciones puede usarse este proceso de hidrlisis con cido diluido combinado con una segunda etapa de hidrlisis con agentes oxidantes que permitan
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incrementar la accesibilidad de las enzimas al substrato e incrementar la produccin de azcares fermentables para obtener una mayor produccin de etanol.

Agradecimientos Se agradece el soporte financiero del Fondo Nacional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico (FONDECYT, proyecto nmero 1070492 y del CNPq/FAPESP, Brasil). H. Franco agradece al Programa Nacional de Investigadores 2005-2010 de SENACYT-IFARHU Panam por la beca de doctorado otorgada.

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CAPTULO III: Pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona y refinamiento en disco de astillas de madera de Pinus radiata y Pinus caribaea para la produccin de bioetanol*

3.1 Resumen Astillas de maderas de Pinus radiata y Pinus caribaea fueron pretratadas por coccin al sulfito alcalino/antraquinona (ASA) seguido de refinamiento en disco para la produccin de pulpas con bajo contenido de lignina y alta fibrilacin. Las pulpas producidas con diferente grado de delignificacin y refinadas a diferentes consumos de energa en el refinador de disco fueron usadas en procesos de sacarificacin y fermentacin por separado (SHF) o sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF). La delignificacin de las pulpas ASA estuvo entre 25 y 50%, con una baja prdida de celulosa (medida como glucanos) siendo la prdida mxima de 13%. El rendimiento de pulpa fue entre 70-78% para las pulpas de P. radiata y de 60% para la pulpa de P. caribaea. Las pulpas obtenidas despus del refinamiento en refinador de discos con diferentes consumos de energa (570 Wh/kg, 1705 Wh/kg y 3635 Wh/kg) fueron evaluadas en ensayos de hidrlisis enzimtica con celulasas. La conversin de glucano a glucosa obtenida vari entre 20 y 70% de acuerdo al grado de delignificacin y fibrilacin de las pulpas. La mejor pulpa ASA de P. radiata usada en experimentos de SHF y SSF con 10% de consistencia del substrato produjo una concentracin mxima de etanol de aproximadamente 20 g/L lo cual representa sobre 90% de conversin de glucosa en base pulpa y una cantidad estimada de etanol de 260 L/ton de madera. La pulpa de P. caribaea tambin presenta un buen
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rendimiento en la hidrlisis enzimtica y fermentacin pero debido al bajo contenido de celulosa presente en la madera, slo fue obtenida una produccin de 140 L/ton de madera. En trminos generales, la coccin ASA seguida de refinamiento en disco demostr ser un pretratamiento eficiente, el que genera un substrato poco lignificado y altamente fibrilado, que permite que la produccin de etanol de madera blanda con alto rendimiento de conversin.

Palabras claves: pretratamiento ASA, refinamiento en disco, hidrlisis enzimtica, Pinus radiata, Pinus caribaea.

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*El contenido del captulo fue enviado como artculo al Journal of Chemical Technology & Biotechnology con el ttulo: Alkaline sulfite/anthraquinone pretreatment followed by disk refining of Pinus radiata and Pinus caribaea wood chips for biochemical ethanol production. Autores: Heriberto Franco A., Andr Ferraz, Adriane M.F. Milagres, Walter Carvalho, Juanita Freer, Jaime Baeza y Regis Teixeira Mendona.

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3.2 Introduccin Los biocombustibles son un importante substituto de los combustibles derivados del petrleo que pueden ser obtenidos de varias fuentes de biomasa. En aos recientes varios pases y regiones alrededor del mundo (Brasil, USA, Canad, Japn, China y Europa) estn desarrollando su mercado interno de biocombustibles y estableciendo planes para usar estos como un combustible simple o como un aditivo oxigenado de la gasolina (Mussatto et al., 2010). Los biocombustibles son generalmente considerados por ofrecer muchos beneficios potenciales, incluyendo la seguridad energtica, balance comercial, bajas emisiones de gases de efecto de invernadero, reduccin de las emisiones contaminantes del aire, desempeo de los vehculos, inversin econmica en el sector agrcola, empleos y desarrollo comunitario, sustentabilidad, renovabilidad y

biodegradabilidad (AIE, 2004; Demirbas, 2009). La demanda mundial de etanol en 2015 es estimada entre 65 y 90 millones de litros. La produccin de etanol para combustible en Brasil y USA es estimada entre 28 a 35 billones de litros, y 23 a 28 billones de litros, respectivamente (Gnansounou, 2009). En la actualidad, la demanda mundial de etanol se deriva principalmente del maz en USA y de la caa de azcar en Brasil. Otras fuentes de biomasa pueden ser utilizadas para la produccin de etanol: madera, gramneas, especies maderables de corta rotacin, bagazo, residuos de madera, aserrn, residuos agrcolas y residuos de papel. En la actualidad la biomasa potencial anual es de 6,49 billones de toneladas, de las cuales 2,48 estn siendo utilizadas, el exceso de biomasa, 4,01 billones de toneladas, puede ser usado para la produccin de biocombustibles (Gupta et al., 2010). El
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bioetanol producido de biomasa lignocelulsica es una alternativa interesante, como materia prima lignocelulsica no compite con los cultivos alimenticios y son menos costosos que las materias primas agrcolas (Alvira et al., 2010). La biomasa lignocelulsica es ms recalcitrante a la accin microbial y enzimtica que la biomasa no maderable para la produccin de etanol a travs de la plataforma bioqumica. Esto es particularmente cierto para especies de maderas blandas debido a su complejidad estructural y qumica (Zhu et al., 2010). Para la conversin de madera a etanol, un proceso complejo de pretratamiento para cambiar los biopolmeros (especialmente celulosa) a azcares fermentables es requerido. El principal objetivo de cualquier pretratamiento es alterar o remover los impedimentos estructurales y de composicin para la hidrlisis, y los procesos subsecuentes de degradacin para permitir una mayor digestibilidad, mejorando la tasa de hidrlisis enzimtica e incrementando el rendimiento de azcares (Mosier et al., 2005). Los pretratamientos qumicos tienen como objetivo principal mejorar la accesibilidad de las enzimas a la celulosa por solubilizacin de hemicelulosas y lignina, y disminuir el grado de de polimerizacin y cristalinidad de los componentes celulsicos (Cardona et al., 2006). Todos los procesos de pulpaje qumicos de uso comercial hoy en da, involucran la remocin de lignina para producir pulpa para varios productos de papel, entonces estos procesos pueden ser considerados como potenciales mtodos de pretratamiento (Chandra et al., 2007).

