UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE AGRONOMA

EVALUACIN DE Trichoderma spp. Y Azoxystrobin (Amistar 50 WP) EN EL CONTROL DE Sclerotinia spp. EN LECHUGA (Lactuca sativa) BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO

MEMORIA DE TTULO

LEOPOLDO DEL CARMEN VILLAGRA MARTNEZ

TALCA-CHILE 2007

UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE AGRONOMA

EVALUACIN DE Trichoderma spp. Y Azoxystrobin (Amistar 50 WP) EN EL CONTROL DE Sclerotinia spp. EN LECHUGA (Lactuca sativa) BAJO CONDICIONES DE

INVERNADERO

por

LEOPOLDO DEL CARMEN VILLAGRA MARTNEZ.

MEMORIA DE TITULO

Presentada a la Universidad de Talca como Parte de los requisitos para optar al ttulo de

INGENIERO AGRNOMO.

TALCA-CHILE 2007

A mi querido hijo Samuel, Prncipe de la Luz A mi Padre, por su gran apoyo A mi Madre, por guiarme todo el tiempo A mis hermanos, por su colaboracin

AGRADECIMIENTOS

Me siento muy agradecido de mis padres, Leopoldo e Isabel, por su apoyo constante, sobretodo en momentos difciles, por confiar en m y por los valores que me han entregado. Un enorme agradecimiento hacia mis hermanos, Marco y Mauricio, a mi cuada Yohana, a la familia Stanton-Espinoza, a mis compadres Rodrigo Lara y Caroline, y a los padres de ambos. Con mucho amor a mi hijo Samuel, mi Prncipe de la Luz, quien me inspira a asumir nuevos desafos y enfrentar senderos desconocidos. Hubo dos eventos que marcaron mi estada en la Universidad, el nacimiento de mi ahijada Valentina, y el de mi sobrina Sofa. Gracias a esas dos hermosas damas por llegar a este mundo. A mi profesor gua Sr. Claudio Sandoval por su gran ayuda ante las dudas y buena disposicin, y por sobre todo por sus buenos consejos, sugerencias y buen trato personal. Sin duda para mi profesor informante Sr. Mauricio Lolas por su valiosa ayuda y sabios consejos. Gracias a la gente del Laboratorio de Fitopatologa de la Universidad, Eduardo, Anita, Jorge, Cristin y a don Jos Miguel Cabezas por su gran colaboracin. Rodrigo Aravena, Karen Marambio, Mara Cecilia Espinosa, Macarena Hernndez, Carolina Arenas, Karina Rojas y Manuel Ibarra, muchas gracias por su ayuda. A todos mis compaeros y amigos, Mauricio Gonzlez, Sebastin Carreo, Mauricio Ziga, Ivn Cornejo, Anita Fandez, Carla Santibez, Claudia Guerra y otros, gracias. Con mucha admiracin y aprecio a Paula Manrquez, nuestra Directora de Escuela, por sus consejos sabios y oportunos en momentos difciles. Indudablemente a Roberto Toty Muoz, Ral Villarreal, Juan Carlos vila, Anita Mndez, Felipe Ausensi, Marcia Morales, Jennifer Ramos, Juan Verdugo y tantos otros. A la gente de Unifrutti Linares, Anita, Lorena, Paola, Ricardo, Daniel, Alberto, los Carlos, Torito, John, Jos Miguel, Richard, Cot, a los Jorges, a todo el personal. Sin duda cada uno de ustedes me han acompaado en estos 5 aos y un poco ms, muchas gracias por formar parte de mi vida.

RESUMEN

Se evalu el efecto de la aplicacin de Trichoderma y azoxystrobin en lechuga sobre la incidencia y severidad de pudricin blanca producida por hongos del gnero Sclerotinia bajo condiciones de invernadero. Se obtuvieron esclerocios desde una muestra de suelo previamente sembrado con plantas de lechuga que haban presentado la enfermedad. La mezcla de cepas nativas del biocontrolador Trichoderma fue obtenida del Laboratorio de Fitopatologa de la Universidad de Talca; stas fueron desarrolladas a travs de un proyecto financiado por la Fundacin para la Innovacin Agraria (FIA) en 1999 y correspondieron a las cepas Queule de Trichoderma harzianum, Trailes de T. parcenamosum y Sherwood de T. virens, las cuales han demostrado buena actividad antagonista frente a ataque de hongos fitopatgenos de importancia agrcola. Se realiz el ensayo en el invernadero de Horticultura, ubicado en el Campus Lircay de la Universidad de Talca, VII Regin desde fines de julio a principios del mes de octubre de 2006. El ensayo estuvo compuesto por 5 tratamientos, que incluyeron aplicaciones al suelo de una mezcla de T. harzianum, T. parcenamosum y T. virens; el fungicida azoxystrobin y un testigo sin ninguna proteccin contra Sclerotinia. Las aplicaciones de los tratamientos fueron realizadas al momento del trasplante. Aquellos tratamientos que incluyeron a Trichoderma spp. y azoxystrobin mostraron un control preventivo mas eficaz en el transcurso del tiempo de la enfermedad, presentando el menor porcentaje de incidencia o niveles superiores de severidad en cuanto a sntomas de esta enfermedad. El tratamiento testigo fue el que present el mayor porcentaje de plantas afectadas durante los tres meses del ensayo. En un principio se observaron diferencias significativas en el parmetro de incidencia (% de hojas enfermas respecto del total) entre los tratamientos que incluan Trichoderma, el tratamiento testigo y el fungicida azoxystrobin. Sin embargo, en la ltima evaluacin no se pudieron establecer diferencias estadsticamente significativas entre el biocontrolador y el producto qumico, pero s entre stos y el testigo. El largo de races tambin fue menor en el tratamiento testigo (8,53 cm) y aunque las plantas que fueron tratadas con Trichoderma tuvieron un promedio en el largo de races levemente superior (10,43 cm) al de aquellas en que se aplic el fungicida azoxystrobin (9,88 cm), no fue posible determinar diferencias estadsticamente significativas entre los tratamientos. No se encontraron diferencias significativas entre Trichoderma, el tratamiento testigo y fungicida azoxystrobin para los parmetros altura de plantas y peso fresco total. Trichoderma y azoxystrobin son una alternativa eficaz en el control preventivo de pudricin blanca en plantas de lechuga bajo condiciones de invernadero. Palabras Claves: Trichoderma spp., control biolgico Sclerotinia spp., Trichoderma harzianum, Trichoderma parcenamosum, Trichoderma virens, azoxystrobin. el

ABSTRACT

The effect of Trichoderma and Azoxystrobin applications on the incidence and severity of Sclerotinia plants was evaluated under greenhouse conditions. The sclerotia were obtained from soil samples collected in a field previously planted with lettuce affected by the disease. The mixture of Trichoderma native strains was obtained from the Plant pathology laboratory at

University of Talca. They were isolated, identified and evaluated in a research project with the financial support of the Fundacin para la innovacin agraria (FIA) in 1998 and they corresponded to Queule strain of Trichoderma harzianum, Trailes strain of Trichoderma parcenamosum and Sherwood strain of T. virens. All of them have demonstrated a good antagonistic effect over different pathogenic fungi of agriculture significance. The assay took place at the Horticulture greenhouse, located in the Campus Lircay of University of Talca, VII region from July to October, 2006. The field assay included 5 treatments: a mixture of the three strains, azoxystrobin and a control without any application. The treatments were applied at the transplant moment. The treatments that included Trichoderma spp. and azoxystrobin presented an effective preventive control of the disease, showing the lowest

percentages of incidence and severity levels of the disease. The control treatment showed the highest percentage of plants with white rot symptoms during the three months of the experiment. At the beginning, there were statistical differences for the incidence parameter ( % of leaves with Sclerotinia disease respect to the total for each plant) among the treatments that included Trichoderma, the fungicide azoxystrobin and the control. However, in the last evaluation non statistical differences were observed between the biocontroller and the fungicide, even though these two treatments resulted different from the control. Roots resulted shorter in the control treatment (8.53 cm). The plants with Trichoderma application showed roots slightly longer (10,43 cm) than those treated with azoxystrobin (9,88 cm), but there were not statistical differences between these treatments. No significant differences were found between plants treated with a mixture of native strains of Trichoderma, the control treatment and the fungicide azoxystrobin, for the parameters of plants height and total fresh weight. Trichoderma and azoxystrobin were a good alternative for the control of Sclerotinia disease in lettuce plants under greenhouse conditions.

