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INFORME TCNICO Fermentacin malolctica (FML) Edita FUNDACIN PARA LA CULTURA DEL VINO Plaza del Per, 1.- Esc. Izda. 1A Tel.: 91 343 07 08 - Fax: 91 343 07 09 fundacion@culturadelvino.org www.culturadelvino.org Presidente: Magn Ravents Vicepresidente: Guillermo de Aranzbal Gerente: Emilio Castro Medina Todos los derechos reservados: Fundacin para la Cultura del Vino Traduccin: Teresa Sans Morales Diseo: Unaluna Publicidad Madrid 2006

Fermentacin

Malolctica

ndice

7 31 53
53 55 59 69 77 7 9 19 23 31 33 41 47

I. Introduccin a la fermentacin malolctica (FML): las bacteria lcticas y su mecanismo. 1. Historia de la bacteria malolctica en el vino 2. La prctica de la fermentacin malolctica 3. Bacterias lcticas y fermentacin malolctica II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica 1. Necesidades nutricionales 2. Factores medioambientales 3. Gua para resolver problemas -aplicacin prcticaIII. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica 1. Estudios sobre la prdida de color 2. Percepcin del consumidor de defectos organolpticos del vino por una fermentacin malolctica sin control 3. Efectos de los contaminantes microbiolgicos inducidos por la fermentacin malolctica descontrolada en el vino 4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica 1. Los tipos de vino y el momento ptimo para la inoculacin. Cmo controlar el proceso. 2. Fermentacin malolctica en barrica. 3. Fermentacin malolctica: cundo y cmo V. La Microoxigenacin 1. Microoxigenacin y fermentacin malolctica

85 125
85 87 97 117 125 127

I. Introduccin a la fermentacin malolctica (FML): las bacterias lcticas y su mecanismo.


ndice

9 19 23
19 23

I.1. Historia de la bacteria malolctica en el vino


Sybille Krieger Lallemand

I.2. La prctica de la fermentacin malolctica


Didier Theodore Lallemand

I.3. Bacterias lcticas y fermentacin malolctica


Aline Lonvaud-Funel Faculte denologie. Universite Victor Segalen Bordeaux 2

I.1. Historia de la bacteria malolctica en el vino

Dra. Sibylle KRIEGER


Lallemand
1.1 Taxonoma de las bacterias lcticas del vino 1.2 Ecologa y desarrollo de las bacterias lcticas 1.3 Factores que influyen en la supervivencia y desarrollo de las bacterias lcticas en el vino 1.4 Influencia de la fermentacin malolctica en la composicin del vino 1.5 Alteracin del vino por las bacterias lcticas 1.6 Control de la fermentacin malolctica

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica

I.1. Historia de la bacteria malolctica en el vino

n 1837, en su libro titulado A Short Education on Suitable Treatments of Vinificated Juices, 1 Freiherr von Babo describi el fenmeno de una segunda fermentacin en los vinos jvenes, que comenzaba con un incremento de las temperaturas al final de la primavera (normalmente cuando florecan las vias). Esta segunda fermentacin liberaba CO2 y originaba una turbidez renovada en los vinos nuevos. Von Babo relacion esta actividad con la fusin de la grasa de la fermentacin alcohlica. Recomend un trasiego inmediato a una barrica nueva, con adicin de SO2, clarificacin y reduccin de la temperatura, seguido de un segundo trasiego y estabilizacin con otra adicin de SO2.

Durante los estudios sobre las alteraciones del vino que llev a cabo en 1866, Louis Pasteur aisl las primeras bacterias del vino e inici sus tudes sur le vin2. Tambin se le puede atribuir la autora de la opinin general de que todas las bacterias presentes en el vino son organismos perjudiciales. La reduccin de cidos observada en el vino se segua relacionando con la precipitacin del cido trtrico, aunque en 1891, Hermann Mller-Thurgau3 ya haba postulado que la reduccin de cidos poda ser resultante de la actividad bacteriana. Koch4 y Seiffert5 confirmaron su teora en 1898 y 1901 respectivamente. En 1913, con su histrica investigacin sobre la bacteria del cido lctico (bacterias lcticas) en el vino6, Mller-Thurgau y Osterwalder, explicaron la degradacin bacteriana del cido mlico en cido lctico y CO2 mediante la frmula:

C4H6O5 = C3H6O3 + CO2


Bautizaron el fenmeno con el nombre de desacidificacin biolgica o fermentacin malolctica, y atribuyeron la responsabilidad del mismo a la Bacterium gracile. En la dcada de 1950, la aplicacin de nuevos mtodos enzimticos ayud a explicar las reacciones enzimticas que se producen durante la degradacin del cido mlico7. La aplicacin de mtodos analticos ms perfeccionados por Radler8, Peynaud9, Beelman10 y Kunkee11 permiti comprender mejor las complejas demandas de nutrientes de las bacterias lcticas del vino, pues la degradacin de cido mlico por s sola slo proporciona una ventaja energtica menor a las cepas bacterianas12.

I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

1.1 Taxonoma de las bacterias lcticas del vino


Desde estos primeros hallazgos, la investigacin sobre las bacterias lcticas ha mejorado. Se ha revisado el nombre de Bacterium gracile, que hace tiempo se utilizaba a menudo como nombre del organismo que causaba la fermentacin malolctica. Los resultados alcanzados por Vaughn13 y Radler8 han demostrado que las bacterias lcticas presentes en el mosto de uva y en el vino pertenecen al gnero de Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y, ms recientemente, Oenococcus14. Muchas bacterias lcticas distintas pasaban al mosto y al vino desde la superficie de las bayas, los vstagos, las hojas, el suelo y el material de bodega. No obstante, debido al medio sumamente selectivo que constituyen los diversos mostos y vinos, slo unos pocos tipos de bacterias lcticas son capaces de desarrollarse en el vino15, 16, 17. La descripcin general siguiente es vlida para todas las bacterias lcticas del vino: Gram-positiva; No mvil y no esporulada; Anaerobios facultativos; Metabolismo quimioorganotrfico - Necesitan un medio rico y azcares fermentables; Temperatura ptima para su desarrollo comprendida entre 20 y 30C.

Adems de sus formas coccideas (redondas) o cilndricas, el metabolismo homo o heterofermentativo del azcar constituye un criterio decisivo para su clasificacin. Las bacterias homofermentativas producen cido lctico a partir de la glucosa y/o fructosa. Las bacterias lcticas heterofermentativas producen dixido de carbono, etanol y cido actico, as como cido lctico, a partir de los mismos hidratos de carbono. Los lactobacilos pueden poseer ambos tipos de metabolismo de los hidratos de carbono, y se dividen en tres grupos: Grupo 1: Homofermentativos estrictos Este grupo nunca se ha detectado en el vino. Grupo 2: Heterofermentativos facultativos Una molcula de glucosa se convierte en dos molculas de cido lctico. Las pentosas fermentan en cido lctico y cido actico. Grupo 3: Heterofermentativos estrictos Fermentan la glucosa en cido lctico, cido actico, etanol y CO2. Las pentosas fermentan en cido actico y cido lctico. En la tabla siguiente se resume el metabolismo de los hidratos de carbono de las bacterias lcticas corrientes en el mosto y el vino.

Tabla 1.
Metabolismo de hidratos de carbono de las bacterias lcticas
Grupo Fermentacin Azucar Heterofermentativa facultativa Grupo 2 Lactobacilli (clulas forma ovalada) Heterofermentativa estricta Grupo 3 Especies

Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum

Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii

Homofermentativa Cocci (clulas redondas) Heterofermentativa

Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus

Leuconostoc oenos Oenococcus oeni)

Esta clasificacin est sujeta a modificaciones debido a los progresos de la identificacin de nuevos aislamientos bacterianos a partir del vino, as como a los avances de las tcnicas de biologa molecular utilizadas para identificar los aislamientos. Por ejemplo, en 1995 Dicks et al.14 han demostrado que la Leuconostoc oenos se diferenciaba de otra especie de Leuconostoc no slo por su crecimiento en medios cidos, su necesidad de un factor de crecimiento de zumo de tomate y su esquema de fermentacin de los hidratos de carbono, sino tambin por la
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hibridacin ADN/ADN y por los anlisis digitales de los esquemas protenicos celulares solubles. Los estudios filogenticos, en especial los que incluyen secuencias 16S y 23S ARNr, han permitido identificar un sublinaje diferenciado, Leuconostoc oenos, que es independiente y distinto de otras especies de Leuconostoc as como de otras bacterias lcticas en general. Este sublinaje es genotpicamente homogneo y constituye un grupo diferenciado de Leuconostoc oenos. Por consiguiente, se le ha asignado un nuevo gnero llamado Oenococcus oeni.

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esta fase figuran Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, y, en menor medida, Leuconostoc oenos [Oenococus oeni] y Pediococcus cerevisiae. Por lo general, estas especies no se multiplican, y desaparecen durante la fermentacin alcohlica, aunque en contadas ocasiones (alto pH los vinos) se puede producir una ligera proliferacin de algunas especies indeseables en su mayora. La sensibilidad al etanol puede explicar este declive de la viabilidad celular. Despus de un intervalo de estancamiento, cuya duracin depende en buena medida de las propiedades del vino, las clulas supervivientes empiezan a multiplicarse y, una vez que han alcanzado la biomasa crtica, se inicia la degradacin del cido mlico. La supervivencia de las bacterias malolcticas despus de terminar la FML depende en buena medida de las condiciones del vino y del tratamiento aplicado al mismo. El aporte de dixido de azufre induce una prdida progresiva de viabilidad de estas bacterias, aunque tambin es muy importante el pH del vino. Con un pH bajo, las bacterias lcticas del vino mueren progresivamente, mientras que con un pH superior a 3.5, la poblacin de bacterias lcticas puede seguir aumentando. No slo la Oenococcus oeni, sino tambin bacterias perjudiciales para el vino, como Pediococcus y Lactobacillus se pueden multiplicar hasta alcanzar concentraciones de nada menos que de 106 a 108 CFU/mL, y por ende, deteriorar el vino. As pues, en condiciones de pH elevado, se recomienda una estabilizacin temprana del vino.

1.2 Ecologa y desarrollo de las bacterias lcticas


Como se ha mencionado ms arriba, en las uvas18 se encuentran recuentos reducidos (inferiores a 100 clulas/g) de bacterias lcticas; en cambio, los recuentos de bacterias acticas y de levaduras son mucho ms altos. Las bacterias lcticas aparecen en las hojas y en los tallos de los racimos de la vid, y tambin se pueden encontrar en el material de bodega. Estudios realizados en varios pases indican que la Oenococcus oeni es la especie predominante en la realizacin de la fermentacin malolctica en el vino, aunque la composicin de las bacterias lcticas presentes en el mosto de uva al principio de la fermentacin alcohlica est dominada por cepas de Lactobacillus. La Pediococcus se encuentra principalmente despus de la fermentacin malolctica (FML) as como en los vinos con un pH ms alto. Normalmente, los vinos con un pH inferior a 3.5 slo contienen cepas de Oenococcus oeni, mientras que los vinos con un pH superior a 3.5 pueden contener diversas especies de Pediococcus as como cepas heterofermentativas de Lactobacillus. El estudio de Wibowo et al.17 identific diversas fases de la de vinificacin (Fig. 1) en las que pueden aparecer y desarrollarse distintas especies de bacterias lcticas. Textualmente, dice as, Despus de la trituracin, por lo general los mostos contienen poblaciones de bacterias lcticas de 103 a 104 CFU/mL; entre las principales especies presentes en

Figura 1.
Ciclo de desarrollo de las bacterias lcticas en el vino durante la vinificacin y crianza

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I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

1.3 Factores que influyen en la supervivencia y desarrollo de las bacterias lcticas en el vino
Los factores que influyen en la supervivencia y multiplicacin de las bacterias lcticas en el vino se pueden dividir en las tres categoras siguientes: La composicin fsica y qumica del vino; Los factores asociados a la vinificacin; Las interacciones microbianas entre las bacterias lcticas y otros microorganismos presentes en el vino. Comentaremos detalladamente los factores especficos, pero por lo que se refiere a la composicin del vino, el pH es uno de los parmetros ms importantes en la determinacin del comportamiento de las bacterias lcticas en el vino, y tambin ejerce una accin selectiva sobre las cepas de bacterias lcticas que estarn presentes en el mismo. El pH del vino contribuye a determinar qu especie bacteriana proliferar, su viabilidad y la tasa de crecimiento de las bacterias lcticas, la velocidad de degradacin del cido mlico, y el comportamiento metablico de las especies bacterianas. El pH crtico en el vino es 3.5, pues por debajo de ese umbral resulta ms fcil controlar la microbiologa del vino. Aunque es ms difcil inducir la FML con un pH ms bajo, slo las especies de bacterias lcticas menos perjudiciales son capaces de desarrollarse y de llevar a cabo la FML a esos niveles de pH. El dixido de azufre (SO2) inhibe fuertemente el desarrollo de las bacterias lcticas, si bien la sensibilidad de las bacterias lcticas al SO2 vara. El dixido de azufre es ms inhibitorio con un pH bajo. El crecimiento y la realizacin de la FML por bacterias lcticas se inhiben progresivamente a concentraciones de alcohol superiores al 6%, siendo el 14% (v/v) el lmite superior tolerado por la mayor parte de las cepas. Las bacterias lcticas del vino son mesoflicas, y la temperatura ptima para su crecimiento est comprendida entre 15 y 30C. Las temperaturas bajas inhiben fuertemente tanto la tasa de crecimiento bacteriano como la velocidad de la FML. Por lo que se refiere a las prcticas de vinificacin, la clarificacin del mosto y del vino puede eliminar gran parte de las bacterias lcticas y reducir asimismo la incidencia del desarrollo bacteriano y su efecto sobre la calidad del vino19. Durante la clarificacin, se suprimen algunos nutrientes y partculas en suspensin que estimulan el desarrollo bacteriano. Se ha comunicado que los vinos elaborados por termovinificacin son menos aptos a la fermentacin malolctica. El momento de la inoculacin de las bacterias malolcticas (bacterias lcticas) tambin influye en la cintica de la FML. Por lo que se refiere a las interacciones con otros organismos del vino, los cultivos mixtos de microorganismos introducen la posibilidad de relaciones antagnicas y sinrgicas, aunque en algunos casos menores pueden carecer de efecto. En la vinifi12

cacin, existe la posibilidad de una interaccin de las bacterias lcticas con levaduras, hongos, bacterias acticas y bacterifagos, as como interacciones entre especies y cepas de BAL20. El efecto antagnico de la levadura se ha explicado por la competencia por los nutrientes y la produccin de sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano, como SO2 o cidos grasos de cadena media. Por otra parte, la levadura puede ayudar al desarrollo de las bacterias lcticas en el vino y estimular la FML. Durante el contacto prolongado de las las con el vino, el proceso de autolisis de la levadura libera vitaminas y aminocidos en el vino. Esto induce un enriquecimiento en nutrientes, con la subsiguiente estimulacin de la fermentacin malolctica. No obstante, Costello21 ha comunicado que el desarrollo de Pediococcus ssp se ve facilitado por la rpida muerte celular de Oenococcus oeni, y en condiciones de pH alto, el desarrollo temprano del Lactobacillus brevis inhibe completamente el desarrollo de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux31 ha demostrado que las condiciones del vino que estimulan la FML pueden ser capaces de inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces tan perjudicial para el vino.

Aaron Kohr - FOTOLIA

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hecho, combinado con los cambios de sabor positivos asociados al desarrollo de bacterias lcticas en el vino, hace de la FML un proceso deseable para casi todos los vinos tintos y para ciertos tipos de blancos. Ahora bien, el desarrollo de bacterias lcticas en el vino debe estar rigurosamente controlado para garantizar que se desarrollen bacterias lcticas deseables que no produzcan sabores desagradables ni compuestos que encierren peligro para la salud humana. En la mayor parte de los casos, es importante lograr que la FML concluya rpidamente, para ahorrar tiempo de proceso y conseguir una estabilidad temprana del vino. En ningn caso se debera confiar en las cepas indgenas de bacterias lcticas para realizar la FML. Aparte de producir cido lctico como principal producto final del catabolismo del azcar23, se sabe que las bacterias lcticas producen otros compuestos con incidencia aromtica, entre ellos el acetaldehdo, el cido actico, el diacetilo, la acetona, y el 2,3-butanodiol. El diacetilo, la acetona y el 2,3-butanodiol son producto del consumo bacteriano de cido ctrico, y tienen una incidencia considerable en el perfil aromtico del vino. A bajas concentraciones, estos compuestos parecen aportar complejidad al aroma del vino. A concentraciones superiores a 5 mg/L, el diacetilo puede resultar dominante, y conferir al vino un claro sabor a mantequilla/avellana. Dependiendo del pH y de la oxidacin-reduccin potencial del vino, el cido actico puede ser otro metabolito producido a partir de la degradacin de cido ctrico por bacterias lcticas. Tambin se han comunicado mayores concentraciones de esteres voltiles, de etilactato, y graduaciones alcohlicas ms altas en los vinos sometidos a la FML24. Henick-Kling25 ha descrito las contribuciones aromticas de las cepas individuales de bacterias malolcticas.

1.4 Influencia de la fermentacin malolctica en la composicin del vino


La FML no consiste en una mera descarboxilacin del cido mlico en cido lctico y CO2. Utilizando el vino como sustrato de crecimiento, las bacterias malolcticas eliminan algunos componentes del vino y producen otras a resultas de su metabolismo. La actividad metablica de las bacterias lcticas no slo influye en los componentes aromticos del vino derivados del fruto y de la fermentacin alcohlica22, sino que adems confiere estabilidad biolgica al producto final. Por norma general, se fomenta el desarrollo de bacterias lcticas cuando se necesita la FML para reducir la acidez del vino. La reduccin de la acidez es beneficiosa para la calidad del vino elaborado en regiones vitcolas fras, porque las bayas presentan naturalmente altas concentraciones de cidos orgnicos. Las preferencias actuales de los consumidores de todo el mundo se inclinan por los vinos afrutados de acidez moderada, lo cual conlleva que la reduccin de los cidos se ha convertido en un aspecto importante para la produccin de vinos en los climas ms fros. Este

1.5 Alteracin del vino por las bacterias lcticas


La FML no siempre es beneficiosa, y puede causar alteraciones indeseables en las propiedades organolpticas del vino. Como se ha mencionado ms arriba, son varias las especies de bacterias lcticas que pueden realizar la FML. Cuando la FML se produce con un nivel de pH inferior 3.5, la suele inducir la bacteria Oenococcus oeni y es menos probable que genere olores indeseables, aunque algunas cepas indgenas tienen la capacidad de hacerlo. Los olores indeseables a mantequilla, leche, queso, metal y tierra, as como cantidades excesivas de cido actico suelen ir asociados a fermentaciones malolcticas desarrolladas en vinos con un pH superior a 3.5 y realizadas por pediococci o lactobacilos. Las bacterias lcticas producen aminas bigenas mediante la descarboxilacin de aminocidos. Se cree que la histamina, derivada de la descarboxilacin de la histidina, provoca una reaccin en individuos sensibles si el vino tiene una concentracin superior a 0.1 mg/L. Se considera que, de
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I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

las diversas bacterias lcticas, Pediococcus sp. y Lactobacillus brevis son las que ms histamina producen26. Estos dos gneros se suelen hallar en vinos con un pH superior a 3.5. Por consiguiente, la sntesis de aminas bigenas parece ser importante nicamente en los vinos con un pH elevado. Si sabe que hay presentes cepas bacterianas capaces de producir aminas bigenas, el productor de vino debe inocular un cultivo malolctico iniciador seleccionado por su capacidad de sustituir a las bacterias lcticas indgenas. Las bacterias tienen una ligera capacidad de formar histaminas, y slo durante su fase de crecimiento activo. No obstante, se ha demostrado26 que incluso una flora bacteriana no proliferante puede desarrollar cantidades considerables de histamina. Por lo tanto, se debe eliminar la poblacin bacteriana de un vino mediante la adicin de SO2 seguida de una clarificacin nada ms terminar la FML; esto es especialmente importante en los vinos con un pH alto. Tambin se pueden producir alteraciones organolpticas indeseables a raz del metabolismo de bacterias lcticas indgenas, como por ejemplo coloraciones parduscas, cambios de color y viscosidad.

1.6 Control de la fermentacin malolctica Impedir la FML:


Si no se desea la FML, hay que impedir el desarrollo de bacterias lcticas en el mosto y en el vino mediante la eliminacin o desactivacin de las bacterias presentes en dichos medios. Aunque en ocasiones puede resultar difcil inducir la FML, impedir el desarrollo de bacterias lcticas es igualmente difcil. Dependiendo del pH, la adicin de 50-100 mg/L de SO2 debera destruir ms del 90% de las bacterias viables presentes. El efecto del SO2 depende de la acidez del vino: el SO2 es ms eficaz con los niveles de pH ms bajos. Por consiguiente, en vinos con un alto pH, hay que considerar la utilizacin de una combinacin de SO2 con lisozimas o la utilizacin de lisozimas solas. Para la inhibicin de la FML se puede utilizar todos los factores contrarios a los empleados para favorecer su desarrollo. Por lo tanto, los parmetros que permiten inhibir la FML son los siguientes: Maceracin mnima; pH bajo; Bajas temperaturas; Trasiego y clarificacin precoz.

Induccin de la FML:
Los anlisis qumicos y sensoriales han demostrado que las bacterias lcticas influyen en la calidad del vino no slo a travs de la propia FML, sino tambin a travs de otras actividades metablicas. Si se desea la FML y la produccin bacteriana de compuestos aromticos, el productor de vino puede propiciar el crecimiento de bacterias lcticas manteniendo condicio14

nes favorables al desarrollo y la supervivencia de las bacterias, como temperaturas ms clidas, adicin mnima o nula de SO2, y retraso del trasiego. Tambin se puede llevar a cabo una inoculacin cruzada con vinos que ya estn experimentando la FML. No obstante, los mtodos ms eficaces y recomendables son o bien la inoculacin en el vino de cepas de bacterias malolcticas preparadas en laboratorio o adquiridas en el comercio, o el paso del vino sobre bacterias malolcticas activas inmovilizadas. Las bacterias lcticas ms recomendables para realizar la FML son las cepas de Oenococcus oeni, porque pueden crecer en vinos con pH bajo y pueden degradar el cido mlico sin producir sabores y olores indeseables ni metabolitos peligrosos. Adems, no degradan los componentes del vino necesarios para la calidad y estabilidad del mismo, como son el cido tartrico, el etanol o el glicerol19. El crecimiento de la Oenococcus oeni ser lento en los vinos con un pH inferior a 3.1 y, dependiendo de otros factores inhibidoress del desarrollo as como de la densidad celular inicial, el inicio y la culminacin de la FML se puede retrasar considerablemente. En las condiciones de crecimiento ms elevadas, es decir con un alto pH, las especies Lactobacillus y Pediococcus pueden realizar la FML. La opinin de que dichas especies producen vinos menos aceptables que aquellos en los que se ha desarrollado la Oenococcus oeni est generalmente aceptada27. En algunos vinos, se puede provocar el fracaso de la FML por la inoculacin de un vino que ya est experimentando la FML. Las principales desventajas de este planteamiento son que hay que disponer de un vino adecuado, y que las bacterias contenidas en el vino inculo pueden no ser adecuadas para su desarrollo en el vino en donde se inoculan. Y lo que es ms importante, no se conocen bien las caractersticas de dichas bacterias. El reconocimiento creciente de la influencia de la FML en la calidad del vino ha llevado a los productores de vino a buscar un mayor control sobre la intervencin y el resultado de la FML. La inoculacin de cultivos iniciadores definidos, cuidadosamente seleccionados en la naturaleza, reduce el potencial de alteracin por otras bacterias lcticas y/o bacterifagos, garantizando con ello el rpido inicio de la FML, un mayor control de la produccin de compuestos aromticos, sabores y olores en el vino28. Se han desarrollado cultivos iniciadores a base de

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fase de rehidratacin consiste en conseguir una mejor distribucin de las bacterias al aadirlas al vino. Las bacterias malolcticas se pueden inocular en las fases siguientes de la fermentacin alcohlica: Simultneamente a la inoculacin de levadura; Durante la fermentacin alcohlica; Hacia el final de la fermentacin alcohlica; Despus de la fermentacin alcohlica.

diversas bacterias lcticas, y en su mayor parte se comercializan en forma liofilizada o congelada, aunque tambin se venden algunos cultivos lquidos. Estas cepas se han seleccionado a partir de la FML espontnea por su buena cintica fermentativa, sus resultados en condiciones restrictivas en el vino, y sus propiedades organolpticas deseables. Estas cepas toleran las difciles condiciones de crecimiento y supervivencia imperantes en el vino y no producen metabolitos peligrosos. No producen compuestos aromticos que puedan incidir negativamente en la calidad del vino, sino que, por el contrario, aportan contribuciones organolpticas positivas al sabor del vino. Hasta hace poco, la mayor parte de estos cultivos iniciadores requeran una fase de aclimatacin o reactivacin en condiciones controladas29. Normalmente, su reactivacin se llevaba a cabo en mosto de uva sin SO2, que se dilua en una proporcin de 1:1 con agua y/o vino. Se ajustaba el pH del mosto diluido a un nivel de 3.6 o superior, y se aadan nutrientes bacterianos a una concentracin de 0.05% w/v. Por lo general, la reactivacin llevaba al menos 24 horas, y se evitaba el choque trmico mediante el desarrollo de las clulas a una temperatura que no difiriera en ms de 10C de la temperatura del vino al que se iba a aadir el iniciador. Desde hace poco se comercializan asimismo cultivos iniciadores para la inoculacin directa de las bacterias en el vino. Estos cultivos iniciadores se han preaclimatado durante su proceso de produccin para que sobrevivan a su incorporacin a un medio hostil en el vino sin que disminuya el recuento de clulas viables ni se produzca la subsiguiente prdida de actividad malolctica. Estas preparaciones de bacterias malolcticas se pueden aadir directamente al vino, o se pueden rehidratar en agua durante un breve periodo de tiempo antes de su adicin al vino. El objeto de la

El mejor momento para la inoculacin de bacterias lcticas sigue siendo objeto de discusin. En Burdeos (Francia) la opinin consiste en recomendar la inoculacin de bacterias lcticas nada ms terminar la fermentacin alcohlica, para evitar el riesgo de producir cido actico y D-cido lctico, la llamada piqre lactique(picado lctico)30. En ocasiones, la FML que se produce durante la fermentacin alcohlica puede provocar una interrupcin de la fermentacin alcohlica. La investigacin no ha confirmado unnimemente los resultados franceses referentes al desarrollo de una alta concentracin de cido actico, al antagonismo con la levadura o a la interrupcin de la fermentacin alcohlica que se han asociado al desarrollo precoz de bacterias lcticas. Se ha abogado por la inoculacin de la levadura junto con bacterias lcticas porque se crea que las bacterias tenan ms posibilidades de crecer y aclimatarse en ausencia de etanol. Para controlar con xito el proceso de vinificacin, es importante comprender los mecanismos reguladores que rigen el desarrollo y el metabolismo de las bacterias malolcticas en el vino. Es importante seleccionar la cepa ms adecuada, elegir el momento ms favorable para la inoculacin, garantizar que la cepa de bacterias lcticas correcta domine la FML y que la FML culmine en un plazo de tiempo predecible (Fig. 2).

Figura 2.
FML controlada

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I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

Referencias
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I.2. La prctica de la fermentacin malolctica

Didier THEODORE
Lallemand
2.1 Gestin de la fermentacin malolctica en bodega 2.2 Determinacin del momento de la inoculacin 2.3 Problemas potenciales 2.4 Procedimientos analticos

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I.2. La prctica de la fermentacin malolctica

enococcus oeni, es la bacteria lctica identificada como la especie responsable de llevar a cabo la fermentacin malolctica (FML) en el vino y de hacer importantes aportaciones a la mejora de la calidad de ste. Incluso en condiciones ideales, la FML presenta fastidiosas exigencias nutricionales, y se desarrolla muy lentamente. Por ello no resulta sorprendente que las condiciones desfavorables para su desarrollo que presenta el vino puedan hacer sumamente difcil que se inicie y complete la FML. Para que se inicie la FML, las poblaciones bacterianas deben alcanzar una concentracin mnima de 106 CFU/mL, y las condiciones fsicas del vino hacen difcil que se cumpla este requisito.

2.1 Gestin de la fermentacin malolctica en bodega


Los factores ms importantes que influyen en el desarrollo bacteriano en el vino son el alcohol, el SO2, la temperatura y el pH. Las bacterias empiezan a presentar signos de inhibicin del desarrollo con una concentracin de alcohol del 10% aproximadamente. La concentracin de SO2 libre se debe mantener lo ms baja posible, para evitar que inhiba an ms el desarrollo y la supervivencia de las bacterias lcticas. Las bacterias lcticas se multiplican a temperaturas comprendidas entre 18 y 20C, pero su crecimiento se ve fuertemente restringido a temperaturas inferiores. Las bacterias se desarrollan en una horquilla de pH de 3 a 4, observndose un crecimiento ms abundante con un pH de 4 que con un pH de 3. La FML se produce ms fcilmente con un pH ms alto que con un pH ms bajo, si bien la presencia de un pH ms alto puede favorecer el desarrollo de cepas de bacterias lcticas que pueden tener un fuerte impacto negativo en la calidad del vino. Es necesario relacionar el efecto de cada uno de estos parmetros en la FML con el de los parmetros restantes, pues no ejercen su influencia individualmente, sino que sta depende de la suma de todos los factores. Por consiguiente, se puede estimar que el vino no es un medio conducente sin esfuerzo al desarrollo de microorganismos. Para superar las tensiones naturales del medio que es el vino, con objeto de garantizar el desarrollo de las bacterias lcticas y una FML completa en ste, se recomienda aadir un cultivo bacteriano iniciador. La bacteria Oenococcus oeni es el organismo de eleccin, y es preferible aadir una cantidad concentrada de dicho organismo. Cuando se aade dicho organismo en cantidades suficientemente importantes, ste se ve obligado a crecer y multiplicarse en las condiciones del vino, lo cual significa que la FML comenzar sin tener que esperar a que se desarrolle un nmero
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I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

de clulas suficientemente importante. Existen cultivos comerciales de bacterias lcticas aptos para su inoculacin en el vino. Estos cultivos estn disponibles en estado lquido, congelado, o deshidratado por congelacin. Algunos de los cultivos deshidratados por congelacin han sido adaptados biofsicamente para resistir los rigores del medio del vino, y se pueden aadir directamente al vino sin necesidad de pasar por una fase de activacin. Los dems tipos de cultivo iniciador requieren fases de activacin y multiplicacin previas a su introduccin en el vino. Este proceso exige pasar por varias etapas planificadas, y conlleva mucho trabajo. Si se realiza correctamente, normalmente garantiza una FML completa, incluso en los vinos ms difciles, pues los cultivos lcticos iniciadores han sido seleccionados por su resistencia a las condiciones adversas del vino. Cuando se utilizan cultivos que se pueden inocular directamente en el vino, o que slo requieren una fase de desarrollo, la intencin es inocular una poblacin bacteriana mnima de 106 CFU/mL sin depender del desarrollo de las bacterias lcticas del propio vino para alcanzar dicha concentracin. La investigacin ha permitido conocer mejor la nutricin bacteriana y la influencia del vino en el desarrollo de bacterias lcticas y la nutricin de las levaduras durante la fermentacin alcohlica. Se ha demostrado que las levaduras con grandes necesidades nutricionales durante la fermentacin alcohlica agotan rpidamente los factores de crecimiento del mosto necesarios para el desarrollo de la bacteria lctica justo cuando se desea la FML. El fenmeno se puede producir en todos los mostos de uva, pero resulta especialmente problemtico en las uvas de varietales con un contenido de nutrientes naturalmente bajo. Esta investigacin ha desembocado en la recomendacin de aadir nutrientes bacterianos despus de la fermentacin alcohlica con objeto de ayudar a la iniciacin y culminacin de la FML. Es imprescindible garantizar una nutricin adecuada y suficiente de los hongos de fermentacin as como de las bacterias lcticas.

La investigacin ha demostrado que cuando se comprenden las interacciones entre la levadura de fermentacin y la bacterias lcticas, la inoculacin de un cultivo malolctico iniciador en diversos momentos de la fermentacin alcohlica puede dar buenos resultados. Ahora bien, dependiendo de los procesos de vinificacin utilizados microoxigenacin, termovinificacin o maceracin prolongada la FML se puede retrasar hasta el final de la fermentacin alcohlica. En esos casos, los responsables pueden ser la adicin de SO2, la clarificacin del vino y los regmenes de refrigeracin. En presencia de vinos con un elevado pH, puede resultar beneficioso una adicin precoz de lisozima, una enzima especficamente dirigida a las bacterias Gram+. Si se controla estrictamente el momento del aporte, la adicin ulterior del cultivo malolctico iniciador deseado se puede llevar a cabo ms tarde. La introduccin de iniciadores de cultivo malolctico comerciales ha permitido a los vinificadores integrar mejor sus procesos de vinificacin gracias a la gestin de la FML.

2.2 Determinacin del momento de la inoculacin


Es imperativo inocular el vino con un cultivo malolctico iniciador que presente una concentracin de poblacin de 106 CFU/mL para garantizar una presencia de clulas bacterianas suficiente para degradar el cido mlico. Si la fermentacin alcohlica se inicia y concluye rpidamente, la degradacin del cido mlico por la bacterias lcticas no suele provocar una acidez voltil (AV) extrema. Cuando se observan cantidades excesivas de AV, stas suelen ser consecuencia de la presencia y crecimiento de bacterias indgenas, con toda probabilidad introducidas en el vino debido a una combinacin de condiciones sanitarias deficientes y elevado pH del vino. Estas bacterias indgenas se desarrollan en el vino utilizando el azcar como fuente de energa, y produciendo cido actico.
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Aaron Kohr - FOTOLIA

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ganismos indeseados puede generar compuestos secundarios, entre ellos, alergenos tales como aminas bigenas (histamina, putrescina y cadaverina), y compuestos potencialmente cancergenos como el carbamato de etilo y la ocratoxina A.

2.3 Problemas potenciales


A veces, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lcticas pueden provocar cambios indeseables. Durante la FML ocurrida naturalmente y sin control, realizada por cepas indgenas de Lactobacillus y Pediococcus, se puede producir una alteracin de las propiedades organolpticas del producto. Concretamente, se puede formar un exceso de AV o de diacetilo. Adems de velar los sabores afrutados primarios del vino, estos compuestos tambin pueden aportar caracteres indeseables a su aroma. Por ejemplo, los AV son irritantes para la nariz y provocan un sabor agrio. El diacetilo puede aportar un sabor almendrado o caractersticas que pueden evocar el caramelo, la levadura e incluso el pelo de animal mojado. Los aromas y sabores indeseados generados por el desarrollo de organismos de putrefaccin pueden producir caractersticas similares al yogur cido, la mantequilla rancia y el sudor. En los vinos tintos, los fenoles voltiles pueden producir olores a establo, y en los blancos, los mismos componentes pueden provocar la aparicin de olores a antisptico. Esos olores pueden ir acompaados de amargor y de taninos metlicos en el paladar. La proliferacin incontrolada de microor-

2.4 Procedimientos analticos


La accin ms obvia de la FML es la descaboxilacin del cido mlico del vino, y siempre provoca una disminucin de la acidez total y un incremento del pH. La forma ms fcil de seguir el avance de la FML consiste en realizar anlisis qumicos para detectar la desaparicin del cido mlico. A continuacin se describen algunos de los mtodos ms utilizados.

Cromatografa en papel
Es una tcnica cromatogrfica cuantitativa utilizada para realizar un seguimiento visual de la desaparicin del cido mlico. No es precisa, pero s fcil de utilizar en bodega.

Tcnicas enzimticas
Esta tcnica es ms compleja y costosa, pero resulta muy precisa. Utiliza el anlisis qumico para determinar la concentracin absoluta de cualquier cido orgnico en el mosto. Durante la FML, el L-cido mlico se convierte especficamente en L-cido lctico, de modo que se puede utilizar la medicin de la concentracin de L-cido lctico como indicador del inicio de la FML. Por lo general, cuando la concentracin de L-cido lctico alcanza 200-300 mg/L, se puede suponer con seguridad que se ha iniciado la FML. Normalmente, se considera que la FML ha concluido cuando la concentracin de cido mlico baja a valores de entre 100 y 200 mg/L.

Recuentos microbiolgicos
Esta tcnica asla y cuenta el nmero de bacterias lcticas presentes en el vino. Su tasa de crecimiento es muy lenta, de modo que puede llevar hasta siete das determinar el nmero de Oenococcus oeni viables. La tasa de crecimiento de bacterias indeseables, como Lactobacillus y Pediococcus, es ms alta, de modo que el recuento de estos organismos se puede obtener en un plazo de dos das.

Observacin microscpica
Este mtodo se basa en la observacin directa de un vino mediante un microscopio de buena calidad. No es cuantitativo, pero si lo aplica un tcnico con experiencia, proporciona una evaluacin rpida y valiosa de la microflora presente en el vino.