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El uso de licores de coccin con NaOH y Na2SO3 como en el pulpaje quimicotermomecnico (CTMP) o con la adicin de pequeas cantidades de antraquinona como en el pulpaje al sulfito alcalino/antraquinona (ASA) han probado ser efectivos en la solubilizacin e incremento de la hidrofilicidad de la lignina, como tambin, promoviendo la estabilizacin oxidativa de los polisacridos y al mismo tiempo alcanzando una alta tasa de delignificacin lo cual resulta en altos rendimientos pulpables (Patt et al., 2006; Huang et al., 2008). El mtodo convencional de manufactura de pulpa CTMP es basado en la pre impregnacin de astillas de maderas blandas con 2-3% de una solucin alcalina de sulfito de sodio antes de la coccin seguida de refinamiento en disco presurizado. El tratamiento al sulfito de astillas de madera resulta en la sulfonacin de lignina, lo cual causa solubilizacin y ablandamiento de la matriz de lignina y consecuentemente afecta el plano de ruptura de la fibra y la defibracin de las astillas de madera, lo cual da una pulpa caracterizada por una mayor y ms flexible fraccin de fibras largas. La desintegracin de fibras individuales a fragmentos de fibras y finos en el pulpaje CMTP provee una alta rea especfica y el contenido de lignina en la superficie de la fibra expuesta es relativamente bajo (Vena, 2005; Hglund, 2009). Las condiciones del pretratamiento alcalino tambin incrementan la hidrofilicidad de la fibra por generacin de nuevos grupos carboxlicos y la sulfonacin de la lignina, particularmente en las regiones ricas en lignina entre las fibras (Johansson et al., 1997; Konn et al., 2007). El pretratamiento al sulfito para superar la recalcitrancia de la lignocelulosa (proceso SPORL por sus siglas en ingls) aplicado a picea ha sido reportado que produce un rendimiento de conversin de glucanos a glucosa
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de 91% y un total de monosacridos recuperados (pentosas y hexosas) de 88% (Shuai et al., 2010). La hidrlisis enzimtica de pulpas SPORL de pino rojo con una carga de enzimas de 14,6 FPU de Celluclast y 22,5 CBU de Novozyme 188 por gramo de substrato result en un rendimiento de glucosa de 40% en base al peso de madera de pino rojo (Zhu et al., 2009). Pinus contorta pretratado con ASA retiene 88% de glucano de la madera en el substrato slido y la hidrlisis enzimtica produce 88% de glucosa al 10% de consistencia de substratos slidos (Tian et al., 2010).

Basado en los antecedentes presentados, este estudio fue realizado para evaluar las condiciones de pretratamiento de astillas de madera de P. radiata con el proceso ASA seguido de refinamiento en disco, hidrlisis enzimtica y fermentacin del substrato slido para la produccin de bioetanol. Adicionalmente, el mismo proceso fue evaluado para una especie de pino tropical, P. caribaea. El uso de ambas especies de maderas blandas se justifica porque P. radiata es ampliamente usada en procesos de pulpaje y distribuida en regiones templadas (incluyendo Chile), mientras que P. caribaea es una especie que slo crece en climas tropicales. En esta va, es importante realizar la comparacin de la produccin de estas especies con potencial de ser utilizadas en plantaciones bioenergticas.

3.3 Materiales y Mtodos

3.3.1 Materia prima

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La madera de P. radiata y P. caribaea fue astillada y seleccionada a un tamao de aproximadamente 2,0 cm x 2,5 cm x 0,5 cm. Las astillas de madera fueron secadas al aire hasta alcanzar 10% de humedad (p/p), y almacenadas en bolsas plsticas hasta su uso. Astillas de madera de P. radiata (rboles de aproximadamente 11 aos) fueron provistas por una industria chilena de pulpa localizada en la Regin del Bo Bo. P. caribaea con una edad estimada de 25 aos fue colectada en plantaciones localizadas en Chiriqu, Panam.

3.3.2 Pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona (ASA) Varios pretratamientos ASA (P) de astillas de pino fueron realizados bajo diferentes condiciones de coccin como se detalla en la Tabla I. P-1 fue realizado en 3 matraces Erlenmeyer cada uno con 200 g de astillas de madera, una razn licor/madera 6:1 (v/p) y 0.1 % (p/p) de antraquinona. La impregnacin de las astillas fue realizada aplicando vaco al matraz por 30 min. Los matraces con las astillas y el licor fue introducido en un autoclave donde la reaccin fue realizada a 120C por 120 min. Las astillas para los pretratamientos ASA P-2, P-3 y P-4 fueron impregnadas de la misma forma que P-1 pero al finalizar los 30 min, las astillas y el licor fueron transferidos a un reactor de acero inoxidable. El reactor fue cerrado y colocado en un bao de silicona con termocupla y calentamiento regulado por una fuente de poder. La coccin fue realizada a 170C y el tiempo de coccin de acuerdo a los datos mostrados en la Tabla 3.1. Para alcanzar la temperatura de coccin se utiliz una rampa de calentamiento de 3 C/min. Para cada

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condicin, 4 reactores independientes fueron usados hasta obtener la cantidad suficiente de material pretratado para los siguientes pasos del proceso. Tabla 3.1. Condiciones de coccin del pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona de astillas de madera de pino.
Muestra P. radiata Experimento P-1 P-2 P-3 P-4 P, caribaea P-5 NaOH (%, b. p.)* 8,5 8,5 7,5 7,5 7,5 Na2SO3 (%, b. p.)* 16,5 16,5 17,5 17,5 17,5 Temperatura (oC) 120 170 170 170 170 Tiempo de coccin (min) 120 30 30 45 45

*b.p. = en base peso seco de madera.

Despus de cada reaccin, el licor fue drenado y la biomasa residual fue lavada con agua corriente en abundancia. El material residual fue desintegrado en una licuadora industrial (Figura A.1, Anexo I) de 10 L (Metvisa, BMG Brasil) por 1 h con 8 L de agua. Despus de la desintegracin, la biomasa fue lavada dentro de una columna de PVC de 1 m de largo por 150 mm de dimetro con una malla de 200 mesh al final de la columna, para evitar la prdida de finos (partculas de menos de 0,2 mm). Los finos que pasan a travs de la malla son nuevamente recirculados en la parte superior de la columna. La recirculacin del filtrado permite la formacin de una capa de fibras en la base de la columna que retiene los finos. La recirculacin del agua es detenida cuando el agua de lavado est libre de turbiedad. Despus de este punto, se adicion ms biomasa a la columna y agua fresca es pasada a travs de la biomasa hasta que el agua de lavado alcance un pH neutral. El
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material lavado fue centrifugado con el objetivo de determinar la humedad de la pulpa la cual fue de aproximadamente 70%. El agua liberada durante la centrifugacin fue colectada y utilizada como agente de dilucin en el siguiente proceso de refinamiento en disco. El material pretratado fue suspendido en agua a un volumen final de 25 L (aproximadamente 2,0% de consistencia) y refinado en un refinador de disco Bauer MD3000 (REGMED, Brasil) con una separacin de disco de 0,1 mm (Figura A.2, Anexo I). El refinamiento fue realizado a 570 Wh/kg, 1705 Wh/kg y 3635 Wh/kg de consumo de energa por el refinador de disco. Las muestras refinadas fueron analizadas para determinar el grado de fibrilacin por el procedimiento del Canadian Standard Freeness (Norma TAPPI T227 om-04) y centrifugados al 30% de consistencia para su posterior uso.