NDICE

1. INTRODUCCIN

2. REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1 El cultivo de la lechuga 2.1.1 Importancia del cultivo en Chile 2.2.2 reas de produccin 2.2 Principales enfermedades que afectan a la lechuga 2.2.1 Esclerotiniosis a. Agente causal b. Sntomas de la enfermedad c. Epidemiologa d. Alternativas de control 2.3 Control biolgico 2.3.1 Trichoderma spp. a. Morfologa y taxonoma b. Mecanismos de accin c. Caractersticas generales de Trichoderma spp.

3 3 5 6 6 7 7 7 8 9 10 10 10 11 12

3. MATERIALES Y MTODOS 3.1 Ubicacin del ensayo 3.2 Material vegetal 3.3 Obtencin de Trichoderma spp. 3.4 Obtencin del patgeno 3.5 Evaluacin del hongo Trichoderma spp. y el fungicida Amistar (azoxystrobin) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga (Lactuca sativa) 3.5.1 Inoculacin del sustrato con el patgeno 3.5.2 Diseo experimental y aplicacin de los tratamientos 3.6 Parmetros a evaluar 3.6.1 Medicin de incidencia y severidad de la enfermedad 3.6.2 Otras variables 3.7 Anlisis de resultados

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17 17 17 18 18 19 19

4. RESULTADOS 4.1 Evaluacin de Trichoderma spp. y Azoxystrobin (Amistar 50 WP) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga (Lactuca sativa) bajo condiciones de invernadero 4.1.1 Evaluacin de la Incidencia de pudricin blanca causada por Sclerotinia spp. en plantas de lechuga tratadas con Trichoderma spp. y Azoxystrobin 4.1.2 Evaluacin de la Incidencia 2 (% de hojas afectadas respecto al total) de pudricin blanca causada por Sclerotinia spp. en plantas de lechuga tratadas con Trichoderma spp. y Azoxystrobin 4.1.3 Evaluacin de los parmetros altura, largo de races y peso fresco total

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5. DISCUSIN

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6. CONCLUSINES

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7. BIBLIOGRAFA

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8. ANEXOS

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NDICE DE CUADROS

Cuadro 2.1 Fases de crecimiento de la lechuga crisphead

Cuadro 3.1 Tratamientos incluidos en el ensayo de evaluacin del efecto de Trichoderma spp. y el fungicida Azoxystrobin (Amistar 50 WP) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga 18

Cuadro 3.2

Escala

de

marchitez

utilizada

para

evaluar

la 19

severidad de pudricin blanca en lechuga.

NDICE DE FIGURAS

Figura 3.1 Severidad de pudricin blanca observada en plantas de lechuga establecidas en un sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Universidad de Talca, Talca, Temporada 2006/2007. 21

Figura 3.2 Incidencia de pudricin blanca (un % de hojas con sntomas respecto al total) observada en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Primera evaluacin, 28/09/07. Universidad de Talca, Talca, temporada 2006/2007. 22

Figura 3.3 Incidencia de pudricin blanca (un % de hojas con sntomas respecto al total) observada en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratados con Trichoderma y azoxystrobin. Segunda evaluacin, 28/09/07. Universidad de Talca, Talca, temporada 2006/2007. 23

Figura 3.4 Largo promedio de races (cm) observado en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Evaluacin realizada el 10/10/07. 24

Universidad de Talca, Talca, Temporada 2006/2007.

NDICE DE ANEXOS

Anexo 8.1 Sustrato Canadiense Anexo 8.2 Evaluacin de los tratamientos 1 y 3 para las variables altura, largo de races y peso fresco Anexo 8.3 Evaluacin de las variables altura, peso fresco total, peso fresco y seco de hojas enfermas para los tratamientos 2, 4 y 5

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1. INTRODUCCIN

La lechuga (Lactuca sativa) es una planta anual que pertenece a la familia Compositae, presentando una gran diversidad gentica por lo que existen diferentes especies. Dentro de stas se encuentran las de hoja suelta (Lactuca sativa L. var. crispa L.), conocidas como escarolas ya que sus hojas son numerosas y de borde irregularmente recortado (crespo); y las lechugas de cabeza (Lactuca sativa L. var. capitata (L.) Janchen), que presentan hojas lisas, orbiculares y de textura suave o mantecosa con hojas internas que forman un cogollo amarillento al envolver a las ms nuevas formando una cabeza. Durante su etapa fenolgica presenta dos perodos, en la primera el crecimiento es vegetativo y en la segunda se da la fase reproductiva. La importancia del cultivo ha ido incrementndose en los ltimos aos debido tanto a la diversificacin varietal como al aumento del consumo de productos de cuarta gama (Infoagro, 2000). En Chile, se estima una produccin anual de 300 millones de unidades, equivalentes a alrededor de 75 mil toneladas. (Odepa, 2007). Una parte importante de la produccin de lechuga en Chile se realiza bajo condiciones de invernadero, por lo que se puede disponer de esta hortaliza prcticamente durante todo el ao. Debido a esto se hace especialmente importante un ptimo manejo del cultivo, minimizando las prdidas por concepto de plagas y enfermedades. Los hongos del gnero Sclerotinia, en particular Sclerotinia sclerotiorum y S. minor, producen enfermedades devastadoras en numerosas plantas suculentas (Agrios, 1996); la fuente natural de inculo de ste patgeno en la naturaleza es el suelo, en el cual el hongo puede estar como esclerocios, micelio o ascosporas. Se han realizado un amplio nmero de esfuerzos tendientes a encontrar alternativas de control eficaz y econmicamente favorables para combatir esta patologa, con resultados poco satisfactorios. La aplicacin de productos en el campo es efectiva, pero no siempre econmicamente factible (Apablaza, 2004). La aspersin localizada al suelo de algunos fungicidas puede reducir la incidencia de pudricin blanda (Latorre, 2004).

Dentro de las alternativas de control con importancia creciente

se encuentra el control

biolgico, cuyo objetivo es producir una disminucin en la incidencia de la enfermedad sin alteraciones ni dao al medio ambiente. De esta manera, se intenta favorecer microorganismos que son antagnicos a los patgenos y utilizarlos contra ellos. Se puede afirmar que en general el desarrollo de este tipo de control ha sido lento en el campo de la fitopatologa, sin embargo, se conocen una serie de casos donde ya se utiliza comercialmente (Apablaza, 2004). Como ejemplo reciente de utilizacin comercial, est la aplicacin del biocontrolador Trichoderma spp., el cual se encuentra en la mayora de los suelos, y su crecimiento se ve favorecido por la presencia de races de plantas, a las cuales coloniza rpidamente. Tiene excelentes caractersticas como biocontrolador siendo especialmente efectivo en el control de hongos de los gneros Rhizoctonia spp., Fusarium spp. y Pythium spp. Adems, posee buenas propiedades como estimulador del crecimiento radical (Agrios, 1997). De acuerdo a lo anterior, el presente proyecto de investigacin plante como objetivo general la evaluacin de la capacidad biocontroladora del hongo Trichoderma spp. sobre Sclerotinia en plantas de lechuga. Como objetivos especficos se sealan: Determinar el efecto de la aplicacin de Trichoderma spp. y azoxystrobin (Amistar 50 WP) al momento de transplante, sobre la incidencia y severidad de pudricin blanca en lechuga. Comparar el uso como controlador biolgico de Trichoderma respecto del azoxystrobin (Amistar 50 WP) Determinar un posible efecto sobre el crecimiento de lechuga de la aplicacin de Trichoderma Definir l o los tratamientos ms efectivos en el control de Sclerotinia spp. en lechuga. qumico

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 El cultivo de la lechuga.- (Lactuca sativa L.)