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I.3. Bacterias lcticas y fermentacin malolctica

Aline LONVAUD-FUNEL
Facult denologie. Universit victor segalen bordeaux 2
3.1 Las bacterias lcticas: generalidades 3.2 Principales metabolismos en el vino 3.3 Vas de utilizacin de ciertos aminocidos 3.4 Metabolismos de alteracin 3.5 Lugar de las bacterias lcticas en el ecosistema microbiano de la uvavino 3.6 Conclusin

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3.1 las bacterias lcticas: generalidades


as bacterias lcticas (BL) son microorganismos comunes en numerosos entornos. Estn presentes en gran nmero de vegetales y en la leche, y participan en la elaboracin de todo tipo de productos fermentados, bebidas y alimentos. Las BL del vino son muy parecidas a las de la sidra, con las que presentan grandes similitudes en cuanto a materia prima y proceso de elaboracin. Por lo tanto, la especie Oenococcus oeni desempea el mismo papel en sendos medios. En otras bebidas o verduras fermentadas, hay mayor presencia de lactobacilos, lactococos y estreptococos, que son los encargados de realizar las transformaciones.

I.3. Bacterias lcticas y fermentacin malolctica

- Definicin
Las BL son bacterias de coloracin Gram positiva. Esta sencilla prueba de color permite distinguirlas rpidamente de las bacterias acticas, Gram negativas, que tambin estn siempre presentes en el mosto y en el vino. Todas las BL producen cido lctico a partir de los azcares. Cultivadas en un medio que contenga glucosa y todos los dems nutrientes imprescindibles para su desarrollo, se multiplican en el mismo acidificndolo intensamente.

- Clasificacin
La forma de las clulas es bien visible tras una prueba de coloracin Gram. Es redondeada en el caso de los cocos y alargada en el de los bacilos. En el entorno enolgico, existen cocos y bacilos. La va metablica de fermentacin del azcar es el criterio que permite clasificar a las BL como bacterias homofermentativas y heterofermentativas. Las primeras producen exclusivamente cido lctico a partir de la glucosa, y las otras forman asimismo cido actico, etanol y CO2 como principales metabolitos. Algunas BL se comportan como homofermentativas en condiciones de cultivo ptimas, pero como heterofermentativas en otras condiciones. Esas bacterias, a diferencia de las homofermentativas estrictas, fermentan las pentosas por la misma va que las heterofermentativas. Son heterofermentativas "facultativas". Hasta ahora, no se ha descrito en el vino ningn lactobacilo homofermentativo estricto. Las especies identificadas se clasifican entre los cocos y bacilos heterofermentativos, y los cocos homofermentativos.

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I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

Figura 1.
Fotografias de bacterias aisladas del vino, tomadas al microscopio electrnico

Oenococcus oeni

Pediococcus damnosus

Lactobacillus brevis

Especies ms comunes de bacterias lcticas del vino Lactobacilos Lactobacilos Cocos Cocos Heterofermentativo facultativo Heterofermentativo Homofermentativo Heterofermentativo

Lactobacillus plantarum -L. casei L. brevis, L hilgardii Pediococcus parvulus, P. damnosus L. mesenteroides, O. oeni

- Identificacin
Los mtodos clsicos de identificacin se basan en la observacin de varios caracteres (denominados caracteres fenotpicos). La clasificacin de una cepa se determina en funcin del parecido de esos caracteres con los de las cepas tipo. Las pruebas de identificacin se realizan sobre aislamientos puros, es decir sobre bacterias aisladas tras su cultivo en medio nutritivo gelificado. Las colonias aisladas se vuelven a poner en cultivo con glucosa como nico azcar para determinar el tipo fermentativo (heterofermentacin/homofermentacin). Despus, en las mismas condiciones, se sustituye la glucosa por otros azcares diversos, hexosas, pentosas y osas varias, que permiten obtener el perfil bioqumico. En funcin de su capacidad de metabolizar tales o cuales azcares, las bacterias se clasificarn dentro de una u otra especie. El mtodo ms cmodo de clasificacin consiste en utilizar las galeras "API 50CH" en las cuales se miniaturiza una cuarentena de pruebas en una misma placa. La identificacin se lleva a cabo cotejando el resultado de todas las pruebas con las claves facilitadas en el manual de clasificacin de Bergeys. Aunque el mtodo sea sencillo, lleva mucho tiempo, pero lo peor es que a veces los resultados son ambiguos. En lo sucesivo la identificacin se basa en el anlisis del ADN, es decir en el verdadero patrimonio gentico de la clula, y no en su reflejo a travs de caracteres fenotpicos ms o menos fciles de poner en evidencia. Existen varios mtodos disponibles, el ms seguro consiste en secuenciar una parte del genoma
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muy caracterstico de la especie, correspondiente a los genes que codifican el ribosoma esencial de la clula, es decir el ARN 16S. Esta regin contiene partes muy conservadas en todas las bacterias de una misma especie, as como otras variables en funcin de las cepas. Basndose en este principio, el mtodo de PCR permite identificar un aislamiento considerando la regin conservada en la especie. Consiste en estudiar esa regin por amplificacin gentica, eligiendo "inicios" cuya la secuencia es especfica de la especie. La identificacin tambin se puede llevar a cabo mediante hibridacin del ADN con una sonda especfica. Por ltimo, a nivel de la cepa, el mtodo ms seguro consiste en analizar el perfil gentico generado por la hidrlisis del cromosoma bacteriano. Todos estos mtodos se utilizan para identificar cepas aisladas por cultivo en un medio nutritivo, aunque tambin se puede hacer inventario de las bacterias presentes en una mezcla como el vino o el mosto de uva, sin cultivo previo. El mtodo (PCR-DGGE) se basa en la diferencia de migracin de ADN 16S en funcin de las especies.

Figura 2.
Hibridacin de colonias con la sonda de ADN genmico Oenococcus oeni

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dentes en la fermentacin alcohlica, si la competencia entre levaduras y bacterias se inclina a favor de estas ltimas, o si la fermentacin se desacelera o se interrumpe por otros motivos. En esa situacin, se fermentan varios gramos de hexosas por litro, y la acidez voltil aumenta sensiblemente. Es el llamado picado lctico. Este incidente es especialmente de temer cuando tanto el pH de la vendimia como la concentracin de los azcares son muy altos.

Figura 3.
Perfil genmico de cepas de O. oeni aisladas en una cuba durante la FML

- Transformacin del cido mlico


Es la reaccin principal de la FML. Qumicamente, consiste en la mera descarboxilacin del cido L-mlico del vino en cido L-lctico. Bioqumicamente, es el resultado de la actividad de la enzima malolctica, caracterstica de las BL. Esta transformacin tiene un doble efecto. Por una parte, desacidifica el vino, es decir eleva el pH, tanto ms cuanta ms alta fuera la cantidad inicial de cido mlico. Por otra parte, tambin suaviza el vino, al hacer desaparecer el sabor cido y duro del cido mlico y sustituirlo por el sabor ms suave del cido lctico. Esta es la reaccin principal que hace que la FML modifique muy sensiblemente los caracteres organolpticos del vino, y el motivo por el cual la segunda fermentacin resulta especialmente recomendable para la mayor parte de los vinos tintos y muchos blancos. La duracin de la transformacin del cido mlico depende de la cantidad inicial de cido ste y del nivel de poblacin total de la bacteria que haya conseguido multiplicarse en el vino. Sin embargo, para una misma biomasa formada, se puede desacelerar como consecuencia de ciertos inhibidores del vino, que de momento todava no estn bien identificados. El pH, el grado alcohlico, la temperatura y la concentracin de dixido de azufre son los principales parmetros que controlan el crecimiento y el nivel de la poblacin total.

3.2 Principales metabolismos en el vino - Fermentacin de los azcares


Los azcares son las principales fuentes de energa para el crecimiento de las bacterias. Dependiendo de las especies de lactobacilos y de cocos, se fermentan bien por va de la glicolisis (homofermentacin) bien por la va de las pentosas (heterofermentacin); sin embargo, slo esta ltima genera el cido actico que incrementa la acidez voltil del vino. No obstante, en una vinificacin normal, sin incidentes, cuando se multiplican las BL, en el medio slo persisten los azcares sin fermentar por las levaduras. Por lo general, se trata de algunas centenas de mg/l de glucosa y de fructosa, y de las pentosas del zumo de uva (arabinosa, xilosa).

Figura 4.
Distintas vas de fermentacin de los azcares por las BL

- Degradacin del cido ctrico


Mientras que, antes de la FML, el vino contiene varios g/l de cido L-mlico, por lo general slo contiene entre 200 y 300 mg/l de cido ctrico. Ahora bien, aunque su concentracin sea baja, el cido ctrico tiene una gran importancia, pues su va metablica conduce por una parte a cido actico, es decir a un aumento de la acidez voltil, y por otra parte a las molculas acetonicas, la ms importante de las cuales es el diacetilo. Este compuesto aromtico, que tiene un olor a mantequilla, se detecta fcilmente en la cata desde concentraciones relativamente bajas, del orden de 56 mg/l en los vinos blancos y 8-9 mg/l en los vinos tintos. Por debajo de ese umbral, el diacetilo contribuye al bouquet del vino y a su complejidad. Por encima, puede llegar a resultar francamente desagradable. No obstante, para algunos vinos s que se busca esa nota mantecosa.
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Los azcares residuales son suficientes para suministrar la energa necesaria para el crecimiento de las BL y permitir la formacin de la biomasa que posteriormente lleva a cabo la fermentacin malolctica (FML). La produccin de acidez voltil es siempre muy limitada, y slo llega a cobrar importancia en caso de inci-

I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

Figura 5.
Va de degradacin del cido ctrico por las bacterias lcticas

fuente principal de carbamato de etilo sigue siendo la urea producida por la levadura durante la fermentacin alcohlica.

- Descarboxilacin de ciertos aminocidos


Las BL pueden producir aminas bigenas por la mera reaccin de descarboxilacin de los aminocidos correspondientes. La histamina y la tiramina son las principales aminas cuya concentracin aumenta durante y despus de la FML. Se forman a partir de la histidina y de la tirosina respectivamente. Las enzimas descarboxilasas necesarias para esas transformaciones se han purificado y estudiado en bacterias lcticas del vino. Son muy frecuentes en los lactobacilos heterofermentativos (L. brevis y L. hilgardii), si bien tambin se han aislado cepas de O. oeni productoras de histamina. Los genes que codifican la histidina y la tirosina descarboxilasas han sido secuenciados y bien localizados dentro de un conjunto de genes que tambin incluyen los que codifican las protenas de transporte que intercambian el aminocido y la amina al nivel de la membrana celular. La capacidad de producir aminas bigenas es totalmente dependiente de la presencia de dichos genes. Por lo tanto, si se detectan esos genes en la poblacin, eso significa que el riesgo de produccin de amina bigena es alto, en caso de que se multipliquen esas bacterias en concreto.

El diacetilo se puede reducir a acetona debido a las actividades enzimticas de las bacterias, y tambin de las levaduras, de manera que si se prolonga el contacto del vino con las las, disminuye su concentracin. Esa puede ser una buena manera de suprimir un exceso. Por el contrario, el trasiego precoz permite conservarlo. La degradacin del cido ctrico es un carcter muy comn de las bacterias del vino, si bien es ms lenta que la del cido mlico. Por ello, a veces al final de la FML el vino todava contiene la mayor parte del cido ctrico inicial. No obstante, la observacin general es que incluso despus de la adicin de azufre, la actividad bacteriana contina y la concentracin final del vino acaba por ser nula. El aumento del cido actico observado durante y en ocasiones despus de la FML se debe a esta degradacin.

3.3 Vas de utilizacin de ciertos aminocidos Figura 6. - Degradacin de la arginina


La mayor parte de los lactobacilos del vino y numerosas cepas de O. oeni catabolizan la arginina del vino. Es uno de los aminocidos ms importantes, y en el vino, despus de la FA, procede sobre todo del metabolismo de las levaduras y de su autolisis. La va de degradacin es la de la arginina deiminasa. Consta de tres etapas, catalizadas por tres enzimas cuyos genes se han caracterizado en la O. oeni. El anlisis de un gran nmero de cepas de esta especie permite concluir que estos genes estn situados en una regin del cromosoma presente o ausente en su totalidad, dependiendo de las cepas. Incluye asimismo los genes que codifican las protenas de transporte de la arginina. Como esta va metablica suministra energa a las bacterias, las cepas que poseen todos los genes tienen una ventaja sobre las dems, algo que puede resultar importante para su supervivencia o su crecimiento. A nivel enolgico, la consecuencia es la formacin de citrulina, precursor del carbamato de etilo. Sin embargo, las concentraciones formadas son dbiles, y la
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Esquemas de los sistemas de produccin de histamina y tiramina por las BL del vino.

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Fermentacin Malolctica Figura 7.


Deteccin por PCR de las bacterias productoras de amargor en el vino

A partir de esta observacin, se ha desarrollado una prueba basada en la amplificacin de estos genes por PCR. Si la prueba da positivo antes de la FML, constituye una buena indicacin para la utilizacin de levaduras malolcticas. En efecto, aunque no se pueda eliminar las bacterias indeseables, se puede frenar su crecimiento mediante una siembra masiva de O. oeni seleccionadas. Luego, desde el momento en que se haya degradado el cido mlico, se puede realizar un sulfitado adecuado que permitir reducir an ms su poblacin, y por ende su actividad. Si la prueba de deteccin de las bacterias productoras de aminas bigenas da positivo despus de la FML, indica la necesidad de sulfitar rpidamente y lo ms eficazmente posible, pero tambin de evitar el contacto prolongado con las las. Durante la crianza de estos vinos, ser necesario vigilar la microflora lctica.

-Produccin de glucano
Durante la FML, las BL forman exopolisacridos en el vino. De momento, todava no se conocen bien, y probablemente participan en reacciones con los dems compuestos del vino. Sin embargo, algunas sintetizan un glucano muy particular, que tiene la propiedad de incrementar considerablemente la viscosidad del vino, incluso a una concentracin relativamente dbil. Es la enfermedad de la grasa o de los vinos ahilados que en ocasiones sobreviene en cuba o en barrica, pero tambin con gran frecuencia en botella. Hasta ahora, las bacterias aisladas ms a menudo en estos vinos alterados se han identificado como Pediococcus parvulus o P. damnosus, pero slo se trata de cepas concretas de estas especies, bien adaptadas para crecer en el vino. Esas cepas poseen un gen particular que codifica una enzima implicada en la sntesis del glucano. Se pueden detectar con la prueba PCR apropiada.

- Metabolismo de los aminocidos azufrados


La cistena y la metionina son metabolizadas por las bacterias que forman compuestos azufrados diversos, entre ellos el hidrgeno sulfurado y el metano-tiol, poco apreciados. El metabolismo de la metionina est mejor estudiado, y conduce, adems del metanotiol y del sulfuro de dimetilo, a molculas ms complejas de probada incidencia organolptica. Las bacterias lcticas del vino producen estos compuestos, metionol y cido metil3-sulfanilo propinico pero la O. oeni es la que los produce en mayores cantidades. Su concentracin aumenta durante la FML, y podran figurar entre las numerosas molculas aromticas que participan en el cambio complejo del aroma de los vinos por influencia de las BL.

Figura 8.
Deteccin por hibridacin ADN/ADN de bacterias de la enfermedad de la grasa. (Izda. Todas las colonias cultivadas a partir de una muestra de vino. Drcha. Slo se revelan las colonias de la enfermedad de la grasa)

3.4 Metabolismos de alteracin - Degradacin del glicerol


El glicerol es un componente fundamental del vino, formado por las levaduras. La mayora de las veces no queda metabolizado despus de la fermentacin alcohlica. Sin embargo, algunas cepas de lactobacilos disponen de una va especial que conduce al 1,3 propanodiol. La primera etapa la cataliza la gliceroldeshidratasa, y produce 3 hidroxi propionaldehdo, que se reduce inmediatamente a 1,3 propanodiol. Sin embargo, una cantidad muy reducida del aldehdo escapa a la reduccin, y forma acrolena, con una doble incidencia en la calidad del vino: por una parte desaparece el glicerol, a veces completamente, y por otra parte, la acrolena, incluso en reducidas cantidades, se combina con los polifenoles del vino y forma molculas de sabor amargo. Es la enfermedad del amargor.

Los vinos afectados por la enfermedad de la grasa no tienen por qu presentar ms defecto que su viscosidad. En ese caso, se pueden tratar para recuperarlos. Una accin mecnica por batido o fragmentacin del vino que permite recobrar una viscosidad adecuada. Despus, la estabilizacin debe recurrir a procedimientos muy eficaces, como el tratamiento trmico y la filtracin esterilizante, con un sulfitado adecuado para suprimir cualquier riesgo de desarrollo ulterior de las bacterias perjudiciales.

27

I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

3.5 Lugar de las bacterias lcticas en el ecosistema microbiano de la uva-vino


En el mosto de uva, las BL forman parte del complejo sistema de mltiples especies de levaduras y bacterias. Inicialmente, estn presentes en la superficie de la baya, aunque muchas veces son difciles de aislar en la via. En la vendimia recin recogida, prensada y encubada, la poblacin de BL es del orden de 102 a 104 UFC/mL. Vara en funcin de las condiciones meteorolgicas durante los ltimos das de la maduracin. En realidad, depende de las innumerables interacciones entre las decenas de especies de otros microorganismos que colonizan el medio, en la superficie de la uva, y despus en la uva reventada por el prensado. En las condiciones habituales de vinificacin, que la mayor parte de las veces suponen un sulfitado de la vendimia, la poblacin de BL deja muy rpidamente paso a las levaduras que desencadenan la fermentacin alcohlica (FA). En un medio cuya composicin qumica cambia constantemente y donde todos los microorganismos luchan por desarrollarse, generalmente las BL consiguen multiplicarse de forma muy transitoria, tras lo cual entran en regresin hasta el final de la FA. En ese momento, su poblacin es mucho ms reducida que las de las levaduras, y su nivel depende en buena medida del pH y del grado alcohlico del vino. En condiciones difciles, de pH relativamente cido (pH <3,4) y fuerte graduacin alcohlica ( > 13 %) muchas veces la poblacin es inferior a 102 UFC/mL. Por el contrario, puede rebasar 104 UFC/mL en las condiciones opuestas, sobre todo si el pH es > 3,5. Esta es la poblacin que deber multiplicarse para iniciar la FML. Un fenmeno muy importante que se desarrolla durante la FA, es la seleccin de las bacterias de la especie O. oeni. En la gran mayora de los casos, las bacterias de esta especie son las nicas que invaden el medio despus de la FA para realizar la FML. La seleccin natural operada entre una mezcla muy variada de especies de BL presentes en el mosto se

lleva a cabo por efecto del cambio de composicin del medio. Inicialmente se identifican lactobacilos y cocos pertenecientes a una decena de especies distintas. Luego, muchos de ellos desaparecen progresivamente, o al menos se vuelven muy minoritarios, dejando que la O. oeni colonice el medio. No se conocen con precisin los mecanismos de esta seleccin. Sean cuales fueren, el hecho es que la O. oeni se adapta mejor que las dems especies al cambio del entorno. Adems de la acidez del medio, estas bacterias soportan mejor que las dems las posibles carencias nutritivas y la toxicidad creciente resultante del metabolismo de las levaduras. Cuando ha cesado por completo la actividad de las levaduras o a veces incluso antes, la poblacin de BL, compuesta principalmente de O. oeni prosigue su adaptacin al medio, y, dependiendo de los factores limitativos con que se enfrente, desencadena un verdadero crecimiento, que puede ser muy rpido, cuestin de das o semanas. Finalmente, esta biomasa cobra entidad suficiente para que se observe la degradacin del cido mlico. Ese es el verdadero comienzo de la FML. Mientras quede cido mlico por degradar, contina la actividad, y la biomasa se mantiene elevada. Cuando todo se ha transformado, la biomasa se elimina por el sulfitado, que pone punto final al proceso de vinificacin. Entonces hay que estabilizar el vino de cara a cualquier desarrollo microbiano, pues va a empezar la crianza, que en principio no representa ms que transformaciones de tipo fisicoqumico. La mayora de las veces, el sulfitado elimina masivamente la poblacin de O. oeni que ha llevado a cabo la FML pero no consigue librar totalmente al vino de todas las bacterias. En ese momento, la microflora puede ser de nuevo totalmente mixta, y compuesta de diversas especies de lactobacilos y de pediococos adems de O. oeni. El sulfitado reduce la poblacin total, pero algunas cepas especialmente resistentes a las condiciones cada vez ms hostiles se seleccionan espontneamente, pudiendo originar alteraciones bacterianas.

Tabla 1. Recuento de BL durante la vinificacin de Cabernet Sauvignon


Recuento de bacterias lcticas durante la vinificacin de Cabernet Sauvignon (UFC ml-1) Especies nococcus ni Leuconostoc mesenteroides Pedicoccus damnosus Lactobacillus hilgardi Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Total
Nd: non dtcte

Das 0 Nd 2.9x10
2

3 Nd 1.7x10 8.0x10 2.0x10 2.0x10


4

6 Nd 9.6x10 4.0x10
4

10 4.3x10 3.2x10 4.4x10 Nd Nd Nd 1.8x104


3 3

18 3.4x106 Nd Nd Nd Nd Nd Nd 3.4x106

6.0x102 1.1x10 Nd 7.5x10 7.7x10


3

3.8x104
4

3.7x104
4

4.9x103
3

2.0x104
4 4

1 1

4.5x104 Nd Nd 1.5x105

2.5x103

1.7x105

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Fermentacin Malolctica
levaduras propuestas ha mejorado mucho durante los ltimos aos, aunque siguen producindose algunos fracasos. El segundo problema, si bien de menor importancia, es la falta de control sobre el impacto organolptico de las cepas implantadas. Si bien es cierto que las cepas de O. oeni pueden tener una incidencia significativa en los caracteres sensoriales del vino, muchas veces tambin resulta imprevisible, y parece depender mucho del propio vino. El inters de los productores de vino, de los enlogos, de los industriales de la fermentacin y de los cientficos por las BL no deja de acrecentarse. Los progresos alcanzados tanto en materia de vinificacin espontnea como de vinificacin controlada por levaduras malolcticas son buena prueba de ello. Los conocimientos y herramientas de investigacin se afinan, y se aplican a una mejor utilizacin de la diversidad natural de la especie O. oeni.

3.6 Conclusin
La vinificacin es el resultado de fenmenos espontneos ligados al crecimiento de las levaduras y bacterias en el vino. Sin embargo, el productor de vino desea controlar cada vez ms completamente los procesos fermentativos. Elige no slo el momento de inicio de las fermentaciones alcohlica y malolcticas, sino tambin el tipo de microorganismos encargados de llevarlas a cabo. Por ello se practica cada vez ms la siembra de levaduras, con un objetivo no slo de rapidez y exhaustividad de fermentacin de los azcares, sino tambin de aporte o de refuerzo de notas aromticas concretas en ciertos vinos. Para la FML, la demanda es idntica, si bien persisten dificultades de control del fenmeno. El primer problema es la dbil tasa de supervivencia de las BL en el vino, o incluso en el mosto en caso de inoculaciones precoces ("inoculacin conjunta" con las levaduras). La eficacia de las

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II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica


ndice

33 41 47
41 47

33

II.1. Necesidades nutricionales


Dr. Sibylle Krieger Lallemand

II.2. Fermentacin malolctica en barrica.


Piet Loubser Lallemand

II.3. Gua para resolver problemas -aplicacin prcticaAnnamarie kyne Lallemand Sigrid Gertsen-Briand Scott Laboratories

II.1. Necesidades nutricionales de la bacteria malolctica

Dr. Sibylle KRIEGER


Lallemand
1.1 Hidratos de carbono 1.2 Compuestos nitrogenados 1.3 Vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento 1.4 cidos orgnicos 1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada por las prcticas de vinificacin 1.6 Formulacin de nutrientes malolcticos

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II.1. Necesidades nutricionales de la bacteria malolctica

urante mucho tiempo se crey que la degradacin del cido mlico en cido lctico era la fuente de energa que permita el desarrollo de la bacteria malolctica (BML) en el vino1. Radler2 refut esa teora, al demostrar que en un medio sinttico, la proliferacin de las bacterias lcticas (BL) depende de la presencia de hidratos de carbono fermentables. Por lo general, las BL del vino son conocidas como microorganismos especialmente fastidiosos por sus complejas necesidades nutricionales. El apartado siguiente presenta las diversas necesidades nutricionales de las BL del vino en general, y de la Oenococcus oeni en particular.

1.1 Hidratos de carbono


Las condiciones de desarrollo durante la fermentacin malolctica (FML) del vino son muy difciles para las BL. Durante la FML, se degradan de 0,4 a 0,8 g/L de azcares, consistentes en su mayor parte en glucosa y fructosa, que son las principales fuentes de energa para el desarrollo bacteriano3. Radler4 ha calculado que para la degradacin de 1 g/L de cido mlico son necesarios aproximadamente 0,01 gramos de bacterias, y que 0,1 g de glucosa suministra energa suficiente para producir esta cantidad de biomasa. Prcticamente todos los vinos contienen estos azcares en cantidad suficiente para alimentar un desarrollo bacteriano que alcance para garantizar una FML completa, pero se ha demostrado que la FML se puede inhibir en los vinos cuyas concentraciones de glucosa y fructosa suman un nivel inferior a 0,2 g/L5. La Oenococcus oeni es heterofermentativa y convierte la glucosa en idnticas cantidades de D-cido lctico, CO2 y cido actico (o etanol). Casi todas las cepas de BML fermentan la glucosa y fructosa, y la mayor parte de ellas prefiere la fructosa a la glucosa, es decir que son fructoflicas. Cuando se desarrollan a partir de la fructosa como nica fuente de carbono, parte de este azcar se convierte en manitol, que produce un mol adicional de ATP, y dbiles concentraciones de cido actico. No obstante, si hay un exceso de manitol presente en el vino, se puede producir un problema denominado alteracin por manitol. Se caracteriza por un incremento de la produccin de cido actico y la aparicin de un sabor agridulce. Este fenmeno se aborda ms detalladamente en el captulo titulado Defectos organolpticos causados por una FML descontrolada.

33

II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

La mayor parte de las BL del vino son capaces de degradar las pentosas arabinosa y xilosa durante su crecimiento6. Los compuestos glicsidos presentes en el vino pueden ser todos ellos substratos para el desarrollo de BL, y Rosi et al.8 han demostrado el efecto positivo de los polisacridos producidos por levaduras (manoprotenas) en el inicio y la aceleracin de la FML. La mayor parte de las cepas de la FML deseada, Oenococcus oeni, son capaces de producir -glicosidasas7 y se pueden distinguir de otras cepas de BL por su incapacidad de fermentar la sacarosa, la lactosa y maltosa.

medios no sintticos de cultivo de la BML deben suministrar extractos de levadura o autolisado de levadura a los organismos16. Para utilizar estos tipos complejos de fuente de nitrgeno para su crecimiento, las bacterias tienen que ser capaces de hidrolizarlos a sus subunidades, y de transportarlos a la clula. Los estudios de secuenciacin del genoma de la Oenococcus oeni realizados por el grupo de Guzzos y la Genome Express Company han revelado la presencia de genes con una capacidad potencial de codificacin de proteasas y peptidasas, as como de transportadores de aminocidos y pptidos. Recientemente, Remize et al.17 han demostrado que dos fuentes distintas de nitrgeno derivado de la levadura tienen un impacto distinto, aunque dependiente de la cepa, en el crecimiento de la Oenococcus oeni.

1.2 Compuestos nitrogenados


Las BL requieren un suplemento extensivo de aminocidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y minerales9, lo cual significa que el contenido de nitrgeno del vino puede variar significativamente durante la FML10. Las necesidades de aminocidos especficos difieren de una cepa de BL a otra. La Oenococcus oeni y la Pediococcus pentosaceus aisladas en el vino pueden necesitar hasta 16 aminocidos distintos11, pero no pueden utilizar fuentes de nitrgeno inorgnicas, como el fosfato diamonio. La Oenococcus oeni, como demostraron Fourcassie et al.13, presenta una necesidad absoluta de los aminocidos arginina, cido glutmico, triptfano e isoleucina, y necesita otros seis aminocidos para su desarrollo ptimo. Lallemand ha estudiado las necesidades de nitrgeno de cuatro cepas comerciales de BL y de una cepa de laboratorio de las BL Oenococcus oeni en colaboracin con el grupo de Jean Guzzo, y compar los resultados con otros dos estudios descritos en la literatura13. De un total de 13 aminocidos, siete eran imprescindibles para el desarrollo. El cido glutmico era imprescindible para todas las cepas de los tres estudios, y la metionina, serina, fenilamina y tirosina resultaron vitales para la mayor parte de las cepas. La alanina, glicina y prolina ejercen un efecto menor en el crecimiento de la Oenococcus oeni, mientras que la valina, leucina, triptfano, isoleucina, histidina y arginina se pueden describir como en cierta medida imprescindibles, pues resultan necesarios para la mayor parte de las cepas de Oenococcus oeni y son necesarios, pero no imprescindibles, para las dems14. Se han confirmado las necesidades cuantitativas de cada aminocido, y es suficiente una concentracin inferior a 2 mg N/L para garantizar el desarrollo de las BL. Durante la proliferacin de la bacteria en el vino, puede disminuir fuertemente la concentracin de varios aminocidos, mientras que puede aumentar la de otros5. No se ha comprobado que la disponibilidad de aminocidos pueda ser limitadora del desarrollo2, pues las protenas y pptidos presentes en el vino tambin se pueden utilizar como fuente de aminocidos15. Se ha demostrado que el desarrollo bacteriano y la FML se ven estimulados por la presencia de compuestos nitrogenados derivados de levaduras, como los pptidos y manoprotenas de la pared celular. Todos los
34

1.3 Vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento


Adems del amino nitrgeno, las BL del vino necesita un suministro de purinas y pirimidinas o sus derivados. La adenina, xantina, guanina y uracilo tienen un efecto estimulante sobre el desarrollo de las BL. Varias vitaminas del grupo B son imprescindibles para el crecimiento, y aparentemente todas las cepas necesitan cido flico y cido nicotnico2. La necesidad de biotina, riboflavina, cido pantotnico y piridoxina depende de la cepa. Durante la produccin comercial de cepas de Oenococcus oeni, se puede incrementar el rendimiento de biomasa aadiendo pantotenato de calcio, tiamina y piridoxina, a razn de 1 mg/L de cada sustancia. 18. El descubrimiento de la contaminacin bacteriana de la salsa de tomate indujo la utilizacin del zumo e tomate como nutriente en la formulacin de medios de cultivo de la BL19. Amachi20 ha descrito un factor zumo de tomate como un derivado del cido pantotnico, y ha demostrado que es estimulador del crecimiento de la Leuconostoc oenos [Oenococcus oeni]. Zickler21 ha demostrado que el desarrollo de la BML denominada Bacterium gracile

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crecimiento inducido por el cido mlico. Aunque hasta hace poco se consideraba que la conversin de L-cido mlico en L-cido lctico y CO2 no produce energa26, la investigacin reciente indica que las clulas intactas de Oenococcus oeni generan ms ATP cuando se han desarrollado en presencia de L-cido mlico27.

requiere potasio, sodio, magnesio y concentraciones relativamente altas de iones de manganeso. El manganeso tambin desempea un papel vital en calidad de coadyuvante en la enzimologa de la FML realizada por BL. Por lo general, las concentraciones de todos estos iones son suficientes para permitir el crecimiento y metabolismo de las BL.

1.4 cidos orgnicos


Aunque el cido mlico es el cido ms importante metabolizado por las BL en el vino, sta tambin metaboliza otros cidos orgnicos, comentados a continuacin.

cido ctrico
El cido ctrico es un componente fundamental del mosto de uva y del vino, y se puede encontrar en concentraciones comprendidas entre 0,1 y 0,7 g/L. El metabolismo del cido ctrico por Oenococcus oeni se ha correlacionado con la sntesis del cido actico, el diacetilo y la acetona28. La Oenococcus oeni no es capaz de desarrollarse a partir del cido ctrico como nica fuente de carbono y energa. Pero en presencia de una fuente de energa como la glucosa, mejoran tanto la tasa de crecimiento especfica como la produccin de biomasa de la Oenococcus oeni29. La mejora del crecimiento en presencia de cido ctrico se debe, en parte, a un incremento de la produccin de ATP derivada de la fosforilacin durante el cometabolismo de la glucosa con el cido ctrico30. El cido ctrico queda completamente metabolizado en algunos vinos, y en menor medida en otros. Mayores concentraciones de cido ctrico31 estimulan la produccin de diacetilo y acetona por la Oenococcus oeni, y la mxima concentracin de diacetilo se observa al terminar la degradacin del cido mlico32. Durante la FML, la degradacin del cido ctrico se retrasa con respecto a la degradacin de cido mlico.

cido tartrico
A veces se observan pequeas reducciones de la concentracin de cido tartrico durante la FML. Lo ms probable es que estas variaciones se deban a modificaciones de la solubilidad del cido tartrico ms que a una degradacin microbiana real16. Slo se ha comprobado que degraden el cido tartrico algunas cepas de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y Lactobacillus arabinosus22. La degradacin del cido tartrico siempre va asociada al picado del vino.

cido mlico
Los cidos tartrico y mlico son los dos principales cidos orgnicos del vino, en especial de los vinos de climas fros. El cido mlico est naturalmente presente en su forma L. El D-cido mlico no est naturalmente presente en el mosto de uva, y no lo metaboliza las BL del vino. Varios estudios han demostrado que el L-cido mlico estimula el crecimiento y la produccin de biomasa de Oenococcus oeni23, 24. Durante el crecimiento con pH bajo, la bacteria degrada cido mlico a gran velocidad, mientras que los hidratos de carbono se degradan a poca velocidad. Este fenmeno induce un aumento global del pH, que por s mismo permite un incremento de la utilizacin de los hidratos de carbono, lo cual explica la observacin de

1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada por las prcticas de vinificacin


La clarificacin de mostos y vinos no slo puede eliminar fsicamente una amplia porcin de las BL, sino que adems puede reducir el desarrollo bacteriano potencial, lo cual incide en la calidad del vino19. Adems, la clarificacin elimina nutrientes y partculas en suspensin que estimulan el desarrollo bacteriano, con lo cual inciden an ms en la FML. De forma similar, se ha comunicado que los vinos elaborados utilizando el proceso de termovinificacin tienen menor capacidad de permitir la FML. La determinacin del momento de la inoculacin de la BL (tratada en otro captulo) tambin influir en la cintica de la FML. La disponibilidad resulta afectada por las interacciones entre los microorganismos del vino. Es corriente esperar que la mezcla de cultivos de microorganismos introduzca la posibilidad de relaciones antagnicas y sinrgicas, si bien, en algunos casos menores, los distintos microorganismos ejercen poca o ninguna influencia mutua. En la vinificacin, siempre existe la posibilidad de que se produzcan interacciones entre las BL y las levaduras, hongos, bacterias acticas e
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II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

incluso bacterifagos. Es ms, tambin se pueden producir interacciones entre diversas especies y cepas de BL20. El efecto antagnico de la levadura sobre las BL se ha explicado por la competencia por los nutrientes as como la produccin de sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano, como el SO2 o los cidos grasos de cadena media. A la inversa, la levadura puede sostener el desarrollo de las BL en el vino y estimular el avance de la FML. Durante el proceso de autolisis de la levadura, se liberan vitaminas y aminocidos en el vino, y el mayor contacto con las las asociado al proceso enriquece el vino con micronutrientes que estimulan la FML. Costello21 ha comunicado que una rpida mortandad de clulas de Oenococcus oeni sostiene el crecimiento de Pediococcus ssp. En condiciones de alto pH, el desarrollo precoz de la Lactobacillus brevis inhibe totalmente el desarrollo de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux (comunicacin personal) ha demostrado que las condiciones del vino que estimulan la FML pueden inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces nociva para el vino.

BL. En esas condiciones, es necesario aadir un nutriente bacteriano33. De forma similar, el aporte de un nutriente bacteriano es vital en los mostos cuyas concentraciones de nutrientes son naturalmente bajas, pues un poco de levadura puede producir niveles excesivos de SO2, que inhiben fuertemente el desarrollo de BL. Baste decir que siempre es fundamental una nutricin adecuada tanto de la levadura como de las BL. En las difciles condiciones de pH, SO2, alcohol y nitrgeno que se dan en el vino, la utilizacin de suplementos nutritivos permitir que la Oenococcus oeni sobreviva y se multiplique. Una cuidadosa preparacin de cultivos de inicio malolcticos y un uso adecuado de las preparaciones de nutrientes diseadas para esos cultivos garantizar el rpido inicio de la FML. Esto se ilustra en la Figura 1, que presenta los resultados obtenidos a partir de la inoculacin de un cultivo iniciador ML en un vino Chardonnay en presencia o ausencia de una preparacin de nutrientes ML. La cintica de la degradacin del cido mlico correspondiente a cada uno de los tres cultivos iniciadores es mucho ms rpida cuando se utiliza el nutriente, mientras que slo se degrad un mximo de 1 g/L de cido mlico cuando se aadieron bacterias en ausencia de suplemento nutricional. Se recomienda un buen suplemento nutricional de los cultivos iniciadores ML, y existe un recomendacin similar en relacin con la levadura. La nutricin de las BL es distinta de la de la levadura, y exige un riguroso control. En casos de escasez de nutrientes en el vino, la alimentacin adecuada del cultivo iniciador ML puede ser determinante para el xito de la FML. En palabras del inmortal Shakespeare, Ser, o no ser Figura 1.