3.3.3 Caracterizacin qumica de madera y pulpas ASA Aproximadamente 3 g de madera molida (40/60 mesh) fue extrada con etanol 95% por 16 h en un aparato Soxhlet y a un reflujo de 3 ciclos/h. La madera libre de extrables y las muestras de pulpa ASA fueron hidrolizadas con 72% (p/p) de cido sulfrico a 30C por 1 h (300 mg de muestra y 3 mL de H 2SO4). El cido fue diluido a una concentracin final de 4% (adicin de 79 mL de agua), y la mezcla fue digerida a 121C, 1 atm por 1 h. El material resultante fue enfriado y filtrado a travs de crisoles de vidrio porosos nmero 3. El slido fue secado a peso constante a 105C, el cual corresponde a la lignina insoluble. La lignina soluble en el filtrado fue leda en una cubeta estndar UV (1 cm de longitud de trayecto) a 205 nm. Un valor de absortividad (coeficiente de extincin) de 105 L/g.cm fue
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usado para calcular la cantidad de lignina soluble presente en el hidrolizado. Las concentraciones de azcares monomricos en la fraccin soluble fueron determinados por HPLC utilizando una columna BIO-RAD HPX-87H a 45C y a una tasa de elucin de 0.6 mL/min con H2SO4 5 mM. Los azcares fueron detectados con un detector IR a temperatura controlada (Ferraz et al., 2000). Los factores para convertir monmeros a anhidro monmeros fueron 0,90 para las hexosas. Todas las muestras fueron analizadas en triplicado.

3.3.4 Hidrlisis enzimtica La hidrlisis enzimtica de las pulpas ASA fueron realizadas utilizando una mezcla de preparaciones enzimticas comerciales Celluclast y Novozyme 188 (Novozymes, Dinamarca) a una carga de 8.8 FPU/g pulpa (en base seca) y 40 UI de -glucosidasa/g pulpa. Cada experimento de hidrlisis fue realizado en un matraz Erlenmeyer fue incubado a 45C bajo agitacin de 150 ciclos por min. La reaccin fue detenida a perodos definidos de 24 a 72 h por calentamiento del matraz de reaccin a 100C por 5 min, en un bao de agua, seguido de la centrifugacin de la suspensin a 10000 x g por 15 min. Para cada tiempo de hidrlisis, tres rplicas de experimentos se realizaron. Los hidrolizados fueron analizados para determinar el contenido de glucosa, celobiosa y hemicelulosas (manosa ms xilosa) usando el procedimiento de HPLC anteriormente descrito. Conversin de glucano a glucosa y hemicelulosas a monosacridos (principalmente manosa) fueron

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calculados considerando 0.90 como el factor de hidrlisis debido a la incorporacin de agua al anhidro azcar.

Con la pulpa P-4 la hidrlisis enzimtica tambin fue realizada con 20 FPU de Celluclast y 40 UI de -glucosidasa por gramo de pulpa en un matraz Erlenmeyer de 1 L a un 10% de consistencia del substrato (50 g de pulpa suspendida en 500 mL de una solucin amortiguadora de 0,05M de citrato a pH 4,8). Los matraces fueron incubados a 45C bajo agitacin recproca de 150 ciclos por min. La reaccin fue parada por perodos definidos entre 24 a 72 h por calentamiento del matraz de reaccin a 100C por 5 min, seguido de centrifugacin a 1000 x g por 15 min. El hidrolizado resultante de los experimentos fueron analizados para determinar el contenido de azcares por HPLC y utilizados para produccin de bioetanol en un proceso de hidrlisis y fermentacin separadas (SHF).

3.3.5 Hidrlisis y fermentacin separadas (SHF) y sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF) El proceso de SHF fue realizado utilizando el hidrolizado obtenido en el ensayo de hidrlisis enzimtica de la pulpa P-4 en el matraz de 1 L. El hidrolizado fue esterilizado a 111C por 15 min. Posteriormente, 49 mL del hidrolizado fueron adicionados a un matraz Erlenmeyer de 250 mL. El pH fue ajustado a 4,8 con 1 mL de solucin amortiguadora de citrato 50 mL y el medio de fermentacin fue suplementado con extracto de malta (3 g/L), peptona (5 g/L) y extracto de levadura (3 g/L) ms 5 g/L de S. cerevisiae comercial. El
52

medio de fermentacin fue incubado en un bao de agua sin agitacin a 30C. Las muestras fueron retiradas a las 24, 48 y 72 h y analizadas por HPLC para determinacin de etanol y azcares residuales. Los experimentos se realizaron en triplicado. El proceso de SSF de la pulpa P-4 (refinada a 1705 Wh/kg) fue realizada con 5 g de pulpa (en base seca) a una consistencia de 10% del substrato en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. La pulpa fue suspendida en 50 mL de una solucin de citrato 50 mM (pH 4,8) con 8,8 o 20 FPU/g de Celluclast y 40 UI de -glucosidasa en ambos casos. Los matraces fueron incubados en un bao de agua a 45C bajo agitacin de 150 ciclos por min para 24 a 72 h como paso de hidrlisis. Despus de esos perodos, el mismo medio fue suplementado con extracto de malta (3 g/L), peptona (5 g/L), extracto de levadura (3 g/L) e inoculado con 5 g/L de S. cerevisiae comercial. La fermentacin fue realizada a 30C sin agitacin por 24 h. Las muestras fueron colectadas, filtradas y analizadas para determinar etanol y azcares residuales por HPLC. Experimentos adicionales de SSF bajo las mismas condiciones fueron realizados con la adicin de 20 UI/g de pulpa de mananasa Megazyme (endo 1,4 mananansa, Megazyme Int. Ltd., Irlanda).

3.4 Resultados y Discusin

3.4.1 Pulpaje ASA y refinamiento en disco Sulfito alcalino antraquinona (ASA) y refinamiento en disco de astillas de madera de P. radiata and P. caribaea fueron utilizados como pretratamiento con el objetivo de obtener un material homogneo y fibrilado para ser usado en hidrlisis enzimtica y fermentacin
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a bioetanol. Diferentes condiciones de pretratamiento fueron evaluadas para obtener una remocin parcial de lignina sin una disminucin significativa de carbohidratos (especialmente glucanos). La composicin qumica de las astillas de madera y las pulpas obtenidas despus del pretratamiento ASA/refinamiento en disco son mostrados en la Tabla 3.2. Para P. radiata, el rendimiento de pulpa vara entre 71 a 78%, lo cual est en el intervalo esperado para pulpaje semi qumico. La retencin de glucano en las pulpas tambin fue muy buena con prdidas que varan entre 0% (P-1) y 13% (P-2). La delignificacin durante la coccin ASA fue del orden de 25% a 50% para P-1 y P-4, respectivamente, mientras que la solubilizacin de hemicelulosas fue entre 50% y 58%.