La lechuga, (Lactuca sativa L.), perteneciente a la familia Compositae es una especie dicotilednea anual, siendo considerada la hortaliza de hoja por excelencia, dada su alta calidad culinaria como ensalada fresca (Carrasco e Izquierdo, 1996). Est ntimamente relacionada con la lechuga silvestre comn o lechuga espinosa (L. serriola L.) y menos estrechamente relacionada con otras dos lechugas silvestres (L. saligna L. y L. virosa L.). La lechuga es diploide con 2n = 18 cromosomas. Otros cultivos populares de las compuestas incluyen la endivia, achicoria, alcachofa, girasol y crtamo. Segn GIACONI y ESCAFF (1995), las variedades de lechuga se pueden agrupar en cuatro tipos bastante definidos: de hojas o de amarra; repolladas o de cabeza, cos o romana y de cortar. Adems se pueden clasificar en variedades de verano y de invierno, aunque no son tan definidas como las anteriores debido a cierto grado de adaptacin a una estacin u otra mostrado por algunas variedades. Lechugas de hojas o amarra (Lactuca sativa var. crispa): la denominacin de amarra se presta a confusin, la amarra es eventual y se practica mucho menos en la actualidad que otrora. Dentro de las variedades de verano se tiene: Milanesa, Gallega de verano y Crespa Simpson. Dentro de las variedades de invierno estn Gallega de invierno, Parker y Francesa. Lechugas repolladas o de cabeza (Lactuca sativa var. capitata): dentro de este tipo se tiene de hojas suaves o lisas (Trocadero, White Boston y Espaola) y de hojas crespas (Great Lakes, Imperial), tambin existiendo variedades mejor adaptadas para cada zona y clima particular. Lechugas Cos o romana (Lactuca sativa var. longifolia): dentro de las variedades de verano se encuentran Blanca de Paris y Corsaro. Para variedades de invierno se tienen Roja y verde de invierno. Lechugas de cortar: tienen limitada importancia aun a nivel de huerto casero, porque las hojas que se cortan, a semejanza de la acelga y de la espinaca, son de inferior calidad en textura, comparadas con las lechugas de cultivo tradicional.

Cuadro 2.1 Fases de crecimiento de la lechuga Fase Germinacin Cotiledn Aumento de las hojas verdaderas poco a poco Roseta Observaciones La radcula emerge de la semilla Los cotiledones emergen y se expanden Las hojas emergen y se expanden Hojas con estructura aplanada a erguida (todava no curvada) Comienza cuando emerge una hoja curvada y se expande. Hojas sucesivas ms curvadas hasta que son completamente envueltas por las hojas exteriores. Se ha desarrollado un nmero suficiente de hojas en el interior, de modo que se forma un cogollo esfrico cada vez ms firme. Requiere 60 a 120 das dependiendo de la estacin. Las hojas del cogollo continan expandindose hasta que se forman grietas por la presin. El punto de crecimiento se alarga y emerge a travs de la parte superior del cogollo. Se inicia con la formacin de la yema Terminal y la apertura de la flor. Continan formndose nuevas flores diariamente durante 50-70 das. Empieza con la flor Terminal, el involucro se seca y abre en unos 12- 14 das.

Formacin del cogollo

Madurez

Sobremadurez

Formacin del tallo de las semillas

Floracin

Produccin de semillas

Fuente: K.V. Subbarao y R. M. Davis. The American Phytopathological Society. Posee un sistema radical profundo, poco ramificado; sus hojas se disponen primeramente en rosetas y luego se aprietan unas con otras. Durante su etapa fenolgica presenta dos perodos, en la primera el crecimiento es vegetativo y en la segunda se da la fase reproductiva. Aunque existe un gran nmero de variedades que se adaptan a una gama amplsima de climas, en trminos generales puede decirse que prefieren climas templados y hmedos (Maroto, 1995)

2.1.1 Importancia del cultivo en Chile

Se utiliza casi exclusivamente como producto fresco, principalmente en ensalada, aunque tambin es de importancia su utilizacin como ingrediente en emparedados y las tpicas hamburguesas de la llamada comida rpida. En los ltimos aos en el pas se han realizado inversiones en el rea de las hortalizas frescas, cortadas, lavadas y envasadas, listas para consumo o fresh cut, produccin que es destinada principalmente al mercado institucional y a la exportacin. Una parte tambin es comercializada en supermercados. Si bien su presencia an es marginal, es probable que crezca en los prximos aos, siguiendo la tendencia que se ha observado en otros pases. Esto generar una dinmica nueva en el mercado de las hortalizas de hoja y otras (zanahorias y cebollas, por citar algunas), que afectar no slo los hbitos de consumo sino tambin a la forma de producir y comercializar (Sitec, 2006).

2.1.2 reas de produccin

La lechuga tiene gran importancia como cultivo hortcola en el pas, ocupando una superficie estimada sobre 6500 ha/ao (ODEPA, 2007), producindose durante todo el ao en todas las regiones del pas, pero concentrndose en las regiones Metropolitana, V y VII. Adems, se cultiva una superficie significativa para la produccin de semillas que se exportan a varios pases. (Krarup, y Moreira, 1998)

Existe una superficie de 32 hectreas en invernaderos, principalmente en las regiones IV y V. Tambin en el pas hay una produccin de lechugas orgnicas e hidropnicas, de las cuales no existen cifras de produccin ni de volumen comercializado. Ambas tienen una presencia muy marginal en el mercado, se venden a precios muy superiores a las producidas en forma tradicional y son comercializadas fundamentalmente en supermercados y, en el caso de las orgnicas, tambin en tiendas especializadas en estos productos. Sin embargo, tanto agentes comerciales como productores sealan un aumento sostenido en la demanda de estos productos (Sitec, 2006).

2.2 Principales enfermedades que afectan a la lechuga

La principales enfermedades que afectan a este cultivo son: Mosaico ( Lettuce mosaic potyvirus LMV), Marchitamiento (Fusarium spp. y Verticillium spp.), Cada de plntulas (Sclerotinia spp., Rhizoctonia spp., Botrytis cinerea y Phytium spp.), moho gris (Botrytis cinerea) y moho blanco (Sclerotinia sclerotiorum y S. minor) Mosaico.- El mosaico es una enfermedad muy difundida en los centros productores de lechuga, siendo la que tiene mayor incidencia en la disminucin de rendimientos. Producida por un virus, en plntulas ocasiona un enroscamiento de las lminas de las hojas hacia abajo, acompaado de deformacin. Despus se produce un mosaico de colores verdes y amarillo en hojas nuevas. pudiendo tambin aparecer aclaramiento de nervaduras, necrosis de venas, bronceamiento laminar y arrosetamiento. No se forman cabezas adecuadamente, tampoco semillas y puede provocar un marcado enanismo. (Giaconi, 1989) Marchitamiento.- Esta enfermedad es producida por dos especies de hongos fitopatgenos del gnero Verticillium (Verticillium albo-atrum y Verticillium dahliae) y Fusarium (Fusarium oxysporum f:sp. lactucum). En algunos hospedantes, la marchitez se desarrolla principalmente en las plntulas, las cuales a menudo mueren poco despus de haber sido infectadas, pero ms comunes son las infecciones tardas, que ocasionan epinastia de las hojas superiores, seguida por la aparicin en el follaje de manchas clorticas irregulares que despus se vuelven necrticas. Las plantas adultas infectadas por Verticillium al igual que por Fusarium, habitualmente sufren varios grados de enanismo y sus tejidos vasculares muestran una decoloracin caracterstica (Agrios, 1996). Cada de plntulas.- Esta enfermedad en lechuga y otras hortalizas es causada por hongos de los gneros Sclerotinia, Rhizoctonia, Botrytis y Phytium. Los sntomas ms comunes de la enfermedad en la mayora de las plantas son el ahogamiento de las plntulas, la pudricin de las semillas y la pudricin de la raz y otros rganos vegetales que se encuentran en contacto con el suelo.. Cuando las semillas de plantas susceptibles se siembran en suelos infectados y son atacadas, se ablandan, empardecen, se contraen y finalmente se desintegran. Es sumamente difcil observar las infecciones de las semillas y los nicos sntomas de la enfermedad consisten en una baja poblacin de plntulas.(Agrios, 1996)

Moho gris- Enfermedad causada por el hongo Botrytis cinerea cuyos sntomas son la pudricin acuosa de la corona y de las hojas basales que quedan en contacto directo con el suelo. Las plantas se abren y se tienden. Necrosis foliar y abundante esporulacin griscea sobre los tejidos parasitados. Se favorece con ambientes templados y hmedos, con altas dosis de fertilizantes nitrogenados y bajos niveles de calcio (Giaconi, 1989).