1.6 Formulacin de nutrientes malolcticos


La investigacin extensiva ha contribuido a un mejor conocimiento de las necesidades nutricionales de los cultivos iniciadores malolcticos, las interacciones de las levaduras con dichos cultivos, y el impacto del medio del vino en el desarrollo bacteriano y la nutricin de las levaduras durante la fermentacin alcohlica. Por ejemplo, se sabe que si una levadura con elevadas necesidades de nutrientes realiza la fermentacin alcohlica, en el mosto se agotan rpidamente los factores necesarios para permitir el desarrollo de

Tiempo (das) Alcohol 14,1% v/v, SO2 total 14 ppm, pH 3,38 Inoculacin directa con cultivos iniciadores de ML con (+) y sin (-) adicin de nutrientes

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II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

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30. Ramos, A., y H. Santos. 1996. Citrate and sugar cofermentation in Leuconostoc oenos, a 13C nuclear magnetic resonance study. Appl. Environ. Microbiol. 62:2577-2585. 31. Nielsen, J. C., y M. Richelieu. 1999. Control of flavour development in wine during and after malolactic fermentation by Oenococcus oeni. Appl. Environ. Microbiol. 65:740-745. 32. Pfi tzer, B. 1992. Zur Physiologie der Bildung aromabzw. geschmacksbeeinfl ussender Substanzen durch Milchsurebakterien. Thesis. University of Hohenheim, Germany. 33. Lallemand Winemaking Update Number 2, 2004.

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Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica

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II.2. Factores medioambientales que afectan a la fermentacin malolctica

Piet LOUBSER
Lallemand
2.1. Factores bien conocidos 2.2. Factores menos conocidos

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Fermentacin Malolctica

II.2. Factores medioambientales que afectan a la fermentacin malolctica

e suele considerar que la fermentacin malolctica (FML) consiste simplemente en la descomposicin del cido mlico presente en los vinos tintos y en algunos blancos, con la emisin de CO2 que la acompaa, en la formacin de cido lctico y en una reduccin del contenido cido total del vino. De hecho, eso es exactamente lo que ocurre, pero aunque eso fuera todo lo que sucede durante la misma, esta descripcin sera una simplificacin excesiva del proceso. La descomposicin del cido mlico en cido lctico confiere estabilidad microbiolgica, y al mismo tiempo, la formacin de diversos componentes tambin produce un impacto organolptico. Es posible asimismo que la reduccin global de cidos, junto con el incremento del pH que la acompaa, d como resultado mejores vinos, ms suaves y redondos, con ms cuerpo.2, 4, 9, 10, 15, 19

En el pasado la FML corra a cargo, en buena medida, de las poblaciones bacterianas indgenas no siempre con los resultados deseados. Durante los ltimos aos, los vinificadores han pasado a disponer de cultivos bacterianos comerciales muy fiables para inducir la FML. Estos cultivos no slo frecen una FML ms fiable y con menores riesgos, sino que tambin aportan una tremenda contribucin al aspecto organolptico de los vinos. Estos cultivos bacterianos comerciales se seleccionan en funcin de criterios muy estrictos, y son capaces de funcionar en condiciones sumamente adversas. Tiene un impacto positivo en el perfil organolptico de los vinos, y contribuyen a incrementar su plenitud y complejidad.2, 4, 7, 9, 15, 19 En el buen desarrollo de la FML intervienen diversos factores, algunos de ellos bien conocidos, y otros menos. Vamos a comentarlos detalladamente para comprender mejor el proceso y la gestin de la FML.

2.1 Factores bien conocidos que afectan a la fermentacin malolctica


Entre los factores que determinan una buena FML, los que mejor se comprenden son el SO2, el pH, el alcohol y la temperatura. Para que se produzca una buena FML, los valores de estos parmetros qumicos deben coincidir con los niveles que permiten el buen funcionamiento de los cultivos bacterianos. Es importante recordar que estos factores funcionan de forma sinrgica, es decir que el efecto total de su accin conjunta es superior a la suma de sus acciones individuales. Adems, la concentracin favorable de un componente puede compensar la concentracin desfavorable de otro u otros componentes. Aunque resulta difcil asignar valores exactos a cada compo41

II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

nente, para garantizar una buena FML, es imperativo atenerse a los parmetros definidos por cada productor de cultivos.2, 4, 17, 18 El cumplimiento de esta regla quiz sea la consideracin ms importante para garantizar el xito de la FML. En algunos casos, puede resultar muy difcil producir un vino cuya analtica cumpla dichos parmetros generales. Los vinos tintos del Nuevo Mundo cosechados con un alto grado de madurez, y por consiguiente con altos niveles de alcohol son un ejemplo tpico. En esos casos, es importante seleccionar la cepa de levadura adecuada para producir el vino, as como la cepa bacteriana adecuada para realizar la FML. Incluso cuando todos los factores qumicos cumplen los parmetros deseados, en ocasiones el desarrollo de la FML resulta problemtico.13 A continuacin pasamos a comentar las posibles causas de estas anomalas.

alcohlica interactan mejor con ciertas bacterias para lograr una buena culminacin de la FML. En condiciones especficas, algunas cepas de levaduras pueden producir elevadas concentraciones de SO2, que influyen negativamente en la proliferacin y la supervivencia de las bacterias malolcticas. De forma similar, las cepas de levadura que presentan una necesidad desmedida de nutrientes pueden agotar el medio hasta el punto de eliminar las reservas de nutrientes disponibles para las bacterias. La aplicacin de una estrategia de nutricin especfica para una bacteria concreta durante las primeras fases de la fermentacin alcohlica puede solventar holgadamente este problema.10, 13, 16, 17

Varios factores menos conocidos pueden influir en el desarrollo de la FML. El hecho de que sean menos conocidos no significa que su impacto sea menos significativo. Entre dichos factores figuran los siguientes:

Taninos Dficits de nutrientes


La investigacin reciente ha demostrado que ciertos taninos de la uva pueden ejercer una influencia negativa en la bacteria malolctica, y por consiguiente en el desarrollo de la FML. De hecho, algunas investigaciones han indicado que ciertos varietales de tinto, como el Merlot, pueden presentar una gran dificultad en experimentar una buena FML.12, 18 Los resultados ms recientes de Lallemand indican que los cidos fenlicos influyen en la proliferacin de ciertas cepas bacterianas en medios de cultivo en laboratorio. El efecto sobre la estimulacin del desarrollo puede ser positivo o negativo, dependiendo de la especie bacteriana, del cido fenlico concreto utilizado y de su concentracin. Por ejemplo, el cido cafeico a 50 mg/L y 100 mg/L provocaba un efecto positivo sobre la proliferacin bacteriana y la degradacin del cido mlico. Por otra parte, el cido ferlico puede afectar negativamente al desarrollo bacteriano y a la degradacin del cido mlico, si bien depende de la cepa. El efecto inhibitorio ms acusado es el del cido p-cumrico, y se incrementa con la concentracin. Bsicamente, estos resultados coinciden con los comunicados por otros investigadores.9, 10. En estas circunstancias limitadoras, conviene considerar un nutriente que ayude al proceso de la FML. Para que la FML culmine con xito, es de la mxima importancia que las bacterias dispongan de una nutricin suficiente. El ejemplo siguiente ilustra la funcin crtica de la nutricin para la FML: se inocul en un mosto de Pinotage, el conocido varietal sudafricano, un cultivo malolctico comercial tras finalizar la fermentacin alcohlica; a los 110 das, slo se haba metabolizado un 40% de la concentracin inicial de cido mlico. Se examin el estado de salud del vino mediante un anlisis microscpico, y se determin su acidez voltil. Se hall poblacin de Oenococcus oeni correcta y saludable, lo cual, de hecho, constitua una confirmacin del cultivo inicial inoculado. Los niveles de acidez voltil tambin eran razonablemente bajos. Basndose en estos anlisis, se aadieron nutrientes especficos de la bacteria malolctica. A los once das, haba terminado la FML.11, 14 El concepto de la adicin de nutrientes no es sencillo. La importancia de las buenas prcticas de higiene y la adicin de cultivos malolcticos seleccionados estn estrechamente vinculadas y son vitales para suministrar nutrientes vitales a las bacterias inoculadas. Es importante garantizar que la FML se produzca siempre en condiciones higinicas y con una presencia de SO2 en el vino suficiente para controlar las poblaciones bacterianas indgenas. Igualmente importante resulta garantizar que se inocule en el

Seleccin de la cepa de levadura


Hace algn tiempo que se sabe que ciertas cepas de levadura seleccionadas para conducir la fermentacin
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2.2 Factores menos conocidos que afectan a la fermentacin malolctica

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Fermentacin Malolctica
vado que a pesar de que el oxgeno puede influir negativamente en la FML incluso a concentraciones reducidas, la micro-oxigenacin puede tener un efecto positivo sobre la FML debido a la leve accin de agitacin asociada al propio proceso de micro-oxigenacin.8, 17

vino el nivel recomendado de un cultivo comercial definido, con objeto de contar la presencia de suficientes bacterias buenas para que la FML culmine con xito cuando se aada el nutriente. En realidad, nunca se recomienda la adicin de nutrientes cuando se confa en las poblaciones de bacterias malolcticas espontneas, surgidas naturalmente, para llevar a cabo la FML. Para mayor informacin srvase consultar el captulo Necesidades nutricionales.

Residuos de fungicidas
Algunos residuos de fungicidas y pesticidas, y en especial de los primeros, pueden tener un efecto negativo sobre el funcionamiento de la bacteria malolctica. Los ms perjudiciales son los residuos de los compuestos sistmicos utilizados con frecuencia en aos hmedos para controlar el hongo de la botritis. En aos con una fuerte incidencia de contaminacin por botritis hay que tomar precauciones concienzudas. Los vinificadores deben conocer los programas y productos de pulverizacin utilizados, y deben ceirse a los periodos de descanso prescritos para los diversos productos fungicidas.2, 3

Compactacin de las
A resultas de la presin hidrosttica, las las presentes en el fondo de una cuba se pueden compactar hasta

Concentracin inicial de cido mlico


Las concentraciones de cido mlico difieren de un viedo a otro, y tambin pueden diferir de un ao para otro en un mismo viedo. Por ese motivo, junto con otros factores, la duracin de una FML puede diferir de un ao para otro.13, 14 Resulta especialmente difcil inducir una FML en los vinos con concentraciones de cido mlico inferiores a 0.8 g/L.8, 10, 13, 14 En estos casos, se recomienda utilizar cultivos ML iniciadores con una fuerte actividad de malato-permeasa.

tal punto que las levaduras, las bacterias y los nutrientes quedan atrapados y no pueden funcionar correctamente. Se ha observado recientemente que las cubas de grandes dimensiones pueden estar correlacionadas con un mayor retardo de la iniciacin de la FML. La inhibicin del comienzo de la FML en las cubas ms grandes se puede solventar bombeando el da de la inoculacin o el segundo da tras la inoculacin de las bacterias.8 La recomendacin general consistira en agitar peridicamente las las (al menos una vez por semana) para asegurar que las bacterias y nutrientes se mantengan en suspensin.8, 14

cidos grasos
Una buena FML depende en gran medida de la capacidad del cultivo malolctico iniciador de alcanzar y mantener una alta viabilidad celular en el vino. Para garantizar que as sea, es necesaria la presencia en el medio de niveles suficientes de cido oleico. En realidad, en el xito de la FML influye la capacidad de asimilacin del cido oleico que tienen las cepas bacterianas. Ciertas prcticas, como la clarificacin de los mostos, pueden dar lugar a un vino con carencia de cido oleico. En esos casos, el xito de la FML depender en buena medida de las concentraciones de cido oleico (C18:19) y de lactobacilo acidfilo cclico (C19:C9) presente en la propia cepa bacteriana. Si se ha inducido la FML utilizando recuentos celulares muy altos, puede que no se observe este fenmeno.2 Los cidos grasos de cadena media pueden tener un impacto negativo en el desarrollo de la FML. Alexandre et al. (2004) y Edwards et al. (1990) han indicado que el antagonismo observado entre las levaduras y las bacterias lcticas se podra explicar por la produccin de ciertos cidos grasos de cadena media (C6 a C12) derivados del metabolismo de las levaduras.1, 6
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Actividad residual de las lisozimas


Si se utilizan lisozimas durante la vinificacin, los niveles residuales de esta enzima pueden influir en el tiempo necesario para el desencadenamiento de la FML. Hay que seguir con atencin las recomendaciones del proveedor relativas al momento de adicin de la lisozima y de inoculacin del cultivo comercial para la FML.10 En la mayora de los casos se recomienda eliminar las las ms gruesas por trasiego.

Niveles excesivos de oxgeno


Se ha demostrado que la bacteria malolctica es sensible a los niveles excesivos de oxgeno. Esto significa que hay que evitar la exposicin de las bacterias a cantidades indebidas de oxgeno tras la terminacin de la fermentacin alcohlica. Tambin se ha obser-

II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

Referencias
1. Alexandre, H., P. J. Costello, F. Remize, J. Guzzo, and M. Guilloux-Benatier. 2004. Saccharomyces cerevisiaeOenococcus oeni interactions in wine: Current knowledge and perspectives. Int. J. Food Microbiol. 93:141-154. 2. Bauer, R., and L. M. T. Dicks. 2004. Control of malolactic fermentation in wine: A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. Vol. 25/2:74-88. 3. Bordons, A., M. Carme Masque, and M. Vidal. 1998. Isolation and selection of malolactic bacteria and effect of pesticides. En: The Management of Malolactic Fermentation and Quality of Wine, Lallemand Technical Meeting, Verona, Italia, 16-17 Abril 1998. 51-56. 4. Davis. C., D. Wibowo, R. Eschenbruch, T. H. Lee, y G. H. Fleet. 1985. Practical implications of malolactic fermentation: A review. Am. J. Enol. Vitic. 36:290 301. 5. Delteil, D., 2005. Comunicacin personal. (El Sr. Delteil es consultor del sector del vino.) 6. Edwards, C. G., R. B. Beelman, C. E. Bartey, y A. L. McConnell. 1990. Production of decanoic acid and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinifi cation. Am. J. Enol. Vitic. 41:48-56. 7. Henick-Kling, T., y T. E. Acree. 1998. Modification of wine flavor by malolactic fermentation. In: The Management of Malolactic Fermentation and Quality of Wine, Lallemand Technical Meeting, Verona, Italia, 16-17 Abril 1998. 17-22. 8. Krieger, S. 2005. Comunicacin personal. (El Dr. Krieger es Jefe de Investigacion y Desarrollo de Lallemand Inc.). 9. Kunkee, R. E. 1967. Malolactic fermentation. Adv. Appl. Microbiol. 9:235-279. 10. Lallemand Research and Development Reports, 1999-2004.

11. Lallemand Winemaking Update. 2004. Bacteria Nutrition The Key to Successful Malolactic Fermentation. 2:1-2. 12. Lonvaud-Funel, A. 2001. Interactions between lactic acid bacteria of wine and phenolic compounds. En: Nutritional Aspects II, Synergy between Yeast and Bacteria, Reunin Tcnica de Lallemand, Perugia, Italia, 27-30 Abril 2001. 27-32. 13. Loubser, P. A. 2004. Familiarise yourself with Malolactic Fermentation. Wynboer Technical Yearbook (a Wineland publication).2004/5:32-33. 14. Loubser, P. A. Trabajo experimental propio, 19932004. 15. Rankine, B. 1990. Malolactic fermentation is more complex than it appears. The Australian Grapegrower and Winemaker. 14. 16. Rauhut, D. 2001. Influence of the time of inoculation on the malolactic fermentation and the interactions between yeast and bacteria. In: Nutritional Aspects II, Synergy between Yeast and Bacteria, Reunin Tcnica de Lallemand, Perugia, Italia, 27-30 Abril 2001. 39-47. 17. Ribreau-Gayon, P., D. Dubourdieu, B. Doneche, and A. Lonvaud. 1998. Handbook of Enology, Volume 1, The Microbiology of Wine and Vinifi cations. John Wiley and Sons Ltd. 18. Vivas, N., M. Augustin, y A. Lonvaud-Funel. 2000. Influence of oak wood and grape tannins on the lactic acid bacterium Oenococcus oeni (Leuconostoc Oenos, 8413). Journal of the Science of Food and Agriculture. 80:1675-1678. 19. Wibowo, D., R. Eschenbruch, C. R. Davis, G. H. Fleet, and T. H. Lee. 1985. Occurrence and growth of lactic acid bacteria in wines. A review. Am. J. Enol. Vitic. 36:302313.

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Fermentacin Malolctica

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II.3. Gua para resolver problemas -aplicacin prctica-

Annamarie KYNE
Lallemand

Sigrid GERTSEN-BRIAND
Scott Laboratories
3.1 Si desea la fermentacin malolctica 3.2 La fermentacin malolctica se est desarrollando 3.3 Si no se desea la fermentacin malolctica

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Fermentacin Malolctica

II.3. Gua para resolver problemas -aplicacin prctica-

l plantearse la realizacin de la fermentacin malolctica (FML), es necesario tomar en cuenta numerosos parmetros fsicos y medioambientales. De todos ellos, los ms importantes son los Cuatro Grandes, a saber el pH, el alcohol, la temperatura y el SO2. Es importante tener presentes estas cuatro condiciones a la hora de preparar la inoculacin de bacterias malolcticas, pues actan sinrgicamente. Por ejemplo, si en el momento de la inoculacin la concentracin de alcohol es alta y el pH es bajo, el efecto combinado resultar en unas condiciones que pueden ser inadecuadas para permitir el crecimiento y el metabolismo de las bacterias inoculadas. Por norma general, si las condiciones siguientes se dan simultneamente en el vino, normalmente la FML se producir con relativa facilidad:

pH superior a 3.2; SO2 libre inferior a 10 ppm1; Temperatura superior a 18C; Alcohol inferior a 13% (v/v).

La Figura 1. ilustra los efectos interrelacionados de los Cuatro Grandes parmetros en la facilidad (o dificultad) de la FML. Es importante tomar en cuenta todos estos factores para decidir el momento del aporte de bacterias, la cepa de bacterias lcticas que se va a utilizar, y el tipo de cultivo (multiplicacin o inculo directo) que se va a utilizar. La comprensin del efecto del entorno total en las bacterias permitir tomar decisiones informadas con respecto a estas variables.

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II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

La gua de resolucin de problemas de la FML que se incluye a continuacin ayudar a disipar los misterios la FML en los diversos casos prcticos de vinificacin. La gua detalla todas las consideraciones necesarias asociadas a la realizacin de la FML. Tambin pretende ayudar a diagnosticar y, en su caso, rectificar fermentaciones malolcticas difciles de controlar. Se presenta en formato de rbol binario (S / No). Por ejemplo, si desea iniciar una FML, parta de A y prosiga a partir de ah siguiendo las instrucciones. Si la FML ya est en curso, pero surgen problemas, parta de B, y si no desea una FML, parta de C.

6. Controle la temperatura el intervalo ptimo es de 18-22C y evite los picos de calor durante la fermentacin, porque a medida que aumenta la temperatura, el alcohol resulta cada vez ms txico para las bacterias. A temperaturas muy bajas, se retrasan tanto la fermentacin alcohlica como la FML. 7. Controle las modificaciones del perfil aromtico del vino durante la FML mediante anlisis sensoriales rutinarios. Si se interrumpe la fermentacin alcohlica o si se permite el desarrollo de bacterias o levaduras indeseadas, se pueden modificar los aromas, y pueden aparecer malos sabores. 8. Controle el azcar, el L-cido mlico y la acidez voltil porque si el pH es alto, si se agota el cido mlico la Oenococcus oeni puede producir cidos voltiles a partir de los azcares. En ese caso, es preferible el control analtico al control sensorial. ii. A la mitad de la fermentacin alcohlica

RESOLUCIN DE PROBLEMAS DE LA FERMENTACION MALOLACTICA 3.1 Si desea la fermentacin malolctica y


a. Desea controlar la FML por inoculacin i. Al principio de la fermentacin alcohlica 1. Utilice una cepa de levadura compatible con la bacteria lctica. 2. Elija un cultivo bacteriano de proliferacin o un cultivo de inoculacin directa, en funcin de las condiciones ilustradas en la Figura 1. 3. Considere la conveniencia de aadir de un complejo nutritivo para la levadura, con objeto de reducir el riesgo de que se interrumpa la fermentacin alcohlica. 4. Tenga en cuenta que la cantidad de SO2 aadida en la trituradora determinar el momento del aporte del iniciador bacteriano: Inferior a 50 mg/L Inocule las bacterias inmediatamente despus de inocular la levadura 50 - 65 mg/L Espere 12 horas despus de aadir la levadura para aadir las bacterias Superior a 65 mg/L No se recomienda la inoculacin conjunta de levadura y bacterias. Mida el contenido de SO2 libre, pero controle tambin el SO2 total porque la Oenococcus oeni es capaz de liberar SO2 libre del SO2. 5. Tenga en cuenta el pH recuerde que el pH superior a 3.5 induce el desarrollo de organismos que alteran el vino; por debajo de este pH, la Oenococcus oeni pasa a ser dominante.

1. No se recomienda aadir bacterias lcticas en esta fase de la fermentacin. La fermentacin alcohlica activa sometera a las bacterias a un estrs excesivo.

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Aaron Kohr - FOTOLIA

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Fermentacin Malolctica
ma es de 18-22C. En climas ms fros, las bajas temperaturas pueden inhibir eficientemente la FML. 4. Controle el SO2 libre despus de la fermentacin alcohlica y asegrese de que sea inferior a 10 ppm. Despus de la fermentacin alcohlica, puede aumentar la concentracin de SO2 libre si la levadura es capaz de producir SO2. 5. Determine el grado alcohlico del vino. A mayor grado alcohlico mayor toxicidad, por lo que puede resultar necesaria una adaptacin de las bacterias mediante la utilizacin de un cultivo de proliferacin en vez de un cultivo de inoculacin directa. b. La FML corre a cargo de bacterias indgenas NO SE RECOMIENDA! i. Controle la poblacin bacteriana al menos una vez por semana, por microscopio o mediante tcnicas de cultivo en placas viables. Es de suma importancia prevenir la proliferacin de bacterias lcticas perjudiciales. ii. Mantenga una temperatura ideal de 1822C. Esto incrementar la posibilidad de que la FML la realicen bacterias indgenas favorables. iii. Ajuste y mantenga un pH inferior a 3.5. Los valores superiores a ste incrementan el riesgo de que se desarrollen organismos perjudiciales para el vino. iv. Controle el azcar, el L-cido mlico y la acidez voltil. Con un pH alto, la Oenococcus oeni may puede producir cidos voltiles a partir de los azcares. En ese caso, es preferible el control analtico al control organolptico. v. Realice un control organolptico semanal para detectar los cambios del perfil aromtico del vino y cualquier mal sabor que pudiera desarrollarse.

iii. Al final de la fermentacin alcohlica 1. Tenga en cuenta el tipo de vino que pretende elaborar, pues su carcter determinar el momento de induccin de la FML: Carcter afrutado sin notas mantecosas: Lgrelo mediante la inoculacin simultnea de las bacterias con la levadura, o aadiendo las bacterias nada ms terminar la primera fermentacin, cuando existe una gran poblacin de levadura disponible para degradar todo el diacetilo que pudiera producirse. Si desea obtener notas de diacetilo y de mantequilla: Estabilice el vino por filtracin o aporte de SO2 justo al final de la FML, en el momento en que se agota el cido mlico, o espere unas semanas despus de la primera fermentacin, para dejar morir las clulas de levadura y evitar que las clulas de levadura vivas consuman el diacetilo producido. 2. Elija una cepa de bacterias capaz de tolerar el grado alcohlico, el SO2, y pH del vino que se va a inocular. 3. Tenga en cuenta que la temperatura pti-

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II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

3.2 La fermentacin malolctica se est desarrollando


a. Lentamente. i. Determine si algn cambio introducido previamente en las prcticas de cultivo, como modificaciones de los tipos o concentraciones de caldos de pulverizacin aplicados al viedo, podran estar afectando a la FML. Las pulverizaciones sistmicas aplicadas al final de la temporada de crecimiento resultan especficamente txicas para la Oenococcus oeni. ii. Recuerde que el varietal de uva y las tcnicas de vinificacin aplicadas pueden incidir en la FML. A menudo resulta difcil completar una FML en los vinos de Chardonnay, Merlot y Tannat, y tambin resulta difcil en los mostos muy clarificados. iii. Tenga en cuenta los Cuatro Grandes parmetros ilustrados en la Figura 1. Han interactuado y creado un medio difcil para las bacterias? Si es as, elija una cepa bacteriana adecuada que pueda resistir esas condiciones. iv. Considere la adicin de un suplemento nutritivo, ya que puede ser vital y necesaria. Si la FML se ha iniciado, pero luego se ha frenado o interrumpido, la situacin puede estar indicando una escasez de nutrientes. A menudo, la carencia de uno o varios nutrientes concretos impide la buena implantacin de las bacterias en el vino, causando una reduccin de la viabilidad bacteriana. v. Puede haber cidos grasos de cadena media presentes en el vino, que pueden estar inhibiendo el desarrollo de las bacterias inoculadas. Si se aade un paquete nutritivo completo, se ayuda a reducir el efecto txico de estos cidos grasos de cadena media. b. Se ha iniciado, pero no ha culminado i. Compruebe que no han variado los parmetros crticos de vinificacin, tales como la temperatura, la acidez voltil y el SO2. ii. Controle analticamente las concentraciones de azcares residuales, acidez voltil y cido mlico, as como el grado de viabilidad bacteriana. iii. Compruebe que ha inoculado las bacterias en las concentraciones recomendadas por el fabricante.
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iv. Confirme el mtodo preparacin del iniciador bacteriano. 1. Proliferacin estndar de clulas en crecimiento Asegrese de que ha preparado correctamente el inculo. Sea objetivo, y cercirese de que ha han seguido todos los procesos y procedimientos necesarios. Determine el material utilizado en la preparacin del iniciador. No utilice concentrado de uva, pues puede contener concentraciones excesivas de SO2 libre que provocan una inhibicin de las bacterias. 2. Inoculacin directa Compruebe si las bolsitas que contienen las bacterias estaban almacenadas correctamente. Si las bolsitas han estado expuestas a una temperatura excesiva, puede que las bacterias hayan muerto. Cercirese de que el paquete utilizado ha permanecido cerrado hermticamente y slo se ha abierto justo antes de ser utilizado. Compruebe que en la inoculacin se ha utilizado la cantidad correcta de clulas. Si no se han aadido suficientes bacterias para alcanzar la dosificacin correcta, aada ms. v. Determine si un bacterifago, es decir un virus que elimina las bacterias, podra ser responsable de que la FML no haya terminado. El cultivo microbiolgico en placas ayudar a determinar si ha sido el caso.

3.3 No se desea la fermentacin malolctica


i. Mantenga el vino a una temperatura de 10C. ii. Aada lisozimas, a una concentracin de 300-500 ppm. Las lisozimas son enzimas que se desarrollan naturalmente y resultan txicas para la mayora de las bacterias lcticas, si bien algunas cepas no son sensibles a las mismas. iii. Aada 30-50 ppm de SO2. La cantidad real que hay que aadir depende del pH del vino. iv. Elimine las bacterias mediante una filtracin por membrana. La filtracin con membranas de 0.45 retira las bacterias.

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Fermentacin Malolctica

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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica


55 59
59 55
III.1. Estudios sobre la prdida de color durante el proceso malolctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004
Manuel Ruiz Ingeniero Tcnico en Industrias de Fermentacin

69 77
77

69

III.3. Efectos de los contaminantes microbiolgicos inducidos por la fermentacin malolctica descontrolada en vino
Jrg Gafner Astrid Bachmann, Andrea Frei Francis Hesford Naomi Porret Katharina Schneider Agroscope

III.2. Percepcin del consumidor bien informado de defectos organolpticos del vino provocados por fermentacin malolctica sin control
Antonio Palacios Carlos Surez Sibylle Krieger Didier Theodore Luis Otao Francisco Pea Dr. Ingeniero Agrnomo y Enlogo

III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos


Vincent Gerbaux ITV Francia

III.1. Estudios sobre la prdida de color durante el proceso malolctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004

Manuel RUIZ
Ingeniero tcnico en industrias de fermentacin La Semana Vitivincola, N 3050 (22 enero 2005)

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Fermentacin Malolctica

III.1. Estudios sobre la prdida de color durante el proceso malolctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004

a demanda de calidad en los vinos tintos incide en el alto contenido de color y sensaciones suaves. El proceso malolctico contribuye a definir una sensacin de suavidad en la boca pero tienen un tributo en color. Este tributo en color se estima en un 20-30% como intensidad colorante y en torno al 5% en valor ndice de Polifenoles totales. Es intencin de los enlogos conseguir la suavidad sin perder color y tal es la intencin tambin de este estudio.

Circunstancia interesante de la cosecha 2004 de Tempranillo en Rioja es la diversidad de contenidos de cido mlico en la uva. Mientras una cosecha estndar oscila entre 3 y 4 gramos por litro de mosto, en la del ao 2004 nos hemos encontrado con variaciones desde 1,8 hasta 5,5 grs/l. Ante esta situacin los tcnicos nos hemos preguntado con temor si la prdida de color puede ser proporcional al cido mlico degradado por las bacterias, lo cual nos hara suponer peligrosamente que en vinos de buen color con 13 de alcohol pero con 5 grs/l. de cido mlico el proceso de color podra ser desastroso. Para discernirlo hemos planteado una experiencia de laboratorio a partir de un vino tinto de Labastida que no haba desarrollado an el proceso malolctico. Sus caractersticas son: Grado Azcares cido mlico pH Acidez voltil Acidez total Intensidad colorante IPT IP 13,49 1,84 grs/l. 2,3 grs/l. 3,53 3,53 7,89 grs/l. 13,5 66 1,6
Agente sembrado: Oenococcus oeni (Vitilactic F. Martn Vialatte a travs de Dolmar)

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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Se sembr con bacterias para DML en vino y se distribuy en cuatro fracciones en erlenmeyer:

Resultados Muestra Testigo sin DML Mlico 2,3 Mlico 3,0 Mlico 4,0 Mlico 5,0
IC= Intensidad Colorante. IPT= ndice de Polifenoles Totales.

T. Induccin 12 das 5 das 5 das 8 das

IC 13,5 12,8 13,2 12,8 12,9

IPT 66 63 63 64 63

IP 1,6 1,5 1,4 1,5 1,5

A. Mlico 2,3 0,1 0,1 0,1 0,2

IP= ndice Polimerizacin. Tiempo de Induccin= N de das que tarda en iniciar desaparicin del cido mlico.

1.- Testigo con 2,3 grs/l. de mlico. 2.- Adicin de L(-) mlico hasta 3 grs/l. 3.- Adicin de L(-) mlico hasta 4 grs/l. 4.- Adicin de L(-) mlico hasta 5 grs/l.

Y la otra derivacin se observa al entender que en bodega no logramos cadas de IC en el proceso DML inferiores al 18% y en este ensayo lo hemos conseguido apenas del 5% . Lo diferente es el volumen de estudio. En bodega de 30.000 litros y en erlenmeyer de 200 cc. Como no vemos razn directa en volmenes se nos ocurri pensar que volumen diferente tiene relacin con aireacin diferente por relacin de superficie libre del lquido muy diferente. Entonces pensamos en la influencia redox sobre la prdida de color en el proceso DML. Para ello planteamos sobre un vino tinto del 2004 de San Asensio con 3,6 grs/l. de cido mlico un estudio DML/redox. Una muestra tal cual con siembra y otra con siembra pero corregida con aportacin de 100 mgs/l. de cido ascrbico. El proceso DML en estufa y matraces erlenmeyer con 300cc. de contenido arrojaron la misma velocidad de fermentacin DML pero los resultados finales fueron:

Se situ en estufa a 22C. y se sigui el proceso DML, retirando las muestras cuando concluy el mlico y pasndolas a situacin de 10C. La incgnita de planteamiento queda resuelta. La prdida de color durante el proceso DML no es proporcional a la cantidad del cido mlico desdoblado. Pero existen dos derivaciones interesantes. Una, como conclusin, que expresa que la DML se desarrolla muy bien a nivel de 3-4 grs/l. de cido mlico y mal para valores inferiores. Que a su vez tendra otra subderivacin. Por qu la DML se dificulta con tan slo 2 grs/l. de mlico y el vino en botella es inestable con 0,7 grs/l. de mlico?

IC Vino Testigo sin DML Desarrollada DML Desarrollada DML Vit. C. 17 15,4 11,2

IPT 71 69 63

IP 1,5 1,4 0,9

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Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica Conclusiones


La prdida de color durante el proceso DML de los vinos tintos no esta relacionada con la cantidad de cido mlico de la uva. El periodo de induccin del proceso DML es corto en contenidos de 3 a 4 grs/l. de cido mlico y se dilata para contenidos diferentes. La prdida de color en el proceso malolctico es proporcional al nivel de reduccin del vino.

Los resultados son muy ostensibles. Cuando el vino est reducido el tributo en color de la DML es muy fuerte. Esto explica que en la prctica la prdida de color en el proceso malolctico sea inferior cuando se hace en barrica o cuando se retrasa, ya que estas acciones suponen atenuar el valor reductor resultante en el vino despus de la fermentacin tumultuosa. Y como subderivacin de todo esto intentamos en estudios posteriores, determinar el nivel de oxigenacin o redox en milivoltios para desarrollar una DML sin tributo de color o mnimo y tambin conocer si esta desaparicin es inicial o final del proceso DML.

Bibliografa
M. Ruiz Hernndez. Sobre la evaluacin del riesgo de prdida de color de los vinos tintos jvenes a travs del proceso DML. Sevi n 2787. 2000.

M. Ruiz Hernndez. Aportacin al estudio de destruccin de antocianos durante la DML de vinos de Tempranillo. Sevi n 2866, 2001. M. Ruiz Hernndez. Sobre los ndices de color en vinos tintos de Rioja de las cosechas 2000 y 2001, a travs del proceso DML. Sevi n 2907, 2002.

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III.2. Percepcin del consumidor bien informado de defectos organolpticos del vino provocados por fermentacin malolctica sin control

Antonio PALACIOS* Carlos SUAREZ* Sibylle KRIEGER* Didier THEODORE* Luis OTAO** Francisco PEA***
* Lallemand Pennsula Ibrica ** Universidad de la Rioja, Dto. Agricultura y Alimentacin ***Catador experto ciego absoluto
2.1 Las bacterias en el vino, los peligros 2.2 Las alteraciones 2.3 Las bacterias en el vino, las contribuciones positivas 2.4 Impacto organolptico de la fermentacin malolctica 2.5 Metabolismo de la fermentacin malolctica 2.6 Materiales y mtodos utilizados 2.7 Resultados obtenidos 2.8 Conclusiones

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Fermentacin Malolctica

III.2. Percepcin del consumidor bien informado de defectos organolpticos del vino provocados por fermentacin malolctica sin control

l vino es uno de los productos ms antiguos donde los procesos microbiolgicos hacen una contribucin importante en la calidad final del producto. La elaboracin del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, no obstante nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biolgicos, son cada vez mas aceptados y utilizados en las bodegas. Principalmente porque cada vez mas a menudo, se hace necesario dar una respuesta a la demanda especfica en el mercado de vinos, especialmente de calidad. Para ello es necesario cumplir unos requisitos:

Limitacin de los elementos qumicos en el perfil organolptico: lo que supone desarrollar una optimizacin de las dosis de SO2 a utilizar y prestar atencin a la fase de latencia de la FML de los vinos. Limitacin de compuestos con riesgo sobre la salud: la obtencin de vinos higinicos para el consumidor, lo que supone que el vino est libre o con mnimas concentraciones en aminas bigenas (especialmente histamina) y de carbamato de etilo. Desarrollo y estabilizacin de la calidad general del producto a lo largo de su vida comercial. Lo que supone una estabilizacin de la calidad aromtica y de la expresin polifenlica, tanto la parte responsable del color como el constituyente tnico del vino. Otro aspecto interesante del mercado de vinos, es que los productos con xito son muy cambiantes en el tiempo. R. Klein, por ejemplo, cit en 1997: el gusto de los consumidores ha cambiado a travs de los tiempos, la mayora de los consumidores prefieren un vino blanco afrutado con una acidez moderada, refirindose especialmente a los vinos blancos de moda actualmente. Por lo que el control de la FML se hace cada vez ms necesario en un mayor tipo de vinos.

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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

2.1 Las bacterias en el vino, los peligros


Uno de los principales problemas que pueden provocar las bacterias en el vino es el aumento de la acidez voltil. Aunque tambin un exceso en diacetilo puede causar la desaparicin del afrutado. Ciertas cepas de bacterias lcticas tambin pueden hacer aparecer aromas y gustos indeseables. Otro de los riesgos de la FML sin control, es la prdida significativa del color, bien por actividad enzimtica de las bacterias y por el aumento del pH. Tambin la produccin de histamina y carbamato de etilo, que son nocivos para la salud humana, estn fuertemente influenciados por esta fermentacin. Los agentes causantes de estos problemas son algunas cepas del gnero Oenococcus y muchas cepas de los gneros Lactobacillus y Pediococcus.

por ejemplo el metabolismo de la arginina por parte de las bacterias, que da como resultado la produccin de citrulina y carbamil-fosfato. Si este compuesto reacciona con la urea producida por algunas levaduras durante la fermentacin alcohlica, puede dar lugar a carbamato de etilo, compuesto txico para la salud humana y para el que existe un lmite legal distinto segn los pases donde se vaya a vender el vino. La descarboxilacin de determinados aminocidos da como resultado la presencia en el vino de diversas aminas bigenas (histamina, putrescina, cadaverina, etc.), que al igual que sucede con el carbamato de etilo, pueden resultar txicas para la salud humana.