Tabla 3.2. Composicin qumica (en base a madera) de astillas de madera de pino y pulpas ASA.
Muestra P. radiata Madera P-1 P-2 P-3 P-4 P. caribaea Madera P-5 Glucanos (%) 44,1 0,2 44,6 0,1 38 2 41 2 42 2 33,9 0,4 27,7 0,7 Hemicelulosas (%) 21,4 0,3 12,4 0,1 10,8 0,6 11,3 0,6 11,5 0,2 12,9 0,3 7,7 0,6 Lignina (%) 29,1 0,7 21,9 0,4 19,0 0,9 18,2 0,2 14,7 0,4 25,8 0,8 22,3 0,1 Extractivos (%) 2,4 0,2 n.d. n.d. n.d. n.d. 21,7 0,4 n.d. Rendimiento de pulpa (%) --78,1 72,8 74,3 71,3 --59,9

n.d.= no determinado
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Las astillas de madera parcialmente delignificadas por el proceso ASA fueron defibradas en una licuadora industrial y posteriormente refinadas en un refinador de discos con el objetivo de fibrilar las fibras de madera e incrementar el rea superficial de las pulpas para la posterior sacarificacin. La fibrilacin fue realizada a 3 niveles distintos de consumo de energa del refinador (570 Wh/kg, 1705 Wh/kg y 3635 Wh/kg) como se muestra en la Figura 3.1. Todas las pulpas presentaron una baja fibrilacin a bajos consumos de energa, aproximadamente 800 mL de freeness a 570 Wh/kg. P-1 tambin mostr bajo grado de refinamiento a 1705 Wh/kg (770 mL de freeness) probablemente debido a la remocin insuficiente de lignina de la pared celular. Para la produccin de pulpa quimico-mecnica, las temperaturas de ablandamiento para lignina estn entre 125-145C y si la lignina de la lamela media es ablandada, las fibras de madera pueden ser liberadas con bajo consumo de energa (Hglund, 2009). Las pulpas P-2, P-3 y P-4 de P. radiata presentaron grados similares de fibrilacin a 1705 Wh/kg y 3635 Wh/kg (390 y 50 mL de freeness, respectivamente). Sin embargo, a 3635 Wh/kg las pulpas tienen una alta cantidad de fibras

molidas lo cual resulta en un material particulado muy fino, mientras que a 1705 Wh/kg se present una apariencia ms fibrilada para las pulpas P-2 y P-4.

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900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

P-1 P-2 P-3 P-4

) L m ( F S C

4000

Energa de refinamiento (Wh/kg)

Figura 3.1. Drenabilidad de pulpas ASA de P. radiata a diferentes consumos de energa durante el refinamiento en disco.

3.4.2 Hidrlisis enzimtica Pulpas ASA P-1 a P-4 producidas despus del refinamiento en disco a diferentes consumos de energa fueron evaluadas en ensayos de hidrlisis enzimtica a un 10% de consistencia de slidos y una carga de celulasas de 8,8 FPU de Celluclast y 40 UI de -glucosidasa por gramo de pulpa. Los resultados de estos ensayos son mostrados en la Figura 3.2.

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Figura 3.2. Hidrlisis enzimtica de pulpas ASA (P-1, P-2, P-3 Y P-4) obtenidas despus de refinamiento en disco a diferentes consumos de energa (570, 1705 y 3635 Wh/kg). La carga enzimtica por gramo de pulpa fue de 8,8 FPU de Celluclast y 40 UI de beta-glucosidasa, 10% de consistencia de pulpa. Las barras de error representan la variacin de 3 rplicas de hidrlisis. Cuando no son visibles, las barras de errores son ms pequeas que el tamao de los smbolos.

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Para la pulpa P-1 slo el refinamiento a 3635 Wh/kg fue capaz de producir un material fibrilado adecuado para hidrlisis enzimtica y tambin en este caso una baja conversin de glucanos a glucosa fue obtenido (30% despus de 72 h) probablemente debido al alto contenido de lignina residual. Las pulpas P-2 y P-3 las cuales presentaban una remocin similar de lignina (35-37%), la mxima conversin de glucosa fue obtenida despus de 72 h de hidrlisis enzimtica y fue en el intervalo de 50-60% para las pulpas refinadas a 1705 Wh/kg y 3635 Wh/kg. Una alta conversin fue obtenida con la pulpa P-4 refinada a 1705 Wh/kg y despus de 72 h de hidrlisis (70% de conversin de glucano a glucosa) sugiriendo que el grado de fibrilacin alcanzado a este consumo de energa, adems de la remocin de lignina del 50% durante el pretratamiento ASA fueron condiciones adecuadas para realizar futuros ensayos de fermentacin. El efecto de la remocin de lignina durante el pretratamiento ASA asociado con los diferentes consumos de energa para la fibrilacin

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la

hidrlisis

enzimtica

de

las

pulpas

se

muestra

en

la

Figura

3.3.

80 70

P-4

P-2
60 50 40 30

P-3

P-1
570 Wh/kg 1705 Wh/kg 3635 Wh/kg

) % ( a c u l g i s r e v n o C

20 10 20 30 40 50

60

Remocin de lignina despus de coccin ASA (%)

Figura 3.3. Efecto de la remocin de lignina despus de la coccin ASA en la hidrlisis enzimtica de pulpas de P. radiata producidas a diferentes consumos de energa en refinamiento en disco. La carga de enzima por gramo de pulpa fue de 8,8 FPU de Celluclast y 40 UI de -glucosidasa; 10% de consistencia de pulpa.

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Existe una correlacin directa entre el grado de delignificacin con la sacarificacin enzimtica de las pulpas, la cual es ms importante que la fibrilacin obtenida durante el refinamiento en disco. Cuando la remocin de lignina es mayor al 50%, la lignina residual no es un obstculo significativo para el ataque enzimtico, por lo tanto el contenido de lignina es el principal obstculo en limitar la hidrlisis completa de los carbohidratos en la biomasa (Zhu et al., 2008). Recientemente, estudios en la delignificacin selectiva (entre 41-63%) de las regiones internodos de la corteza y la mdula de la caa de azcar con clorito de sodio/cido actico acuoso demostraron tambin un aumento de la sacarificacin de celulosa por celulasas comerciales (Siqueira et al., 2011). Probablemente la lignina en la pulpa P-4 tiene un alto grado de sulfonacin, haciendo la lignina ms hidroflica y disminuyendo los enlaces de la lignina con la parte hidrofbica de las enzimas.

Adicionalmente, la remocin de hemicelulosas (ms de 50%) tambin incrementa la accesibilidad de las celulasas a la celulosa, permitiendo una alta conversin durante la sacarificacin (hgren et al., 2007; Zhu et al., 2008; Zhu et al., 2009). Incrementando el grado de refinamiento para la pulpa P-4 (70 mL de CSF a 3635 Wh/kg) no se obtiene un efecto en el aumento de la conversin en la hidrlisis enzimtica. Durante el refinamiento las dimensiones de las fibras son reducidas, la pared celular es parcial o completamente colapsada y, con altos consumos de energa, se produce una alta cantidad de finos en la pulpa y la lignina de la lamela media se encuentra ms expuesta que en otras fracciones de fibra, lo cual puede incrementar los enlaces improductivos de las enzimas y disminuir la conversin de azcares (Konn et al., 2007). El ensayo de hidrlisis enzimtica con
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incremento de la cantidad de Celluclast (20 FPU/g de pulpa) y 40 UI de -glucosidasa result en un ligero incremento en la conversin de glucano a glucosa de 75,5% despus de 72 h.

