Reglas Generales del Uso del HPLC Teniendo como objetivo establecer los lineamientos para el uso adecuado

del equipo de HPLC es necesario comunicarles ciertas normas para su utilizacin. 1. La computadora de registro de datos y control del HPLC se ha contaminado continuamente con virus, lo que ocasiona que no se pueda usar el software. Para evitar que esto vuelva a suceder, sta computadora estar desconectada de la red. 3. La persona autorizada para cambiar columnas y operacin en general del HPLC es el responsable del equipo. 2. Les recuerdo que todas las muestras que se vayan a inyectar al HPLC deben ser seleccionadas, es decir estar completamente seguros de la necesidad de analizar las mismas. Inyectar una muestra en el HPLC es muy caro, implica desgaste del equipo, solventes, gasto de helio, viales, etc. 3. Los fines de semana y vacaciones son desde ahora "descanso obligatorio" del HPLC, no as de la computadora que puede ser usada para fines de anlisis de datos de las muestras inyectadas. Cuando su uso sea estrictamente necesario en estos das, se puede usar bajo la supervisin de un acadmico y el experimento debe estar autorizado por el Dr. Agustn Lpez. .4. Cuando terminen de trabajar con el HPLC es obligatorio retirar la fase mvil sobrante, dejar sin viales el inyector automtico y retirar cualquier material que hayan usado durante su jornada en esa rea. 5. El clculo de la fase mvil a usar es primordial para el uso eficiente de los solventes. Los turnos de noche solamente son permitidos en casos de urgencia y con mtodos completamente probados o supervisados por el responsable del equipo. 6. Solo para recordarles, queda estrictamente prohibido comer en el cubculo destinado al HPLC

Uso del equipo y software Tenemos un pizarrn en donde deben anotarse los usuarios para planear el uso de los equipos. Deben anotar en la fecha que desean usarlo, el nombre del usuario y mdulos a utilizar y ponerse de acuerdo con el responsable para el tipo de columna y condiciones de la misma dependiendo de las muestras a analizar. La idea general es tener el quipo funcionando como dos mdulos independientes y en consecuencia abrir la posibilidad de que dos usuarios ocupen el sistema de manera simultanea. En el caso del uso simultaneo por dos usuarios del HPLC el tutor y el responsable del equipo decidirn cual es la configuracin mas adecuada. Contamos con 3 detectores. ndice de refraccin (IR410) Arreglo de Diodos (996) ELSD (evaporative light scattering detector). Tenemos tambin 2 inyectores, uno manual y otro automtico. Una bomba 510 para uso isocrtico y un controlador 600E con 4 lneas de solventes y 4 lneas para helio para programar gradientes. Para utilizar el HPLC es necesario contar con un Proyecto creado en el software de adquisicin de datos. El software se llama Millenium y solamente el responsable del equipo puede crear proyectos. Los datos son guardados en una base de datos Oracle y cada proyecto es independiente, de esta forma es imposible que los datos de un proyecto se confundan con los de otro proyecto. Por esto, es necesario seleccionar primero su proyecto en el men principal del software y despus seleccionar en la ventana run samples el detector que se va a utilizar. Los usuarios deben preparar su fase mvil, muestras y estar vigilando los cromatogramas de las muestras que estn inyectando. La fase mvil debe estar contenida en los recipientes que tenemos para uso exclusivo debidamente etiquetados. Los datos que debe contener son: tipo de solvente, concentracin, nombre del usuario y fecha de elaboracin. El uso del Inyector Automtico estar dedicado siempre a mtodos establecidos completamente probados. Esto no implica dejar de supervisar las muestras para tener la posibilidad de detener el anlisis si algo extrao sucede.

La fase mvil debe ser filtrada con membrana 0.22 m y degasada con helio a 100 ml/min durante 10 min. y despus a 15 ml/min. en forma constante. Estos parmetros de degasado se fijan en el mtodo de instrumento creado en cada proyecto de cada usuario. Para utilizar cualquiera de los mdulos es necesario tener un mtodo de instrumento que hay que revisar antes de dar clic en la pestaa setup o enviar la seal de inyeccin al sistema. Al dar setup o enviar la seal de inyeccin al sistema, la computadora toma el control de los mdulos y establece las condiciones programadas en el mtodo de instrumento. La lnea de solvente donde est la fase mvil debe ser la misma que est programada en el mtodo de instrumento, de otra manera el sistema podra empezar a tomar fase de otra lnea y meter aire al sistema u algn solvente diferente al deseado, lo que puede ocasionar, desde desequilibrar la columna, hasta daarla irreversiblemente. Todas las columnas para HPLC son muy delicadas y tienen condiciones muy particulares de operacin, flujo, temperatura, solventes compatibles, etc. La preparacin de muestras es una parte primordial el anlisis de las mismas. Es necesario centrifugarlas o filtrarlas para eliminar cualquier slido en suspensin, as como diluirlas en caso necesario para evitar altas concentraciones y saturar la columna. La dilucin debe ser de preferencia en la fase mvil a usar en el sistema. Al abrir el tanque de helio, deben asegurarse que el manmetro debe estar cerrado (sin presin) para dar presin al sistema, esto para evitar que la presin que existe en el tanque llegue directamente a los sensores del mdulo 600E y stos puedan daarse. Al terminar de usar el HPLC deben cerrar la llave del tanque para evitar que ste contine gastndose. Antes de inyectar cualquier muestra desconocida deben inyectarse los estndares. Primero, para estar seguros que la columna est lista, equilibrada y en condiciones normales de uso; segundo, para correr diferentes puntos con el fin de hacer una curva de calibracin y cuantificar los productos de inters. Para utilizar el inyector manual tenemos jeringas marca Hamilton de diferentes volmenes. Es importante verificar el volumen del loop que esta conectado en el inyector para saber cual es el volumen mximo de inyeccin al sistema. Tenemos loops de 20, 50 y 100 L. Para inyecciones preparativas con fines de purificacin de grandes cantidades de algn producto de inters tenemos 1 loop de 2 ml. Todas las columnas tienen precolumna. La precolumna es una columna pequea que est empacada con la misma fase estacionaria que la columna. Tiene como funcin proteger la

columna de compuestos que se quedan adheridos permanentemente a la fase y tambin funciona como prefiltro. Finalmente, despus de leer este documento y haber estado en un proceso de entrenamiento del uso del HPLC, se aplicar un examen terico-prctico para determinar si el usuario est capacitado para usar de manera independiente el equipo.

Columnas En el laboratorio contamos generalmente con columnas Amino Waters para anlisis de carbohidratos, principalmente fructosa, glucosa y sacarosa. Amino Alltech (Prevail) para anlisis de carbohidratos que incluyen oligosacridos. Amino Supelco (Kromasil), para anlisis de carbohidratos. Columnas fase reversa: C18, C8 y C18 preparativa Amino preparativa Permeacin en gel para determinar peso molecular de polmeros. Aminex para determinacin de cidos orgnicos. Columnas quirales para separar enantimeros de tipo alcohol y amina. Es preciso tener en cuenta que el manejo apropiado del HPLC es en beneficio directo de nuestros proyectos, por lo cual el conjunto de estos lineamientos deber ser observado de manera estricta. Cualquier situacin particular no incluida en este documento deber ser consultada con el responsable del equipo para encontrar la solucin adecuada.