2.3 Las bacterias en el vino, las contribuciones positivas


La contribucin positiva ms evidente es la disminucin de la acidez total del vino, especialmente del cido mlico. Pero tambin la produccin equilibrada de etil-lactato, diacetilo y otros compuestos aromticos es positiva, ya que dan mayor complejidad aromtica. El incremento de los aromas varietales, como se ha demostrado ya por algunos autores, (Gerland, C., 1999). La reduccin de notas vegetativas y la disminucin de la astringencia y el amargor final en boca, es a veces muy notable. En algunos casos, tambin aumenta la redondez en boca y la suavidad de los taninos. Debido al consumo de acetaldehdo, que puede ser muy intenso para algunas cepas (R. Mira de Ordua, 2001), se reduce la combinacin del SO2, lo que permite rebajar su dosis. Los agentes positivos son algunas cepas de bacterias lcticas del gnero Oenococcus. Por esta razn es tan importante continuar realizando seleccin de bacterias naturales que sirvan de inculos para la obtencin de vino de calidad con un mayor control de los procesos biolgicos.

2.2 Las alteraciones que pueden aparecer en los vinos como resultado del metabolismo de bacterias lcticas son de forma general las siguientes:
Picado lctico: aparece en condiciones favorables para el desarrollo de bacterias (fermentaciones ralentizadas o paradas) cuando todava hay azcar en el mosto. Se transforman los azcares de seis tomos de carbono en etanol, carbnico y cido actico. En el medio aparece el ismero D del cido lctico, mientras que el Llctico se origina en la FML. Este fenmeno es provocado por bacterias lcticas. Amargor: degradacin del glicerol generando acrolena. Por la combinacin de sta con los taninos, aparecen sabores amargos muy desagradables en el final de boca. Produccin de fenoles voltiles: que en el caso de los vinos tintos son el 4-vinilfenol, 4vinilguayacol, 4-etilfenol y 4-etilguayacol, responsables de olores a cuadra, a sudor de caballo, etc. La aparicin de estos compuestos se asocia a la accin de algunas cepas de Pediococcus y Lactobacillus, aunque los microorganismos mximos responsables de estos defectos organolpticos son levaduras contaminantes del gnero Brettanomyces y Dekkera. Produccin de bases heterocclicas aromticas, por parte de algunas cepas de las especies Lactobacillus heterofermentativos y Oenococcus oeni, asociadas a aromas desagradables identificados como gusto a ratn. Al igual que el caso anterior, estos defectos tambin pueden deberse a la accin de levaduras del gnero Brettanomyces/Dekkera. Por ltimo, se pueden producir alteraciones que afectan a la calidad sanitaria del vino. Como es
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2.4 Impacto organolptico de la fermentacin malolctica


Los vinos que han realizado la FML suelen tener una valoracin comn en cata, encontrndose descriptores positivos; como la mantequilla, nueces, toques de levadura, miel, vainilla, cuero, tonos vegetativos, especiados, tierra, tostados, ms cuerpo y redondez, con taninos dulces y mayor persistencia en boca. Pero con FML mal controlada, se puede tambin terminar con la aparicin de descriptores negativos; como aromas lcticos intensos, yogurt cido, aromas de sudor, tonos mantecosos, presencia de acetatos, amargor intenso final y el gusto animal en retronasal. El impacto del diacetilo en el perfil aromtico del vino es muy variable. Dependiendo de la concentracin alcanzada, los aromas aportados pueden ser muy diferentes. As con una concentracin de 5-14 mg/l, los aromas dominantes son los de mantequilla, mien-

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Fermentacin Malolctica
cin del cido mlico, tampoco hay degradacin del cido ctrico y hay alta produccin de cido actico. 2. Fase estacionaria I: no hay utilizacin del azcar por parte de la bacteria, es cuando el cido mlico se transforma en cido lctico. No hay degradacin de cido ctrico, ni produccin de cido actico. 3. Fase estacionaria II: no existe degradacin del azcar, no hay catabolismo del malato, pero la bacteria aprovecha el cido ctrico, produciendo cido actico y diacteilo en exceso. Esta es la fase que hay que evitar en vinificacin mediante tratamientos con SO2 y lisozima.

tras que con una concentracin de 2-4 mg/l, los aromas presentes son de nueces, caramelo, levadura y piel mojada. El umbral de percepcin es superior en los vinos tintos que en los blancos, por eso los vinos tintos soportan mayores concentraciones de diacetilo. Entonces dependiendo del objetivo de vino, interesa o no evitar el consumo del cido ctrico como fuente de diacetilo.

2.5 Metabolismo de la fermentacin malolctica


La evolucin de las bacterias en el vino durante la FML est marcada por tres fases bien diferenciadas metablicamente (Figura 1). 1. Crecimiento celular: utilizacin del azcar del medio para obtener energa. No hay degrada-

Figura 1.
Evolucin de diferentes metabolitos durante la FML Crecimiento celular
azcar

Fase estacionaria I

Fase estacionaria II
biomasa

ac. mlico

ac. lctico

ac. ctrico ac. actico ac. actico Tiempo

2.6 Materiales y mtodos utilizados


Se cataron 22 vinos en total: dos testigos y 20 vinos modificados por adicin de distintas concentraciones de diacetilo (vino blanco: 0,1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y en el vino tinto: 0,1 ppm, 10 ppm, 30 ppm), aminas bigenas voltiles (putrescina y cadaverina en vino tinto en concentraciones de 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm y 100 ppm) y etilfenoles (2-etil-fenol y 2-etil-guayacol en vino tinto en concentraciones de 425 g/l, 800 g/l y 1000 g/l), agrupados en 6 series en funcin de estos compuestos, (DB: diacetilo en vino blanco,

DT: diacetilo en vino tinto, P: putrescina, C: cadaverina, EF: etilfenol y EG: etilguayacol). Dichas muestras se sometieron a un panel de cata formado por 24 consumidores informados previamente de los riesgos en vinificacin de contaminaciones microbianas que pueden provocar la aparicin de defectos organolpticos mediante un curso breve de 30 minutos. Los resultados se evaluaron mediante un cuestionario (Figura 2). Estos datos se contrastaron con la opinin de un catador profesional ciego absoluto.

Figura 2.
Cuestionario utilizado durante la cata

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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

2.7 Resultados obtenidos


Los catadores encontraron con una alta frecuencia defectos que ellos identificaron mediante descriptores definidos de forma diferente y elegidos libremente por ellos mismos. Lo hicieron de forma ms evidente segn la concentracin del producto aadido

aumentaba, especialmente en los casos de los etilfenoles y el diacetilo, tanto en vino blanco como el tinto y de forma menos clara cuando los vinos tenan adiciones de aminas biognicas (Figura 3). Los defectos ms fciles de identificar fueron los provocados por las adiciones de etilfenoles y el diacetilo en el vino blanco.

Figura 3.
Frecuencia de deteccin de defectos por los catadores

Los defectos encontrados en los vinos con adiciones de diacetilo son diferentes segn se trate de vino blanco o tinto, tambin la frecuencia de deteccin de defectos identificados cambia. En el vino blanco un 31% de los catadores identificaron un defecto pero no supieron definirlo. El defecto ms frecuente fue

descrito con los descriptores de aromas a mantequilla, queso y cierta tendencia a la oxidacin, como si se tratase de un vino evolucionado. En vinos tintos, la frecuencia de no identificacin aumenta hasta el 43% y dentro de los identificados, los ms comunes son de mantequilla y tonos almendrados (Figuras 4 y 5).

Figura 4.
Descriptores en el vino blanco con diacetilo.

Figura 5.
Descriptores en el vino tinto con diacetilo.

7% 13%

2% 2%

3% 31%
8%

5%

3%

3%

3%

3% 43%

8%

15% 27%
N o id e n t if ic a d o O x i d a c i n Ques o J ab n M a n t e q u il la F e r m e n ta c i n E v o lu c i n V a i n i lla

8% 16%
N o id e n tif ic a d o A c e ito s o C ue ro A g u a s u c ia M a n te q u il la V a in il la R e d u c c i n A lm e n d r a a m a r g a C orcho Jabn

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Fermentacin Malolctica
Respecto a los etilfenoles, hay que destacar que la identificacin de problemas resulta mucho ms fcil para los catadores. Existiendo una estrecha relacin entre concentracin y aumento de identificacin y descripcin del defecto. En el caso del 2-etil-fenol, tan solo un 7% no encontr adjetivos para describir el problema. Los ms utilizados fueron los de cuadra, cuero, aromas animales, boiga, caballo y betn (Figura 8).

Cuando el vino tinto fue modificado con las adiciones crecientes de putrescina, no hubo relacin entre la concentracin adicionada y mayor identificacin de defectos. Un 30% de los catadores encontraron defecto sin saber identificarlo. Los descriptores ms utilizados para describir el defecto fueron de fruta podrida y sensacin de fermentacin, aromas rancios y suciedad (Figura 6).

Figura 6.
Descriptores en vino tinto con putrescina

Figura 8.
Descriptores en vino tinto con 2-etil-fenol
2% 2% 2%

2% 5% 7%

2% 2% 2% 2% 2%

2% 2%

5%

4%

7% 35%

30%

12%

12% 19%

9% 12%
N o i d e n t if ic a d o R a n c io Q u m ic o C r n ic o A g u a s u c ia F r u t a p o d r id a L ac a V m it o E v o l u c i n J ab n

21%
F e r m e n ta c i n M a d e r a p o d r id a M e d ic a m e n to A n im a l

N o id e n ti f ic a d o B o ig a M a d e r a m o ja d a

C uadra C a b a l lo B r e tt

C ue ro B e t n

A n im a l L aca

En el caso del 2-etil-guayacol, la frecuencia para encontrar un defecto aunque sin descripcin aumenta hasta el 31%. Los descriptores ms utilizados para identificar el problema fueron de moho, medicamento, aromas a quemado (Figura 9).

Cuando la amina bigena adicionada fue la cadaverina, existe una tendencia a aumentar la identificacin del defecto segn aumenta su concentracin en el vino. Un 36 % encontr defecto sin saber identificarlo. Los descriptores ms utilizados por los consumidores estn en relacin con aromas crnicos y avinagrados, con ciertos tonos sucios (Figura 7).
5%

Figura 9.
Descriptores en vino tinto con 2-etil-guayacol

4% 5% 5%

2% 2% 2% 2%

31%

Figura 7.
Descriptores en vino tinto con cadaverina

7% 17% 18%
M e d ic a m e n t o O x i d a c i n T ie r r a m o ja d a Que m ado Yodo Ques o

4% 4% 4%

4% 2%

2% 2% 2% 2% 36%
N o id e n ti f i c a d o M o s ta z a V e rdura M oho Form ol P in tu r a

8% 30%
N o id e n tif ic a d o F e r m e n ta c io n R e d u c c i n G u is o d e c a r n e M e d ic in a Hu m e d ad V in a g r e C aza A n im a l F r u ta p o d r id a M a n t e q u il la F s fo r o

En la tabla 1 se presentan vino a vino la frecuencia de deteccin de defectos y la intensidad con la que puntuaron los vinos cada uno de los catadores, adems de los adjetivos elegidos por ellos de forma libre. Dependiendo de la intensidad descrita, se valor de forma distinta la frecuencia de deteccin del defecto. La intensidad baja puntu de forma unitara, la intensidad media 2 veces y la intensidad alta puntu 3 veces.
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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Tabla 1.
Tipos de defectos encontrados y grado de intensidad otorgada por los catadores Muestra 1DB 2DB 3DB 1DT 2DT 3DT 1P 2P 3P 4P 1C 2C 3C 4C 1EF 2EF 3EF 1EG 2EG 3EG
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Tipo de defecto Queso III; Oxidado; No identificado II; Jabn; Mantequilla

Intensidad Baja Media ****** *** * Alta

No defecto ************ **

Defecto 13 37 35 9 22 36 16 20 14 13 13 16 18 24 24 57 65 30 42 49

No Defecto 14 7 5 17 11 7 13 11 15 14 16 12 10 9 11 3 0 10 3 2

No identificado III; Oxidado I; Mantequilla III; ***** **** Evolucionado; Levadura; Queso II; Detergente I

****** ******* **

Lcteo I, No identificado IIIII; Gasolina; ****** ****** ***** ***** Evolucionado III; Mantequilla; Queso III; Vainilla ** No identificado III; Aceite; Almendra amarga; Jabn No identificado IIIIII; Aceite; Corcho; Mantequilla; Almendra amarga; Vainilla; Cuero ***** ** ***** ****** * * ************ ***** ***********

No identificado IIII; Aceite; Corcho; Mantequilla IIII; **** Reducido; Agua sucia; Almendra amarga; Vainilla I No identificado III; Qumico; Podrido; Fruta podrida I; Vmito; Laca I

****** ****** ******* * * ************ ** *********** ************ *** ************ ** ************ **** ** * ************ ********** ********* ***********

***** ****

No identificado IIII; Rancio; Madera hmeda; Podrido; ****** ***** * * Fruta podrida; Quitaesmalte; Fermentacin I Rancio I; Fermentacin II; Medicamento; Crnico; Barniz; No identificado ***** *** *

Evolucin; Madera hmeda; No evolucionado; Caballo; ****** *** Agua sucia; Podrido; Fruta podrida I; Jabn; No identificado * No identificado II; Humedad III; Guiso No identificado I; Humedad III; Guiso; Esmalte; Fsforo; Fermentacin I; Mantequilla No identificado IIIII; Humedad III; Reduccin; Fruta pasada; Vinagre *** *****

****** *** * ****** ** *****

No identificado III; Humedad I; Caza I; Vinagre II; ****** ****** * * * Medicina; Fruta pasada; Queso Tronco; No identificado III; Cuero; Animal I; Cuadra II; Laca; Sudor ***** ***** *** ****

Cuadra IIIIIII; Betn I; Cuero III; Sudor de caballo; * Animal II; Boiga I Cuadra IIIIIIII; Cuero IIIII; Sudor de caballo; Boiga III; Animal I; Brett No identificado II; Oxidado; Medicina II; Quemado; Queso; Formol; Moho I; Yodo * ***

****** ****** *** ****

****** ***** ****** ****** ****** ***** **********

No identificado IIIIIII; Oxidado; Medicina I; ****** ****** ****** *** * * Quemado; Moho II; Verdura; Mostaza II; Formol * No identificado IIII; Oxidado; Medicina IIII; Quemado I; Moho IIII; Pintura; Tierra; Formol **** ****** ****** ** *** ***

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Fermentacin Malolctica
3TD: Aromas de leche hirviendo a copa parada y de yogurt natural y cuajada con miel. Los aromas lcteos son muy dominantes y tapan todo lo dems. Boca con dominancia del lcteo que recuerda la cuajada. Final de boca a caf con leche, moca de caf y cacao. 1P: Aromas florales y de fresa, carcter especiado con recuerdos de humami. Tonos crnicos de sangre con recuerdo a la morcilla, tierra hmeda y de lombriz. Aromas de salinidad, salitre, recuerdo de cangrejo de playa y marisco, tambin de pez fresco vivo recin pescado. En boca resulta un vino marinero y con dominancia del carcter humami. Percepcin de arroz, paella de marisco de bivalvos. 2P: A copa parada intenso melocotn muy maduro y fruta en almbar, regaliz rojo, corteza de rbol. Jersey de lana y algodn. Aromas de bacalao ahumado y salado, piel de bacalao. Escamas de pez. En la boca aparecen de nuevo aromas de arroz pasado. Recuerdo de flor de levadura muy desagradable, arroz quemado de paella. Vegetales en putrefaccin va retronasal. 3P: Muy especiado al principio, pero se convierte luego en un vino con aromas muy desagradables de aguas fecales y de desecho. Muy desflecado en sus sensaciones gustativas, vomitivo en boca, retronasal ftida. 4P: Intenso y especiado a copa parada. Ptalos de flor de geranio, yeso hmedo, escayola. Aromas de corteza de alcornoque hmeda con moho. Aguas fecales, a cubo de basura, paal de nio. En boca recuerda a abono orgnico de origen animal, a purn de establo de vaca. 1C: Nariz con aromas crnicos y especiados, aromas de sudor humano, axila, cabello recin cortado. Recuerdos de pizarra en la familia de los minerales, canto rodado. Aromas de ptalo de rosa muerto, en putrefaccin. Recuerda a cucaracha con sensacin de bltido al final de la evolucin olfativa. En boca muy modificado, muy crnico, guiso de ternera con guisantes. Retronasal de insecticida. 2C: Aromas de yeso o cemento hmedo recin preparado en agua. Aromas de peluquera, con laca y acetona. Aromas de pozo y agua estancada, stano hmedo con hongos. Trapo de cocina sucio, parecen mercaptanos por los tonos azufrados. Boca muy agresiva por la carnosidad percibida. Retronasal muy pronunciada en hongos y ceniza, muy quemado.

Para corroborar los datos de cata manifestados por el panel de catadores formados por consumidores informados de la posible contaminacin microbiana durante la elaboracin del vino, se dieron a catar los mismos vinos a un catador experto. Dicho catador es un profesional dedicado a la enologa ciego absoluto. Se eligi dicho catador dada su especial habilidad para la deteccin de problemas organolpticos en vinos. Las descripciones organolpticas determinadas por este catador se encuentran a continuacin: 1BD: Aromas primarios en nariz, mentolados muy agradables, caramelo de naranja y fresa. Aromas almibarados. Tonos lcteos de mantequilla dulce y queso fresco y notas de leche, tambin de almendra. Un poco graso a la nariz, pero agradable por los matices almibarados. Boca agraz, afrutado, con retronasal de mantequilla. 2BD: Aromas ntidos de vainilla y queso semicurado, con percepcin de ajo y mantequilla rancia, calzado usado. Por debajo se aprecian las notas de tomillo y el carcter primario del vino. Boca ms densa y con sensacin ms dulce que el anterior. El carcter lcteo va retronasal es tan evidente como en nariz, revelndose como de leche hirviendo y queso de cabra, un poco sucio. 3BD: Nariz intensa con dominancia de la mantequilla, aromas de levadura, miga de pan de molde, bollo de leche, corteza de pan y grasa de mantequilla. Tonos de trigo y aromas de oxidacin con sensacin olfativa de laca. En boca mantecoso, con recuerdo de tocino, torrezno. Retronasal muy lctea. 1TD: Aromas de sudor a copa parada, queso fresco, trapo hmedo sucio, leche caliente, nata fresca de leche grasa. Frutos secos del tipo pin y tambin especiados. En boca untuoso, con recuerdos a tostado y pan quemado. Retronasal con crema, resulta licoroso, crema de whisky. 2TD: Aromas de yogurt de frambuesa y vainilla a la nariz. Tambin madera quemada, parece que tiene crianza en madera. Aromas de regaliz rojo, leche hirviendo, crema catalana, azcar flameada y aromas melosos al mover la copa que se hacen dominantes. Boca con buena evolucin, retronasal muy lctea y de yogurt natural. Dominan los lcteos en toda la evolucin en boca.

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III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

3C: Yeso seco en nariz. Aromas muy cocineros, garbanzo cocido. Carne pasada, mucha humedad, polvo de barrer, suciedad. Sensacin de agua sucia en boca, con tanicidad terrosa y agresiva. La intensidad del problema se percibe cada vez ms en boca. Retronasal de laca y fijador de pelo. 4C: Aroma a pelo humano dominante, peluqun, pelo quemado. Aromas perrunos y de escoba sucia. Percepcin grasa de la acidez voltil. Pescado encurtido, boquern en vinagre. En boca muy agresivo, con recuerdo a polvo de barrer y productos de peluquera. En retronasal sale el recuerdo al encurtido con vinagre, conejo o perdiz escabechada. 1EF: Aromas de caramelo de fresa a copa parada, sensaciones dulces almibaradas, tonos de hierba y menta. Recuerdos de levadura descompuesta en mal estado, levadura rancia y de grasa rancia. Aromas metlicos de clavo de carpintera. Aromas de tierra y agua sucia de alcantarilla y de establo. Boca con taninos muy agresivos, metlicos, recuerdos de hierro mojado, clavo oxidado. Trapo de fregar. 2EF: Aromas de pintura plstica, barniz, papel de calco, cartn hmedo, butano, plstico sinttico, aromas de vacuno, piel de vaca, cuero de vaca, establo y de boiga de caballo. Boca con taninos rebeldes acerados y de hierro muy oxidado, lima. Recuerdos de hojalata y silla de montar a caballo, piel de zapato y betn. 3EF: Sudor de caballo, dominancia de los aromas animales y de betn de zapatos. Sudor humano, axila humana, muy desagradable. En boca recuerda a la boiga de caballo y a hormiguero. Muy agrio, de cido frmico, recuerdo a hormiga. 1EG: Aromas afrutados de pltano muy maduro, cscara de pltano ya casi descompuesto. Aromas de yodo, moho, hongo. Aromas de mercromina, anestesia de dentista. Especiado en boca, clavo y laurel. Muy amargo, con aromas de almendra amarga.

2EG: Aromas muy especiados a copa parada, mucho clavo y laurel, licor de pltano. Aromas de anestesia lquida intensos, farmacuticos y de medicamento, serie empireumtica, jarabe, aspirina efervescente, ter. Champin y moho, paja mojada y heno verde. Tonos de yodo. Muy medicinal en boca con gusto a jarabe. Retrogusto de caucho, de corcho descompuesto, corteza de rbol podrida. 3EG: A copa parada impresin especiada muy intensa acompaada de aromas a micelio de hongo y moho verde. Aromas de ceniza y tierra mojada. Tonos ahumados, neumtico caliente, goma de coche despus de frenar. Gusto a moho muy perceptible, recuerda al amargor de flor de levadura asociado con yodo muy dominante.

2.8 Conclusiones
1. Un consumidor bien informado acerca de posibles problemas fermentativos en la vinificacin, es capaz de detectar defectos organolpticos presentes en el vino asociados a ciertos compuestos qumicos originados por una fermentacin malolctica sin control. Los descriptores empleados y elegidos de forma libre para definir los defectos encontrados en los vinos fueron similares y concordantes a los empleados por un catador profesional que analiz las mismas muestras de vino aromtica y gustativamente, aunque con menor agudeza sensorial y con menor frecuencia de deteccin. 2. Entonces los consumidores habituales de vino, cuando son sometidos a una disciplina de cata concentrndose en las sensaciones olfativas percibidas, son capaces de discriminar y distinguir entre vinos correctos y vinos defectuosos, con aromas impropios causados por problemas microbianos. 3. Estos defectos organolpticos se pueden evitar ejerciendo un control de la FML del vino, inoculando una bacteria seleccionada que evite presencia de contaminantes y manteniendo unas condiciones higinico sanitarias adecuadas en bodega durante la elaboracin del vino.

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Fermentacin Malolctica
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III.3. Efectos de los contaminantes microbiolgicos inducidos por la fermentacin malolctica descontrolada en vino

Jrg GAFNER* Astrid BACHMANN Andrea FREI Francis HESFORD Naomi PORRET Katharina SCHNEIDER
Agroscope ACW Wdenswil, Swiss Federal Research Station for horticulture, po box 185, 8820 Wdenswil, Suiza
*Autor corresponsal: juerg.gafner@faw.admin.ch

3.1 Resumen 3.2 Introduccin 3.3 Trastornos por intolerancia a la histamina 3.4 Prevencin de la formacin de aminas bigenas en el vino 3.5 Garantizar la seguridad microbiolgica y la calidad del vino 3.6 Resumen de resultados

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3.1 Resumen

III.3. Efectos de los contaminantes microbiolgicos inducidos por la fermentacin malolctica descontrolada en vino

Las aminas biognicas que se encuentran en el vino y en otros alimentos constituyen siempre una indicacin de la presencia de microorganismos indeseables con una gran actividad descarboxilasa, como por ejemplo las bacterias lcticas de las especies Pediococcus (Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus) y Lactobacillus (Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii). La deteccin de microorganismos durante la vinificacin se suele hacer al microscopio. Con este mtodo se puede detectar la aparicin de microorganismos indeseables y prevenir que sigan desarrollndose. Sin embargo, a menudo esta forma de deteccin sencilla, relativamente barata y eficaz no resulta suficientemente sensible, pues se pueden formar metabolitos indeseables a partir de concentraciones de microorganismos inferiores al umbral de deteccin de un microscopio (que ronda las 104 clulas/ml). La utilizacin de un sistema de deteccin basado en PCR cuantitativo, desarrollado por nuestro grupo, permite detectar la presencia de levaduras y bacterias por debajo de un umbral de deteccin de 100 clulas/ml, e indicar as el riesgo potencial de bacterias que forman aminas biognicas. Durante la vinificacin, la adicin de cultivos iniciadores de bacterias Oenococcus oeni impide o retrasa el desarrollo de Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp. y por lo tanto la formacin de aminas biognicas.

3.2 Introduccin
La descarboxilacin del aminocido histidina tiene como resultado la formacin de histamina, una de las llamadas aminas biognicas. De entre todas las aminas biognicas, la histamina es la ms importante en medicina. Normalmente, esta sustancia se degrada sin problemas tras la ingesta de alimentos, pero el nmero de personas que reaccionan a pequeas cantidades de aminas biognicas en los alimentos con sntomas radicales aumenta constantemente. Este tipo de patologa se llama Intolerancia a la histamina. Las personas aquejadas de esta enfermedad tienen que observar dietas bajas en histamina. La histamina se forma durante la biosntesis normal de las protenas por los seres humanos, pero tambin a consecuencia de la actividad bacteriana. En el vino, la histamina es un contaminante indeseable. Se forman aminas sobre todo durante la fermentacin y maduracin de alimentos como el queso, las verduras, los embutidos y el pescado. Un alto contenido de histamina en la comida tambin est correlacionado con la alteracin de la misma; la concentracin de histamina en la comida es, en efecto, signo de frescura y calidad.
69

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Durante el tratamiento de la comida, tambin es frecuente la formacin de aminas biognicas distintas de la histamina, como la putrescina, la tiramina, la

cadaverina etc. La presencia concurrente de estas aminas biognicas incrementa la toxicidad de la histamina 1 y 5.

Tabla 1.
Contenido de histamina de los alimentos con mayor contenido de histamina 2. Queso (mg/kg) Emmental Bergkaese Parmesano Gouda, Edam, Stangenkaese Tilsiter, Geheimratskaese, Butterkaese Quesos azules austriacos Camembert, Brie Schlosskaese, Romadur Quargel (queso cido curado) Queso fresco, de Burgos Bebidas alcohlicas (g/kg) Vino tinto Vinos tintos austriacos Vinos blancos austriacos Vino espumoso Cava 670 Cerveza Weizenbier Cerveza sin alcohol Embutido (mg/kg) Salami <10-280 Otras salchichas curadas Osso collo, jamn Westfaeler Carne fresca Pescado y derivados (mg/kg) Pescado fresco Pescado fresco, estropeado Productos ultracongelados Conservas (p.e. atn en lata) Verduras (mg/kg) Tomates (ketchup) Espinacas Aguacates Berenjenas Col fermentada Vinagre (g/kg) Vinagre de vino tinto
70

contenido (max) <10-500 (2500) <10-1200 <10-580 <10-200 (900) <10-60 <10-80 <10-300 (600) <10-100 <10-50 (390) 0

hasta 3800 60-600 (1100) 10-120 15-80 20-50 120-300 15-40

<10-100 <10-300 <1

0 hasta 13000 0-5 (>50) 0-15 (300)

22 30-60 23 26 10-200

4000

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rancia de histamina en diversos productos alimentarios. En el caso del vino, el umbral de tolerancia es de 10 mg/L. Para ser considerado sin histamina, un vino no debe tener una concentracin de histamina superior a 0.5 mg/L. Se sabe que, entre las especies de bacterias lcticas, existen cepas capaces de no formar prcticamente aminas biognicas, o al menos no niveles elevados. Ms concretamente, las cepas de Pediococcus ssp.. y Lactobacillus ssp. son capaces de producir mayores cantidades de histamina en el vino. La industria alimentaria y la industria del vino han empezado a utilizar cultivos bacteriolgicos iniciadores con propiedades definidas tambin con respecto a la formacin de aminas biognicas. La inoculacin de especies y cepas de bacterias lcticas con poca o ninguna capacidad de formacin de aminas biognicas reduce su incidencia en los alimentos procesados. Las aminas biognicas (histaminas) no deberan aparecer en absoluto en los vinos. Sin embargo, durante la vinificacin pueden estar presentes tanto microorganismos indeseables como deseables. Los productores de vino deben asegurarse de que los microorganismos indeseables no tengan ninguna oportunidad. Mediante la adecuada inoculacin de levaduras Saccharomyces cerevisiae para las fermentaciones alcohlicas y de bacterias Oenococcus oeni para las fermentaciones malolcticas, se puede avanzar mucho hacia la produccin de un vino de buena calidad 1 y 5. En los cultivos iniciadores, se ha controlado meticulosamente la presencia de sustancias metablicas indeseables.

3.3 Trastornos por intolerancia a la histamina


En la actualidad ya se sabe mucho sobre los efectos mdicos de la histamina. La mayor parte de las personas con intolerancia no tienen suficiente actividad de diamina-oxidasa (DAO), una enzima que normalmente est presente en el organismo. Esta enzima convierte las aminas biognicas como la histamina en productos inocuos. Los trastornos comienzan despus de ingerir un alimento rico en histamina. Los sntomas ms importantes son el enrojecimiento de la piel junto con picores, dolor de cabeza, nuseas, trastornos digestivos, diarrea y trastornos respiratorios. Tambin aparecen signos tpicos de alergia, como ojos enrojecidos y goteo nasal. La capacidad de degradar la histamina presente en los nutrientes se reduce drsticamente en los seres humanos al consumir alcohol, y tambin como efecto secundario de ciertos frmacos. Ambos inhiben la actividad de la enzima diamina oxidasa que est presente en el intestino. Por ese motivo, hay que evitar el consumo conjunto de bebidas alcohlicas (cerveza, vino, espumosos, destilados etc.) y alimentos con altas concentraciones de aminas biognicas.

3.4 Prevencin de la formacin de aminas biognicas en vino


El motivo ms frecuente del incremento de la cantidad de aminas biognicas presentes en los alimentos son las bacterias de alteracin que pueden formar aminas biognicas como las histaminas durante el tratamiento, la maduracin o el almacenamiento de comida deficientemente controlado1 y 5. Las normas de alimentacin suizas estipulan los umbrales de tole-

Tabla 2.
Contenido de aminas biognicas de los vinos del este de Suiza (1984) 3, 5 Valores medios en mg/L Aminas biognicas Histamina Tiramina 2- Feniltilamina Putrescina Isoamilamina Cadaverina 151 vinos tintos / 51 vinos blancos (valores mximos) 2.0 (20) / 1.5 (10) 2.8 (24.6) / 7.5 (43.8) 1.7 (9.4) / 1.7 (8.5) 21.4 (200) / 11.1 (>100) 8.2 (38.8) / 6.3 (17) 0.3 (1.2) / 0.1 (0.8)

Los valores mnimos y medios se han observado en los vinos con procesos controlados. La vinificacin sin control microbiano origina los valores mximos 71

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Las investigaciones realizadas durante varios aos han demostrado que la inoculacin adecuada de

cepas de Oenococcus oeni durante la vinificacin previene la formacin de aminas biognicas.

Tabla 3.
Contenido de histamina en los vinos sometidos a FML impacto de los cultivos iniciadores en la mejora de la calidad del vino 4, 5 Cultivos iniciadores de O. oeni utilizados Bitec EQ 54 Viniflora oenos espontneo Contenido de Histamina del vino (mg/L) <1 <1 <1 <1

Las dems aminas biognicas detectadas en el vino presentan concentraciones inferiores a <1 mg/L

3.5 Garantizar la seguridad microbiolgica y la calidad en el vino


Durante la vinificacin, es fundamental conocer la composicin microbiana del mosto y el vino para garantizar la calidad del producto final. Existen levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Oenococcus oeni) deseables, as como levaduras (Hanseniaspora uvarum y Brettanomyces bruxellensis) y bacterias (Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp.) indeseables. Nuestro sistema de deteccin, basado en PCR cuantitativo, permite diferenciar entre las especies mencionadas ms arriba, y tambin entre

microorganismos vivos o muertos. Hemos optado por mantener los genes de levaduras y bacterias. Los hemos secuenciado, y hemos definido los cebadores y sondas para PCR. Con nuestro sistema hemos podido diferenciar entre las diversas especies. En los vinos con mayores concentraciones de aminas biognicas hemos encontrado Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp. No obstante, la concentracin de aminas biognicas formadas y los recuentos celulares determinados no son correlativos. Las aminas biognicas analizadas en el vino son: histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, 2-feniletilamina, espermina, triptamina e isopentilamina.

Tabla 4.
Contenido de aminas biognicas en los vinos (2005, datos inditos) Histamina: 8 vinos con >10mg/l, hasta 26.1 mg/l Tiramina: 11 vinos con >10mg/l, hasta 22.7 mg/l Putrescina: 18 vinos con >10mg/l, hasta 500 mg/l Isopentilamina: 6 vinos con 10mg/l, hasta 39.7 mg/l Cadaverina: n.d. 7.2 mg/l Triptamina: n.d. 11.6 mg/l 2-PE-amina: n.d. 17.7 mg/l Espermina: n.d. 0.9 mg/l

En muchas muestras con bacterias Pediococcus ssp., tambin se encuentran levaduras Brettanomyces bruxellensis. Ya habamos observado esta incidencia conjunta en estudios anteriores. No obstante, no sabemos cmo interactan estos dos microorganismos. En las muestras de vino que contienen ambos micro72

organismos, hemos detectado mayores cantidades de aminas biognicas (a partir de Pediococcus ssp.) as como el sabor desagradable producido por Brettanomyces, los etilfenoles (a partir de Brettanomyces bruxellensis). Como los vinos se filtraron antes de su embotellado,

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Fermentacin Malolctica Tabla 5.

Contenido de aminas biognicas y etilfenoles en vinos con sabor a moho generado por Brettanomyces (2005, datos inditos) 2-Feniletilamina1 Isopentilamina1

4-Etilguayacol2

573 574 575 576

2003 2002 2000 1998

3.3 7.7 10.5 11.6

2.4 6.3 8.8 10.5

n.d n.d. n.d. n.d.

0.4 0.8 0.4 0.7

0.4 1.0 0.5 0.6

6.4 11.4 15.6 17.4

1.0 1.3 1.1 1.3

n.d. n.d. 0.1 0.1

607.4 1351.3 1180.3 1346.8

186.8 243.9 198.5 227.2

69.6 226.0 183.4 213.6

Umbral sensorial
1 en mg/L; 2 en g/L

300-600

50

no se pudieron detectar levaduras Brettanomyces ni bacterias lcticas (Lactobacillus ssp y Pediococcus ssp.). Los catadores a menudo describen este sabor desagradable (a moho) como medicinal, animal, a calcetn sudado, a establo, a humo, metlico, a tirita y especiado. Mediante la determinacin de 4-etilguayacol, 4-etilfenol y 4-etilcatecol, las tres principales sustancias del sabor a moho presentes en nuestras muestras, hemos podido observar una buena correlacin entre su concentracin y el recuento celular determinado: a mayor nmero de clulas, ms cantidad de dichas sustancias se forma. En nuestra bodega hemos observado un incremento de la alteracin del moho desde finales de julio de 2002 hasta finales de septiembre de 2002. Este efecto sensorial est correlacionado con la concentracin de las tres sustancias principales, as como con el incremento del recuento celular en algunos casos a razn de al menos cinco veces (no se presentan los datos).

suficiente de precursores de la formacin de aminas biognicas, es decir los aminocidos. Hemos desarrollado un sistema basado en la tcnica de PCR cuantitativo para determinar las levaduras y bacterias presentes en el vino6. Con este sistema, tenemos la posibilidad de medir la cantidad de bacterias lcticas productoras de aminas biognicas presente, antes de que empiecen a producir sustancias indeseables. Este mtodo no incluye un sistema de enriquecimiento previo. Hemos analizado al menos un centenar de vinos para comprobar la presencia de aminas biognicas en los mismos, y hemos determinado las especies y recuentos de bacterias lcticas presentes. Los resultados se pueden resumir brevemente como sigue: Todas y cada una de las cinco bacterias lcticas pueden ser responsables de la produccin de aminas biognicas. Existe poca o ninguna correlacin entre el recuento celular de bacterias lcticas y la concentracin de aminas biognicas. Hemos observado que, en algunos casos, un recuento de 106 clulas/ml no desemboca en la formacin de aminas biognicas. No obstante, a veces bastan 103 clulas/ml para producir importantes concentraciones de aminas biognicas. Normalmente, son suficientes 103 clulas/ml para la formacin de aminas biognicas. La formacin de aminas biognicas parece ser especfica de cada cepa, como ya se haba observado en otros estudios. Adems, la formacin de aminas biognicas especficas no se puede correlacionar con una especie concreta de bacterias lcticas (por ejemplo, la putrescina la forma Pediococcus damnosus).
73

3.6 Resumen de nuestros resultados sobre las aminas biognicas en el vino


La produccin de aminas biognicas en el vino acompaa la presencia de bacterias lcticas de las especies: Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus brevis y Lactobacillus hilgardii. Tanto P. damnosus como P. pentosaceus prefieren las regiones vitcolas de clima fro, mientras que L. brevis, L. hilgardii y P. parvulus son ms frecuentes en las regiones vitcolas clidas. Durante la vinificacin hay presencia de una cantidad

4-Etilcatecol2 50

Cadaverina1

Triptamina1

Espermina1

Putrescina1

4-Etilfenol2

Histamina1

Tiramina1

Vino No.