3.4.3 SHF Y SSF Considerando los resultados obtenidos, la pulpa P-4 fue usada como substrato en ensayos de SHF y de SSF para la produccin de bioetanol. En SHF la pulpa fue hidrolizada en las condiciones ptimas para las enzimas (45C) por un perodo de 24 (Figura A.6, Anexo III) a 72 h y el caldo de azcar obtenido fue separado de los residuos de fibra y fermentado por S. cerevisiae a 30C. La concentracin inicial de glucosa fue de 40-44 g/L dependiendo de las condiciones de hidrlisis y despus de 24 h de fermentacin la concentracin de etanol alcanz valores de 18-20 g/L (Figura 3.4).

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45 40 35 30 25 20 15 10 5
s u l g d i a r t e c n o C ) L / g (

0 0 12 24 36 48 60 72 Tiempo de fermentacin (h)

Figura 3.4. Etanol (cuadrados y crculos negros rellenos) y glucosa residual (cuadrados y crculos blancos rellenos) durante la fermentacin (SHF) del hidrolizado de pulpa ASA P-4 (750 Wh de energa de refinamiento). Condiciones de hidrlisis enzimtica: 20 FPU/ g Celluclast, 40 UI/ g -glucosidasa, 24 h de incubacin a 45C (crculos blancos y negros) y 72 h de incubacin bajo las mismas condiciones de hidrlisis descritas (cuadrados rellenos blancos y negros); 10% de consistencia de pulpa en todos los casos.

La glucosa fue metabolizada completamente por S. cerevisiae en 24 h de fermentacin. La conversin de glucosa a etanol obtenida en estas condiciones fue de aproximadamente 90% y la baja concentracin de etanol es slo debido a la baja consistencia de pulpa utilizada (10%). La cantidad mxima de etanol que puede producirse de P. radiata es de aproximadamente 320 L/ton de madera. El rendimiento de etanol obtenido con la pulpa P4 fue de 260 L/ton de madera, correspondiendo a un rendimiento del 80% del valor terico. La diferencia en las cantidades se debe a la conversin incompleta de glucanos en

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la hidrlisis enzimtica y la pequea cantidad de glucosa utilizada por la levadura para su mantenimiento y crecimiento.

En el proceso SSF la pulpa primero fue pre hidrolizada con las enzimas por distintos periodos de tiempo a 45C seguido de la adicin de la levadura y los nutrientes (en el mismo matraz), y la temperatura de fermentacin fue disminuida a 30C (Figura A.7, Anexo III). La combinacin de cargas de enzimas y tiempos de pre hidrlisis fueron evaluados, incluyendo un ensayo con la adicin en el medio de una mananasa (Megazyme), con el objetivo de verificar si se puede obtener algn incremento en el rendimiento de etanol por la liberacin de alguna glucosa de los glucomananos residuales en pulpa. El resultado demuestra que de acuerdo a las diferentes condiciones usadas, la produccin de etanol vara de 15 a 22 g/L (Tabla 3.3). La adicin de mananasas no parece tener un impacto significativo en el aumento de la produccin de etanol, ya que los resultados obtenidos en el ensayo P-4E fueron similares a los obtenidos en el ensayo P-4A. Tiempos ms largos de hidrlisis fueron ms importantes y favorecieron ms el proceso de fermentacin. Por otra parte, el descenso en la temperatura durante la fermentacin probablemente reduce la actividad de las enzimas y slo los azcares liberados durante la pre hidrlisis fueron fermentados. Los resultados obtenidos en ambos procesos SHF y SSF fueron similares con una conversin de glucanos presentes en la pulpa a etanol sobre el 90%. Los rendimientos de etanol en este trabajo fueron muy similares a los reportados con el proceso SPORL de 270 L/ton de madera en SSF con 10% de slidos. Los resultados son
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ms altos que los obtenidos en hidrlisis y fermentacin por separados de rastrojo de maz pretratado con expansin de fibra con amonio (AFEX), y fermentacin con S. cerevisiae 424A (LNH-ST) en la cual se obtuvo un rendimiento de 242 L/ton de biomasa (Lau et al., 2009).

Tabla 3.3. Etanol producido en SSF de pulpas ASA de P. radiata (P-4 refinado a 1705 Wh/kg) despus de pre hidrlisis con diferentes tiempos y cargas enzimticas.
Muestra* Celluclast (FPU/g pulpa) 8,8 20 20 20 20 -glucosidasa (IU/g pulpa) 40 40 40 40 40 Mananasa (IU/g pulpa) --------20 Tiempo pre-hidrlisis (h) 72 24 48 72 72 Etanol-24h fermentacin (g/L) 21,5 0,6 15,5 0,9 18 1 20,7 0,4 22,0 0,1

P-4A P-4B P-4C P-4D P-4E

*Consistencia de pulpa de 10% en todos los casos. + representa el error de los triplicados.

3.4.4 Fermentacin de pulpa de Pinus caribaea proveniente del proceso ASA/refinamiento en disco P. caribaea es una especie de pino que crece en las reas tropicales y puede tolerar periodos de sequa de hasta 6 meses, temperaturas de 20 a 27C y precipitaciones de 1000 a 1800 mm (Barret et al., 1962). Esta madera blanda puede ser una potencial materia prima para biocombustibles en zonas tropicales como Amrica Central, por ejemplo. Las muestras de madera fueron obtenidas de plantaciones de 25 aos de edad localizadas en
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Panam. La composicin qumica de la madera present una cantidad relativamente baja de celulosa y hemicelulosa (34% y 13%, respectivamente), 26% de lignina y una cantidad muy alta de extractivos solubles en etanol (22%), comparado con la madera de P. radiata de 11 aos como se muestra en la Tabla 3.2. Valores similares de lignina y extractivos (26,3% y 23,6%, respectivamente) en P. caribaea fueron reportados previamente (Brito et al., 2008). La coccin ASA y el refinamiento en disco fueron realizados bajo las mismas condiciones de la pulpa P-4 (Tabla 3.1), que fueron las que presentaron una pulpa ptima para la fermentacin. Una delignificacin de slo 14% fue alcanzada despus de la coccin y un valor de freeness de 730 mL despus del refinamiento a 1705 Wh/kg. La pulpa (P-5) present un bajo contenido de glucanos (28%, en base madera). Despus de 72 h de hidrlisis enzimtica (20 FPU de Celluclast/g de pulpa y 40 UI -glucosidasa/g pulpa) a un 10% de consistencia, la conversin de glucano a glucosa fue de 72%. SSF de pulpa P-5 realizada despus de 72 h de pre hidrlisis result en un rendimiento de etanol de 16 g/L (aproximadamente 140 L/ton de madera). Los resultados de produccin de etanol estn directamente relacionados con la baja cantidad de celulosa presente en la madera de P. caribaea la cual hace la especie (por lo menos a esta edad) poco factible de ser utilizada como materia prima para la produccin de bioetanol en comparacin con P. radiata.