2.2.1 Esclerotiniosis o pudricin blanca (Sclerotinia sclerotiorum)

a) Agente Causal

Los hongos del gnero Sclerotinia, en particular Sclerotinia sclerotiorum y S. minor, producen enfermedades devastadoras en numerosas plantas suculentas, en particular de hortalizas y plantas florales, as como de algunos arbustos. Las enfermedades causadas por ste gnero se encuentran ampliamente distribuidas por todo el mundo y afectan a las plantas en cualquiera de las etapas de su desarrollo, incluyendo plntulas, plantas maduras y rganos cosechados durante su transporte y almacenamiento (Agrios, 1996).

b) Sntomas de la enfermedad

Los sntomas que produce Sclerotinia varan un poco con el hospedante o la parte afectada de l y con las condiciones del medio ambiente. El sntoma primario ms caracterstico y evidente es la aparicin, sobre la planta afectada, de un micelio velloso y blanco en el que en poco tiempo se desarrollan grandes estructuras compactas de resistencia llamadas esclerocios. Estos esclerocios son blancos al principio pero ms tarde se ennegrecen y endurecen superficialmente. Su dimetro puede ser 0.5 a 1 mm, en S. minor y hasta 2 a 10 mm, en S. sclerotiorum, aunque a menudo son ms aplanados y largos que esfricos. En la base de los tallos de las plantas herbceas suculentas que han sido afectadas aparecen en primer trmino varias lesiones de color caf plido u oscuro. Con frecuencia, estas lesiones se cubren con gran rapidez de un moho algodonoso blanco que corresponde al micelio del hongo. En las primeras etapas del desarrollo de la lesin en el tallo, el follaje muestra muy pocos signos del ataque del patgeno, de ah que las plantas infectadas pasen fcilmente

inadvertidas, hasta que ste se desarrolla totalmente sobre el tallo y lo pudre. Debido a esto, el follaje localizado arriba de la lesin se marchita y muere con gran rapidez. En algunos casos, la infeccin se inicia sobre una hoja y avanza despus hacia el tallo a travs de ste. Los esclerocios del hongo pueden formarse internamente en la mdula del tallo, sin que denoten signos o fuera de ste donde son bastante conspicuos. Las hojas y los pecolos de plantas tales como la lechuga, apio o remolacha se colapsan y mueren repentinamente a medida que el hongo infecta la base del tallo y las hojas inferiores. El hongo invade el tallo y se propaga con gran rapidez en l y toda la planta muere y se degrada; de ah que sus hojas se desprendan y depositen sobre el suelo. Generalmente, el hongo forma micelio y esclerocios sobre el envs de las hojas ms externas, pero en condiciones de alta humedad invade totalmente a la planta y la pudre, produciendo una masa micelial vellosa de color blanco sobre toda la superficie de la planta. Cuando el clima es seco y prosigue la infeccin, el hongo forma cancros en el tallo, los cuales destruyen a la planta sin que produzcan una pudricin blanda (Agrios, 1996).

c) Epidemiologa Los hongos Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotinia minor invernan en forma de micelio en plantas vivas o muertas y en forma de esclerocios que han cado en el suelo. En la primavera o a principios del verano los esclerocios germinan y producen de uno a varios tallos delgados que terminan en un pequeo apotecio con forma de copa o disco y un dimetro de 5 a 15 mm. En ste se forman las ascas y las ascosporas, los que son liberados al cabo de 2 a 3 semanas. Las ascosporas son diseminadas y en caso de que se depositen sobre rganos vegetales senescentes, como las flores muy maduras (las cuales proporcionan una fuente de alimento fcilmente aprovechable), germinan y producen infeccin. En algunas especies de Sclerotinia, los esclerocios producen infeccin al formar filamentos miceliales, los cuales atacan directamente a los tallos de plantas jvenes. Cuando hay suficiente humedad, este ltimo modo de infeccin es quiz ms comn que el que utiliza ascosporas, aunque cabe decir que en S. sclerotiorum la mayora de las infecciones se inician por estas ltimas (Agrios, 1996). Ambos patgenos requieren humedad alta en el follaje y las temperaturas ptimas para su desarrollo son 18 a 25 C. La diseminacin se produce en forma ms rpida entre 13 a 18C. Se disemina por agua de riego, por labores culturales y por el viento.

d) Alternativas de control El control de las enfermedades causadas por Sclerotinia se basa en prcticas de cultivo y aspersin con compuestos qumicos. En la mayora de las especies afectadas, pocas variedades vegetales muestran gradientes apreciables de resistencia a este patgeno. En los invernaderos, la esterilizacin del suelo con vapor elimina a Sclerotinia, mientras que en la campo, los productos esterilizantes qumicos que se aplican en el suelo no han mostrado ser eficientes en el control de la enfermedad. Control cultural.- Dado que sta patologa se ve favorecida por una gran cantidad de humedad en el suelo y atmosfrica y, afecta a un gran nmero de plantas silvestres y cultivadas, los cultivos susceptibles deben sembrarse slo en suelos con buen drenaje. Las plantas no deben establecerse muy cerca unas de otras a fin de permitir su aireacin y debe evitarse que las malezas crezcan dentro de los cultivos. En caso de que la enfermedad se vuelva severa al atacar a las plantas susceptibles, stas deben arrancarse y quemarse para evitar que el hongo forme esclerocios. Dado que stos permanecen viables en el suelo por lo menos durante 3 aos y a que no todos germinan o mueren al mismo tiempo, los campos infectados deben sembrarse con cultivos no susceptibles, como el maz y cereales de grano pequeo, cuando menos durante 3 aos antes de que se vuelvan a sembrar cultivos susceptibles.(Agrios, 1996). Control qumico.- En varios cultivos se ha logrado un control eficiente de las enfermedades causadas por Sclerotinia al asperjar los suelos con metham sodio o al aplicar sobre las plantas los fungicidas benomyl, dicloran o metil tiofanato, antes y durante su etapa de susceptibilidad al patgeno. (Agrios, 1996) Control biolgico.- Numerosos autores citan el control biolgico como una estrategia alternativa para el control de hongos patgenos, entre ellos Sclerotinia spp. ste ha sido definido por Cook y Baker (1983) como la disminucin de la cantidad de un inculo o de la actividad productora de enfermedad de un patgeno, a travs de uno o ms organismos antagnicos o por el hombre.

2.3 Control biolgico

En los ltimos aos, se ha informado que ms de 30 especies de hongos, bacterias, insectos y otros organismos, parasitan a Sclerotinia o inhiben su crecimiento. Se han obtenido resultados alentadores en el control biolgico de las enfermedades que produce este hongo en algunos cultivos al incorporar en los suelos que ha infestado, los hongos micoparsitos Coniothyrium minitans, Gliocladium roseum, G. virens, Sporrodesmium sclerotivorum y Trichoderma viride. Estos hongos destruyen a los esclerocios que existen o inhiben su nueva formacin, por lo que disminuyen en forma considerable la poblacin de Sclerotinia en el suelo. Sin embargo, hasta ahora no se ha hecho extensivo su uso en el control prctico de las enfermedades que ocasiona este hongo (Agrios, 1996).

2.3.1 Trichoderma spp.

Diferentes especies del gnero Trichoderma se usan como agentes de control biolgico de enfermedades en agricultura. Los ms utilizados son T. harzianum, T. viride y T. virens. Se ha demostrado que son capaces de controlar a hongos de diversos gneros, como Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletotrichum, Dematophora, Diaporthe, Endothia, Fulvia, Fusarium, Fusicladium, Helminthosporium, Pseudoperonospora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium, Venturia y Verticillium (Hermosa, 1998). Las razones para utilizar los hongos de este gnero son dadas primero, por el alto grado de adaptabilidad demostrada por su distribucin cosmopolita, en casi todos los suelos del mundo, bajo diferentes condiciones ambientales y de substratos utilizables. Segundo, por su carcter de saprfito (capaz de degrada materia orgnica en descomposicin), lo que genera su capacidad competidora (Harman, 1998). Adems, sus mecanismos de interaccin con el patgeno y planta, unido al bajo nivel de riesgo para los mamferos y el ecosistema, lo hacen uno de los mejores biocontroladores que existen en el mundo.