Aada

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

En el futuro, esperamos transferir nuestro conocimiento del mecanismo de las aminas biognicas a

otros productos alimentarios que tambin pueden presentar mayores cantidades de aminas biognicas.

Tabla 6:
Alimentos que ms a menudo causan efectos adversos relacionados con las aminas biognicas2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Bebidas alcohlicas (en especial los vinos tintos) Queso (en especial los quesos duros, como el Emmental) Chocolate Salami y otros embutidos Frutos secos Tomates Fresas, ctricos y otros liberadores de histamina Col fermentada (chucrut) Espinacas Pescado

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74

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica

75

III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos


Vincent GERBAUX
ITV Francia, Unidad de Beaune 4.1 Control de la fermentacin malolctica mediante la siembra bacteriana de los vinos 4.2 Inoculacin conjunta levaduras / bacterias lcticas aplicada a los tintos jvenes 4.3 Influencia de la siembra bacteriana en el color de los vinos dePinot Noir. 4.4 La lisozima, posible alternativa para estabilizar los vinos despus de la FML 4.5 Influencia directa de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos 4.6 Siembra bacteriana y prevencin de los vinos fenolazos 4.7 Siembra bacteriana y control de los contenidos de aminas biognicas. 4.8 Conclusiones

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III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos

L
Figura 1.

a fermentacin malolctica (FML) influye en la calidad organolptica de los vinos, en especial en la de los tintos. Las modificaciones cualitativas van mucho ms all de una mera disminucin de la acidez asociada a la transformacin del cido mlico en cido lctico. En el caso de los vinos de Pinot Noir, la FML aumenta la calidad y complejidad olfativas, en especial las vinculadas a los aromas frutales. En boca, la FML atena los sabores astringente, cido, amargo y alcohlico (Figura 1).

Modificaciones gustativas vinculadas a la realizacin de la FML en un vino de Pinot Noir.


(La lnea de base corresponde al mismo vino, sin realizacin de la FML)

Astringencia

Acidez

Alcohol

Amargor

Consistencia

Afrutado

Caramelizado

El control de la FML constituye un problema complejo. Cuando el vino es desfavorable al crecimiento de las bacterias lcticas, la FML slo se inicia al cabo de un plazo de tiempo ms o menos largo y aleatorio. A la inversa, la FML se puede producir rpidamente cuando el vino es favorable, pero ese tipo de vino tambin permite el desarrollo de diversos microorganismos, algunos de los cuales pueden originar alteraciones ms o menos graves.

4.1 Control de la fermentacin malolctica mediante la siembra bacteriana de los vinos


La siembra bacteriana de los vinos permite paliar una flora deficiente o garantizar la presencia de una poblacin controlada. Esta tcnica ha evolucionado considerablemente desde sus comienzos, hace unos veinte aos. Inicialmente, no se poda inocular las biomasas en el vino sin haberlas sometido a una reactivacin previa. A principios de los aos 1990, las inves77

Fr. Rojas

Vegetal

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

tigaciones sobre la adaptacin de las bacterias lcticas a las condiciones hostiles han permitido preparar biomasas de siembra directa. En comparacin con el de las biomasas "clsicas", el proceso de fabricacin incluye operaciones especficas que permiten una adaptacin previa de las bacterias a las condiciones que prevalecen en el vino. Gracias a dicha adaptacin, las bacterias lcticas se vuelven tan fciles de utilizar como las levaduras secas activas. El nmero de preparaciones bacterianas comercializadas aumenta constantemente. Las nuevas biomasas tienen que presentar una mayor eficacia o un inters especial. El ITV de Francia participa activa-

mente en la seleccin de cepas de bacterias lcticas y en el desarrollo de nuevas biomasas, como por ejemplo: Enoferm Alpha, Lalvin 31 y FML Expertise S. Ha desarrollado estas bacterias lcticas en colaboracin con la sociedad Lallemand. Los numerosos experimentos realizados en Borgoa sobre vinos del varietal Pinot Noir, as como en otras regiones vitcolas francesas, han permitido comprobar las aptitudes enolgicas de estas biomasas. As pues, la FML de un vino de Pinot Noir se puede llevar a cabo en unos 15 das a una temperatura de 18 C, y en menos de un mes a 14C de temperatura. Este segundo resultado permite prescindir de la calefaccin (Figura 2).

Figura 2.
Influencia de la temperatura en la actividad de las bacterias lcticas en un vino tinto.

150 Realizacin de la FML (das) 120 90 60 30 0 Testigo Lalvin 31 Enoferm Alpha FML Expertise S
FML no iniciada al da 220. 75% de la FML a 130 das

11C 14C 18C

4.2 Inoculacin conjunta levaduras / bacterias lcticas aplicada a los tintos jvenes
Normalmente, el inicio de la fermentacin malolctica slo es deseable despus de que finalice la fermentacin alcohlica. Lgicamente, se aconseja pues proceder a la siembra bacteriana en esa etapa. No obstante, tambin puede ser interesante una siembra bacteriana ms precoz, al principio o en el transcurso de la fermentacin alcohlica, principalmente por los motivos siguientes: - Reducir el tiempo de elaboracin de los vinos destinados a ser consumidos jvenes, - Evitar la proliferacin de bacterias lcticas indeseables procedentes de la flora indgena. Esta tcnica requiere un buen seguimiento enolgico para evitar el riesgo principal, que es el del picado lc78

tico. Este riesgo depende de diversos parmetros, en muy especialmente del nivel de pH (el riesgo es mayor cuanto ms alto es el nivel de pH). En la prctica, el picado lctico no se puede desencadenar hasta que se ha agotado el cido mlico. El ITV Francia ya ha trabajado sobre esta tcnica hace una decena de aos, con resultados interesantes. El objetivo principal consista en simplificar la utilizacin de las bacterias lcticas, que por entonces requera una fastidiosa reactivacin antes de su uso. En la actualidad, esta tcnica se aplica con las biomasas bacterianas de siembra directa. Los trabajos acometidos hace ya varios aos persiguen un mejor conocimiento de los crecimientos y actividades metablicos respectivos de las levaduras y las bacterias lcticas. Los experimentos realizados con Gamay en Beaujolais (fermentacin de vendimia entera) demuestran que la inoculacin conjunta de levaduras y bacterias permite que la FML se lleve a

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mine la fermentacin alcohlica. En esa situacin, el riesgo de picado lctico es real. Para permitir un mayor control de esta tcnica, el ITV Francia ha trabajado en una nueva formulacin de biomasa bacteriana adaptada a la inoculacin conjunta de los vinos tipo joven poco o nada sulfitados. El objetivo consiste en hacer coincidir la duracin de la FML con la duracin de la fermentacin alcohlica (Figura 3).

cabo en un plazo de tiempo acusadamente ms breve que el registrado en los lotes testigo sin siembra. Ahora bien, la utilizacin de biomasas bacterianas inicialmente destinadas a su siembra directa en los vinos una vez finalizada la fermentacin alcohlica puede inducir un desarrollo demasiado rpido de la FML. sta se puede producir en cuestin de das tan slo, y por lo tanto culminar mucho antes de que ter-

Figura 3.
Optimizacn de la inoculacin conjunta en los vinos tintos de tipo "jvenes".

Testigo 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0

Co-inoculation Lev. / BL

BL n FA

ac mlico(g/l)

Trasiego

Fin de la FA

14

tiempo (das) 21

28

35

Esta nueva formulacin especial inoculacin conjunta saldr al mercado enolgico probablemente en 2006, a un precio reducido comparado con el de las biomasas destinadas a la siembra directa de los vinos. Los trabajos demuestran que los vinos acabados elaborados mediante inoculacin conjunta no presentan ninguna anomala analtica. El nivel de acidez voltil, el color o la concentracin de polifenoles son similares a los obtenidos con la tcnica de referencia.

4.3 Influencia de la siembra bacteriana en el color de los vinos de Pinot Noir


Tradicionalmente, los vinos de Pinot Noir de Borgoa requieren plazos de tiempo considerables para la realizacin de la FML. La frescura de las bodegas, la alta graduacin alcohlica as como el nivel de pH, que puede ser relativamente bajo, explican este fenmeno. El recurso a la siembra bacteriana permite reducir el plazo de obtencin de la FML. En un vino de pinot noir, sembrado de bacterias lcticas al final de la FA y mantenido a unos 18C, la FML culmina rpidamente (15 das, frente a ms de dos meses para el vino sin sembrar). Paralelamente, se observa una prdida de

intensidad colorante de un 10 a un 15% con respecto a un vino testigo sin sembrar. El tono de color y los polifenoles no se modifican, y en las catas analticas, los jurados no diferencian significativamente los lotes sembrados de los lotes testigo por lo que a la calidad visual se refiere. De todas formas sera interesante buscar soluciones que permitan reducir esa prdida de color observada analticamente. Los trabajos han tratado principalmente sobre la temperatura de realizacin de la FML. La temperatura influye en el crecimiento y la actividad de las bacterias lcticas. Cuanto ms baja es la temperatura (entre 10 y 20C), ms lenta ser la culminacin de la FML. A 18C, los lotes sembrados de bacterias lcticas pierden ms color a raz de la FML que los lotes expuestos a una temperatura ms baja. A 14C, y ms an a 11C, el color aumenta durante el periodo de latencia ms o menos prolongado previo a la puesta en marcha de la FML. Slo disminuir despus de que haya terminado la FML. El sulfitado de final de la FML aplicado ms tardamente tiene una incidencia ms limitada sobre la prdida de color que un sulfitado precoz (Figura 4). Una siembra bacteriana retrasada con respecto al final de la FA puede provocar el mismo fenmeno. En
79

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Figura 4.
Influencia de la temperatura ambiente en bodega en la evolucin del color de un vino de Pinot Noir.
(claridad: inversamente proporcional a la intensidad colorante)

32 color (claridad) 28 24 20 16 0 30 60 90 120 tiempo (das) 150 180 n FML + SO2

11C 18C

la evolucin del color de los vinos tintos durante la crianza intervienen fenmenos qumicos lentos. En efecto, los resultados demuestran que el color de los vinos de Pinot Noir evoluciona en tres fases: - intensificacin entre el trasiego y la puesta en marcha de la FML, - estabilizacin durante la realizacin de la FML, - disminucin despus del sulfitado del final de la FML y de los siguientes. Una temperatura fresca en bodega permite prolongar la primera fase, con lo cual se mantiene intacto el inters de la siembra bacteriana para garantizar un desarrollo lento pero controlado de la FML.

4.4 La lisozima, posible alternativa para estabilizar los vinos despus de la fermentacin malolctica
Si no se les aplica un tratamiento de estabilizacin, en los vinos tintos la poblacin de bacterias lcticas se mantiene elevada durante varios meses despus de la terminacin de la FML. Por ello, se recomienda estabilizar los vinos sin tardanza. La utilizacin de SO2 es la solucin habitual. Sin embargo, aunque el efecto del SO2 sobre las bacterias lcticas es incuestionable, lo cierto es que este producto no es neutro para el vino. Ya hemos expuesto ms arriba sus consecuencias sobre el color. El SO2 tambin puede engendrar prdidas olfativas y gustativas, prdida de caracteres fruta-

les, merma de la armona, incremento del carcter desecante. En esos casos, la lisozima (protena extrada de la clara de huevo) puede ser una solucin interesante para tratar los vinos al final de la FML con el propsito de retrasar o reducir la utilizacin de SO2. La adicin de 250 mg/l de lisozima permite una reduccin de la flora bacteriana equivalente a la de un sulfitado a razn de 50 mg/l. Tambin resulta interesante una dosis de lisozima de 125 mg/l (equivalente a un sulfitado a unos 30 mg/l). En esas condiciones, se estabiliza la acidez voltil, mientras que en los lotes sin tratar, sta aumenta durante las semanas siguientes a la FML. La lisozima ejerce una accin especfica sobre las bacterias lcticas, contrariamente al SO2, que tiene un amplio espectro de actividad. Por lo tanto, en caso de utilizacin de lisozima, conviene vigilar el desarrollo siempre posible de levaduras Brettanomyces, contra las cuales sigue siendo aconsejable el sulfitado. Pero a la inversa, la utilizacin de lisozima puede resultar preferible al sulfitado en caso de conclusin difcil de la fermentacin alcohlica, cuando la FML, en cambio, ha terminado. Se ha ensayado la adicin de lisozima despus de la FML (200 mg/l) en varios casos, comparndola con un sulfitado (30 mg/l). Los anlisis sensoriales realizados sobre los vinos acabados demuestran que los lotes estabilizados con lisozima y que presentan contenidos reducidos de SO2 tienen niveles cualitativos equivalentes o superiores a los sulfitados (Figura 5). Las aplicaciones prcticas realizadas en Borgoa en vinos de Pinot Noir criados en barrica de roble confirman estos resultados.

80

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica Figura 5.

Influencia comparada de la utilizacin de lisozima y de SO2 despus de la FML en la calidad de los vinos tintos

SO2 : 30 mg/l 14 calidad global (sobre 20) 12 10 8 6 Bourgogne Pinot Noir Touraine Cabernet Franc

Lyso.: 200 mg/l

Bordeaux Merlot

Bordeaux Cabernet Sauv.

4.5 Influencia directa de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos
Las bacterias lcticas son microorganismos que presentan numerosas actividades metablicas. Ya se ha demostrado que algunas de esas actividades afectan a molculas aromticas. Por ejemplo, el metabolismo del cido ctrico desemboca en la produccin de diacetilo, un compuesto con olor a mantequilla. No obs-

tante, en el medio, que es el vino, la actividad de las bacterias lcticas se diluyeen la complejidad del producto. El seguimiento organolptico de vinos obtenidos en condiciones experimentales demuestra que, en general, no existe ninguna diferencia significativa entre los vinos testigo y los vinos sembrados de bacterias lcticas (Figura 6).

Figura 6.
Influencia de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos

Testigo 4

Lalvin L31

Enoferm Alpha

puntuaciones de 1 a 5

3,5 3 2,5 2 Calidad visual Calidad olfativa Calidad gustativa Calidad global

81

III. Incidencias organolpticas, color y efectos al realizar la fermentacin malolctica

Las condiciones muy controladas favorecen la obtencin de vinos testigo (no sembrados) sin defectos, si bien esto no siempre es as en condiciones prcticas.

4.6 Siembra bacteriana y prevencin de los vinos fenolados


El control de la FML mediante siembra bacteriana tambin puede contribuir a preservar el nivel cualitativo de los vinos tintos evitando el desarrollo de Brettanomyces, la levadura de alteracin directamente responsable del carcter fenlico de los vinos. La siembra bacteriana induce una ejecucin ms rpida y homognea de la FML, lo cual permite plantearse una estabilizacin precoz del vino. En esas condicio-

nes, se minimiza el tiempo de que dispondr Brettanomyces para desarrollarse y expresar su metabolismo. Esta competencia temporal es decisiva, pues adems, las floras de bacterias lcticas y de Brettanomyces no desarrollan interacciones sensibles entre s. Los resultados obtenidos en Pinot Noir demuestran que los vinos elaborados aplicando una siembra bacteriana adecuada tienen un contenido dbil o nulo de fenoles voltiles (niveles siempre muy inferiores al umbral de percepcin). Por otro lado, los vinos elaborados sin siembra de bacterias lcticas presentan contenidos de fenoles voltiles ms o menos altos, segn de qu vino se trate. Estos resultados se han obtenido en laboratorio, con contaminaciones por Brettanomyces provocadas, y en bodegas con contaminaciones espontneas (Figura 7).

Figura 7.
Inters de la siembra bacteriana para la prevencin de la aparicin de gustos fenolados.

Testigo no sembrado
cata (puntuaciones de 1 a 5)

Siembra bacteriana Fenoles voltiles:

1100 g/l 30 g/l

1 Calidad olfativa Calidad gustativa Calidad global Nota animal

El anlisis sensorial de los vinos contaminados por esta va demuestra que el perjuicio cualitativo asociado a Brettanomyces es significativo. Los vinos sin sembrar presentan notas animales desarrolladas, mientras que los vinos sembrados de bacterias lcticas presentan un nivel cualitativo global superior. Si la temperatura de bodega es fresca, la tcnica sigue resultando interesante. El metabolismo bacteriano se desacelera, la FML es ms lenta, pero tambin se desaceleran el crecimiento y la actividad de Brettanomyces. La siembra bacteriana de los vinos tintos constituye pues una herramienta interesante para reducir el riesgo de aparicin del carcter fenlico.

4.7 Siembra bacteriana y control de los contenidos de aminas biognicas


Ciertas aminas biognicas estn directamente vinculadas a la actividad de las bacterias lcticas en los vinos. La histamina, la tiramina y la putrescina son las tres aminas biognicas que pueden evolucionar sig82

nificativamente durante y despus del desarrollo de la FML. A la histamina y la tiramina se les imputa la responsabilidad de ciertos casos de alergias alimentarias. En comparacin con otros productos alimentarios expuestos a bacterias lcticas, en los vinos estas molculas slo llegan a alcanzar concentraciones bajas, en principio carentes de efectos sobre la salud. De todas formas, la presencia excesiva de aminas biognicas en un vino puede constituir un obstculo para su comercializacin. El control de los contenidos de aminas biognicas en los vinos est estrechamente vinculado al control de las bacterias lcticas. La siembra con biomasas seleccionadas hace posible ese control. Los vinos cuya FML se ha controlado mediante siembra bacteriana presentan contenidos reducidos de histamina, tiramina y putrescina en comparacin con los vinos testigo con flora indgena. Las biomasas bacterianas comercializadas en el mercado enolgico deben pues incluir ese criterio en sus pruebas de seleccin (Figura 8).

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica Figura 8.

Influencia comparada de la utilizacin de lisozima y de SO2 despus de la FML en la calidad de los vinos tintos

Enoferm Alpha 10 contenidos en g/l 8 6 4 2 0 histamina

Lalvin 31

FML Expertise S

tiramina

putrescina

Ahora bien, hay que recordar que la poblacin de bacterias lcticas se mantiene a un nivel elevado despus de la culminacin de la FML, sobre todo en los vinos tintos. Para los vinos de Pinot Noir, naturalmente ricos en aminocidos, ese periodo es crtico en relacin con la produccin de aminas biognicas. Por lo tanto se aconseja proceder a una estabilizacin microbiolgica inmediatamente despus de terminar la FML (sulfitado clsico o utilizacin de lisozimas).

ter fenlico. Ciertas cepas de bacterias lcticas producen demasiadas aminas biognicas. Para restringir la actividad de los microorganismos perjudiciales, la solucin obvia consiste en la estabilizacin microbiolgica precoz. Para conciliar estas dos necesidades opuestas, en especial en los vinos de crianza, la siembra bacteriana constituye una respuesta interesante. En efecto, permite asegurar la realizacin de la FML en un plazo que se podr modular jugando principalmente con la temperatura de la bodega. Las biomasas propuestas en la actualidad soportan temperaturas frescas. En el caso de los vinos destinados a ser consumidos jvenes, se puede acelerar el control de la FML utilizando la inoculacin conjunta. En ese caso, la FML se realiza al mismo tiempo que la fermentacin alcohlica. Por ltimo, la estabilizacin microbiolgica de los vinos despus de la FML se puede regular en funcin del riesgo afrontado. Si es necesario, se puede combinar un sulfitado clsico con la utilizacin de lisozima para crear mejores condiciones al principio de la crianza, si bien, en ese caso, no se inhibirn las Brettanomyces ni las bacterias acticas. En ese caso, un control microbiolgico deber concretar ese riesgo. En la actualidad, el enlogo dispone de numerosas bazas para controlar la FML y la estabilizacin microbiolgica de los vinos. Estas se deben adecuar a las situaciones enolgicas para aprovechar al mximo sus efectos beneficiosos.

4.8 Conclusiones
El inters de la FML para la calidad de los vinos tintos est bien reconocido. Por lo general, esta operacin se realiza al principio de la crianza, a la vez que se inician fenmenos qumicos y biolgicos ms o menos controlados y ms o menos interesantes para la calidad del vino. Obviamente, durante esta etapa el vino no est estabilizado. El color y los compuestos fenlicos evolucionan debido sobre todo a las aireaciones (trasiego, crianza en barricas). El sulfitado aconsejado al final de la FML tiende a bloquear o a desacelerar esta evolucin. Por lo tanto, puede resultar interesante prolongar la duracin de la FML, por ejemplo rebajando la temperatura de la bodega (en torno a 14C), para prolongar ese tiempo de crianza sin SO2. Sin embargo, la prolongacin del plazo de realizacin de la FML plantea o puede plantear un problema de tipo microbiolgico. Es corriente que la flora indgena de los mostos y los vinos contenga microorganismos perjudiciales. A menudo est presente Brettanomyces, levadura directamente implicada en el carc-

83

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica


ndice

87 97 117
97 117

87

IV.1. Los tipos de vino y el momento ptimo para la inoculacin. Cmo controlar el proceso.
Dra. Sybille Krieger Lallemand

IV.2. Fermentacin malolctica en barrica.


Jos Hidalgo Togores Dr. Ingeniero Agrnomo y Enlogo

IV.3. Fermentacin malolctica: cundo y cmo


Antonio Palacios Carlos Surez Jos Mara Heras Sibylle Krieger Lallemand

IV.1 Los tipos de vino y el momento ptimo para la inoculacin. Cmo controlar el proceso

Dra. Sybille KRIEGER


Lallemand Alemania
1.1 Inoculacin simultnea de levadura y bacterias 1.2 Produccin de acidez voltil 1.3 Inoculacin de cultivos lcticos iniciadores durante la fermentacin alcohlica 1.4 Inoculacin de cultivos lcticos iniciadores despus de la fermentacin alcohlica 1.5 Demora en la induccin de la fermentacin malolctica

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Fermentacin Malolctica

IV.1. Los tipos de vino y el momento ptimo para la inoculacin. Cmo controlar el proceso

a fermentacin malolctica (FML) se produce en el vino a resultas de la actividad metablica de ciertas cepas de bacterias lcticas adaptadas. Frecuentemente se considera que la reduccin de la acidez y la modificacin del aroma del vino a raz de esta segunda fermentacin bacteriana son favorables a la calidad del vino. La induccin de la FML mediante la inoculacin de cepas seleccionadas de bacterias lcticas presenta dos ventajas: en primer lugar, permite un mayor control sobre el momento y la velocidad de la conversin del cido lctico, y en segundo lugar influye positivamente en el sabor y la calidad del vino. Los estudios sensoriales demuestran que los compuestos aromticos producidos por las bacterias lcticas introducen cambios sensibles en las caractersticas aromticas del vino1. Varios estudios demuestran que diversas cepas de bacterias malolcticas producen efectos sensoriales en los vinos1,2,3,4,5, si bien todava no se entiende perfectamente la influencia del momento de la adicin bacteriana y del nivel de inoculacin.

1.1 Inoculacin simultnea de levadura y bacterias


La opinin generalizada en la regin francesa de Burdeos consiste en recomendar la inoculacin de bacterias lcticas una vez terminada la fermentacin alcohlica, con objeto de evitar la posible produccin de cido actico y D-cido lctico, una situacin a menudo denominada piqre lactique (picado lctico)6. En efecto, la FML que se desarrolla durante la fermentacin alcohlica puede provocar ocasionalmente la interrupcin de la fermentacin alcohlica. La experiencia americana no ha confirmado los resultados franceses que constatan un incremento de la produccin de cido actico, del antagonismo de la levadura, o la interrupcin de la fermentacin alcohlica cuando interviene un desarrollo temprano de bacterias lcticas. Se ha abogado por la inoculacin de bacterias lcticas porque se entenda que de ese modo, las bacterias tenan ms posibilidad de desarrollarse y aclimatarse en ausencia de etanol. De ese modo las bacterias no sufren escasez de nutrientes, ni se ven expuestas a los efectos txicos del alcohol. Beelman y Kunkee7 han demostrado que, en presencia de azcares fermentables, la FML no provoca necesariamente una produccin de cantidades excesivas de cido actico por las bacterias, a condicin de que la fermentacin de la levadura se inicie y concluya rpidamente1. En cambio, King y Beelman8 han sugerido que el desarrollo de Oenococcus oeni (anteriormente denominada Leuconostoc oenos) PSU-1 durante la fermentacin alcohlica en un sistema de mosto modelo se puede retrasar a consecuencia de la produccin de
87

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

compuestos txicos derivados de la levadura distintos del etanol y del dixido de azufre. Al comparar las curvas de desarrollo bacteriano en cultivo puro y en cultivo mixto con levadura, han observado que la presencia de levadura de crecimiento rpido es antagnica del desarrollo bacteriano (Figura 1). Han atribuido la inhibicin del crecimiento bacteriano a la presencia de metabolitos de la levadura y/o a la eliminacin por la levadura de sustancias importantes para la nutricin bacteriana. Los datos ilustrados en la Figura 1, indican que en el cultivo mixto con levadura, el punto de transicin de las bacterias de la fase estacionaria a la fase

de crecimiento logartmico coincide con la fase de mortandad del ciclo de desarrollo de la levadura. Este fenmeno puede ser resultado del retorno al sistema de nutrientes imprescindibles para las bacterias, a resultas de la muerte y la autolisis de la levadura. Mediante la comparacin de las curvas de crecimiento de la levadura en cultivo puro y en cultivo mixto, han podido demostrar que la presencia de bacterias no afecta al desarrollo de la levadura durante la fase estacionaria. Por el contrario, han observado una tasa de mortalidad acelerada en la levadura en cultivo mixto en presencia de un rpido desarrollo bacteriano.

Figura 1.
Desarrollo de la levadura y las bacterias en el vino, en cultivo puro y mixto

7 Recuentos de clulas viables(cfu/ml)

5 levadura (cultivo puro) levadura (cultivo mixto) bacteria (cultivo puro) bacteria (cultivo mixto )

0 0 2 3 5 8 10 15 20 30 35 40 50

tiempo (das)

Sistema de Mosto/Vino 20 0B8

1.2 Produccin de acidez voltil


Un intenso crecimiento bacteriano puede inhibir el desarrollo de la levadura, lo cual, a su vez, induce la produccin de niveles excesivos de acidez voltil9. En la Figura 2, Radler22 comunica un consumo de azcar de 0.2-2g durante las tres fases de crecimiento ilustradas ms abajo. Durante la Fase de crecimiento I, se pueden producir pequeas cantidades de cido actico y D-cido lctico. Cuando se alcanzan recuentos celulares de ms de 5x106 cfu/ml en la Fase II, comien88

za la degradacin del cido mlico, si bien durante dicha degradacin del cido mlico no se produce cido actico. La Fase III se caracteriza por la degradacin de cido ctrico y azcares, acompaada de un incremento del cido actico. No obstante, las bacterias slo empezarn a consumir azcares cuando haya terminado la degradacin de cidos orgnicos. El cido mlico ser el primero en consumirse, seguido del ctrico, el fumrico y otros10. En ese punto, la degradacin de azcares induce un incremento significativo de la acidez voltil.

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Fermentacin Malolctica Figura 2.

Metabolismo de azcares y cidos orgnicos durante la FML en el vino

azcares (fructosa)

biomasa

malato

lactato

citrato acetato

CRECIMIENTO CELULAR Catabolismo de azcares No hay catabolismo de malatos No hay catabolismo de citrato Ligera produccin de acetato Ligera produccin de lactato

Fase Estacionaria I No hay catabolismo de azcares Catabolismo de malato No hay catabolismo de citrato No hay produccin de acetato Produccin de lactato

Fase Estacionaria II No hay catabolismo de azcares No hay catabolismo de malato Catabolismo de citrato Produccin de acetato No hay produccin de lactato

Experimentos realizados por el grupo de investigacin de Lallemand han confirmado que durante el desarrollo de las bacterias lcticas y la FML activa no se produce cido actico. En esos experimentos, slo se ha observado una produccin de cido actico cuando ya se ha degradado la mitad del cido mlico y las bacterias empiezan a utilizar el cido ctrico. Los ensayos realizados mediante la inoculacin simultnea de bacterias y levadura y su comparacin con la inoculacin de bacterias una vez terminada la fermentacin alcohlica no han arrojado diferencias de concentracin final de cido actico, aunque s han demostrado en cambio la existencia de una relacin directa entre la degradacin de cido ctrico y un incremento de la concentracin de cido actico11. Dependiendo de la disponibilidad de oxgeno y del potencial de oxidacin-reduccin del medio, el cido ctrico o bien puede ser utilizado como un aceptor de electrones, con el resultado de una produccin de cido actico, o se puede degradar en diacetilo. La subsiguiente reduccin de diacetilo en acetona y 2,3butanodiol tambin depende del potencial de oxidacin-reduccin del vino. Se considera que el diacetilo es un compuesto aromtico importante, y que a concentraciones comprendidas entre 0.02 y 2 mg/l, puede conferir al vino un claro aroma de mantequilla. El umbral gustativo de la acetona y del 2,3-butano-

diol es muy superior a las concentraciones que suelen presentar en el vino. Por lo tanto, no contribuyen al sabor del vino. Hacen falta nuevos estudios que permitan definir con mayor precisin el efecto del oxgeno y del potencial de oxidacin-reduccin sobre las concentraciones finales de final diacetilo y cido actico en el vino. La FML en presencia de las siempre resulta en bajos niveles de diacetilo, debido a que el poder reductor de la levadura viable transforma el diacetilo en componentes menos aromticos. Por consiguiente, la inoculacin conjunta de levaduras y bacterias en el vino resulta en una menor presencia de sabores lcticos y de mantequilla, es decir en tipos de vino con una mayor carga frutal. Lallemand, en collaboracin con la Massey University de Nueva Zelanda, ha elaborado vino utilizando una cepa de levadura compatible con las bacterias lcticas (CY3079), y dos cepas de bacterias lcticas, Lalvin EQ54 y Enoferm ALPHA. Para cada combinacin de levadura/bacteria, se inocularon bacterias malolcticas conjuntamente con la levadura (FA/FML simultnea) o despus de terminar la fermentacin alcohlica (FA/FML secuencial). El vino se elabor con uvas Chardonnay procedentes de un viedo comercial en la comarca de Fernhill de la regin de Hawke's Bay de Nueva Zelanda. Se prens la uva, no se aadi SO2 y
89

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

el vino se estabiliz en fro a 4C durante 24 horas, tras lo cual se aadi 300 mg/l de fosfato diamnico. Se realizaron las vinificaciones por triplicado en garrafones de 25 litros, y el mosto presentaba la analtica inicial siguiente: - 20.70B, pH 3.28 y 10 g/l acidez total cal-

culada como cido tartrico. Los resultados resumidos en la Tabla 1 demuestran que la FA/FML secuencial siempre produca el resultado de una fermentacin malolctica prolongada comparada con la FA/FML simultnea.

Tabla 1.
Prolongacin de la FML en funcin de la secuencia de inoculacin
FA/FML Simultnea Cultivo lctico iniciador EQ54 Cultivo lctico iniciador ALPHA 26 das 19.5 das FA/FML secuencial 74 das (quedaba cido mlico) 68 das

El cido mlico, con una concentracin inicial de 5 g/l, se degrad en unas tes semanas, un lapso idntico al periodo necesario para la conversin del azcar en alcohol durante la FA/FML simultnea. Si se inoculaban las bacterias lcticas despus de la fermentacin alcohlica, la FML resultaba difcil y tardaba bastante ms tiempo en concluir. El tratamiento secuencial utilizando un cultivo lctico iniciador A, resultaba en una FML incompleta, y quedaba 100 mg/l de cido mlico en el vino (Tabla 1). Durante las dos primeras semanas del experimento, no se apreciaron diferencias significativas en la degradacin de glucosa y fructosa al comparar las inoculaciones FA/FML simultnea y secuencial. Sin embargo, a los, 20 das de terminar la FA/FML simultnea, no quedaba ni glucosa ni fructosa detectables en el pro-

tocolo de inoculacin conjunta, mientras que en las inoculaciones secuenciales permaneca una concentracin global de glucosa y fructosa de 700 mg/L. Dado que la glucosa y la fructosa pueden servir de fuentes de carbono y energa para muchos microorganismos, la total ausencia de estos dos azcares mejora la estabilidad microbiolgica. La degradacin de cido ctrico difera en los tratamientos mediante inoculaciones FA/FML simultneas o secuenciales. En los tratamientos simultneos, el cido ctrico se degradaba ms deprisa, y se produca una cantidad de cido actico ligeramente superior. No obstante, las diferencias de concentraciones finales de cido actico eran reducidas y estadsticamente significativas.

Tabla 2.
Produccin de cido actico (g/L) en funcin del protocolo de inoculacin
FA/FML Simultnea Cultivo lctico iniciador EQ54 Cultivo lctico iniciador ALPHA 0.195 0.187 FA/FML secuencial 0.147 0.168

El anlisis sensorial de los vinos producidos en este experimento puso de manifiesto diferencias entre los vinos elaborados con secuencias de inoculacin distintas, si bien poca o ninguna diferencia se poda atribuir a la cepa de bacterias lcticas utilizada. Los vinos elaborados con inoculacin conjunta eran ms afrutados que los vinos realizados con inoculacin simultnea. En colaboracin con las estaciones de investigacin alemanas sitas en Neustadt y Trier, Lallemand investi90

g la inoculacin simultnea de levadura y bacterias en vino Riesling. Este experimento estaba concebido para determinar el impacto de la adicin simultnea de levadura y bacterias lcticas en los aromas del varietal, as como la produccin bacteriana de un exceso de cido actico. Los resultados presentados en la Figura 3, demuestran que la inoculacin simultnea de levadura y bacterias no influye en la fermentacin de la levadura, y no se forma cido actico.

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Fermentacin Malolctica Figura 3.

Adicin simultnea de levadura y bacterias en funcin de la fermentacin alcohlica

200

160 Simultnea CY3079 Despus de la fermentacin alcohlica CY3079 Simultnea EC1118 Despus de la fermentacin alcohlica EC1118

Azcares totales (g/l)

120

80

40

0 0 2 6 10 14 17 21 24 28 31 35 Das a partir de la inoculacin

La inoculacin temprana de un cultivo lctico iniciador tena por resultado una FML mucho ms rpida, y el cido mlico se degradaba en 23 das, comparado con ms de 50 das si la inoculacin se realizaba despus de la FA Figura 4. El momento de la inoculacin tuvo un impacto importante en el perfil sensorial del vino. En el caso de la inoculacin simultnea, el rpido inicio de la FML permita una degradacin del cido mlico en las condiciones reductoras genera-

das por las clulas de levadura todava activas. En el experimento de inoculacin conjunta, este medio reductor impeda la formacin de aromas lcticos o de mantequilla, y el vino conservaba los sabores y aromas tpicos de la uva Riesling. Los vinos inoculados despus de la fermentacin presentaban los sabores a mantequilla y nuez tpicos de una fermentacin malolctica, y estaban ausentes los sabores y aromas de la uva Riesling.

Figura 4.
Adicin simultnea de levadura y bacterias en funcin de la fermentacin alcohlica
4 Inoculacin despus de la fermentacin alcohlica

CY3079 sim AF/MLF EC1118 sim AF/MLF CY3079 post AF EC1118 post AF

cido mlico (g/l)

0 0 10 20 30 Das 40 50 60

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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Estos resultados demuestran que la induccin simultnea de FA/FML da lugar a vinos que terminan antes la fermentacin malolctica. Los vinos elaborados con este mtodo tendrn una mayor estabilidad microbiolgica porque el dixido de azufre se puede aadir en una fase ms precoz de la elaboracin y adems estn ausentes los azcares glucosa y fructosa. Esta tcnica de induccin simultnea de la FA y la FML ha resultado muy satisfactoria en los mostos blancos de pH bajo. Recientemente, la literatura francesa ha mencionado la posibilidad de inoculacin simultnea12 de la levadura y las bacterias en el mosto de uva. En la regin de Champagne se ha aplicado una variacin de esta tcnica para aclimatar los cultivos lcticos normales durante las primeras fases del proceso pie de cuba. El procedimiento utilizado en esta regin consta de dos fases, y consiste en una adicin de levadura para evitar la contaminacin por Lactobacillus durante la aclimatacin de las bacterias lcticas deseadas. Los cultivos bacterianos utilizados en la regin de Champagne no se aclimatan durante su produccin, y por lo tanto no son aptos para su inoculacin directa en el vino. Durante el proceso de aclimatacin en dos etapas, la fase 1 de reactivacin va seguida de la fase 2 pie de cuba malolctico durante la cual las bacterias lcticas se aclimatan lentamente a las difciles condiciones del vino. El nico inconveniente del procedimiento pie de cuba malolctico es su dificultad y el tiempo que lleva, pero la primera fase se tiene que llevar a cabo en el laboratorio. En 1993 Michel Valade et al.13 han propuesto un protocolo de reactivacin bacteriana de aplicacin ms sencilla. Han adaptado las bacterias a concentraciones crecientes cultivndolas en mosto de uva diluido y enriquecido con nutrientes de bacteria lctica y levadura seca activa, y manteniendo el pH controlado en una horquilla de 3.2-3.5. Este procedimiento ha sido una simplificacin muy de agradecer de la fase del pie de cuba malolctico. Los autores no han observado una produccin excesiva de cido actico y lctico (picado lctico), aunque han advertido que este procedimiento de reactivacin no es comparable con la inoculacin conjunta del vino. En la actualidad, los investigadores franceses reconocen las ventajas de la inoculacin simultnea de bacterias y levadura para la produccin de vinos jvenes diseados para ser consumidos a los dos meses de la ven-

dimia. Este proceso permite a las bacterias lcticas adquirir tolerancia al alcohol durante la fermentacin alcohlica, a la vez que permite que se inicie la FML durante el ltimo tercio de la fermentacin alcohlica14 y que termine rpidamente al final de la fermentacin alcohlica. La utilizacin de este mtodo favorece una estabilizacin temprana de los vinos, los hace aptos para el consumo desde fechas anteriores, adems de reducir la posibilidad de que se desarrollen organismos perjudiciales, como bacterias acticas y hongos Brettanomyces. Esta tcnica, combinada con una nutricin satisfactoria de la levadura, garantiza una fermentacin de levadura sana con una buena cintica y permite utilizar una cepa de levadura que ayude a la FML. Es fundamental controlar el pH del mosto, mantenindolo a un nivel de 3.5 aproximadamente, pues si se rebasa este techo, los azcares se degradan ms fcilmente. No obstante, hay que recordar que la Oenococcus oeni no degradar los azcares hasta que no se haya consumido la totalidad del cido mlico.