3.5 Conclusiones El pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona de astillas de madera de P. radiata seguido de un proceso de refinamiento en refinador de discos demostr ser un
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pretratamiento efectivo que puede reducir el contenido de lignina en madera hasta en un 50% con baja perdida de glucanos en una pulpa de alto rendimiento (sobre 70%). De acuerdo al grado de fibrilacin, las pulpas ASA fueron sacarificadas por celulasas hasta en 70% y durante el proceso SHF y SSF la conversin de glucano a bioetanol fue sobre 90% indicando que el substrato fue fcilmente convertido en bioetanol cuando se utiliz una consistencia del 10%. Las astillas de madera de P. caribaea pretratadas con condiciones similares a la mejor pulpa de P. radiata tambin present buen rendimiento durante la sacarificacin y fermentacin. Sin embargo, la alta cantidad de extractivos y la baja cantidad de celulosa en la madera gener un bajo rendimiento de etanol comparado con los obtenidos para pulpas de P. radiata, haciendo esta especie, al menos para plantaciones de edad elevada, no apta como materia prima para la produccin de bioetanol por el proceso ASA/refinamiento en disco. Esfuerzos pueden ser realizados para incrementar la consistencia del substrato en procesos SHF o SSF con el objetivo de incrementar la concentracin de etanol sobre 50 g/L la cual es adecuada para su recuperacin por destilacin u otras tcnicas.

Agradecimientos H. Franco agradece al Programa Nacional de Investigadores 2005-2010 de SENACYTIFARHU Panam por una beca de PhD y al proyecto MECESUP2-UCO0702. Soporte financiero de FONDECYT (proyecto 1070492) tambin es agradecido.

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CAPTULO IV: DISCUSIN GENERAL

Este trabajo de investigacin tuvo como objetivo la evaluacin del proceso de produccin de bioetanol a partir de dos especies de madera blanda P. radiata y P. caribaea. En el captulo II se evaluaron las condiciones de pretratamiento con cido sulfrico diluido de astillas de P. radiata y la utilizacin de S. carevisiae encapsulada en alginato de calcio para el proceso de sacarificacin y fermentacin simultnea de la fraccin slida y lquida del pretratamiento. Se evalu adems el pretratamiento con cido diluido de P. caribaea, pero debido a la alta concentracin de extractivos en la madera (22%), el pretratamiento result inviable para esta especie, porque con el pretratamiento slo se lograba la remocin de extrables, quedando las astillas cubiertas de estas sustancias y conservando adems su apariencia fsica y rigidez. En el captulo III se evalo el pretratamiento de astillas de P. radiata y P. caribaea con sulfito alcalino/antraquinona y el refinamiento en disco del residuo slido y su posterior sacarificacin y fermentacin mediante los procesos SHF y SSF en los cuales se utiliz una cepa de S. cereviae comercial. En la Tabla 4.1 se resumen los resultados ms relevantes del proceso de produccin de etanol utlizando medio sinttico de fermentacin (glucosa) y proceso SSF de madera de P. radiata pretratada con cido diludo, utilizando S. cerevisiae IR2-9 inmovilizada en alginato de calcio. Una de las dificultades encontradas en el proceso fue la preparacin de S. cerevisiae para ser encapsulada en la membrana de alginato de calcio. El paso crtico en la preparacin de la levadura, se present en el proceso de liofilizacin, en el cual la levadura precultivada fue congelada y posteriormente liofilizada para extraer el agua. Este proceso de liofilizacin se utiliz porque el encapsulamiento de las levaduras utilizando biomasa de S. cerevisiae hmeda, presenta cpsulas de un tamao y forma heterognea y tampoco permite conocer en forma directa mediante pesada, cul es la biomasa exacta de levadura que estbamos utilizando para encapsular. El perodo de congelamiento al que fue sometida la levadura fue de aproximadamente 12 h y el de liofilizacin de 18 h. El congelamiento prolongado del microorganismo causa la muerte por colapso de las clulas de levadura. Esta limitante tcnica es solucionable ya que existen en la industria que utiliza clulas inmovilizadas, liofilizadores con control para realizar la etapa de congelamiento en pocos segundos y por rampas de temperatura, previniendo el colapso de la levadura por choque trmico y perodos prolongados de congelamiento (Bekatorou et al., 2001).
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Tabla 4.1. Produccin de etanol obtenida utilizando S. cerevisiae IR2-9 inmovilizada en alginato de calcio. Muestra Proceso/tiempo Concentracin de etanol (g/L) 14,5 17,3 3,5 5,5 12,2 4,2 Productividad volumtrica (g/L.h) 0,30 0,36 0,07 0,11 0,25 0,058 Rendimiento de etanol (% del max.valor torico) 62,3 74,3 16,0 29,0 65,7 22,0

Medio Fermentacin/ sinttico 48 h b Medio Fermentacin/ sinttico 48 h c Residuo slido SSF/48 h sin molienda d Residuo slido SSF/48 h con molienda e Residuo slido SSF/48 h con molienda f Residuo slido SSF/72 h con molienda a Fermentacin realizada con S. cerevisiae CaCl2.
b

inmovilizada en alginato de calcio con 3.5% de

Fermentacin realizada con S. cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio con 8.0% de

CaCl2.
c

Residuo slido del pretratamiento con cido diluido sin molienda (muestra 6 del diseo

experimental) sometido a SSF con S. cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio con 3,5% de CaCl2 Residuo slido del pretratamiento con cido diluido con molienda (muestra 6 del diseo experimental) sometido a SSF con S. cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio con
d

3,5% de CaCl2 y e8,0% de CaCl2

Residuo slido con molienda sometido a SSF con S. cerevisiae libre.