A) Morfologa y taxonoma El hongo Trichoderma fue identificado en el ao 1871 por Haz, fecha desde la cual ha sido largamente estudiado. Es parte del grupo de los Hyphomicetes y miembro de la familia Moniliaceae, de la que tambin forman parte Fusarium y Monilinia.

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Este hongo presenta un micelio blanco, el que en pocos das toma un color verde oscuro, por la aparicin de las estructuras reproductivas llamadas conidias. Adems, presenta una fase sexual poco comn, en la que toma el nombre de Hypocrea (Cook, 1989).Comenz a ser utilizado en 1960 como degradador de celulosa y desde ese momento, se ha empleado en la industria qumica, textil y alimenticia y la del control biolgico (Harman, 1998).

B) Mecanismos de accin Trichoderma tiene efecto sobre hongos patgenos, a travs de varios mecanismos de accin, que funcionan de manera individual o conjunta, y pueden variar en grado segn el patgeno a controlar y la cepa de Trichoderma a utilizar (Dubos, 1987). Los mecanismos de control ms importantes son: Antibiosis: Trichoderma es capaz de producir una amplia variedad de metabolitos secundarios, tanto voltiles como no voltiles, permitiendo inhibir el crecimiento de otros organismos pese a no haber contacto fsico. Entre lo ms conocidos estn gliotoxin, viridin y gliovirin (Howel and Stipanovic, 1983). Alguno de estos compuestos tambin estn relacionados con el proceso de micoparasitismo, afectando en forma diferencial a distintas especies de patgenos (Claydon , 1987; Denis y Webster, 1971). Micoparasitismo: El parasitismo se define como el ataque directo de un hongo, sobre otro hongo (Chet, 1987). El micoparasitismo presenta 4 fases las que se inician con el crecimiento qumico trpico, en el cual un qumico proveniente del hongo presa, atrae a Trichoderma. La segunda fase es la de reconocimiento especifico, mediada por compuestos de la pared de los hongos. La tercera fase es la unin y enrollamiento de Trichoderma alrededor del otro hongo, y finalmente la secrecin de enzimas lticas que degradan al patgeno (Hjeljord, 1998). Competicin: La competicin ocurre cuando dos o ms organismos demandan un recurso en cantidades o tasas, mayores a las disponibles. Esta forma de control biolgico se define ms precisamente como explotacin competitiva o interferencia competitiva, lo que involucra mecanismos de conducta o qumicos, por los que un organismo limita el desarrollo de otro (Wilcklow, 1992, Bionativa, 2004).

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C) Caractersticas generales de Trichoderma spp. Trichoderma como saprfito del suelo, est adaptado a una colonizacin agresiva, ocupando rpidamente los sustratos disponibles. Esto no slo ocurre en las races, sino que adems en los tejidos necrosados, como consecuencia del ataque de un patgeno, lo que le permite tener un efecto curativo, como en los casos de Botrytis y Sclerotinia (Dubos, 1987; Gullino, 1992; Harman, 1996). Otra forma de competencia altamente relevante, es por los exudados de las races, lo que le permite tener un efecto preventivo y curativo en enfermedades ocasionados por Pythium (Nelson, 1987) y Fusarium (Sivan y Chet, 1989). Trichoderma, es capaz de tomar nutrientes de los hongos (a los cuales degrada) y de materia orgnica ayudando a su descomposicin. Por lo anterior, las incorporaciones de sta y compostaje le favorecen. Tambin requiere de humedad para poder germinar, siendo la velocidad de crecimiento de este organismo bastante alta. Por esto es capaz establecerse en el suelo y controlar enfermedades. Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, ms verstil y polifactico que abunda en los suelos. No se conoce que sea patgeno de ninguna planta; sin embargo, es capaz de parasitar, controlar y destruir muchos hongos, nemtodos y otros fitopatgenos, que atacan y destruyen muchos cultivos; debido a ello, muchos investigadores le llaman el hongo hiperparsito. Ello convierte a Trichoderma en un microorganismo de imprescindible presencia en los suelos y cultivos, y de un incalculable valor agrcola (Pez, 2006). Se conocen muchas funciones beneficiosas que realiza este hongo en la agricultura, especialmente en el campo de la sanidad vegetal. A modo de resumen se han demostrado las siguientes:

- Estimulador del crecimiento de las plantas Por muchos aos, la habilidad de estos hongos para incrementar la velocidad de crecimiento y desarrollo de plantas, incluyendo, especialmente su capacidad para promover la produccin de races ms robustas y profundizadoras, es bien conocida, aunque los mecanismos por los cuales esto ocurre an no estn del todo claros (Harman, 2000). Se ha comprobado que Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas. Estas actan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemticos primarios, aumentando su reproduccin celular, logrando que las plantas

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alcancen un desarrollo ms rpido respecto a aquellas plantas que no hayan sido tratadas con dicho microorganismo. Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, tagetes, petunia, pepino, berenjena, arveja, pimienta, rbano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodn, frejol y pastos ornamentales (Pez, 2006).

- Proteccin de semillas contra el ataque de hongos patgenos Muchos productores al recoger la cosecha, guardan semillas para la prxima siembra, y no les dan la suficiente cobertura de conservacin, para que stas mantengan su potencial germinativo y productivo. Esto trae como consecuencia que varias especies de hongos patgenos los ataquen con relativa facilidad, producindose una significativa prdida de sus cualidades botnicas y productivas. Diversos ensayos han mostrado un efecto protector de Trichoderma, ya que este hongo coloniza las semillas botnicas protegiendo las futuras plntulas en la fase post-emergente de patgenos fngicos (Pez, 2006). Cepas de Trichoderma son capaces de colonizar la superficie de la raz y la rizsfera desde las semillas tratadas y las plantas adultas existentes en el suelo, protegiendo a las mismas de enfermedades fungosas. El tratamiento de semillas con Trichoderma permite una proteccin eficiente del almcigo sin necesidad de tratamiento del suelo previo a la siembra. Este tipo de tratamiento es probablemente la forma ms econmica y extensiva para introducir el biocontrol en la produccin. El mtodo sencillamente consiste en tratar las semillas con una suspensin acuosa de esporas o en forma de polvo, con o sin necesidad de adherente. - Proteccin directa a suelos y diferentes cultivos La rotacin de cultivos ayuda, a que Trichoderma reduzca en el suelo los propgulos del fitopatgeno, vulnerables durante su latencia en ausencia del hospedante. Por esta razn la utilizacin del biopreparado en los cultivos a rotar en las reas altamente infectadas ser una forma a contribuir en la reduccin de la poblacin del patgeno en un menor plazo de tiempo.

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Adems la preparacin adecuada del terreno, una adecuada fecha de plantacin, fertilizacin y riego actan a favor de la combinacin Planta Trichoderma. La aplicacin de Trichoderma, directa al suelo ofrece incluso una proteccin mayor a los cultivos. Cuando Trichoderma es utilizado para el control de hongos del suelo, puede mezclarse con materia orgnica (estircol, casting y biotierra) y otras enmiendas utilizadas como biofertilizantes, tal como se hace con inoculantes bacterianos usados como fertilizantes ecolgicos (Pez, 2006). Es evidente que la presencia de Trichoderma en la plantacin es necesaria, y la forma ms eficiente sin duda es el transporte del bioagente junto con el sustrato donde el mismo se encuentra previamente establecido como micobiota normal de la rizsfora. - Trichoderma como agente para la biodegradacin de agrotxicos Dentro de los organismos utilizados para la biodegradacin se ha estudiado el gnero Trichoderma el cual puede degradar pesticidas organoclorados, clorofenoles, y otros insecticidas como DDT, endosulfn, pentacloronitrobenceno, aldrin y dieldrin, herbicidas como trifluralin y glifosato. Este hongo posee enzimas tales como celulasas, hemicelulasas y xylanasas que ayudan a la degradacin inicial del material vegetal y por ltimo enzimas de mayor especializacin que contribuyen a la simplificacin de molculas complejas como son las de biopesticidas. Se han realizado experimentos donde se ha comprobado que Trichoderma degrada algunos grupos de pesticidas de alta persistencia en el ambiente. Esto abre las puertas hacia la descontaminacin de extensas reas de suelos que se han contaminado por el uso irracional e indiscriminado de productos de un alto efecto residual, causantes de grandes daos para la salud animal y humana (Pez, 2006). Trichoderma posee resistencia innata a la mayora de los agroqumicos, incluyendo a los funguicidas. Sin embargo, el nivel de ste difiere entre cepas. Algunas lneas han sido seleccionadas o modificadas para ser resistentes a agroqumicos especficos. La mayora de los productores de cepas de este hongo destinadas al control biolgico poseen informacin relacionada con la susceptibilidad o resistencia a un amplio rango de productos. Esto con el fin de que estos aislamientos sean compatibles con los mtodos de control aplicados, los cuales incluyen control qumico.