1.3 Inoculacin de cultivos lcticos iniciadores durante la fermentacin alcohlica


La ventaja de inocular las bacterias durante la fermentacin alcohlica se puede explicar por el hecho de que en esa etapa, la mayor parte del SO2 libre est ligado por compuestos de carbonilo que se produjeron durante el crecimiento de la levadura, mientras que la concentracin alcohlica an no ha alcanzado niveles txicos. Sin embargo, en esta etapa es cuando se pueden dar los niveles ms altos de antagonismo por metabolitos -como el cido decanoico- inducido por la levadura15. Rosi et al16 han comunicado una reduccin de la viabilidad bacteriana cuando la inoculacin se lleva a cabo a la mitad de la fermentacin alcohlica. Han atribuido dicha reduccin a factores como el agotamiento de nutrientes, la produccin de etanol y una cada del pH provocada por la produccin de cidos. Estos resultados indican adems que si se realiza la inoculacin en este momento, la fermentacin someter a las bacterias a un fuerte antagonismo con la levadura, que puede resultar insuperable. La investigacin realizada en Lallemand ha confirmado estas observaciones, y ha confirmado la conclusin de que la inoculacin a la mitad de la fermentacin alcohlica resulta siempre en una acusada reduccin de la viabilidad y actividad bacterianas. (Figura 5).

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Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica Figura 5.

Supervivencia de las bacterias lcticas despus de la inoculacin en distintas fases de la FA


1. 00E+ 08 1. 00E+ 07 Recuento de clulas viables (cfu/ml) 1. 00E+ 06 1. 00E+ 05 1. 00E+ 04 1. 00E+ 03 1. 00E+ 02 1. 00E+ 01 1. 00E+ 00 0 20 40 60 80 Das 100 120 140 160 inoculacin simultnea (1g/hl) inoculacin a la mitad de FA (1g/hl) inoculacin despues de la FA (1g/hl)

1999 ltima vendimia Rieslaner Blanco. pH 3.3, Alcohol 12.5% v/v, 130C

1.4 Inoculacin de cultivos lcticos iniciadores despus de la fermentacin alcohlica


La inoculacin al final de la fermentacin alcohlica no plantea el riesgo de descomposicin bacteriana heterofermentativa de los azcares con el resultante incremento de la acidez voltil. Este tipo de inoculacin tarda evita buena parte de la toxicidad de los cidos carboxlicos producidos, pues su concentracin disminuye despus de la fermentacin alcohlica17. El mrito de la inoculacin al final de la fermentacin alcohlica tambin se puede relacionar con la disponibilidad de nutrientes bacterianos originados por la muerte de la levadura y su autolisis subsiguiente18. No obstante, la exposicin a los altos niveles de etanol presentes en el momento de la inoculacin tarda puede causar un retraso de la FML, en especial en los vinos producidos en climas clidos. Normalmente, las bacterias aadidas despus de la fermentacin alcohlica son capaces de alcanzar concentraciones celulares comparables a las de las bacterias inoculadas en el mosto, siempre que las condiciones del vino no sean restrictivas. En caso de limitacin de nutrientes (vase el captulo sobre Necesidades Nutricionales) o cuando los parmetros qumicos del vino son limitadores, la adicin de un sistema nutriente bacteriano ayuda a la FML. En los casos en que el grado alcohlico supera un 15.5% v/v, es necesario aclimatar los cultivos bacterianos iniciadores antes de

su inoculacin en el vino. El captulo prctico de esta publicacin presenta protocolos de aclimatacin especializados.

1.5 Demora en la induccin de la fermentacin malolctica


Durante los ltimos 15 aos ha mejorado espectacularmente la calidad de los cultivos iniciadores malolcticos. Los cultivos iniciadores disponibles para su inoculacin directa en el vino son fciles de manejar y permiten controlar mejor la fermentacin malolctica. La utilizacin de estos cultivos lcticos iniciadores de nueva generacin permite tanto un inicio temprano como una rpida terminacin de la fermentacin malolctica. En la regin francesa de Burdeos, o en otras regiones vitcolas que producen principalmente vinos de Pinot Noir, el desarrollo rpido de la FML es contrario a las tcnicas de vinificacin tradicionales, que siempre han confiado en una FML espontnea en primavera. La utilizacin creciente de cultivos iniciadores lcticos de inoculacin directa ha inducido una FML ms rpida, pero tambin ha tenido como resultado una reduccin significativa de la pigmentacin. Gerbaux19 ha ilustrado la influencia del inicio temprano y la rpida culminacin de la FML en la claridad y la intensidad del color en los vinos de uva Pinot Noir los vinos en Figura 6.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Figura 6.
Influencia de la cintica de la FML en el color del vino de Pinot Noir

30 28

3,5

3 26 _ _ _ _cido mlico(g/l) 24 _____ Claridad (L*) 22 20 18 16 14 0,5 12 10 0 30 60 90 Tiempo (das) 120 150 180 0 1,5 2,5

Gerbaux, Enoforum Piacenza, 2005

Ha podido conseguir una mayor estabilizacin del color cuando se dan las condiciones siguientes: 1. Aumento del tiempo transcurrido entre el trasiego, o eliminacin de las las de fermentacin, y el comienzo de la FML 2. Reduccin de la velocidad de la FML 3. Retraso de la adicin de SO2 hasta despus de terminar la FML Por norma general, las tcnicas de vinificacin que inhiben o retrasan la FML- niveles de SO2 ms altos, temperaturas por debajo de 10 C, o la adicin de lisozima en cualquier etapa de la vinificacin- ayudar a estabilizar la prdida de color en los vinos de pigmentacin ligera como Pinot Noir o Sangiovese. Los consumidores de vino de todo el mundo piden vinos con un color estable, lo cual ha inducido un uso creciente de la tcnica de microoxigenacin en la vinificacin. La microoxigenacin provoca la formacin de pequeas cantidades de etanal (acetaldehdo), lo cual mejora la polimerizacin de los polifenoles, resultando en una estabilizacin del color. Por consiguiente, al terminar la micro-oxigenacin, el
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color del vino tinto se estabiliza, lo cual reduce la prdida de color achacada a la FML. Se sabe que la microoxigenacin retrasar el inicio de la FML, lo cual significa que no se debe intentar la inoculacin de bacterias lcticas hasta que haya terminado la microoxigenacin. Las bacterias lcticas Oenococcus oeni consumirn acetaldehdo, por lo cual sern capaces de rescatar en el vino cantidades residuales de este compuesto. Por ello, la induccin de la FML despus de la microoxigenacin tendr la ventaja adicional de reducir la concentracin de acetaldehdo. Cuando se utiliza la microoxidacin en climas clidos para producir vinos tintos de alto pH, se recomienda retrasar la induccin de la FML. Para conseguirlo, se recomienda utilizar lisozimas20 o una combinacin de lisozima y SO2. En conclusin, probablemente no exista un planteamiento universal para la induccin de la FML por inoculacin. Como han indicado Silver y Madej21, el momento ms deseable para la inoculacin depende de todo un abanico de factores de vinificacin, los ms importantes de los cuales son la composicin del mosto, la cepa de levadura utilizada para elaborar el vino, y las tcnicas de vinificacin.

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Fermentacin Malolctica
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IV.2. Fermentacin malolctica en barrica

Jos HIDALGO TOGORES


Dr. Ingeniero Agrnomo y Enlogo
2.1 Efectos de la fermentacin malolctica en los vinos. 2.2 Acumulacin de polisacridos de origen microbiano. 2.3 Prdidas de color en los vinos tintos. 2.4 Modificacin de los aromas en los vinos. 2.5 Prctica de la fermentacin malolctica en barrica. 2.6 Crianza de vinos sobre las en depsito.

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Fermentacin Malolctica

IV.2. Fermentacin malolctica en barrica

e todos es conocido los efectos que sobre los vinos produce la fermentacin malolctica (FML), pudiendo ser beneficiosos en algunos casos, como por ejemplo en los vinos tintos que se destinan a crianza, donde es imprescindible lograr una buena estabilidad biolgica, que garantice su conservacin en el tiempo; o bien para otros vinos, donde la acidez mlica puede ser tan elevada, que la desacidificacin biolgica es prcticamente la nica solucin posible. En otros casos, este proceso puede suponer un inconveniente, como por ejemplo en los vinos destinados a consumo rpido, donde la presencia de cido mlico puede ser interesante conservar, pues en concentraciones pequeas, su existencia contribuye a mejorar las sensaciones gustativas, as como tambin a mantener un nivel adecuado de acidez y frescura en los mismos.

2.1. Efectos de la fermentacin malolctica en los vinos.


Las consecuencias positivas o negativas, que la FML ocasiona en los vinos se resumen en los siguientes aspectos: Importante disminucin de la acidez total de los vinos, que realizada de forma natural mediante un proceso biolgico, en ocasiones puede superar una desacidificacin superior al 50 por 100 de la acidez inicial, producida no solo por la eliminacin total o parcial del cido mlico, si no tambin por una mayor insolubilizacin del cido tartrico contenido en el vino. Adems, las propiedades gustativas de los vinos, mejoran notablemente no solamente por la cada de la acidez, sino tambin por la desaparicin de un cido spero y astringente como es el mlico, y surgiendo el cido lctico de gusto ms suave y vinoso. Aumento de la acidez voltil en los vinos, en valores normales de 0,1 a 0,2 gramos/litro, debido a una posible degradacin de los azcares residuales, o tambin cuando intervienen bacterias heterolcticas en el proceso, pero sobre todo, cuando se produce la metabolizacin del cido ctrico natural de la vendimia, generalmente durante la etapa final de la FML y prcticamente cuando ya no existe cido mlico en el medio, as como tambin de otros compuestos existentes en el vino, tales como: cido tartrico, glicerina, cido srbico, etc.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Disminucin de la intensidad de color en los vinos tintos, explicada en parte por una importante modificacin de su pH, que puede implicar una modificacin molecular de los antocianos, aunque sobre todo se debe a una destruccin de estas sustancias, debido posiblemente a la hidrlisis de las molculas de antocianos, producida por el complejo enzimtico de las bacterias en la bsqueda de la parte azucarada de estas sustancias. Mayor estabilidad biolgica de los vinos, debido en parte a un empobrecimiento en nutrientes o factores de crecimiento en el medio, as como tambin a una mayor presencia en el medio de inhibidores microbianos formados por las bacterias lcticas, sustancias conocidas como bacteriocinas, que comunican al vino una cierta inmunidad frente a otras posibles alteraciones microbianas. Las bacteriocinas son compuestos de naturaleza peptdica o proteica, habindose descubierto recientemente algunas, tales como: brevicina, caseicina, nisina, pediocina y leucocina, proponiendo su uso, bien individualizadas o bien asociadas a otros bactericidas, para la estabilizacin biolgica de los vinos frente a las bacterias lcticas.

Modificacin de aromas en los vinos, debido en parte a una disminucin de los aromas varietales, por otra parte a una atenuacin o desaparicin de algunas sustancias aromticas formadas durante la fermentacin alcohlica, y por ltimo, a la formacin de diferentes steres y alcoholes superiores responsables de olores no siempre agradables. Acumulacin de polisacridos en los vinos, procedentes de las levaduras en autolisis, as como de las propias bacterias lcticas, que por si solas o bien polimerizadas con los taninos, comunican al vino una agradable sensacin untuosa y de volumen. Degradacin de los aminocidos de los vinos mediante su descarboxilacin, producindose unas sustancias txicas denominadas aminas bigenas, tales como: la histamina que es una sustancia alrgena derivada de la histidina, o bien la ornitina y el carbamato de etilo derivados de la arginina, siendo la primera un inhibidor microbiano y la segunda una sustancia de supuestas propiedades cancergenas, o tambin el 2-acetil tetrahidropiridina de caracterstico olor a ratn producido a partir de la lisina, o

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Fermentacin Malolctica
propia clula, pues a travs de ella se producen todos los intercambios de nutrientes, asimilacin y salida de sustancias de desecho, as como otras funciones reproductoras, siendo sede de molculas responsables de interacciones celulares, como las de carcter floculante, killer, etc., as como conteniendo numerosas enzimas, generalmente hidrolasas, asociadas a la pared celular o alojadas en el espacio periplasmtico. La pared celular confiere a la levadura su forma caracterstica, generalmente de aspecto redondeado elptico.

algunas sustancias ms derivadas de otros aminocidos: alanina, tirosina, etc. La existencia en el vino de estas sustancias perjudiciales para la salud humana, ha supuesto en los ltimos aos el desarrollo de una tecnologa suficiente para impedir su formacin en los vinos durante la FML. Eventual formacin de polisacridos exocelula res, producto de determinadas bacterias lcticas, tales como: Pediococcus damnosus y Lactobacillus brevis, que se recubren de una sustancia viscosa de glucano derivada de la glucosa, confiriendo a los vinos un aspecto denso y viscoso, conocido vulgarmente como ahilado o enfermedad de la grasa, de consecuencias desagradables pero poco graves. El desarrollo de la FML en barrica, frente a su ejecucin en depsitos de mayor capacidad, no supone una novedad, pues esta tcnica se ha venido realizando desde tiempo inmemorial en determinadas zonas productoras, pero los conocimientos que hoy da se tienen sobre la misma, as como las ventajas que de ella se derivan, hacen que sea una prctica de gran inters para la elaboracin de vinos tintos y blancos de elevada calidad. La FML realizada en barrica, mejora especialmente los siguientes efectos: mayor acumulacin de polisacridos, menor prdida de materia colorante, y mejora o modificacin del aroma de los vinos, que de forma ordenada y sin tener en cuenta su importancia se desarrollan a continuacin.

2.2. Acumulacin de polisacridos de origen microbiano.


Las manoprotenas son unos polisacridos parietales de los microorganismos, existentes sobre todo en las levaduras vnicas, cuya presencia en los vinos, les comunica una serie de importantes mejoras sensoriales, as como tambin en lo referente a su estabilizacin. Antes de estudiar estos importantes efectos en los vinos, para entender mejor la naturaleza de estos compuestos, es importante conocer su localizacin en las paredes celulares de las levaduras, as como tambin las funciones que ellas desempean.

Durante el desarrollo de una fermentacin alcohlica, la poblacin normal de levaduras que se puede alcanzar es del orden de 100 x 106 clulas por ml de mosto, que suponiendo fueran todas Saccharomyces cerevisiae de forma elptica y con unas dimensiones aproximadas de 5 x 10 m, representara una superficie del orden de 18 m2 por litro de mosto; siendo este dato conocido como superficie de reaccin, a travs de la cual se producen todos los fenmenos vitales de las clulas, y que tambin tiene una gran importancia en la lisis de las levaduras, as como en la cesin de polisacridos al medio.

2.2.1. Estructura de la pared celular de las levaduras.


La pared celular externa de las levaduras representa el 15 a 25 por 100 de su peso seco, siendo una envuelta de carcter rgido ligeramente elstico, teniendo por misin asegurar la proteccin de los elementos que contiene la clula, principalmente por regulacin de la presin osmtica con el medio exterior, siendo adems un rgano dinmico multifuncional, donde se desarrollan una serie de fenmenos vitales para la
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

La pared celular est formada por una pared externa, as como de una pared interna o membrana plasmtica, estando ambas separadas por un espacio periplsmico. La pared celular externa se compone principalmente de polisacridos, destacando en un 60 por 100 los glucanos, principalmente por -1,3 glucano de aspecto fibroso, encontrndose ste siempre asociado a la quitina, y teniendo por misin la de mantener la forma y rigidez de la clula. Existe un segundo 1,3 glucano de tipo amorfo, que se asocia a las manoprotenas, que asegura la elasticidad celular, y por fin un tercero -1,6 glucano, cuya misin es unir los diferentes elementos que forman la pared celular, como si de un cemento o cola se tratase. Las manoprotenas se encuentran en la pared celular externa, representando el 20 a 50 por 100 del peso seco de la pared, estando formadas por molculas de alto peso molecular, desde 20.000 hasta 450.000 Dalton, conteniendo aproximadamente un 90 por 100 de manosa y el 10 por 100 restante de pptidos. Estructuralmente se encuentran unidas a los glucanos amorfos antes citados, pudiendo ser separados de stos por hidrlisis enzimtica con -glucanasas. Por ltimo, tambin se encuentra la quitina que, de forma minoritaria ocupa el 1 a 2 por 100 de la pared celular externa, encontrndose asociada a los glucanos a los que les comunica rigidez, localizndose en mayor concentracin en los crteres o cicatrices externas de gemacin de las levaduras, donde asegura un cierre perfecto para la pared celular.

En consecuencia, la pared celular externa presenta en su cara exterior una capa de manoprotenas asociadas a una matriz de -1,3 glucanos amorfos, as como en su cara interna, otra capa de -1,3 glucanos fibrosos asociados a pequeas cantidades de quitina, quedando unidas ambas capas por medio de los -1,6 glucanos. La rigidez y la forma de la pared celular depende de los glucanos, mientras que su porosidad es determinada por las manoprotenas. La composicin de la pared celular depende de las condiciones nutritivas del medio, as como tambin de la edad de las clulas. El glucano de la pared celular aumenta con la riqueza en azcares del mosto, as como tambin con la edad de las levaduras, siendo del mismo modo, ms rica en quitina y ms pobre en manoprotenas. La carencia en mesoinositol eleva la proporcin de glucanos respecto de las manoprotenas.

El espacio periplsmico se sita entre la pared celular externa y la membrana plasmtica, donde se encuentran algunas enzimas vitales para las clulas, destacando la invertasa capaz de desdoblar la sacarosa en glucosa y fructosa, u otras diversas enzimas (-glucosidasa, -galactosidasa, melibiasa, aminopeptidasa, esterasa, etc.), as como enzimas importantes para el crecimiento de las levaduras o su gemacin: -glucanasas del tipo 1,3 y 1,6 cuya mxima concentracin se encuentran en la fase de crecimiento exponencial de las levaduras, y que enolgicamente tienen un gran inters por ser responsables de la autolisis de las paredes de las levaduras cuando permanece un vino sobre sus las, conservando esta actividad algo ms atenuada meses despus de terminar la fermentacin alcohlica.

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Fermentacin Malolctica

Por ltimo, la membrana plasmtica situada hacia en interior de las clulas, constituye una barrera selectiva que controla los intercambios entre la levadura y el medio exterior, siendo por tanto un rgano esencial para la vida de stas. Contiene aproximadamente un 40 por 100 de lpidos y un 50 por 100 de protenas, mientras que las manoprotenas y los glucanos tan solo suponen un 5 por 100.

Los principales fosfolpidos de estas membranas son: la fosfatidil-etanolamina (FE), el fosfatidil-colina (FC) y el fosfatidil-inositol (FI), que representan un 70 a 85 por 100 del total, existiendo adems otros como: la fosfatidil-serina (FS) y el difosfatidil-glicerol o cardiolipina (FG). Los fosfolpidos son compuestos de 1,2-diacilglicerol y un enlace fosfodister que une el esqueleto del glicerol a algunas bases, como colina, inositol, serina y etanolamina. Los cidos grasos situados en la posicn 1 del glicerol son mayoritariamente saturados, mientras que los situados en la posicin 2 son insaturados; teniendo siempre un nmero par de tomos de carbono en su molcula, siendo los de 16 a 18 los ms abundantes, pudiendo estar saturados como el cido palmtico y el cido esterico, o bien insaturados como el cido oleico y el cido linoleico. Segn las condiciones ambientales (oxgeno, temperatura, etanol, etc.) predominantes en el medio de crecimiento, las levaduras pueden sintetizar cidos grasos de cadena mediana (C6 a C12) o de cadena larga (C14 a C18) saturados o insaturados. Todos los fosfolpidos poseen una parte polar o hidrfila de alcohol fosforilado, y otra no polar o hidrfoba formada por dos cadenas paralelas de cidos grasos, que se estructuran en la membrana en forma de doble capa, con las cabezas polares situadas hacia el exterior y unidas por las colas no polares, dentro de las cuales se encuentran fuertemente asociadas las protenas membranarias. La superficie de esta membrana toma una caracterstica forma ondulada o rizada.

Las protenas de las membranas o glicoprotenas, tienen un peso molecular entre 10.000 a 120.000 Dalton, pudiendo ser de tipo intrnseco situadas en el interior de la doble capa lipdica antes mencionada y asociadas a la parte no polar, o bien de tipo extrnseco ubicadas hacia el exterior de la membrana. Entre estas protenas destacan la adenosintrifosfatasa (ATPasa), teniendo por misin transportar los solutos (azcares, aminocidos, etc.) a travs de la membrana plasmtica. La fluidez de paso de la membrana depende de la composicin en los cidos grasos de los fosfolpidos y la cantidad de esteroles que tambin contiene. Cuando las colas de los fosfolpidos estn situadas ordenadas, la membrana se torna ms rgida e impermeable, mientras que cuando se desordenan, sta se convierten ms permeable, dependiendo una u otra forma de la temperatura del medio fermentativo. En cuanto a los esteroles, el ms importante es el ergosterol, siendo sintetizados exclusivamente en las mitocondrias, en condiciones de aerobiosis durante la fase de crecimiento de las levaduras. Se encuentran situados en la membrana plasmtica y unidos a los fosfolpidos. La presencia de ergosterol permite la penetracin de los azcares dentro de la clula, siendo por lo tanto un factor de importancia en el correcto desarrollo de la fermentacin alcohlica. Del mismo modo, el enriquecimiento de los fosfolpidos membranarios en cidos grasos insaturados, como los cidos oleico y linoleico, favorecen la permeabilidad de la membrana plasmtica, y por lo tanto tambin el intercambio de sustancias con el medio exterior. La presencia de etanol en cantidades crecientes, en ocasiones tambin impermeabiliza la pared celular. Por ltimo, la temperatura baja durante la fase de crecimiento de la levaduras, aumentan el contenido en ergosterol en la pared celular, y por lo tanto asegura el desarrollo y final de la fermentacin. Sin embargo, la temperatura baja reduce la permeabilidad celular, y por lo tanto, limita los fenmenos de intercambio entre el interior y el exterior de las clulas.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

2.2.2. Autolisis de las levaduras.


El concepto autolisis de las levaduras define la autodegradacin enzimtica de las distintas partes de las mismas, que comienza inmediatamente despus de la muerte de las clulas, cuando cesa su actividad. La degradacin de las membranas de las levaduras, comprende por una parte la liberacin de las enzimas de hidrlisis acumuladas en el espacio periplsmico de la pared celular, y por otra la destruccin de los componentes de las paredes, permitiendo el vertido de los compuestos autolizados hacia el exterior.

La autolisis de las levaduras se desarrolla en las siguientes etapas: primera, una fase de activacin que desorganizando las endoestructuras celulares libera las enzimas de hidrlisis contenidas en la pared celular. Segunda, un desprendimiento de manoprotenas de cadenas cortas unidas covalentemente al glucano en las paredes internas de las levaduras. Tercera, una liberacin de manoprotenas de alto peso molecular procedente de la zona periplsmica de la clula. Y cuarta, una posible degradacin de estas sustancias liberadas en el medio, interviniendo enzimas glucanasas, manosidasas, y proteasas. La liberacin de estos polisacridos de las paredes de las clulas se produce por la accin de enzimas parietales: endo--(13) y endo-(16) glucanasas, estando localizadas stas en el espacio periplsmico de las paredes celulares, presentando una importante actividad durante la fermentacin alcohlica, sobre todo en la fase de crecimiento exponencial de las levaduras, y un contendido cada vez ms debilitado durante algunos meses despus de la misma. La autolisis de las levaduras durante la conservacin de los vinos sobre sus las, conduce a una liberacin de las manoprotenas fijadas sobre el glucano de las paredes celulares, as como una hidrlisis parcial de las glucomanoprotenas, siendo estos compuestos resultantes muy solubles en medios acuosos como es el vino. Las manoprotenas pueden ser degradadas por enzimas tales como: exo-(16)--Dmanosa, exo-(12)--manosa y -D-manosidasa.

La autolisis comprende tres aspectos diferentes, el primero una liberacin de aminocidos por proteolisis debido a un efecto de las enzimas proteolticas contenidas en las mismas levaduras, cuya actividad se ve bastante reducida por la acidez del vino, pero que podra ser ms importante si el pH del medio fuera superior. As a un valor de pH de 3,0 los aminocidos liberados durante la autolisis representaran solamente el 13 por 100 del nitrgeno total liberado, mientras que a un pH de 5,0 supondran un 60 por 100. El segundo una formacin de compuestos voltiles, que participan en el aroma de los vinos, los cuales sern descritos posteriormente. Y el tercero se refiere a la degradacin de las paredes celulares de las levaduras, producindose una fuerte actividad enzimtica debida principalmente a la intervencin de -glucanasas existentes en el espacio periplsmico, que hidrolizando los glucanos liberan las manoprotenas contenidas en la pared celular externa, segn el mecanismo descrito a continuacin. Durante este proceso se produce un engrosamiento de un 10 por 100 de la pared celular, mientras que el espesor de la capa polisacardica, o cara externa de la pared celular, aumenta del orden de un 26 por 100, empobrecindose sta en aminocidos, enriquecindose en hexosas por la actividad enzimtica, y aumentando fuertemente la relacin manosa / glucosa.
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con unas 150 a 250 unidades de manosa muy ramificadas a su vez con otras cadenas laterales de manosa ms cortas de una a tres unidades, unido a la cadena peptdica sobre la asparagina mediante un enlace Nglicosil y haciendo intervenir dos unidades de N-acetil-glucosamina. Recientemente se ha descubierto otra cadena lateral de glucomanano, as como tambin otra cadena de etanolamina-fosfato-manosamanosa-manosa-glucosamina-inositol-fosfolpido, que se unen del mismo modo a la cadena peptdica principal.

Las manoprotenas excretadas por las levaduras durante la fermentacin alcohlica, especialmente durante la fase de crecimiento exponencial, no poseen las mismas propiedades que las formadas por hidrlisis de las enzimas parietales por la autolisis de las levaduras, siendo stas ltimas las que poseen efectos protectores frente a los enturbiamientos proteicos y a las precipitaciones tartricas, debido a que poseen una masa molecular cercana a los 30.000 Dalton. La autolisis de las levaduras en los vinos puede ser muy rpida en medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35 a 40 C, mientras que en las condiciones reales de los vinos, con valores de pH entre 3,0 a 3,5 y temperaturas inferiores a 15 C, se puede realizar en un plazo de 2 a 3 meses o ms, intensificndose la autolisis si peridicamente se agitan las las, como se hace con el bttonage en la crianza de ciertos vinos blancos y tintos en barrica o depsito. La liberacin de estos polisacridos tambin puede ser activada, mediante la adicin de preparados especficos de levaduras inactivas ricas en enzimas glucanasas, o tambin mediante la adicin de la propia enzima -1,3 glucanasa sintetizada, cuya tecnologa se tratar posteriormente. Las bacterias lcticas tambin son capaces de ceder al vino compuestos polisacridos parecidos a las manoprotenas de las levaduras cuando se produce su destruccin por autolisis, ya que estas sustancias tambin se encuentran en sus paredes celulares, aunque la cantidad de estos polisacridos cedidos al medio es muy inferior al procedente de las levaduras. Sin embargo, durante la FML en presencia de las o restos de la fermentacin alcohlica, las bacterias lcticas son capaces de acelerar la destruccin de las paredes celulares de las levaduras contenidas en las las, debido posiblemente a la accin de enzimas -glucanasas formadas por las bacterias, con el propsitos de proveerse de los factores de crecimiento contenidos en la masa de levaduras muertas: protenas, aminocidos, minerales, etc. y especialmente de los glucanos parietales.

Las manoprotenas constituyen el 25 a 50 por 100 de la pared celular de las levaduras, pudiendo encontrarse en los vinos en cantidades de hasta 100 a 150 mg / litro, y de acuerdo con la siguiente composicin: Manoprotenas mayoritarias en un 80 por 100 del total, que contienen un 90 por 100 de manosa y un 10 por 100 de protenas, estando su masa molecular oscila de 100.000 a 2.000.000 Dalton. Glucomanoprotenas minoritarias en un 20 por 100, conteniendo un 25 por 100 de glucosa, 25 por 100 de manosa y 50 por 100 de protenas, encontrndose su masa molecular entre 20.000 a 90.000 Dalton. La presencia de estos polisacridos en los vinos blancos o tintos, presenta una serie de importantes efectos, que por un lado afectan a las caractersticas sensoriales de los vinos, y por otra parte a la estabilidad de los mismos.
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2.2.3. Las manoprotenas: composicin y propiedades.


La estructura de las manoprotenas se encuentra formada por una cadena peptdica lineal, llevando por un lado otras cadenas ms cortas de una a cuatro molculas de manosa, unidas a la cadena peptdica por enlaces O-glicosil sobre la serina y treonina, y por otra parte de un -D-manano de alta masa molecular,

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Mejora gustativa de los vinos. La presencia de polisacridos en los vinos aumenta la sensacin de volumen y untuosidad en la boca, apareciendo a veces tonos dulces ms patentes en los vinos blancos.

Estabilizacin de las precipitaciones tartricas, protei cas y de color. La presencia de estos polisacridos en los vinos, proporciona una cierta estabilidad frente a las precipitaciones tartricas y proteicas, como si de coloides protectores se tratase. Las manoprotenas formadas por las levaduras en la fase de fermentacin, as como los residuos de arabinogalactanos II procedente de la hidrlisis de sustancias pcticas, no tienen efecto alguno sobre la insolubilizacin de tartratos; mientras que los ramnogalacturonanos II y las manoprotenas de autolisis de microorganismos, son capaces de frenar o impedir dichas precipitaciones. Cuando el contenido en ramnogalacturonano II es inferior a los 30 mg / litro, como en el caso de los vinos blancos comunes, puede ser un activador de la nucleacin de estas sales, pero cuando excede los 100 mg / litro, como en los vinos tintos o en los blancos fermentados en barrica, se comporta al igual que las manoprotenas, como inhibidor de la nucleacin y crecimiento de los cristales de tartratos. Esta propiedad es de tal inters enolgico, que se est estudiando la utilizacin de manoprotenas exgenas para el tratamiento de estabilizacin de los vinos. Por otra parte, las arabingalactan-protenas II y las manoprotenas, procedentes tanto de las levaduras de fermentacin, como de su autolisis, tambin presentan un efecto inhibitorio frente a las precipitaciones proteicas de los vinos, as como estabilizante de la materia colorante en estado coloidal. Estas propiedades protectoras se deben a su carcter fuertemente hidrfilo, que las hace ser unas sustancias muy solubles y estables en soluciones hidroalcohlicas como es el vino, e impidiendo la formacin de agregados, algo parecido al efecto producido por otro polisido autorizado en el tratamiento de vinos, como es la goma arbiga, mezcla de arabinogalactanos II y arabinogalactan-protenas II. Estos polisidos son bastante resistentes a las degradaciones enzimticas, siendo difcilmente metabolizados por los microorganismos del vino, e incluso tambien las manoprotenas poseen un efecto activador de las bacterias lcticas del gnero Leuconostoc, que puede ser interesante para el desarrollo de la FML, aunque perjudicial para otras posibles alteraciones de los vinos.

Del mismo modo, la presencia de las las reduce el contenido en taninos elgicos procedentes de la madera de roble, bien por fijacin de estos compuestos sobre la paredes de las levaduras, o bin por su combinacin con las manoprotenas liberadas por las levaduras; aunque tambin stas se pueden unir a los taninos ms simples y reactivos provenientes de vendimia, obtenindose unos taninos polimerizados, conocidos como buenos taninos o taninos dulces, sensorialmente muy similares a los existentes en las vendimias de buenas aadas de los grandes vinos. La autolisis de las levaduras, produce un enriquecimiento del medio en aminocidos y cidos nucleicos, comportndose como sustancias exaltadoras del sabor, y en consecuencia mejorando la fase gustativa del vino.

Conservacin de aromas varietales en los vinos. Independientemente de las sustancias aromticas que pueden formarse o modificarse durante una FML en barrica o en depsito, las manoprotenas pueden secuestrar los aromas varietales en su estructura tridimensional, conservndolos de este modo ms tiempo en los vinos.
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de oxidacin-reduccin es ms elevado, pudiendo entonces oxidarse excesivamente el vino; mientras que si son usadas, con ms de dos a tres aos de edad, el potencial oxidacinreduccin desciende, pudiendo entonces aparecer olores anormales de reduccin producidos por las las. Una buena norma puede ser renovar las barricas cada 2 a 3 aos, introduciendo un medio o un tercio de barricas nuevas, y manteniendo el resto de barricas con la edad proporcional. La estancia sobre las diminuye la posibilidad del defecto del enrojecimiento oxidativo de los vinos blancos, caracterizado por la aparicin de un tono gris rosceo en vinos ligeramente oxidados, no procediendo este color de una posible contaminacin de antocianos, y por lo tanto tampoco puede ser decolorado por el anhdrido sulfuroso o por una modificacin del pH, aunque s por la exposicin de las botellas de vino a la luz solar. Los tratamientos de clarificacin con casena o PVPP, tampoco son eficaces. La sustancia responsable no es conocida, siendo sin embargo absorbida por las las de fermentacin, o por el contrario prevenir su aparicin con la adicin de cido ascrbico en la fase previa del embotellado (100 mg / litro). Existe un test que mide el ndice de sensibilidad al enrojecimiento oxidativo, que consiste en medir el vino en un espectrofotmetro a 500 nm de longitud de onda, antes y despus de 24 horas de adicionar agua oxigenada, multiplicando por 100 el valor diferencial alcanzado. Cuando este valor es superior a 5, entonces existe un riesgo de enrojecimiento oxidativo en el vino blanco analizado.

Mejora del color en los vinos blancos. Por una parte, la fijacin de los compuestos fenlicos oxidables del vino blanco, bien sobre las paredes de las levaduras, o tambin con las manoprotenas producida por su autolisis, limitan el sustrato oxidable del vino, y en consecuencia tambin su oxidacin.

Pero por otra parte, durante la estancia en barrica del vino sobre sus las, el oxgeno que penetra a travs de la madera o de las manipulaciones del vino, como los trasiegos o rellenos, compensa la capacidad reductora de las las, evitando de este modo la aparicin de olores azufrados desagradables, y al mismo tiempo la oxidacin del vino, resultando entonces unos vinos blancos aromticamente correctos y de una sorprendente coloracin plida.

2.3. Prdidas de color en los vinos tintos.


Durante la FML se produce una disminucin de la intensidad de color en los vinos tintos, motivada por un desequilibrio de las molculas de antocianos debido a una modificacin del pH, as como tambin por una destruccin de estas sustancias, debido posiblemente a la hidrlisis de las molculas de antocianos, producida por el complejo enzimtico de las bacterias lcticas en la bsqueda de la parte azucarada de las mismas.
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El equilibrio entre la oxidacin y reduccin se consigue manteniendo el parque de barricas con una edad adecuada, pues cuando stas son nuevas, el potencial

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

En la actualidad, la investigacin enolgica est buscando paliar este importante efecto negativo en los vinos tintos, encontrando algunas posibles soluciones, como la utilizacin de levaduras genticamente modificadas para la eliminacin del cido mlico durante la fermentacin alcohlica, y sin que ello suponga una prdida de color en los vinos. O bien utilizando la tcnica de micro-oxigenacin del vino tinto antes de la FML, buscando la polimerizacin y estabilizacin de los antocianos con los taninos, antes de que sta se desarrolle y cause una disminucin de la intensidad de color, mediante la aplicacin de una dosis de 10 a 25 ml de oxgeno por litro de vino y por mes. La FML de los vinos tintos realizada en barrica, produce del mismo modo una estabilizacin del color, y en consecuencia evita una cada de la intensidad colorante, ya que al introducir el vino en las barricas, comienza a penetrar aire a travs de la madera a razn de 2 a 4 mg de oxgeno por litro de vino y por mes, producindose una polimerizacin de los antocianos y taninos de tipo puente etilado; donde el etanal o acetaldehdo que contiene el vino procedente de la oxidacin del etanol en presencia de polifenoles o de iones Fe3+ o Cu2+, o bien de la descarboxilacin del cido pirvico, reacciona con las valencias negativas de los taninos en las posiciones 4 y 8, as como tambin con los antocianos en la forma carbinol (AOH) neutra.

las, el efecto protector de la morfologa de las levaduras por los polifenoles, pues en ausencia de stas sustancias las levaduras adquieren rpidamente una forma aplastada hacia el final de la fermentacin alcohlica, mientras que cuando existen polifenoles en el medio, las levaduras permanecen esfricas, emitiendo la hiptesis de que los compuestos fenlicos protegen las paredes de la levaduras frente a la hidrlisis enzimtica, y dificultan en consecuencia la cesin de manoprotenas al vino.