Diferencias significativas fueron encontradas en relacin a la concentracin de CaCl 2 utilizado para formar las cpsulas de alginato de calcio con levadura. En la Tabla 4.1 se observa que la productividad de etanol (g/L.h) (que relaciona la produccin de etanol con el tiempo de fermentacin), en un medio sinttico de fermentacin que contena 45 g/L de glucosa es superior para S. cerevisiae IR2-9 inmovilizada en la membrana en la que se
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utiliz 8,0% de CaCl2. En trabajos recientes se ha reportado que S. cerevisiae inmovilizada en alginato con concentraciones de 1,5 y 2,0 % de CaCl2 no tienen la suficiente estabilidad y son fcilmente rotas debido al menor entrecruzamiento de las cadenas moleculares que dan una baja densidad a la estructura tridimensional de la red. Se ha reportado una productividad volumtrica de etanol para S. cerevisiae inmovilizada con 3,5% de CaCl2 y alginato de sodio de 3,54 g/L.h y concentracin de etanol de 49,52 g/L, pero a 30C y para concentracin de glucosa de 100 g/L (Inal et al., 2011). En las plantas industriales la productividad de etanol est en el rango de 1-3 g/L.h para S. cerevisiae libre (Hahn-Hgerdal et al, 2007). La productividad volumtrica obtenida en nuestro trabajo puede explicarse en el hecho de que a pesar de que la cepa S. cerevisiae fue adaptada para crecer a una temperatura de 40C, para S. cerevisiae se ha reportado efectos importantes en sus condiciones de crecimiento metablico, respiratorio y fermentable, que produce una disminucin del rendimiento de etanol y acumulacin de glicerol, a temperaturas mayores a 30C (Ferreira et al., 2007). Sin embargo, el rendimiento de etanol en medio sinttico de 74,3 % obtenido con S. cerevisiae IR2-9 inmovilizada con 8,0% de CaCl2 fue similar al obtenido con esta misma levadura libre utilizada en fermentacin de un medio sinttico: 75% (Araque et al., 2008). Para S. cerevisiae libre, utilizada en proceso SSF a 40C de residuos de papel corrugado se ha reportado una productividad volumtrica de etanol de 0.19 g/L.h (Kdar et al, 2004), que es inferior a la productividad volumtrica de etanol (0,25 g/L.h), obtenida en esta investigacin para el proceso SSF del residuo slido molido del pretratamiento con cido diluido de P. radiata, demostrando la efectividad de utilizar levadura inmovilizada en la fermentacin de este residuo lignocelulsico. Una diferencia importante fue encontrada cuando se compara el rendimiento de etanol al utilizar levadura inmovilizada en alginato de calcio, en el proceso SSF del residuo slido molido del pretratamiento de P. radiata con cido sulfrico diluido, con el proceso del mismo material realizado con S. cerevisiae libre. Una posible explicacin es que el encapsulamiento de la levadura ofrece un efecto protector ante la presencia de lignina y algunos compuestos fenlicos derivados de ella que pueden estar presentes en el residuo slido y que inhiben la levadura. El efecto de la inhibicin de S. cerevisiae por lignina y compuestos aromticos derivados durante la hidrlisis con cido ha sido ampliamente investigada (Klinke et al., 2000, Larsson et al., 2000; Tengborg et al, 2001; Klinke et al., 2004). La principal limitante que presenta la utilizacin del pretratamiento de maderas blandas con cido diluido es la poca efectividad en la remocin de lignina y su mayor efecto se produce
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sobre las hemicelulosas, las cuales son removidas del substrato slido en un alto porcentaje (Silverstein et al. 2007), lo cual se confirm en este estudio donde el contenido de lignina residual es de aproximadamente 89% de la contenida originalmente en la madera y la remocin de hemicelulosas alcanz hasta 90%. Es conocido que la lignina y las hemicelulosas actan como barrera para la adsorcin de las enzimas hidrolticas utilizadas en la sacarificacin de materiales lignocelulsicos (hgren et al., 2007; Guo et al., 2009, Lin et al., 2010, Yu et al., 2011). Para superar esta dificultad y mejorar la conversin de azcares y el rendimiento de etanol procesos SSF con residuo slido del pretratamiento con cido diluido de P. radiata, se podra utilizar surfactantes que faciliten la eliminacin de las interacciones improductivas entre las enzimas y la lignina y que adems no tengan efecto en la inhibicin de S. cerevisiae. En hidrlisis enzimtica de Avicel (celulosa) sin y con adicin de ciertas cantidades de lignina se ha comprobado una relacin directa y negativa entre la eficiencia en la hidrlisis de la celulosa y el aumento en el contenido de lignina, esa interaccin entre la lignina y las enzimas fue eliminada por la adicin de un surfactante no inico triblock copolmero L64 que se acompleja a la lignina en el hidrolizado enzimtico y no es txico para S. cerevisiae (Wang et al., 2011). En la Tabla 4.2 se muestran los resultados de la produccin de etanol de pulpa ASA refinada de P. radiata (P-4) y P. caribaea (P-5), obtenido en procesos SHF y SSF. El pretratamiento ASA de P. radiata result en un alto rendimiento de pulpa (>70%) y de P. caribaea de 60%, lo cual representa una ventaja porque una gran mayora de azcares es retenida en la pulpa y se logr una disminucin importante del contenido de ambas: lignina y hemicelulosas en pulpa (>50%). Estos resultados demuestran el efecto de la adicin de 0.1% de antraquinona al licor de coccin del pretratamiento, demostrndose su efecto como catalizador de la delignificacin en el pulpaje alcalino y de proteccin de los grupos aldehdos de los carbohidratos antes de que ocurra la relacin de peeling( Ban et al., 2004; Hedjazi et al., 2009). En el proceso de refinamiento se observ que las muestras con mayor contenido de lignina eran ms difciles de refinar, presentando problemas de agregacin de fibras en los discos, a pesar que inicialmente se utiliz una separacin de 0,50 mm entre discos, disminuyndose progresivamente hasta alcanzar 0 mm de separacin en donde realmente se alcanza el refinamiento adecuado del material lignocellosico. Por lo tanto, la optimizacin de las condiciones de pretramiento son importantes para obtener un material blando que pueda ser refinado, homogenizado y generando nueva rea superficial en la pulpa, con consumos de
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energa bajos, ya que es conocido que en los procesos de pulpaje termomecnicos, aproximadamente slo se consume en el proceso de generacin de nueva superficie de pulpa entre 1-30% de la energa total del proceso (Hglund, 2009). Al evaluar las pulpas ASA obtenidas bajo distintas condiciones de coccin, en relacin al consumo de energa utilizado en su refinamiento y la conversin de glucanos a glucosa, se encontr que a un consumo de energa de 1705 Wh/kg, las pulpas presentaron una alta conversin, principalmente la pulpa P-4 (70% de conversin de glucanos a glucosa), en la Figura A.4, Anexo II, se muestra la microscopa electrnica de P-4 en donde se observa una pulpa homognea y desfibrada lo cual facilita la hidrlisis enzimtica. Los rendimientos de etanol para los procesos de SSF y SHF de pulpa ASA P-4 fueron similares (entre 260 y 270 L/ton de madera) al igual que la productividad volumtrica de etanol para ambos procesos, en trminos generales se obtuvo la mayor productividad volumtrica para un tiempo total del proceso (tiempo de hidrlisis enzimtica + fermentacin) de 96 h. El rendimiento de etanol obtenido para la pulpa ASA P4 es muy superior al obtenido del proceso SSF (utilizando S. cerevisiae), de pulpa SPORL de Pinus contorta, obtenida con 8% de bisulfito de sodio (p/p) a una temperatura de coccin de 180 C y 25 min que fue de 167 L/ ton de madera (Zhu et al., 2010b). Por razones de un proceso con menor nmero de etapas es recomendable la utilizacin del proceso de SSF. La etapa que elimina en este proceso, en comparacin con el proceso SHF es la separacin de la glucosa de la fraccin de lignina, evitando una prdida de azcares y disminuyendo el nmero de vasos y costo de inversin al momento de realizar un proceso SSF a mayor escala, dicho capital de inversin para un proceso SSF en comparacin a un proceso SHF ha sido estimado entre 14-20% menos (Wingren et al., 2003; Olofsson et al., 2008). En futuras investigaciones de pretratamiento ASA de maderas blandas, se debe explorar la posibilidad de utilizar reactores y refinadores de discos presurizados que permitan una mejor impregnacin de las astillas por el licor de coccin y de esta forma reducir el tiempo de coccin, obteniendo un material con una mayor remocin de lignina y hemicelulosas, que facilite el proceso de refinamiento, disminuyendo el consumo de energa y obteniendo una mayor conversin de azcares en la hidrlisis enzimtica. A escala industrial el refinamiento en disco se realiza bajo una atmsfera de vapor altamente presurizada y dependiendo del nivel de fibrilacin los consumos de energa para pulpas quimiotermo mecnicas vara entre 1000 a 4300kWh/ ton de madera y para pulpaje mecnico entre 1000 a 2300 kWh/ ton (http://www.fing.uy/iq/maestrias/icp/materiales/2010/10_Environmental/Mechanica1%20Pul ping.pdf).
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En relacin a la hidrlisis enzimtica debe ensayarse el aumento del contenido de slidos, por lo menos hasta 20% para obtener una concentracin de azcares fermentables de al menos 80 g/L, que permitan en el proceso de fermentacin la obtencin de etanol en concentraciones cercanas al 4% que sera la concentracin mnima requerida para un proceso de destilacin costo efectivo (Hoyer et al., 2010; Lu et al., 2010). Para este objetivo se tiene que estudiar las diferencias en la utilizacin de reactores con sistemas de agitacin y estacionarios, que produzcan una buena mezcla, ya que al aumentar el contenido de slidos se aumenta la viscosidad del medio y la mezcla del sistema es fundamental para permitir una buena interaccin entre las enzimas y el substrato (Ojeda et al., 2009). Otro aspecto que puede explorarse es la utilizacin de distintos tipos de hemicelulasas en hidrlisis multienzimtica de P. radiata pretratada con diferentes mtodos de pretratamiento y la optimizacin de las cargas de enzimas, tiempo de hidrlisis, contenido de slidos y la secuencia de adicin de las enzimas, si se utiliza un sistema en donde se prepara un cctel de enzimas o se adiciona en forma escalonada cada enzima para comprobar de que manera es ms eficaz el sistema, por efecto de las distintas afinidades e interacciones que tienen estas con el substrato. Se ha comprobado en distintos materiales lignocelulsicos que la adicin de hemicelulasas al coctel de enzimas que incluye celulasas y beta glucosidasa incrementa los rendimientos de azcares en hidrlisis enzimtica (Berlin et al., 2007; Zhang et al., 2010; Gao et al., 2011). Con esta investigacin se logr la obtencin de un rendimiento aceptable de etanol a partir del pretratamiento con cido sulfrico diluido y molienda a partir de astillas de P. radiata, mientras que mediante el pretratamiento ASA con refinamiento en disco, se obtuvo un alto rendimiento de etanol y de productividad volumtrica lo que hace de este proceso una opcin viable a ser explorada a una escala mayor. En relacin a las dos especies de pino utilizados, existen diferencias significativas en la composicin qumica del P. radiata (especie de climas templados) y P. caribaea (especie de climas tropicales), en el caso de esta ltima especie el alto contenido de extractivos y la menor cantidad de glucanos, afectan la aplicacin de pretratamientos como el cido diluido y afectan el rendimiento de pulpa en el caso del ASA y el rendimiento final de etanol.