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- Trichoderma como alternativa para el ahorro de fertilizantes qumicos y pesticidas Investigaciones recientes han demostrado que la aplicacin de Trichoderma en el cultivo del maz, permite un ahorro de fertilizante nitrogenado. Esto implica una reduccin del 35 al 40% en la aplicacin del nutriente respecto a un maz no tratado. Conociendo que dicho cultivo demanda mucho Nitrgeno, existe la posibilidad real que las aplicaciones de este conjunto qumico, sean disminuidas, reduciendo as los costos de aplicacin y una mejora apreciable del medio ambiente. El empleo del Trichoderma puede beneficiar a los productores agrcolas en sus propsitos de lograr cosechas mas sanas y con mayor productividad (Pez, 2006). Est comprobado el efecto de Trichoderma en la solubilizacin de los fosfatos insolubles del suelo, facilitando su asimilacin por los cultivos. Trichoderma forma asociaciones con micorrizas, aumentando de manera significativa la rizsfera del suelo, permitindole a las plantas hacer una mayor extraccin de nutrientes y con un alto grado de asimilacin. Se ha demostrado tambin que Trichoderma es compatible con un biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum, una bacteria que fija Nitrgeno en el suelo; por lo que se establecen relaciones de ayuda mutua, con el consiguiente beneficio para la nutricin de los cultivos. Trichoderma tambin es empleado como bioagente para el control de diferentes fitopatgenos, por lo que ha contribuido a sustituir en muchos cultivos las aplicaciones de pesticidas qumicos, que son ms caros y mas dainos a la salud de las personas y de los animales. Ello ha posibilitado la produccin de alimentos ms sanos y ecolgicos, potenciando de manera significativa una Agricultura Orgnica y ms en correspondencia con las actuales necesidades de los consumidores (Pez, 2006). - Trichoderma y su empleo en sustratos bajo condiciones de cultivo hidropnico y zeopnico Aunque los resultados alcanzados hasta el momento son insuficientes, el empleo de Trichoderma en cultivos de hidropnicos ha demostrado otra de las aplicaciones y uso de este microorganismo para la agricultura. Esto tambin puede ser vlido para los cultivos zeopnicos, debido a las propiedades de la zeolita para el intercambio, la adsorcin, la absorcin y el almacenamiento de nutrientes, as como la capacidad que pudiera tener de dejarse colonizar por dicho microorganismo, o al menos permanecer ste, por un tiempo mas prolongado (Pez, 2006).

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3. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Ubicacin del Ensayo El ensayo se llev a cabo en uno de los invernaderos no calefaccionados del Campus Lircay de la Universidad de Talca (34 23 13 latitud Sur y 71 40 41 longitud Oeste a 90 m.s.n.m) entre Junio y Octubre de 2006. 3.2 Material Vegetal Con el fin de evaluar in vivo el efecto de Trichoderma spp. en el control de pudricin blanca sobre lechuga, se utilizaron plntulas del cultivar Great Lakes transplantadas cuando stas posean 4 a 5 hojas verdaderas, 8 a 10 cm de altura en la parte area y 3 cm de largo radical. 3.3 Obtencin de Trichoderma spp. Para tratamientos que incluan Trichoderma, se utiliz una mezcla de tres cepas nativas de este biocontrolador, las cuales fueron aisladas, identificadas y evaluadas durante tres aos de estudio, a travs de un proyecto de investigacin desarrollado en la Universidad de Talca con financiamiento FIA (C98-1-A-072). Las cepas nativas son Queule (Trichoderma harzianum), Trailes (Trichoderma parcenamosum) y Sherwood (Trichoderma virens) que se caracterizan por su agresividad como antagonistas de hongos de importancia agrcola y buena capacidad para colonizar los suelos. 3.4 Obtencin del patgeno Se efectu la separacin de los esclerocios del patgeno desde muestras de suelo contaminado obtenidas de un potrero previamente sembrado con lechuga en la localidad de Colina, Santiago, que haba presentado pudricin blanca. La presin de esclerocios encontrada en ese tipo de suelo fue de uno por gramo. La metodologa usada consisti en pesar 100 gramos de la muestra de suelo en una balanza y posteriormente tamizar permitiendo la separacin de las partculas de mayor tamao entre las cuales se encontraban los esclerocios. Una vez que los residuos estuvieron libres de agua, se procedi a la extraccin de esclerocios con un pincel. Cada extraccin fue contabilizada y se lleg a reunir la cantidad suficiente de estructuras de resistencia del patgeno como para efectuar la infeccin en una relacin de 10 esclerocios por

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cada 100 g de sustrato (turba-vermiculita-perlita en proporcin 8:4:1). Sobre ste se transplantaron posteriormente las plntulas de lechuga. 3.5 Evaluacin del hongo Trichoderma spp. y el fungicida Amistar (azoxystrobin) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga (Lactuca sativa) 3.5.1 Inoculacin del sustrato con el patgeno Se utiliz como sustrato una mezcla de turba, vermiculita y perlita en proporcin 8:4:1, respectivamente. El uso de turba canadiense Sunshine mezcla 3, se ajustaba a las caractersticas de esterilidad y capacidad de retencin de humedad requerida para el ensayo en combinacin a los sustratos inertes perlita-vermiculita. Cada maceta fue llenada con 200 g de este sustrato, por lo tanto, en cada una de ellas se colocaron 20 esclerocios. La inoculacin del sustrato se realiz el da anterior al transplante, esto fue el 25 de junio de 2006. 3.5.2 Diseo experimental y aplicacin de los tratamientos Se utiliz un diseo experimental completamente al azar el que const de 5 tratamientos con cuatro repeticiones cada uno, estando compuesta cada unidad experimental por 10 plantas de lechuga colocadas en bolsas con 200 g de sustrato. Dependiendo del tratamiento se adicionaron los esclerocios del patgeno en la cantidad ya sealada. El lunes 24 de Julio se efectu el transplante de las plntulas con 4 a 5 hojas

verdaderas cuyo tamao era de 8 a 10 cm de altura en la parte area y una longitud radical de unos 3 cm. La aplicacin de los tratamientos se realiz previo transplante. El fungicida Amistar (azoxystrobin) fue adicionado en su dosis comercial (60 g/100 L) al sustrato infectado. Para el caso de los tratamientos que incluan Trichoderma, se utiliz una mezcla de las cepas nativas Queule, Trailes y Sherwood (proporcin 1:1:1). La dosis aplicada fue de 10 ml/L, con una concentracin del hongo de 109 conidias/ml. Se fertiliz con Ureasul (1 g/L) aplicado durante el primer riego, equivalente a 40 unidades de N, 5 unidades de MgO y 3 unidades de SO4. Se aplic la misma dosis de fertilizacin cada 3 semanas hasta la evaluacin final. El riego se realiz con una frecuencia de dos a tres veces por semana.

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Una vez aplicados los tratamientos se procedi a distribuir las unidades experimentales al azar dentro del espacio asignado para el ensayo. Cuadro 3.1 Tratamientos incluidos en el ensayo de evaluacin del efecto de Trichoderma spp. y el fungicida azoxystrobin (Amistar 50 WP) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga. Tratamientos (1) Sustrato estril Sustrato infectado Sustrato estril + Trichoderma Sustrato infectado + Trichoderma Sustrato infectado + azoxystrobin

T1 T2 T3 T4 T5
(1)

Las plntulas de lechuga fueron colocadas en contenedores plsticos con 200 g de sustrato (turba, vermiculita, perlita) a los cuales se les aplicaron los tratamientos.