2.4. Modificacin de los aromas en los vinos.


Durante la FML se produce una modificacin de los aromas de los vinos, debido en parte a una disminucin de los aromas varietales por una degradacin o hidrlisis de los compuestos aromticos de la uva; por otra parte a una atenuacin o desaparicin de algunas sustancias aromticas agradables formadas durante la fermentacin alcohlica, donde destacan: 3-metil-n-butilacetato, n-hexilacetato, 2-fenil-etilacetato y 2-etil-n-hexanoato; y por ltimo a la formacin de diferentes steres, como el acetato de etilo de inconfundible olor a pegamento, o el lactato de etilo de olor lcteo, o bien los alcoholes superiores como: n-propanol, 2-butanol y n-hexanol de olor ms pesado y grosero. Pero quizs el compuesto aromtico ms caracterstico que se forma durante la FML es el diacetilo o 2,3-butanodiol, formado a partir de la degradacin del cido ctrico por las bacterias lcticas, y con un inconfundible olor a mantequilla, perceptible por encima de los 5 a 7 mg/litro. El anhdrido sulfuroso reduce el contenido en diacetilo, debido a una interaccin entre ambas sustancias, atenundose el impacto olfativo, que puede aparecer de nuevo cuando se reduce el nivel de sulfuroso. Las poblaciones reducidas de bacterias lcticas, la presencia de oxgeno en el medio, los valores de pH bajos y la temperaturas reducidas, ralentizan la FML y en consecuencia contribuyen a elevar el nivel de diacetilo en los vinos. Por el contrario, el contacto del vino con las las, as como la presencia de azcares residuales en el mismo, disminuyen la formacin de esta sustancia. Por otra parte, la autolisis de las levaduras tambin

El polmero formado es de color rojo-malva muy estable, de tono vivo al principio y evolucionando con el tiempo hacia un matiz ms oscuro llamado como rojo sombra o rojo picota. Este es uno de los motivos de realizar este proceso en barricas nuevas o seminuevas, donde la penetracin del oxgeno a travs de la madera es la que exactamente corresponde para realizar el proceso de polimerizacin antes descrito. Se ha estudiado durante la crianza de los vinos sobre

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Fermentacin Malolctica 2.5. Prctica de la fermentacin malolctica en barrica.


No se debe confundir la tcnica de fermentacin de mostos blancos en barrica, con la de FML en barrica generalmente de vinos tintos, pues aunque con ambos mtodos se consigue unos efectos sensoriales muy parecidos originados por la autolisis de las levaduras; en la primera se trata de realizar la fermentacin alcohlica de un mosto blanco dentro de un envase de madera, seguido de una estancia del vino sobre sus las, con o sin FML posterior, y buscando obtener como principal fin, unas mayores sensaciones de volumen y complejidad en la boca; mientras que con la segunda se pretende conseguir, adems de una mayor estructura gustativa, otros objetivos sensoriales diferentes, como son la estabilizacin del color del vino tinto, as como la adquisicin de aromas agradables muy particulares, mediante la FML del vino en envases de madera de similares caractersticas, y tambin seguido de una permanencia del vino sobre sus las. Un primer aspecto tcnico a tener en cuenta para la FML en barrica son las caractersticas fisico-qumicas que debe reunir el vino tinto. Este deber poseer unas mnimas condiciones cualitativas, sobre todo en lo referente a la calidad de la vendimia, as como tambin a su grado de maduracin, partiendo de vinos sanos y bien elaborados, mejor dotados de una elevada carga de fruta, y presentando una analtica y estructura fenlica suficiente, que podemos resumir en las siguientes condiciones: Indice de polifenoles totales (IPT) superiores a 60 o 70. Intensidad de color (IC) superior a 10 o 12. Riqueza en antocianos superior a 600 o 800 mg/litro. Riqueza en taninos superior a 3 o 4 gramos/litro. Relacin antocianos / taninos de 1 / 4 a 1 / 5. Nivel de dixido de azufre lo ms bajo posible. Acidez total superior a 5 o 6 gramos / litro en cido tartrico. Valores de pH los ms bajos posible y siempre inferiores 4. Acidez voltil moderada y siempre inferior a 0,5 a 0,6 gramos / litro. Ausencia de azcares residuales. El vino tinto deber introducirse lo ms ntegro posible, es decir con toda la carga de las que pudiera contener como consecuencia de la fermentacin alcohlica, con objeto de disponer de la mayor masa posible de levaduras para su posterior autolisis. Lgicamente, en el caso de desear la extraccin de un nivel de manoprotenas ms reducido, entonces ser posible realizar el correspondiente trasiego, consiguiendo la eliminacin parcial de las las gruesas, y prestando siempre atencin para no airear en exceso el vino,
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genera la formacin de compuestos voltiles, que participan en el aroma de los vinos, donde destacan cuantitativamente y cualitativamente, los steres pesados de los cidos grasos de cadena larga; as como los alcoholes terpnicos como el linalol, -terpineol, citronelol, geraniol y farnesol; tambin los alcoholes superiores, como el alcohol isoamlico y el fenil-2-etanol, y sus aldehdos, citando el metil-3butanal de olor herbceo y el benzaldehdo de aroma a almendras amargas; las lactonas como la -decalactona de olor a melocotn y nuez de coco y el 3-hidroxi-4,5-dimetil-5-furanona o sotoln de aroma a nuez que aparece patente en los vinos criados bajo velo de levaduras; y por ltimo los compuestos azufrados voltiles, u otras sustancias, como el vitispirano, que es un derivado norisoprenoide de aroma alcanforado o eucalipto. Por ltimo, la madera de roble y sobre todo su interaccin la FML, hacen que aparezcan en el vino sustancias aromticas agradables procedentes de este material. Los compuestos cedidos por la madera de roble se ven muy atenuados, por una parte los taninos por su combinacin con los polisacridos de las paredes celulares, y por otra parte algunas sustancias aromticas son reducidas por las levaduras perdiendo el carcter aromtico, especialmente la vainillina y los aldehdos furnicos de aromas tostados. Mientras que otros compuestos, como el eugenol de aroma especiado o la -metil--octolactona de aroma a coco no se ven afectados. La consecuencia es un vino de menor carcter maderizado, as como de boca ms suave e integrada. Las bacterias lcticas consumen cantidades notables de vainillina de la madera de roble, lo que explica su contenido inferior en los vinos que han realizado la FML en barrica. Recientemente se ha comprobado que, la presencia de las en la barrica, favorece la sntesis de furfuriltiol, sustancia de agradable aroma a caf tostado, muy caracterstico de los vinos que se elaboran por FML en barrica; el cual procede de la reaccin del sulfuro de hidrgeno (SH2) con el furfural contenido en la madera tostada, favoreciendo en consecuencia la aparicin de este compuesto en las barricas nuevas. Sin embargo, durante la estancia del vino sobre sus las, las enzimas glucanasas pueden producir una liberacin de aminocidos y glucosa, llegando esta ltima sustancia hasta concentraciones de 500 a 900 mg / litro, pudiendo incidir en el desarrollo de levaduras del gnero Brettanomyces de nefastas consecuencias para el vino almacenado en la barrica.

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

pues esto dificultara el posterior arranque de la FML. Un criterio que puede seguirse en este sentido es el de eliminar las las ms pesadas de tamao superior a las 100 m, compuestas principalmente de restos vegetales de la vendimia y despus de una sedimentacin de 24 a 48 horas, conservando las las gruesas y finas de tamao inferior a 100 m, compuestas principalmente de levaduras. Con el fin de facilitar el arranque de la FML, algunos enlogos conservan el vino con sus las en depsito, y esperan que ste inicie la FML, para inmediatamente trasegarlo sin aireacin y con todas sus las hacia las barricas. De este modo se vence la dificultad que ofrece el arranque de este proceso en pequeos envases de madera, donde por una parte el vino se puede enfriar, y por otra parte, la posible entrada de aire debido a la operacin de trasiego, o bien al que penetra a travs de la madera, dificultan el desarrollo y la actividad de las bacterias lcticas. Sin embargo, esta forma de operar no es muy conveniente, pues se pierde parte del efecto de proteccin del color que se busca con la FML en barrica, ya que se reduce el tiempo necesario para la polimerizacin de antocianos y taninos, cuya reaccin de por s es bastante lenta. Un segundo aspecto a tener en cuenta es el tipo de envase a utilizar, debiendo siempre tratarse de barricas nuevas, o a los sumo seminuevas, donde se posibilite la entrada de aire en los anteriormente citados valores de 2 a 4 mg de oxgeno por litro de vino y por mes, y utilizando diferentes tipos de maderas y grados de tostados, en funcin de los gustos particulares de cada elaborador. Sin embargo siempre es aconsejable para este tipo de elaboraciones, utilizar maderas bastante tostadas, para favorecer la sntesis del furfuriltiol, una sustancia de agradable aroma a caf con leche, cuyo origen se detalla ms adelante. El volumen del envase tiene tambin una gran importancia, pues debe facilitarse en la medida de lo posible, el contacto de las las con el vino. En los recipientes de gran volumen, la superficie de contacto lasvino es muy limitada, sin embargo, cuando se utiliza una barrica, esta superficie es ms elevada.

As para un depsito de 200 hl, la superficie las-vino situadas en el fondo del mismo es del orden de 2 a 3 cm2 / litro, mientras que para una barrica bordelesa de 225 litros es de 5 a 10 cm2 / litro.

Para aumentar esta superficie de contacto, se procede al removido peridico de las las despus de terminar la FML, mediante una operacin conocida como btonnage, realizada durante el tiempo de contacto que se crea oportuno, en general de 4 a 8 meses, y con una periodicidad suficiente de 3 a 7 das. Para realizarla, existen diferentes herramientas de btonnage, desde simples listones de madera o metal, hasta complicados sistemas de agitacin; siendo un buen y sencillo sistema de removido, el rodado o girado de la barrica en un ngulo 180, realizado en el primer caso, directamente sobre el suelo, lo que supone un pequeo desplazamiento de la barrica, o en el segundo caso, utilizando un durmiente especial dotado de un juego de cuatro pequeas ruedas.

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Durante el desarrollo de la FML en barrica, es conveniente que las barricas no estn llenas del todo, respetando un espacio de un 5 a 10 por 100, pues debido al metabolismo de las bacterias lcticas, siempre de produce un desprendimiento de gas carbnico, y adems se debe evitar el derramamiento del vino cuando se introduce el dispositivo de btonnage, y mejor colocando un sistema de cierre semihermtico, existiendo tapones especficos para esta operacin.

La operacin de btonnagesupone poner las levaduras en suspensin en el vino, consiguiendo de esta forma, una superficie de contacto las-vino elevadsima, del orden de 18 m2 / litro o 180.000 cm2 / litro, muy superior a las conseguidas con un mero contacto esttico. A las pocas horas de realizar esta operacin, las las se vuelven a depositar en el fondo del recipiente, lo que implica realizar su removido de forma peridica, con los plazos anteriormente sealados.

Otra razn que obliga a la utilizacin de envases de pequeo volumen, es la influencia que tiene el tamao del recipiente en la aparicin de olores azufrados defectuosos, pues las las situadas en el fondo de envases de gran capacidad, hace que las las sean comprimidas y entonces se favorezca la aparicin de estas sustancias. Sin embargo, separando temporalmente las las del vino y alojndolas en barricas durante un mes, se logra atenuar su actividad sulfitoreductasa, pudiendo ser luego reincorporadas al vino y evitar de este modo la aparicin de olores azufrados, especialmente del sulfuro de hidrgeno y del metanotiol. La prdida progresiva de la aptitud de las las de liberar compuestos azufrados, puede explicar entre otros factores, la posibilidad de mantener vino sobre sus las en barricas o bien en depsitos de mayor volumen.

Un tercer aspecto a contemplar son las condiciones ambientales ideales para el desarrollo de la FML en barrica, pues por una parte deben posibilitar la actividad de las bacterias lcticas, y por otra parte mantener el ambiente adecuado para permitir una buena estancia del vino en barricas. Durante la FML, el factor ambiental ms importante es la temperatura, que deber estar comprendida entre los 18 a 22 C, para lo que se recurre generalmente a la climatizacin de la sala de barricas, e incluso llegando a la instalacin de suelos radiantes en una zona de la bodega. Sin embargo, cuando la FML termina, las condiciones ambientales deben cambiar radicalmente, pues en primer lugar es conveniente bajar la temperatura del vino bruscamente, hasta alcanzar valores comprendidos entre 5 a 10C, buscando inhibir la actividad bacteriana, para en segundo lugar, despus alcanzar temperaturas entre 12 a 15 C que permitan unas buenas condiciones de crianza del vino, acompaado de otras muy importantes como: humedad relativa no superior de 70 a 80 por 100, ausencia de olores extraos, poca o nula iluminacin, etc.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

La autolisis de las levaduras en los vinos puede ser muy rpida en medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35 a 40 C, mientras que en las condiciones reales de los vinos, con valores de pH entre 3,0 a 3,5 y temperaturas inferiores a 15 C, se puede realizar en un plazo de 2 a 3 meses o ms, intensificndose la autolisis si peridicamente se agitan las las. Un cuarto aspecto a tener en cuenta es la utilizacin de cultivos seleccionados de bacterias lcticas, obtenidas industrialmente en forma lquida, congelada o liofilizada, y preparadas de forma sencilla para su adicin al vino, en unos casos mediante una protocolo de reactivacin, o bien en la actualidad mediante su adicin directa (one-step). La bacteria lctica seleccionada ms utilizada es la Oenococcus oeni, antiguamente llamada Leuconostoc oenos, que contienen una poblacin de 1 x 1011 a 1 x 1012 bacterias vivas por gramo, lo que supone una dosis del orden de 30 a 50 mg / litro, que asegura la siembra de una poblacin de 1 a 10 millones de clulas por ml y creciendo en el medio hasta unos 50 millones de bacterias por ml de vino. La inoculacin de bacterias seleccionadas impide el desarrollo de las bacterias lcticas salvajes, que pueden tener un efecto negativo sobre la calidad del vino, especialmente en la acidez voltil, y debida al desarrollo de bacterias lcticas salvajes de los gneros Lactobacillus y Pediococcus. Adems, las bacterias lcticas seleccionadas suelen ser criotolerantes, desarrollndose bien a temperaturas de 13 a 14 C, lo que evita el calentamiento de los vinos, y permite un desarrollo de la FML lenta y a baja temperatura, conservando mejor los aromas varietales de los vinos y reduciendo las prdidas de materia colorante en los vinos tintos. La inoculacin con cantidades elevadas de bacterias lcticas reduce sensiblemente la formacin de diacetilo en los vinos, as como evitando la formacin de las aminas bigenas. Para aumentar la cesin de manoprotenas a los vinos que permanecen sobre sus las, se puede aadir la misma enzima que hidroliza los glucanos de la Botrytis cinerea, es decir una -(13)-D-glucanasa; realizando el tratamiento con una dosis de 1 a 2 gramos / hectlitro de vino, durante un tiempo de 2 a 4 semanas, y siempre sobre las levaduras muertas de la fermentacin; respetando adems las condiciones del medio sealadas con anterioridad, es decir: temperatura superior a los 10 C y ausencia de bentonita en el vino. Otra opcin es aadir cortezas de levaduras de elevado contenido en manoprotenas (CLECM), en dosis de 20 a 40 gramos/hectolitro. La utilizacin de autolizados de levaduras tambin tiene un gran inters, pues estas sustancias pueden ser aadidas a partir de preparados comerciales de cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae seleccionadas por su elevado poder proteoltico, rea110

lizndose su autolisis en un medio hidroalcohlico tamponado a pH 3,0 y 30 a 50 C de temperatura, siendo despus centrifugadas para separar las paredes celulares y luego secadas por calor. Tambin existen preparados de levaduras inactivas, a la cual se le aplica un proceso de extraccin especfico para hacer ms fcil la liberacin de polisacridos de las paredes celulares. Aplicado en dosis de 30 gramos por hectolitro en vendimias tintas, al principio de la fermentacin alcohlica y de la maceracin, se consigue suministrar al medio una cantidad temprana de polisacridos, que son capaces de fijar los taninos extrados de los hollejos y de las pepitas, estabilizndolos en el vino y comunicndoles sensaciones de redondez y volumen. Un quinto aspecto a contemplar, es el control y ries gos del proceso de FML en barrica. Previo a su inicio es importante realizar una analtica al vino, para conocer algunos parmetros. Unos servirn para conocer las posibles dificultades del medio para el arranque de la FML: anhdrido sulfuroso libre y total, azcares, pH, y grado alcohlico, y otros servirn para controlar el desarrollo de la misma: acidez total, acidez voltil y cido mlico. La FML se manifiesta exteriormente por un patente desprendimiento de anhdrido carbnico, que forma en la superficie del vino una espuma caracterstica, al mismo tiempo que comienza una continua cada de la acidez total, con una progresiva disminucin del cido mlico y un aumento del cido lctico, as como tambin del cido actico sobre todo al finalizar el metabolismo. La evolucin de los cidos mlico y lctico se pueden medir mediante mtodos enzimticos, aunque la mejor manera de hacerlo es hacerlo por cromatografa sobre papel, que supone un mtodo semicuantitativo y rpido de realizar. Otro sistema para la fcil medicin del cido mlico o del cido lctico es el sistema Reflectoquant de la firma Merck, que consiste en la utilizacin de un aparato reflectmetro para la evaluacin de tiras analticas, que impregnadas de mosto o vino, son capaces de medir instantneamente una gran cantidad de parmetros, donde adems de estos cidos, destacan los siguientes: azcares, dixido de azufre libre, acidez total, calcio, potasio, etc. Adems de la disminucin de la acidez total y de la evolucin de los cidos mlico y lctico, tambin es conveniente controlar el incremento de la acidez voltil, pues una subida anormal de esta sustancia puede indicar una anomala en el desarrollo de la FML, e incluso llegar a tener que tomar medidas para paralizar el proceso microbiano. La seguridad de que una FML se realice con una determinada especie o cepa de bacteria lctica, puede ser comprobada con mtodos de anlisis

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permanecer mucho tiempo sobre una masa de las. Acidez voltil. Anhdrido sulfuroso libre y total. Potencial redox. Control microbiolgico. Anlisis sensorial.

moleculares (RAPD, Ribotipado, ARDRA, AFLP, etc.), que permiten una identificacin rpida y precisa de estos microorganismos. Del mismo modo otras tcnicas, como la de hibridacin fluorescente in situ (FISH. fluorescent in situ hybridization), posibilitan adems de la identificacin de las bacterias, su recuento simultneo. El final de la FML es una etapa que debe ser controlada y manejada adecuadamente, pues normalmente los vinos son abandonados, y entonces se pueden producir transformaciones indeseables sobre otras sustancias del vino, que tienen como consecuencia una excesiva subida de la acidez voltil. Cuando el cido mlico desaparece, las bacterias lcticas comienzan a metabolizar el cido ctrico del vino, producindose una fermentacin citroactica que produce notables cantidades de cido actico. Para evitarlo se debe operar de la siguiente forma: cuando en el vino resta medio gramo por litro o menos de cido mlico, la FML se debe de dar por finalizada, y entonces se procede al trasiego y sulfitado del vino (3 a 6 gramos / hl) para paralizar a las bacterias lcticas; resultando el vino sin cido mlico al terminar el proceso, debido a que la enzima malolctica residual es capaz de metabolizar por inercia los restos de este cido, a pesar de la muerte de estas bacterias, y quedando por lo tanto el cido ctrico sin degradar. La duracin de la FML es muy variable, transcurriendo en un plazo medio de una a dos semanas, aunque en algunas ocasiones puede desarrollarse en un perodo mucho ms largo, cuando se manifiestan en contra uno o ms factores de crecimiento, siendo la baja temperatura y el valor reducido de pH los que ms influyen en esta ralentizacin. Terminada la FML, los controles que se deben realizar al vino en crianza sobre sus las, deben ser los habituales para un vino situado en estas condiciones, teniendo especial cuidado en lo referente a posibles alteraciones microbianas, pues no se debe olvidar que ste

El nivel de anhdrido sulfuroso a mantener en el vino debe ser lo ms bajo posible, con objeto de permitir la formacin de acetaldehdo y as posibilitar la polimerizacin de antocianos y taninos, pero esta carencia de dixido de azufre puede conducir al desarrollo de microorganismos indeseables, como las mismas bacterias lcticas que podran metabolizar otras sustancias del vino: cido ctrico, cido tartrico, glicerina, etc., o tambin bacterias acticas, e incluso de levaduras indeseables como las Brettanomyces, todos ellos de nefastas consecuencias. Del mismo modo, la ausencia de anhdrido sulfuroso podra conducir a una oxidacin irreversible en el vino. Con este motivo, es muy importante realizar controles peridicos de los vinos, atendiendo especialmente a su anlisis sensorial, que permitir al enlogo conocer la evolucin del vino, y as decidir el final de su permanencia sobre las las, pudiendo entonces completarse la crianza en madera con una estancia suplementaria en barrica. En sexto y ltimo lugar, las condiciones de embotella do de los vinos elaborados por este sistema, no pueden ser ms sencillas, pues en general no es necesario realizar tratamiento de estabilizacin alguno, pues como anteriormente se ha comentado, los vinos resultan estables frente a las insolubilizaciones de tartratos, protenas y materia colorante. Aunque los tratamientos de estabilizacin de los vinos, como las clarificaciones y estabilizacin tartrica, no afectan sustancialmente a su contenido en manoprotenas, mientras que las filtraciones muy cerradas pueden hacerlo en cierta cuanta, y teniendo como consecuencia una rpida colmatacin de los filtros.

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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Unicamente podra ser necesario realizar un ajuste del nivel de anhdrido sulfuroso libre hasta 30 a 40 mg/litro, y en ocasiones aadir una dosis de hasta 200 mg/litro de goma arbiga inmediatamente antes del embotellado, con el propsito de prevenir la precipitacin de materia colorante en el tiempo.

2.6. Crianza de vinos sobre las en depsito.


Una alternativa a la FML en barrica y su posterior estancias sobre las las, consiste en realizar este mismo proceso en depsitos de mayor capacidad, y en consecuencia aprovechar las mismas ventajas que este mtodo ocasiona, y sin que las sensaciones aromticas y gustativas aportadas por la madera se transmita y deforme a los vinos. Se trata de obtener un vino fermentado en barrica, pero sin barrica. Esta tcnica se puede aplicar tanto a los vinos tintos como a los blancos, donde simplemente consiste en dejar los vinos sobre sus las, removindolas con la misma periodicidad, y consiguiendo que el poder reductor de las las se compense con oxgeno aportado, bien mediante aireacin o mejor utilizando la tcnica de micro-oxigenacin, permitiendo de este modo la autolisis de las levaduras sin la aparicin de olores azufrados desagradables. Las cantidades de oxgeno a aplicar oscilan entre 1 a 3 ml por litro y da, acompaadas de un puesta en suspensin de las las, utilizando para ello cualquier dispositivo al efecto: bombas de remontado, agitadores de hlice, turbobazuqueadores, etc.

El control de este proceso es similar al anteriormente expuesto, aunque en este caso se debe prestar especial atencin para conseguir un buen equilibrio de oxidacin-reduccin, aireando u oxigenando algo ms cuando el vino se comience a reducir, o bajando la aireacin u oxigenacin, e incluso llegando a corregir el nivel de anhdrido sulfuroso libre, cuando el vino presente ligeros sntomas de oxidacin.

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Fermentacin Malolctica
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Fermentacin Malolctica

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IV.3 Fermentacin malolctica: cundo y cmo

Antonio PALACIOS Carlos SUREZ Jos Mara HERAS Sibylle KRIEGER.


Lallemand
3.1 Introduccin 3.2 fermentacin malolctica: si o no 3.3 Conclusin

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Fermentacin Malolctica

3.1 Introduccin
l vino es uno de los productos ms antiguos donde los procesos microbiolgicos hacen una contribucin importante en la calidad final del producto. La elaboracin del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, pero no obstante nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biotecnolgicos, son lentamente aceptados y utilizados en las bodegas.

IV.3. Fermentacin malolctica: cundo y cmo

Ms recientemente, las bodegas ms modernas han introducido instalaciones que hacen posible seguir unas normas higinicas rigurosas, donde todos los procesos de elaboracin se controlan, incluyendo los microbiolgicos. Al comienzo de esta evolucin apareci el uso de levaduras seleccionadas con fines enolgicos, siendo un tratamiento muy extendido en nuestros das. A principios de los aos noventa, los cultivos de bacterias lcticas liofilizadas se haban introducido en los mercados, comenzando con productos tipo Standar, que requieren un tiempo y trabajo intenso de reactivacin. Posteriormente los cultivos tipo 1-Step (de un solo paso), con una nica etapa de adaptacin y luego, los primeros cultivos de inoculacin directa, que aparecieron en los aos noventa. Los nuevos cultivos tipo MBR se introdujeron a principios del ao 2000, pertenecen ya a la segunda generacin de cultivos de bacterias malolcticas de inoculacin directa. Estos cultivos con alta concentraron bacteriana, representan una herramienta til e innovadora para una controlada, rpida y confortable fermentacin malolctica (FML) dentro de un proceso de vinificacin en condiciones limitantes, con resultados predecibles y uniformes.

3.2 Fermentacin malolctica: si o no


La realizacin de la FML nunca ha sido cuestionada en un vino tinto, pero en vinos blancos, es todava una materia de preferencia y del estilo de vino. Investigando en diversos vinos tintos y blancos australianos, Bartowski y Henschke1 observaron que la gran mayora de vinos tintos haban experimentado una FML completa, encontrando en los vinos blancos una gama completa de diferentes niveles de FML, comenzando sin FML en vinos de la variedad Riesling y terminando por vinos reservas Chardonnay con 100% de FML y con mucho cuerpo. Pero la mayora de los vinos blancos haban experimentado una FML parcial.

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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Desde hace algn tiempo, era posible distinguir fcilmente los vinos blancos producidos en las regiones norteas de climas fros con una acidez muy marcada, de los vinos producidos en climas ms clidos. Pero obviamente el gusto de los consumidores ha cambiado a travs de los tiempos, la mayora de los consumidores prefieren un vino blanco afrutado con una acidez moderada5. As aparecen unas preguntas importantes a resolver: En qu vino?, En qu grado la acidez tiene que ser disminuida? y mediante Que mtodo?. Durante aos, la FML ha sido reconocida nicamente por la reduccin de la acidez, pero ms recientemente la FML se ha mostrado como un medio para mejorar organolpticamente y dar una estabilidad microbiolgica al producto final, Krieger, 1999 6. La decisin FML "SI" o "NO" tiene que ser tomada muy rpidamente en el proceso de vinificacin. Si la decisin es "NO" para los vinos blancos o FML parcial, los tratamientos posibles y nicos sern: una buena clarificacin, adicin de SO2 y disminucin de la temperatura. Ms recientemente, un nuevo aditivo se ha introducido en la industria del vino llamado lisozima como un elemento de control de bacterias lcticas, Gerbaux, 983 y Gerland 99 4. La OIV ha aprobado el uso de lisozima en el vino y la decisin se transmiti debidamente a la CEE. Este La lisozima no tiene efecto antioxidante. As, el SO2 no puede ser completamente reemplazado. Como la lisozima tiene una estructura proteica, la bentonita reacciona con la enzima inmediatamente. Si un tratamiento con bentonita se lleva a cabo, debe hacerse con anterioridad a la adicin de lisozima. El efecto de la lisozima disminuye despus de algunas horas. La lisozima puede inhibir la FML durante un perodo corto de tiempo, pero

organismo ha incluido la lisozima en la lista de tratamientos y prcticas autorizadas en la vinificacin, pero dentro de unos lmites, a condicin de ser determinados dichos lmites. Desafortunadamente la Comisin no fue capaz de establecer estos lmites en el plazo de tiempo requerido. En USA el uso de lisozima est permitido, pero la bodega debe notificarlo a la BATF. En nuestro conocimiento, ninguna reglamentacin existe para Australia y Nueva Zelanda. La lisozima es una enzima extrada de la clara de huevo de gallina, con una accin inhibitoria muy especfica sobre bacterias Gram +, especialmente lcticas. Las diversas experimentaciones realizadas han mostrado que aplicando lisozima en dosis de 500 mg/l al comienzo de la fermentacin alcohlica en vinos con un alto riesgo de sufrir FML o dos adiciones separadas en el tiempo en vinos con menor riesgo, al comienzo y al final de la fermentacin alcohlica, pueden evitar la FML, permitiendo utilizar niveles reducidos de SO2. Acorde a Gerbaux (98), las dosis de SO2 pueden ser reducidas a 4 o 5 g/hl con la presencia de lisozima. La fermentacin alcohlica no se ve influenciada por el tratamiento con lisozima. Algunas reglas importantes tienen que ser respetadas en la aplicacin de lisozima en vinificacin en blanco: reaccin positiva despus de un calentamiento, aunque numerosas experimentaciones no han podido probar ninguna inestabilidad proteica en el vino embotellado. ATENCION: La adicin de cido metatartrico para la estabilizacin tartrica de vinos tratados con lisozima, provoca una fuerte turbidez en el vino, aunque los vinos se hayan tratado con bentonita. Este fenmeno no ha podido ser aclarado hasta el momento.

el vino todava tiene que ser filtrado antes de ser embotellado para evitar una FML espontnea en botella. La actividad de la lisozima disminuye con el pH. Existe riesgo de recontaminacin cuando se mezclan vinos tratados y no tratados. Aunque siendo inactivada, la lisozima permanecer en el vino a causa de su estructura proteica. Los vinos tratados mostrarn una

A pesar de todas las ventajas y la buena actividad de la lisozima, las reglas bsicas de buenas prcticas enolgicas todava tienen que ser respetadas: higiene, higiene e higiene. Si la decisin se ha hecho en favor de una FML parcial, las adiciones de lisozima en la gama de 200 a 300 mg/l durante la fermentacin, pueden parar la FML durante varias horas. Nuevamente, se debe prestar atencin a la disminucin del efecto de la lisozima a
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travs del tiempo, por lo que se hace preciso vigilar las posibles recontaminaciones. Durante la vendimia de 1999, la supervivencia de bacterias lcticas salvajes en el vino poda ser observada durante meses, pudo comprobarse lo mismo en algunos vinos tratados con lisozima, aunque con menor frecuencia. Una observacin realizada por parte del ITV en Francia, que debe ser todava confirmada, conduce a pensar que en vinos inoculados con

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de la inoculacin con el cultivo llamado Alpha. El control (tanque 1) no fue tratado con lisozima, en el tanque 2 se hizo FML con una adicin pequea de lisozima cuando se haba degradado la mitad del cido mlico, y en el tanque 3, se agreg lisozima al principio, directamente despus de la inoculacin con Alpha, para evitar cualquier degradacin del cido mlico. La adicin de lisozima provoca una muerte brusca de las bacterias y 4 das despus de la adicin de lisozima, no debera detectarse ninguna bacteria.

cultivos seleccionados para iniciar la FML, las bacterias parecen ser ms fcilmente inactivadas por lisozima que las bacterias propias de una FML espontnea. As, si la decisin es una FML parcial, interrumpiendo la FML con lisozima o SO2, la recomendacin es inducir la FML mediante cultivos iniciadores seleccionados. La figura 1 muestra la supervivencia y la cintica de la FML en un vino Riesling de 1999 (Alemania) despus

Figura 1.
FML en un vino Riesling de 1999 despus de la inoculacin directa con Alpha, con y sin tratamiento de lisozima (pH 3,03; alcohol 12 % vol; AT 8,0 g/l; SO2 total < 35 ppm; temperatura 18 C)
5,0 1,0E+07
1 (m lic o) sin lisozim a

1,0E+06
Clulas Viables (cfu/ml)

4,0 1,0E+05
cido mlico

2 (m lic o) lis ozim a MLF 50 % MLF 3 (m lic o) lis ozim a al principio 1 (cfu) sin lisozim a

3,0
(g/l)

adic in de lisozim a

1,0E+04

2,0

1,0E+03

1,0E+02 1,0 1,0E+01

2 (cfu) li s ozim a MLF 50 % 3 (cfu ) lis ozim a al principio

0 0 5 10 15 20 Tiem po (d) 25 30 35

1,0E+00

Cuando la FML se para en alguna etapa de la degradacin del cido mlico, pueden aparecer algunas secuelas organolpticas. Durante la FML, pueden producirse algunos compuestos con gusto indeseable, que se degradarn nuevamente al final o durante la FML. Si la FML se interrumpe, algunos de estos compuestos pueden ser no degradados permaneciendo en el vino. En la mayora de los casos, es mejor mezclar un vino con FML completa con el mismo vino donde se ha evitado la FML. De esta forma, ser posible hacer una maceracin post-FML, incluyendo en el esquema de elaboracin una buena gestin en la produccin de diacetilo1.
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CHA RDO NNA Y (1 0 t a n q u e s ) P IN O T N O IR (1 7 t a n q u e s ) A NT ES M L F D ES P U ES M L F M LF + 3 m

Si la FML es deseada, las decisiones adicionales son necesarias en lo que concierne al "COMO", y "CUANDO", FML espontnea o inducida. Si la decisin es en favor de la FML, se recomienda restringir la aplicacin de SO2 al comienzo de la vinificacin. El nivel de SO2 total no debe ser superior de 50 mg/l. Un contenido en SO2 libre de 15-20 mg/l puede atrasar la FML o incluso impedirla completamente, que es frecuentemente el caso de vinos con pH bajo, donde el efecto antimicrobiano del SO2 libre es mucho ms fuerte. Si la preferencia es de FML espontnea, las uvas debern ser sanas. Los conteos altos de clulas viables de bacterias lcticas salvajes pueden tener una influencia negativa sobre la calidad del vino. En la mayora de los casos, cuando Lactobacillus o Pediococcus dominan la FML espontnea, frecuentemente resultan niveles altos de subproductos indeseables, tal y como acidez voltil, aromas de reduccin; o en el supuesto del crecimiento excesivo de Pediococcus, altos niveles en aminas bigenas (histamina entre otras), que pueden provocar problemas importantes a personas sensibles (Figura 2).

% DE VINOS CON CONCENTRACIONES DE HISTAMINA > 2.5 mg/l

Figura 2.
Aminas bigenas Evolucin durante la vinificacin (datos:ITV FRANCE, 1998)
119

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

En vinos con alto pH, la inoculacin temprana del cultivo bacteriano seleccionado y caracterizado, como las cepas L31 o Alpha, es altamente recomendable.

Figura 3.
Desarrollo de una FML controlada

En condiciones ptimas para el crecimiento de bacterias, como pH alto, excesiva madurez o presencia de uvas botritizadas, temperaturas prximas a los 22 C, una temprana adicin de lisozima (500 mg/l) consigue reducir la presencia de bacterias lcticas indeseables y ayuda a conseguir una fermentacin alcohlica ms saludable. La FML puede ser inducida posteriormente al final de la fermentacin alcohlica inoculando bacterias seleccionadas (Figura 3). La alta tolerancia a las bajas temperaturas (inferiores a 13-14 C) de los nuevos cultivos MBR de inoculacin directa, puede ser un parmetro muy interesante a utilizar en vinificacin en tinto as como en blanco. Adems supone una ventaja econmica, ya que no es

necesario calentar el vino o las bodegas para alcanzar una temperatura entre 18 y 22 C. Reduciendo la temperatura, se reduce la velocidad de la FML. Lonvaud-Funel8 ha publicado resultados donde se muestra un incremento del diacetilo y una degradacin ms lenta del cido mlico, as como un incremento en la produccin de cido actico cuando la FML es muy rpida. Una degradacin del cido mlico ms lenta permite estabilizar mejor el color en los vinos tintos a baja temperatura, resultando un descenso menor del color, causado solamente por el cambio de pH. Por esta razn, ciertos enlogos franceses prefieren para sus vinos una FML lenta a baja temperatura (comunicacin personal Vignerons Buzet). Ver figura 4.

Figura 4.
Tiempo de FML en Pinot Noir de Burgundy de 1999 (Francia), despus de inocular directamente los cultivos seleccionados a diferentes temperaturas (pH 3,46, alcohol 13,3 %vol)

120

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica
Laurent y Henick-Kling7 comprobaron que pueden encontrar diferencias en el impacto aromtico segn la contribucin de diferentes cepas de bacterias. A algunas cepas se les ha reconocido la capacidad de producir un fuerte impacto de mantequilla, nueces y aromas de levadura; otras cepas parecen contribuir muy poco en el aroma del vino1. La Figura 5 muestra la cintica de degradacin del cido mlico en vinos Riesling de Alemania de 1999 (pH 3,03, alcohol 95,0 g/l) a una temperatura de 18 C, inoculando con diferentes cultivos comerciales. La figura 6 muestra los resultados del perfil sensorial de estos vinos.