Tabla 4.2. Produccin de etanol obtenida en procesos SSF y SHF de P. radiata y P. caribaea pretratada con ASA/ refinamiento en disco con S. cerevisiae comercial.
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Muestra

Proceso/tiempo

Concentracin de etanol (g/L) 18,2 19,8 19,6 16,5 20,7 21,5 16.0

Productividad volumtrica de etanol (g/L.h) 0,76 0,83 0,82 0,69 0,86 0,89 0.67

P-4 a P-4b P-4c *P-4d P-4f *P-4g P-5

SHF/ (24 h H.E. + 24 h F.) SHF/ (48 h H.E. + 24 F.) SHF/(72 h H.E. + 24 h F.) SHF/ (72 h H.E. + 24 h F.) SSF/(72 h H.E. + 24 h F.) SSF/(72 h H.E. + 24 h F.) SSF (72 H.E. + 24 h F.)

Rendimiento de etanol (del mximo valor terico)^ 72,0 78,3 77,5 65,0 82,0 85,0 77,8

Todos los proceso SHF Y SSF fueron realizados a una carga de slidos del 10%. P-4 (a,b,c, f) y P-5: procesos SHF y SSF realizados con una carga de Celluclast de 20 FPU/g de pulpa en base seca y 40 UI de -glucosidasa/g de pulpa en base seca. *P-4 (d y g): proceos SHF y SSF realizados con una carga de Celluclast de 8.8 FPU/g de pulpa en base seca y 40 UI de -glucosidasa/g de pulpa en base seca.
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CAPTULO V: CONCLUSIONES

La inmovilizacin de S. cerevisiae IR2-9a en alginato de calcio permiti la obtencin de un rendimiento de 65% de etanol en un proceso SSF del residuo slido del pretratamiento con H2SO4 diluido, en comparacin con slo 22% de rendimiento de etanol al utilizar clulas libres.

En la sacarificacin y fermentacin simultnea del residuo slido y del hidrolizado de la mejor condicin de pretratamiento con sulfito cido, se obtuvo una produccin total de etanol de 171 L/ton.

El pretratamiento con sulfito alcalino/antraquinona permite la obtencin de una pulpa con alto contendio de glucano (> 90% del contenido en base madera) y una reduccin significativa de lignina y hemicelulosas (>50%).

Los rendimientos de etanol para los procesos de SHF y SSF de pulpa ASA de P. radiata refinada en refinador de disco fueron muy similares comprendiendo una alta produccin de etanol comprendida entre 215 a 272 L/ton de madera. Para pulpa ASA refinada de P. caribaea la mxima produccin de etanol fue de 137 L/ ton de madera, debido al bajo contenido de glucanos y alto contenido de extrables en la madera.

El pretratamiento al sulfito alcalino/antraquinona es un mtodo ms eficaz en la remocin de lignina y hemicelulosas de astillas de P. radiata que el pretratamiento con sulfito cido, permitiendo una mejor sacarificacin en la hidrlisis enzimtica.

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ANEXO I Equipo utilizado en el refinamiento de astillas de madera de P. radiata y P. caribaea pretratadas con ASA.

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Figura A.1. Licuadora industrial de 10 L de capacidad utilizada para desfibrar las astillas de P. radiata pretratadas con ASA y posteriormente refinar en refinador de disco.

Figura A.2. Refinador de disco Bauer MD-3000 (REGMED, Brasil) utilizado en el refinamiento de astillas de Pinus spp. pretratadas con ASA a consumos de energa de 250, 750 y 1600 Wh.
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ANEXO II Estado fsico de las muestras pretratadas con cido diluido y ASA

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Figura A.3. Astillas de P. radita pretratadas con cido sulfrico diluido a 170C por 30 min y molidas.

Figura A.4. Microscopa electrnica de barrido (SEM) de pulpa ASA de P. radiata (P-4) refinada en refinador de disco a un consumo de energa de 750 Wh. Fotografa tomada en equipo INSTRUMENT JSM-6380, magnificacin 80X.

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ANEXO III Proceso de hidrlisis enzimtica y fermentacin

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Figura A.5. Fermentacin de medio sinttico (50 g/L de glucosa) utilizando levaduras inmovilizadas en membrana de alginato de calcio.

Figura A.6. Hidrlisis enzimtica (24 h) de pulpa ASA P-4 refinada a 750 Wh en reactor de 1 L con carga de Celluclast de 20 FPU/ g de pulpa y 40 UI de glucosidasa.

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Figura A.7. Procesos de fermentacin del hidrolizado obtenido de pulpa ASA (P-4) de P. radiata en hidrlisis enzimtica por 24, 48 y 72 h en reactor de 1.0 L y proceso SSF de pulpa ASA (P-4). La fermentacin se realiz en un bao con agua a 30C y sin agitacin.

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