3.6

Parmetros evaluados

Las variables evaluadas en lechugas cultivar Great Lakes con un peso fresco de 100 g, fueron incidencia y severidad, realizando las primeras evaluaciones a los 60 das desde transplante.

3.6.1

Medicin de la incidencia y severidad de la enfermedad

Se realizaron evaluaciones de dos tipos de incidencia y severidad al momento en que las plantas evidenciaron sntomas de la enfermedad aproximadamente 60 das despus de transplante, en la fase de inicio de formacin de cabeza. Las hojas que presentaron sntomas fueron removidas despus de la primera evaluacin y transcurridos diez das se realiz una evaluacin final de incidencia (2). Para medir incidencia (1) se contabiliz el nmero de individuos afectados respecto al nmero total de plantas totales por unidad experimental. Esto de acuerdo a la siguiente frmula, expresada como porcentaje (%):

Incidencia (1) = (Nmero de individuos afectados/ Total de individuos)* 100

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Para incidencia (2) se contabiliz el nmero de hojas con sntomas de la enfermedad respecto al total de hojas de la planta para cada unidad experimental. ste valor tambin fue expresado en porcentaje.

Incidencia (2) = (Nmero de hojas afectadas/ Total de hojas planta)* 100

En el caso de la severidad, se utiliz la siguiente escala de marchitez:

Cuadro 3.2 Escala de marchitez utilizada para evaluar la severidad de pudricin blanca en lechuga.

Nivel 0 = No se observan sntomas de la enfermedad Nivel 1 = Marchitez suave (1 a 2 hojas con clorosis y/o marchitez) Nivel 2 = Marchitez moderada (decaimiento de la planta y clorosis en ms de 3 a 4 hojas) Nivel 3 = Marchitez Severa (Cada de plantas y presencia de micelio en la base del tallo)

3.6.2 Otras variables

Para medir el efecto de los tratamientos sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas se tomaron datos de altura (cm) en ambas evaluaciones, a los 60 y 70 das, respectivamente. En la evaluacin final se registraron datos de longitud de races (cm), peso fresco (g) y peso seco (g).

3.7 Anlisis de resultados

Los datos obtenidos fueron sometidos a un anlisis de varianza (ANDEVA), en el programa estadstico Statgraphics Plus para Windows. En aquellos casos en los que el ANDEVA result significativo se realiz la separacin de medias mediante el test Fisher LSD (p0,05).

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IV. RESULTADOS

4.1. Evaluacin de Trichoderma spp. y azoxystrobin (Amistar 50 WP) en el control de Sclerotinia spp. en lechuga (Lactuca sativa) bajo condiciones de invernadero.

4.1.1 Evaluacin de la Incidencia de pudricin blanca causada por Sclerotinia spp. en plantas de lechuga tratadas con Trichoderma spp. y azoxystrobin.

Una vez que las plantas alcanzaron un tamao comercial se realiz un conteo de aquellas que presentaban sntomas tpicos de la enfermedad. La incidencia en cuanto al nmero de plantas enfermas fue de un 100 por ciento no slo en aquellos tratamientos que fueron inoculados con el patgeno, por lo cual fue necesario efectuar un segundo tipo de evaluacin en que se cuantific el nmero de hojas con sntomas respecto del nmero total de hojas de la planta. Lo anterior se efectu considerando las caractersticas de la planta de lechuga y que la Incidencia puede sobrestimar el dao causado por Sclerotinia en el cultivo. Una planta de lechuga puede presentar dao slo en las hojas externas, las que pueden ser removidas y posteriormente la planta puede ser comercializada y consumida. Por el contrario, si la lesin causada por el patgeno se presenta en la base del cuello de la planta, comprometiendo el centro de sta, la lechuga ya no puede ser comercializada, ni consumida. En ambos casos, la incidencia es la misma. Por lo anterior, se consider ms pertinente utilizar como parmetro el porcentaje de hojas daadas por Sclerotinia respecto al total en cada planta (Incidencia 2). De igual forma se realiz una medicin de severidad utilizando la clasificacin por niveles que se haba planteado al principio del ensayo. sta ltimo valor se presenta en la figura 3.1, donde se puede observar que en ningn tratamiento hubo plantas sin dao (nivel 0), lo cual da cuenta de las condiciones favorables para la infeccin primaria del patgeno y la alta presin de inculo existente. El testigo (tratamiento 2) es el que present el mayor porcentaje de plantas con los niveles superiores de severidad, siendo menor que el resto de los tratamientos en los niveles inferiores.

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90 80 70 60 50 40 30 20 10
a a a a c b
d

Nivel 0 = No se observan sntomas de la enfermedad

Nivel 1 = Marchitez suave (1 a 2 hojas con clorosis y/o marchitez) Nivel 2 = Marchitez moderada (decaimiento de la planta y clorosis en ms de 3 a 4 hojas) Nivel 3 = Marchitez Severa (Cada de plantas y presencia de micelio en la base del tallo)

b a

0 1 2 3
Tratamiento (*)

Figura 3.1.- Severidad de pudricin blanca observada en plantas de lechuga establecidas en un sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Universidad de Talca, Talca, Temporada 2006/2007.
(*) Tratamiento 1 = sustrato estril, tratamiento 2 = Sustrato infectado, tratamiento 3 = Sustrato estril + Trichoderma, tratamiento 4 = Sustrato infectado + Trichoderma y tratamiento = Sustrato infectado + Azoxystrobin. Cada grado de severidad fue sometido a un anlisis de varianza por separado comparando los porcentajes de plantas con los distintos niveles. Barras del mismo color con letras diferentes sealan diferencias significativas (p0,05) segn el test Fischer LSD para separacin de medias. Mediciones realizadas el 28 de septiembre de 2007.

4.1.2 Evaluacin de la Incidencia 2 (% de hojas afectadas respecto al total) de pudricin blanca causada por Sclerotinia spp. en plantas de lechuga tratadas con Trichoderma spp. y azoxystrobin.

Debido a que el tratamiento 1 (Sustrato estril sin inculo del patgeno) y tratamiento 3 (Sustrato estril + Trichoderma) presentaron sntomas primarios de clorosis (amarillez) en las hojas exteriores de la planta, los que no son atribuibles a un ataque de Sclerotinia, se decidi evaluar especficamente los tratamientos en los cuales fue inoculado el patgeno con el objetivo

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de no distorsionar la interpretacin y evaluacin de los resultados del ensayo. De igual forma, se realiz un anlisis de varianza por separado para los tratamientos 1 y 3 en el que no se observaron diferencias estadsticamente significativas entre ellos (anexo 8.2). Una primera toma de datos de Incidencia 2 se realiz el da 28 de Septiembre, la cual arroj diferencias entre los tratamientos 2, 4 y 5. stos corresponden al testigo (Sustrato con esclerocios), sustrato infectado con esclerocios + Trichoderma y sustrato infectado con esclerocios + azoxystrobin, respectivamente. En la figura 3.2 se pueden visualizar dichas diferencias. Posteriormente, se eliminaron las hojas de los tratamientos que presentaron dao y aproximadamente 10 das despus se hizo una segunda evaluacin que correspondi al momento de cosecha (10 de Octubre). En sta no se observaron diferencias estadsticas significativas entre los tratamientos 4 y 5, pero s entre stos y el Testigo (Figura 3.3).

Incidencia 2
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

c
b

48,2

37,175

42,275

4
Tratam ientos (*)

Figura 3.2 Incidencia 2 (un % de hojas con sntomas respecto al total) observada en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Primera evaluacin, 28/09/07. Universidad de Talca, Talca, temporada 2006/2007.
(*) Tratamiento 2 = Sustrato infectado, tratamiento 4 = Sustrato infectado + Trichoderma y tratamiento 5 = Sustrato infectado + azoxystrobin. Letras distintas en las barras indican diferencias estadsticamente significativas (p0,05) segn el test Fischer LSD para separacin de medias.

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Incidencia 2 al momento de cosecha 30

b

25 20 15 10 5 0 2 4
Tratamiento (*) 16,98 15,97 25,30
a a

Figura 3.3 Incidencia 2 (un % de hojas con sntomas respecto al total) observada en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratados con Trichoderma y azoxystrobin. Segunda evaluacin, 28/09/07. Universidad de Talca, Talca, temporada 2006/2007.
(*) Tratamiento 2 = Sustrato infectado, tratamiento 4 = Sustrato infectado + Trichoderma y tratamiento 5 = Sustrato infectado + azoxystrobin. Letras distintas en las barras indican diferencias estadsticamente significativas (p0,05) segn el test Fischer LSD para separacin de medias.