Otra ventaja muy importante resultante de inducir la FML con cultivos seleccionados, es limitar el crecimiento de bacterias en el vino, ya que los cultivos son inoculados a un nivel de 2 millones de bacterias por ml de vino, creciendo hasta 50 millones de clulas por ml. Para inducir la FML de forma espontnea, es necesario crecer desde 100 bacterias/ml hasta 50 millones de clulas, lo cual significa un crecimiento celular mayor y mayor nmero de generaciones, acumulndose gran cantidad de metabolitos. Lo que significa un mayor riesgo de producir un impacto lctico indeseable.

Figura 5.
Cintica de la degradacin del cido mlico en vinos de Riesling, 1999 (D). (pH 3,03, alcohol 95,0 g/l).

Las cinticas de las FML llevadas a cabo en tanques de acero inoxidable inoculados con varias cepas de bacterias seleccionadas fueron comparadas en la degradacin del cido mlico durante 30 das. Los anlisis de implantacin fueron positivos para todas las cepas, lo cual indica que las cepas inoculadas indujeron la FML. Este tipo de control es necesario para poder relacionar las diferencias observadas durante la evaluacin sensorial de los vinos segn la contribucin de cada cepa en particular. A pesar de observar unas cinticas de degradacin de mlico muy similares, la evaluacin sensorial de los

vinos revel unas diferencias significativas entre las diferentes cepas. Los vinos fermentados con la cepa MCW mostraron una mayor apreciacin de los descriptores "cuerpo/intensidad". Esta cepa ha tenido un importante mercado en California debido a su contribucin en los aromas de mantequilla, nueces, nata y carcter de levadura. Unos anlisis qumicos ms exhaustivos revelaron niveles de acetaldehdo medidos a mitad de la FML superiores. La cepa Alpha, como en otros casos, dio una percepcin sensorial dirigida hacia un vino afrutado en combinacin con complejidad aromtica y mejora del cuerpo. En los vinos fermentados con SP1, se produjo un incremento del afrutado.
121

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacin malolctica

Figura 6.
Influencia de los inculos bacterianos de FML en el perfil gustativo de un vino Riesling QBA de 1999 (Wrttemberg Alemania)

El diacetilo esta asociado al carcter de mantequilla. Este compuesto se forma como intermediario en la degradacin de azcares y del cido ctrico por parte de las bacterias lcticas. Bartowsky 1. Fornachon y Lloyd2 demostraron que los vinos que han sufrido la FML contienen ms diacetilo que los vinos sin FML. Concentraciones superiores a 5-7 mg/l son indeseables en los vinos, pero si el diacetilo participa en concentraciones inferiores, contribuye positivamente en el aroma y en la calidad organolptica del vino. La concentracin de diacetilo puede ser manejada de una forma significativa por el enlogo. La dosis de inoculacin de bacterias afecta al grado de degradacin del cido mlico y tiene una influencia importante en la concentracin final del diacetilo.

La figura 7 muestra el contenido en diacetilo de un vino Pinot Noir de Baden en Alemania de 1998. Tres cultivos comerciales distintos fueron inoculados a diferentes dosis junto a levaduras o directamente despus de la fermentacin alcohlica. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Inmediatamente despus de la FML, los ensayos "A" fueron tratados con SO2 (100 mg/l) y filtrados posteriormente. Los ensayos "B" sufrieron una crianza sobre las durante cuatro semanas realizando un batonnage por semana; despus de las cuatro semanas, los ensayos "B" fueron tambin tratados con dixido de azufre y filtrados. Los contenidos en diacetilo al final de la FML fueron significativamente diferentes. Obviamente, el tiempo de induccin de la FML durante la fermentacin alcohlica o posteriormente, tiene poca influencia en el contenido de diacetilo de los vinos.

Figura 7.
Contenidos en diacetilo en vinos Pinot Noir de 1998 segn el tratamiento y dosis de inoculacin
4,5 4 3,5

diacetilo (mg/l)

mg/l

2,5 2

diacetilo (mg/l) despus MLF diacetilo (mg/l) despus de filtrar + SO2 A diacetilo (mg/l) despus 4 B sem anas sobre lias

Diacetilo despus de ferm. alcoh.


1,5 1 0,5 0

2x10e5 cfu/ml despus ferm. alcoholica

2x10e5 cfu/ml inoculacin simultanea

1x10e6 cfu/ml inoculacin simultanea

1x10e6 cfu/ml despus ferm. alcohol. fermentation

2x10e6 cfu/ml inoculacin simultanea

2x10e6 cfu/ml despus ferm alcohol. fermentation

4x10e6 cfu/ml inoculacin simultanea

122

4x10e6 cfu/ml despus ferm alcohol. fermentation

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Fermentacin Malolctica
se corresponde con el umbral mnimo de percepcin sensorial en vinos de Chardonnay9. Aun as, el diacetilo no puede explicar por s solo la gran variacin en el perfil aromtico entre vinos fermentados con diferentes cultivos bacterianos, como recientemente Richardson y Henick-Kling11 han mostrado en vinos de Cabernet Sauvignon y Chardonnay despus de realizar la FML y analizando los vinos usando tcnicas de GC/MS y GC/olfactometra.

Adems, no se ha podido observar en nuestros ensayos una influencia importante por parte de la cepa inoculada, pero si se pudo mostrar un efecto segn la dosis de inoculacin en la concentracin final de diacetilo. Los ensayos inoculados con alta dosis (5x106 cfu/ml) de bacterias, donde hubo un crecimiento limitado, mostraron niveles bajos de diacetilo (1,1 mg/l), mientras que en los ensayos inoculados con un bajo nmero de bacterias (2x104 cfu/ml) se encontraron cantidades de diacetilo de 3,9 mg/l. Despus de adicionar dixido de sulfuroso, huvo un detrimento del 50 % del diacetilo medible, debido a la interaccin entre ambas molculas, aunque todava permanece por enzima del umbral mnimo detectable en vinos de Pinot noir. En todos los ensayos con tratamiento sobre las se observ un importante y rpido detrimento en la concentracin de diacetilo. Independientemente del nivel de diacetilo al comienzo de la crianza sobre las, solo 0,2 mg/l de diacetilo fueron medidos despus de cuatro semanas, lo cual

3.3 Conclusin
Basndose en los amplios resultados encontrados en una extensa bibliografa internacional y en los nuestros propios, creemos que se puede manejar el perfil sensorial de los vinos eligiendo el cultivo bacteriano adecuado para dirigir la FML, siendo un cultivo bien definido por sus propiedades fermentativas y efectos organolpticos.

Referencias:
1 Bartowsky, E. J., Henschke P. A.: Management of malolactic fermentation for the "buttery" diacetyl flavour in wine. The Australian Grapegrower & Winemaker, Annual Technical Issue 2000, 58-67, 2000. 2 Fornachon, J.C.M., Llyod , B.: Bacterial production of diacetyl and acetoin in wine. J. Sci. Fd. Agric. 16:710716, 1965 3 Gerbaux, V., Gerland, C., Villa, A.: Le Lysozyme: Nouvel outil biotechnologique pour matriser les bactries lactiques. Revue des nologues n 93 S, 44-46, 1998 4 Gerland, C.: Gestion de la flore bactrienne lactique: enjeu important pour l'laboration de vins de qualit. Revue des nologues n 96, 31-33, 1999 5 Klein, R.: Malo macht munter. Alles ber Wein 1/97, 98-99, 1997 6 Krieger, S.A., Lemperle, E., Ernst, M.: Management of malolactic fermentation with regard to flavour modification. Session 3B, Flavour modification in the winery: Microbiological. In, proceedings of 5 th International Symposium on Cool Climate Viticulture and Oenology . 16-20 January, 2000, Melbourne, Australia.

7 Laurent, M.H., Acree, T.E., Henick-Kling,T.: Changes in aroma and odor of Chardonnay due to malolactic fermentation. Weinwissenschaft 49, 3-10, 1994 8 Lonvaud-Funel 9 Martineau, B., Acree, T.E., Henick-Kling, T.: Effect of wine type on the detection threshold for diacetyl. Food Res. Intern., 28:139-143, 1995 10 Martineau, B., Henick-Kling, T., Acree, T.E.: Reassessment of the influence of malolactic fermentation on the concentration of diacetyl in wines. Am. J. Enol. Vitic., Vol. 46, No. 3, 385 - 388, 1995 11 Richardson, J., Arnik, K., Acree, T., Henick-Kling, T.: Flavor profiles created by various strains of Oenococcus oeni in malolactic fermentation of Cabernet Sauvignon. Poster session ASEV 2000 Seattle, 2000

123

V. La microoxigenacin

ndice

127

127

V.1. Microoxigenacin y fermentacin malolctica


Stphane Yerle Oenodev S.A.R.L.

V.1. Microoxigenacin y fermentacin malolctica


Stphane YERLE
Oenodev S.A.R.L.
1.1 Histrico y presentacin de la microoxigenacin 1.2 Microoxigenacin y fermentacin malolctica? 1.3 Bases de la oxigenacin cuantificada 1.4 Aplicaciones de la microoxigenacin. 1.5 Reacciones del vino implicadas en la microoxigenacin. 1.6 Nociones tericas sobre el control de la microoxigenacin antes de la fermentacin malolctica 1.7 Parmetros de control de la microoxigenacin antes de la fermentacin malolctica. 1.8 Novedades sobre la secuencia cronolgica de la microoxigenacin y de la fermentacin malolctica.

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Fermentacin Malolctica

V.1. Microoxigenacin y fermentacin malolctica

o se trata en modo alguno de sustituir la barrica. La microoxigenacin y la barrica son incluso complementarios, como lo demuestra el hecho de que nuestro mayor mercado en la regin de Burdeos sea Saint-Emilion, donde el 90% de nuestros clientes cran el vino en barrica. Por lo tanto, con la microoxigenacin se confiere estructura a los vinos antes de su envejecimiento. Esta tcnica viene a ser como los cimientos de una casa: cuanto ms slidos sean, mejor resistir la casa el paso del tiempo.

(...) Todos los vinos del mundo necesitan oxgeno. Algunos muy poco, como el Beaujolais, mientras que otros, muy tnicos, tienen necesidades enormes, como el Madiran. (...)" A continuacin se exponen algunos comentarios del inventor, que todava permiten resumir la herramienta adicional que tenemos en la microoxigenacin.

1.1 Histrico y presentacin de la microoxigenacin Los experimentos de un viticultor con talento


A principios de los aos 1990, Patrick Ducournau y la familia Laplace, viticultores de la denominacin Madiran, deciden estudiar el control de los aportes de oxgeno durante la crianza. Enfrentados a los problemas de la crianza de los vinos elaborados a partir del varietal Tannat, ricos y con una alta concentracin de taninos (hasta 7 g/l) y tambin de antocianos al principio de la crianza (2 g/l, comparada con la concentracin de 0,6 g/l de un vino de Garnacha o Pinot Noir), observan una desecacin de los vinos al final de la crianza. As comienza la bsqueda de una tcnica de crianza adecuada que permita conservar la untuosidad y el carcter afrutado del vino, ya se cre en depsito o en barrica. En 1991, los primeros ensayos de aportes de oxgeno cuantificados y constantes demuestran rpidamente su superioridad con respecto a los trasiegos y ms an con respecto a la ausencia de oxgeno: los vinos evolucionan mejor, y tambin, cosa ms sorprendente para la poca, parecen evolucionar ms despacio. En unas circunstancias en las que los vinos evolucionaban perdiendo color y desecndose, ahora conservan ms color y ms fruta, pero tambin y sobre todo conservan taninos ms arropados. (LEMAIRE, 1995). En 1996, apoyndose en el xito naciente de la microoxigenacin, se funda Bois France con el objeto de desarrollar una gama de viruta de roble pensada por el enlogo y para el enlogo: en lugar de contentarse
127

V. La microoxigenacin

con el mero efecto aromtico de la madera (lactona, aldehdos, fenoles voltiles y furanos), se perseguan adems efectos enolgicos sobre la estructura (riqueza en taninos elgicos).

mente en las bodegas, y as adaptar nuestros productos a las necesidades de los clientes.

1.2 Microoxigenacin y fermentacin malolctica?


Esta pregunta es tan antigua como la historia del vino. En realidad, no se trata tanto de una tecnologa como de una antigua prctica. Porque en 1993, Patrick Ducournau y sus colaboradores no han inventado una receta; simplemente han puesto a punto una herramienta de oxigenacin lenta fiable, precisa y regulable. Una de sus aplicaciones modernas se inscribe entre la fermentacin alcohlica y la FML, con objeto de estabilizar el color y la estructura del vino, y es el fruto de aos de observacin de los efectos beneficiosos del contacto prolongado entre un vino joven con un pH bajo, sin azufrar, y el aire. Se habla entonces de FML en barrica, una operacin que genera etanal porque al vaciar la barrica sta contiene un vino con color, concentrado y sin azufre, similar al obtenido mediante el bazuqueo borgon que a menudo provoca la cada del sombrero de orujo, dejando el vino contenido en una cuba troncocnica en contacto con el aire libre. En la actualidad, Oenodev se ha convertido en una empresa especializada en la crianza de vinos, y se sigue planteando las mismas preguntas. Cul es el mejor ajuste de las herramientas eficaces desarrolladas durante estos ltimos aos (microoxigenacin, inyector de oxgeno, virutas de roble, bazuqueador) para conseguir el vino perseguido a partir de una materia prima determinada? Lo mismo cabe decir sobre la fase estratgica de la espera de la FML: cules son los lmites e imperativos de esta aplicacin?

La validacin cientfica
Financiada inicialmente por un proyecto ANVAR con el aval cientfico del INRA de Montpellier, representado por Michel Moutounet, la empresa Oenodev se ha esforzado por conseguir rpidamente una validacin cientfica de la patente registrada en 1993. En la actualidad, la validacin cientfica de la microoxigenacin se basa fundamentalmente en ensayos en bodegas. Se ha hecho un seguimiento analtico de los vinos, y los estudios se han basado en grupos de jurados expertos, entrenados regularmente en ese tipo de anlisis sensorial por un profesional (Maurice Chassin, del Institut de Dgustation de Tours). En 2006, ya la tcnica suma 13 aos de validacin en todo el mundo y en todo tipo de tintos, as como de blancos y rosados tanto en bodegas industriales como en estaciones experimentales (INRA Pech Rouge, Institut Rhodanien, Universidad de Tarragona, Estacin Enolgica de Rueda,). Adems, desde hace tres aos, Oenodev tambin dispone de su propia nave tecnolgica equipada con 150 cubas inertes de tres hectolitros, en las que se puede controlar la turbidez, la temperatura y la madera. Con la experiencia, las prescripciones han cambiado. Desde principios de los aos 1990, la tcnica de microoxigenacin se ha refinado. Los ensayos en bodega han llevado a modificar las precauciones. Antiguamente, el aporte de oxgeno empezaba despus de la fermentacin malolctica (FML), con el vino azufrado. Se prefera no correr ningn riesgo. Desde hace algunos aos, se prescribe una adicin de oxgeno ms precoz, justo al final de la fermentacin alcohlica.

1.3 Bases de la oxigenacin cuantificada


Ante todo, hablemos del propio principio de la microoxigenacin y de la mecnica que consiste en estabilizar la evolucin de la estructura de un vino tinto. Es el principio de la oxigenacin cuantificada: velocidad de introduccin del O2 en el vino, inferior en todo momento a la velocidad de reaccin del O2 en el vino. Eso es lo que sucede empricamente en barrica (aporte lento, a un ritmo de entre 0,5 y 0,75 ml/l/mes), y es lo que hemos reproducido para las cubas gracias a un sistema de microoxigenacin con mayor control: Caudal dbil, continuo y controlado de O2 ; 100 % de transferencia al vino.

Oenodev, innovacin sobre el terreno


En la actualidad, Oenodev tiene una plantilla de 25 personas, de las que 17 son enlogos, 2 tcnicos y 3 investigadores repartidos por todos los continentes. Con sus filiales en Australia, Estados Unidos, Argentina, Chile e Italia, Oenodev dispone de su propia red de distribucin, lo cual le permite llevar la misma propuesta al mundo entero. En Espaa, AZ3oeno constituye el mejor ejemplo de colaboracin de Oenodev con cuatro jvenes enlogos competentes y formados desde los primeros pasos de la microoxigenacin: cursos de cata, expertos en clientela (oxgeno disuelto y Brettanomyces), asesora en microoxigenacin y crianza sobre las Esta presencia nica sobre el terreno permite transmitir rpidamente la informacin recopilada directa128

De ese modo, la gran diferencia entre el aporte puntual (trasiego) y el aporte cuantificado es que nunca se produce una acumulacin de oxgeno disuelto (< 0,03 ppm) lo cual asegura la preservacin de numerosos compuestos, en especial aromticos. Para ello, Oenodev ha colaborado con el INRA de Pech Rouge para desarrollar el primer protocolo de dosificacin del oxgeno disuelto en los vinos por mtodos electroqumicos.

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica Figura 1.

Niveles de oxgeno disuelto idnticos en barrica y en cuba inerte (Lemaire, 1994).

1.4 Aplicaciones de la microoxigenacin.


Las principales aplicaciones de la microoxigenacin sern pues: Aporte de O2 a las levaduras durante las FA Aporte de O2 durante la crianza sobre las de los vinos blancos, consiguindose mayor untuosidad y frescor aromtico Disminucin de los caracteres de reduccin Reduccin de los caracteres herbceos Trabajo de la estructura global de los tintos.

un heterociclo oxigenado C unido al ciclo A. Despus, estas molculas se podrn asociar directamente mediante enlaces C4-C6 o C4-C8. Globalmente, los antocianos tienen las mismas caractersticas qumicas que los flavanoles, con la diferencia de la posibilidad de rotacin alrededor del enlace entre el ciclo B y el heterociclo C. As, se podrn observar reacciones de polimerizacin directa entre taninos y antocianos a travs de enlaces C4-C6 o C4-C8. Tambin se pueden producir otras reacciones de polimerizacin, principalmente a travs del etanal . Cmo se forma el etanal en el vino? Se obtiene mediante oxidacin conjunta de los ortodifenoles y el etanol (trabajos de Singleton 1974-1987). El O2 presente en el medio (y en mayor medida gracias a la microoxigenacin) reacciona con los ortodifenoles originando ortoquinona y perxido de oxgeno, que permitir la oxidacin del etanol en etanal. De ese modo, se pueden obtener distintos tipos condensacin: Taninos Etilo Taninos Taninos Etilo Antociano Esta ltima asociacin se caracteriza por un aumento del color rojo y prpura. De ese modo, el aporte de oxgeno a un vino tinto estructurado y rico en anto129

Nos concentraremos en esta ltima aplicacin, aunque en la actualidad numerosos usuarios apliquen con xito esta tcnica en las situaciones restantes.

1.5 Reacciones del vino implicadas en la microoxigenacin.


A continuacin expondremos esquemticamente las reacciones diversas que se producen en el vino gracias a la oxigenacin cuantificada. Aqu tenemos representado un flavanol (vulgarmente denominado tanino). Los flavanoles forman parte de la familia de los flavanoides (igual que los antocianos, dicho sea de paso) y se caracterizan por una estructura de 15 carbonos que consta de dos ciclos fenlicos A y B, y de

V. La microoxigenacin

cianos libres permite estabilizar los antocianos con los taninos por mediacin del puente etanal, bloqueando la evolucin de estos ltimos (los antocianos cierran la polimerizacin al final de la cadena). Por lo tanto, es necesario oxigenar vinos suficientemente estructurados y colorados para obtener un buen rendimiento de la reaccin, pues la oxidacin del etanol (reductor secundario) en etanal requiere una oxidacin previa de los taninos (reductor primario). Por ltimo, la oxigenacin de un vino desequilibrado por falta de color (y por tanto de antocianos) desembocara en la polimerizacin sin lmite de los polifenoles entre s, provocando la desecacin y el amarilleo (SAUCIER, 1997). As pues, en presencia de grandes cantidades de antocianos monomricos, las reacciones conducen a molculas de menor peso. La polime-

rizacin inducida por el etanal cesa cuando los dos extremos de la cadena estn ocupados por un antociano. (CHENIER & al 2000). Los ltimos ensayos realizados durante la campaa 2002 (ver figura 2) por el departamento de Investigacin y Desarrollo de Oenodev permiten confirmar el efecto positivo de este aporte sobre el color del vino, y la pertinencia del modelo de control de la oxigenacin en funcin de la percepcin del etanal (CABRI, DUCOURNAU, LEMAIRE, 2002). Esta fase de estabilizacin es necesaria para la buena evolucin de cualquier tinto en barrica, pues adems de estabilizar su color, confiere al vino una mayor resistencia a la oxidacin gracias a una menor oxidabilidad de sus polifenoles.

Figura 2.
Evolucin del color de un vino sometido a un aporte cuantificado entre FA y FML (Oenodev, 2002).
Balance de densidades pticas: 420, 520, 620, IC y matiz al cabo de 23 das de micorooxigenacin antes de la FML
DO 420 DO 520 DO 620 IC Matiz

20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 DO 420 DO 520 DO 620 IC Matiz

Testigo 4,63 5,95 1,93 12,51 0,78

30 cc 5,55 7,57 2,25 15,37 0,73

60 cc 6,33 8,45 2,45 17,23 0,75

90 cc 6,63 9,23 2,63 18,49 0,72

Por lo tanto, se puede observar que: Los vinos jvenes se caracterizan por sus altos contenidos de pigmentos no resistentes a la decoloracin por el SO2 y ms concretamente por los antocianos nativos En los vinos ms viejos, los contenidos de estos compuestos han disminuido claramente, dejando su lugar a compuestos ms estables, como los piranoantocianos y los pigmentos T-A+ En los vinos microoxigenados, se ha podido observar la presencia de flavanoles piranoantocianos, y el anlisis por espectometra de masa ha permitido identificar compuestos en los que participa el etanal (simbolizado en azul turquesa): Condensacin de compuestos fenlicos

gracias, principalmente, al etanal (F-etil-A+). Por otra parte, se han identificado otros dos tipos de molculas resultantes bien de la reaccin directa entre antocianos (Ant-Ant) bien con la participacin del etanal (Ant-etil-Ant). Este ltimo descubrimiento es absolutamente innovador en el mundo de la enologa, puesto que es la primera vez que se ha puesto de manifiesto este tipo de reaccin, que bien podra contribuir al cambio de las caractersticas organolpticas, y ms concretamente del color (su evolucin). La caracterstica general de los pigmentos obtenidos es una mayor resistencia a la decoloracin por el SO2, y por lo tanto una mayor estabilidad de la materia colorante con el paso del tiempo (ATANASOVA, 2003).

130

Informe Tcnico Fundacin para la Cultura del Vino

Fermentacin Malolctica
vino oxigenado
entre los ncleos A y B. Hay que sealar que se trata de una polimerizacin que hace aumentar el grado de polimerizacin medio. Los productos formados son de tamao considerable (y por lo tanto menos solubles, hasta precipitarse) y presentan un color pardusco (VIDAL, 2003). Es la llamada desecacin de los vinos tintos caracterstica de las oxigenaciones tardas, al final de la crianza.

vino joven

vino viejo

A
COOH

F A

F n

A F

CPNR SO2

A n

F n

Pigmentos resistentes a la decoloracin por SO2


ATANASOVA, 2003 (tesis doctoral)

1.6 Nociones tericas sobre el control de la microoxigenacin antes de la fermentacin malolctica


Para controlar esta fase ideal de oxigenacin de los vinos, Oenodev ha desarrollado varios modelos que recurren tanto al anlisis como a la cata, de forma similar a las operaciones de seguimiento de la crianza en barrica. El enlogo no elige la fecha del trasiego de barrica en funcin de los resultados de su espectrofotmetro! Por lo que se refiere a la percepcin del etanal, desde 2002 (figura 3) Oenodev ha confirmado la existencia de una excelente correlacin entre la concentracin qumica de este compuesto y su percepcin sensorial.

Ahora bien, hay que recordar que la oxigenacin no est reservada a esta fase nicamente, y que ms adelante, durante la crianza, el equilibrio inicial taninos/antocianos se modifica debido a la desaparicin de una gran cantidad de antocianos. Esto induce una evolucin excesiva de los flavanoles en un medio oxidante pobre en antocianos. La polimerizacin oxidativa de los flavanoles se lleva a cabo por mediacin de la formacin de quinonas. En este caso, la polimerizacin no se realiza entre los ncleos A y C, sino

Figura 3.
Correlacin entre el etanal percibido y el etanal analizado (Oenodev, 2002).

Comparacin entre el etanal percibido y el etanal analizado (Etanal analizado mediante CPG) 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00
Etanal mg/l
T Analizado 60 Analizado T peru 60 peru 30 Analizado 90 Analizado 30 peru 90 peru

5,00

4,00

3,00

25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 8/10/02 17/10/02 23/10/02 29/10/02 0,00 1,00 2,00

Intensidad

131

V. La microoxigenacin

He aqu una tabla de simulacin en funcin de algunas reglas: Aumento del volumen, pero sin evolucin del OD (Oxgeno Disuelto) y del etanal: hay que incrementar la dosis (dosis insuficiente) ; Aumento del volumen, del etanal y sobre todo del OD: hay que reducir la dosis, pues no se ha utilizado parte del O2; Aumento del volumen y del etanal y estabilidad del OD: hay que mantener la dosis (dosis correcta) ; Estabilidad de los diversos factores: hay que preguntarse por los factores limitadores, como la turbiedad; Estabilidad del volumen y del etanal pero aumento del OD: ensamblaje imperativo, pues falta concentracin.

Al final, sern los objetivos de reactividad y de aporte total (dosis acumulada) los que dicten el trabajo de oxigenacin, sabiendo que el etanal no constituye un fin en s, sino un paso obligado para la construccin de la futura estabilidad de los vinos. El etanal no se debe conservar en ningn caso despus de la FML a niveles distintos de los de un vino sin tratar. Dependiendo de los vinos, el umbral de deteccin es del orden de 20 mg/l.

1.7 Parmetros de control de la microoxigenacin antes de la fermentacin malolctica.


Empezando por los grandes parmetros que hay que vigilar antes de la FML, la turbidez es el que ms influencia tendr en la reactividad del vino: una biomasa puede consumir diez veces ms que cualquier carga tnica! A continuacin se facilitan algunos valores de referencia del consumo de oxgeno: Las (108 levaduras/ml): alrededor de 900 g/l/h Vino blanco limpio: 0,2 g/l/h Vino tinto joven limpio: 120 g/l/h

En la actualidad, la dosificacin del oxgeno disuelto se lleva a cabo de forma rutinaria hasta algunas decenas de ppb mediante la luminiscencia (figura.4), una tcnica que no requiere ni regeneracin, ni calibrado, y que permite al enlogo controlar de ese modo el oxgeno disuelto desde la extraccin de los mostos hasta el embotellado de los vinos. Entre la FA y la FML el oxgeno disuelto constituye pues un valioso asistente de ayuda a la decisin, que Oenodev propone sistematizar.

Cuanto mayor es la turbidez, menos eficaz sobre la estructura es el oxgeno, pero ms se favorece el aumento de untuosidad originado por la autolisis de las levaduras. Sin embargo, no hay que olvidar que esta autolisis requiere largos Figura 4. meses de espera a alta tempePrincipio de medicin del oxgeno disuelto por luminiscencia (Hach Lange, 2004). ratura (VUCHOT, 2001).

Lange LDO
Cuerpo Caps

Molculas luminescentes
Capa polmero

Oxgeno

Por otro lado, el segundo parmetro que debe figurar entre los elementos de control, y sin el cual no se puede hacer nada, son las Brettanomyces. Estas autnticas levaduras de contaminacin esperan a la fase de latencia del final de la fase alcohlica para desarrollarse en ausencia de azufre, en un momento en que en el medio abundan azcares. Nuestro microbilogo, el doctor Jean Franois Bilis, ha demostrado el inters del recuento sistemtico al final de la FA para desplegar medios preventivos y poder mocrooxigenar con tranquilidad. Recordemos que las Brettanomyces no han esperado a la microoxigenacin para desarrollarse, y que los aportes puntuales (trasiego que ocasiona la disolucin de algunas ppm) son los que ms estimulan las colonias (GILIS, 2003). Estas levaduras son

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Fermentacin Malolctica
crianza, observamos que los lotes oxigenados por acumulacin de oxgeno disuelto (trasiego y dosis excesivas) son los que permiten la mayor proliferacin de Brettanomyces (figura 5).

capaces de consumir hasta 0,3 mg de O2/l/hora con una poblacin de 105 UFC/ml, de modo que pueden anular todo el efecto positivo del oxgeno aportado bruscamente. En este ensayo, realizado durante la

Figura 5.
Evolucin de las poblaciones de Brettanomyces en funcin del modo de oxigenacin (despus de la FML, Oenodev, 2001).
16 00000 Azufre 14 00000 O2 - 20 cc (dosis excesiva) O2 - 10 cc O2 - 5 cc (dosis normal) 12 00000 (UFC/ml) Brettanomyces O2 - Efecto inyector del Oxgeno 10 00000 Cata 1 Cata 3 Cata 2

80 0000

60 0000

40 0000

Efecto inyector

20 0000

0 0 5 10 15 Tiempo (das) 20 25 30

En esta fase estratgica, entre la FA y la FML, no debemos desdear el papel determinante desempeado por los azucares residuales en el desarrollo de las levaduras de tipo Brettanomyces. Ms que el oxgeno, la presencia de glucosa y fructosa en canti-

dades importantes es capaz por s sola de aniquilar todo el trabajo de crianza de los vinos. En efecto, Gilis (figura 6. 2003) ha demostrado que la influencia de los azcares (> 2 g/l) es ms determinante que la del oxgeno.

Figura 6.
Evolucin de las poblaciones de Brettanomyces en funcin de la concentracin de azcares residuales (Oenodev, 2003).

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V. La microoxigenacin

Una presencia importante de azcar residual incrementa considerablemente la produccin de fenoles voltiles (+ 40% de etilguayacol, + 45% a + 60% de etilfenol). Desde el punto de vista gustativo, slo los vinos que contienen azcares residuales desarrollan un olor animal caracterstico (sudor, cuero, establo) muy desagradable, que aparece durante la fase estacionaria y aumenta considerablemente durante la fase de declive. Son vinos que presentan una desaparicin total de los caracteres afrutados, y en boca se caracterizan por una prdida de untuosidad, un aumento del amargor, y una sensacin general de sequedad. En el caso de los vinos secos, se observa un cambio en la paleta aromtica, que desemboca en una disminucin del carcter afrutado en beneficio de los caracteres especiados que contribuyen en la complejidad. Esta es pues una razn adicional para terminar primero la fermentacin alcohlica antes de proceder a ninguna adicin de oxgeno.

Por todos esos motivos de turbidez y estabilidad microbiolgica, Oenodev preconiza recurrir sistemticamente al centrifugado de los vinos almacenados en grandes depsitos > 500 hl, pues ha quedado demostrado el inters de esta herramienta debido a su accin de eliminacin selectiva de las Brettanomyces y no de las bacterias, lo cual permite concluir las FML con toda tranquilidad. Finalmente, el ltimo parmetro de control, a saber el oxgeno disuelto, permite comprobar el buen consumo del oxgeno aportado, en especial en el caso de los inviernos fros, pues la temperatura condiciona estrechamente su consumo por parte de los polifenoles. Antes de la FML, por lo general los vinos tienen temperatura suficiente, pero el control del oxgeno disuelto tambin puede garantizar que no se caiga en una dosificacin excesiva por falta de concentracin fenlica del vino: una vez ms, el oxmetro demuestra ser una ayuda muy valiosa.

Figura 7.
Ausencia de relacin entre dosis de oxgeno y oxgeno disuelto antes de la FML (Oenodev, 2001).

D.O. / Dosis de Oxigeno medida en ms de 160 depositos. 2,0 1,8 1,6 1,4
D.O. mg/l

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20

R2=0.3

40 60 80 Dosis de microoxigenacin ml/l/mes

100

Tambin hemos puesto de manifiesto la ausencia de oxgeno disuelto en la totalidad de los depsitos microoxigenados antes de la FML cuando las dosis aadidas son acordes con las recomendaciones, es decir de hasta 60 ml/l/mes (Figura 7). A veces, la prctica nos lleva a continuar el trabajo de oxigenacin despus de la FML, cuando los vinos an estn suficientemente equilibrados, y en caso de que la temperatura sea correcta, pero habr que tener cuidado en todo momento de no volver la estructura
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ms desecadora, por oxigenacin de un vino empobrecido en antocianos (en especial tras un periodo de fro prolongado, cuando se pierden ms antocianos que taninos). Este riesgo no existe antes de la FML y esa es la razn por la cual el 100% de los usuarios prefiere iniciar la adicin en ese momento: el rendimiento de la reaccin siempre es ptimo, a condicin de que se controle el entorno del vino (turbidez, oxgeno disuelto y Brettanomyces). En efecto, si se administra bien esta adicin, no debe aumentar el oxgeno disuelto.

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Fermentacin Malolctica
cido mlico se practica conjuntamente con el de los azcares. En algunos lotes, se microoxigenan los vinos al final de la FA y tambin de la FML (por la coinoculacin) sin adicin azufre, cuando ya no queda cido mlico, en cuyo caso se bloquear la poblacin de bacterias mediante la adicin de lisozimas. El perfil de oxigenacin coincide entonces con el aplicado al vino sin azufrar (adicin total > 10 ml/l) y el azufre no se aadir hasta el final de la oxigenacin, en una dosis de 5 g/hl.

1.8 Novedades sobre la secuencia cronolgica de la microoxigenacin y de la fermentacin malolctica.


Durante los ensayos realizados sobre la vendimia de 2005, los investigadores del departamento de I+D de Oenodev han estudiado la posibilidad de microoxigenar despus de la FML un vino sin azufrar pero estabilizado con lisozimas. La siembra se lleva a cabo mediante inoculacin conjunta, y el seguimiento del

Figura 8.
Aplicacin innovadora de la adicin de oxgeno mediante lisozimas (Oenodev, 2005).
Fermentacin Alcohlica Maceracin Crianza

Levaduras

Oxgeno: - 40 mL/L/mes - 2 das 30 mL/L/mes - 6 das 15 mL/L/mes - 2 das 10 mL/L/mes - 11 das Total: 13 ml/l sobre 21 das

Azc Ac. Mlico

Azcares (g/L)

Bacteria

Mlico (g/L)

Lisozimas

Fin MicroO 2 MicroO 2

SO 2

Tiempo (das)

El estudio comparativo entre esta aplicacin y una adicin ms clsica antes de la FML demuestra que se consigue mayor efecto sobre el color (intensidad y tono) antes que despus de la FML, en el vino sin azufrar, a pesar de que esta ltima aplicacin innovadora tambin aporta resultados alentadores (figura 8). En efecto, sabemos que esta diferencia de resultado se explica sin lugar a dudas por la mejor reactividad de los antocianos y del etanal con un pH bajo. En

cambio, resulta obvio que de cara al objetivo de un mayor control de las diversas poblaciones de microorganismos (bacterias y levaduras contaminantes), la inoculacin conjunta seguida de una adicin de lisozimas al final de la FML puede ser positiva si se desea estabilizar significativamente el color del vino mediante una micro-adicin de oxgeno. Por otra parte, en este ensayo confirmamos que no existe relacin entre un aporte cuantificado y el desarrollo de la FML, observacin corroborada en numerosas bodegas (figura 9).

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V. La microoxigenacin

Figura 9.
Comparacin de la FML entre un testigo y un vino microoxigenado (Oenodev, 2005).
6,00

5,00

cido Mlico Testigo cido Mlico (Microoxigenacin)

4,00
Ac. Malique (g/L)

3,00

2,00

1,00

0,00 0 10 20 30 40 50 60 Temps (jours) 70 80 90 100

Por ltimo, para incrementar la reactividad del sistema tanino-antociano, tambin se podra plantear una reduccin del pH del vino durante esta fase, o bien la sustitucin del efecto de las lisozimas por acidificacin, mediante tcnicas de electromembranas (electrodilisis mediante membranas bipolares) que tal vez nos abran nuevas perspectivas de aqu a algunos aos Lo que es indudable a estas alturas, es decir al cabo de los ms de diez aos que viene definindose, es que la microoxigenacin, inspirada en la antigua prctica de la crianza de los vinos, es una tcnica fiable, segura y precisa. El enlogo dispone al fin de

una herramienta regulable de adicin moderada de oxgeno, que puede utilizar con la mxima seguridad controlando parmetros como la temperatura, el oxgeno disuelto, la medicin de la turbidez, el seguimiento de las poblaciones de Brettanomyces, las lisozimas y por ltimo la siembra de bacterias malolcticas. Al margen de los esquemas convencionales de aplicacin del oxgeno entre la FA y la FML, se abren nuevas perspectivas que permiten al enlogo dirigir todas las facetas del juego: controlar el proceso de elaboracin en funcin de imperativos tcnicos y de objetivos propios, hasta el producto final: el vino.

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