En ambos casos, el tratamiento testigo evidenci los sntomas propios de la enfermedad, incluso present formacin de micelio blanco algodonoso y en algunos individuos necrosis total en la zona del cuello.

4.1.3 Evaluacin de los parmetros altura, largo de races y peso fresco total.

Cabe sealar que no se obtuvieron diferencias estadsticas significativas para el parmetro altura en ninguna de las dos fechas de evaluacin en que fueron recopilados dichos datos. Respecto al largo de races se encontraron diferencias estadsticamente significativas entre el Testigo y los tratamientos 4 y 5. Sin embargo, no se pudieron establecer diferencias entre estos

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dos ltimos a pesar que las plantas tratadas con Trichoderma presentaron un largo de races en promedio 1 cm superior al de aquellas en que se aplic azoxystrobin. (Figura 3.4)

Largo de races al momento de cosecha

12 10 8 6 4 2 0 2 4 5
a b

8,525

10,425

9,875

Tratamientos (*)
Figura 3.4.- Largo promedio de races (cm) observado en plantas de lechuga establecidas en sustrato inoculado con Sclerotinia y tratado con Trichoderma y azoxystrobin. Evaluacin realizada el 10/10/07. Universidad de Talca, Talca, Temporada 2006/2007.
(*) Tratamiento 2 = Sustrato infectado, tratamiento 4 = Sustrato infectado + Trichoderma y tratamiento 5 = Sustrato infectado + azoxystrobin. Letras distintas en las barras indican diferencias estadsticamente significativas (p0,05) segn el test Fischer LSD para separacin de medias.

Finalmente para el parmetro peso fresco total, no se observaron diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, sin embargo, al comparar peso fresco y seco de las hojas enfermas se detectaron diferencias significativas (anexo 8.3).

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V. DISCUSIN

El objetivo del presente ensayo fue determinar la accin de Trichoderma y Azoxystrobin en el control de pudricin blanca en lechuga bajo condiciones de invernadero. Las cepas nativas del biocontrolador fueron capaces de disminuir el porcentaje de hojas con sntomas causados por Sclerotinia minor al igual que azoxystrobin. Sin embargo, la accin antagonista de Trichoderma spp. al ser un organismo vivo sometido a condiciones de temperatura y humedad en un sistema de invernadero al igual que el patgeno Sclerotinia, pudo verse afectada debido a las condiciones que fueron registradas durante el desarrollo del ensayo. Es importante sealar que la temperatura promedio observada dentro del invernadero a nivel de plantas fue de 15 a 20 C y la humedad relativa se mantuvo en promedio en 70%. Esto result favorable para el desarrollo del patgeno. En contraposicin, la accin de Trichoderma spp. se vio afectada debido a que las condiciones ptimas de temperatura y humedad relativa para llevar a cabo un nivel de control eficiente no fueron ptimas. Trichoderma a pesar de ser un hongo saprofito cosmopolita, requiere de temperaturas y humedad relativa mayores para su desarrollo.

Las plantas de lechuga si bien manifestaron algn nivel de incidencia en cuanto a sntomas de esclerotiniosis en la mayora de los tratamientos, no presentaron diferencias entre ellos para los parmetros de altura y peso fresco total. No obstante, se pudo establecer que tanto Trichoderma spp., como azoxystrobin disminuyen el porcentaje de hojas con sntomas del hongo y aumentan el largo de races respecto al tratamiento testigo.

A modo de recomendacin se puede sealar que la aplicacin preventiva de Trichoderma spp, as como la aplicacin del qumico azoxystrobin resultaron efectivas en el control de pudricin blanca para las condiciones del ensayo. Se sugiere realizar experimentos similares a fin de acotar las condiciones en que uno u otro tratamiento acta con mayor eficiencia. Por el

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momento ambos resultan una alternativa eficaz como control preventivo de pudricin blanca en lechuga.

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VI. CONCLUSIONES

La aplicacin de Trichoderma o azoxystrobin al momento de transplante para el control de pudricin blanca causada por Sclerotinia minor en lechugas bajo condiciones de invernadero resulta efectiva ya que se evidencia un menor porcentaje de hojas con sntomas en plantas tratadas. A la vez estas plantas mostraron un mayor largo de races lo cual da cuenta de un control eficiente de la enfermedad.

El antagonista Trichoderma spp mostr un nivel de control muy similar a Azoxystrobin, por lo cual ambos constituyen una buena alternativa a considerar para aplicaciones preventivas en el control de esta enfermedad. Azoxystrobin fungicida del grupo de las estrobirulinas derivadas de hongos comestibles silvestres ejerce una accin antiesporulante sobre el patgeno.

No se pudo establecer un efecto de Trichoderma sobre el crecimiento de la parte area de plantas de lechuga. S se evidenci un mayor largo de races pero sin establecer una diferencia estadstica respecto del tratamiento con azoxystrobin.

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VII.- BIBLIOGRAFA

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VIII. ANEXOS Anexo 8.1 Sustrato Canadiense La mezcla Sunshine Mix 3 est integrada por una combinacin uniforme de musgo, Sphagnum Canadiense, vermiculita cuidadosamente seleccionada, a la que se le adicionan carbonatos para ajustar el pH, un agente humectante patentado y adems una formulacin base de fertilizantes. *La mezcla Sunshine Mix No.3, se formula utilizando musgos seleccionados y contiene una excelente fibra y una adecuada estructura, lo que permite una ptima retencin del agua aplicada y una buena aereacin, lo que conlleva a la obtencin de plantas sanas y vigorosas. *La vermiculita usada es de grado fino- especialmente seleccionada la cual se combina con el musgo para mejorar la retencin del agua y adems auxiliar en la aireacin y el drenaje, as como tambin permite mantener la estructura del contenedor al momento del transplante. *A la mezcla se le agrega carbonatos para ajustar el pH en el rango de 5.9 a 6.2. *La formulacin de fertilizante, contiene elementos mayores y menores, en concentraciones bajas, lo que permite que la fertilizacin se mantenga a un nivel apropiado para la germinacin y a su vez, proteger a los tejidos suculentos de las plantas. Por regla general, se debe iniciar un programa de fertilizacin adecuado a las necesidades locales, tan pronto aparezcan las primeras hojas verdaderas. *La mezcla Sunshine Mix no. 3 es inocua y libre de semillas de malezas, por lo que no requiere de fumigacin o desinfeccin alguna antes de su uso. *La mezcla contiene el agente humectante patentado de Sun Gro Horticulture. Este producto nico en su gnero no se lixivia con facilidad, ni sufre descomposicin qumica. Favorece la retencin de la humedad inicial y la del re-humedecimiento de la mezcla lo que reduce en s, las necesidades de agua. Esto da lugar a una disminucin de la prdida de los fertilizantes y permite a la mezcla mantener el nivel de agua necesaria y de manera uniforme, para que desarrollen plantas con un adecuado sistema radicular. Sunshine es sometida a pruebas constantes de control de calidad.

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Anexo 8.2. Evaluacin de los tratamientos 1 y 3 para las variables altura, largo de races y peso fresco. Altura (primera evaluacin) (cm) 20,2 20,275 (*)n.s.

Tratamientos 1 3 Significancia

Altura(segunda evaluacin) (cm) 21,025 21,675 n.s.

Largo de races (cm) 10,5 10,825 n.s.

Peso Fresco (g) 99,7 101,2 n.s.

(*) No existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos.

Anexo 8.3. Evaluacin de las variables altura, peso fresco total, peso fresco y seco de hojas enfermas para los tratamientos 2, 4 y 5. Peso seco hojas Tratamientos enfermas (g) 2 17,2 87,505 83,55a 13,825a 4 18,075 79,8575 36,75b 5,65b 5 18,625 82,9475 46,2b 8,075ab Significancia n.s n.s ** ** ** Letras distintas indican diferencias estadsticamente significativas (p0,05) segn el test Fischer LSD para separacin de medias. Altura (cm) Peso freco total (g) Peso fresco hojas enfermas (g)

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