Seleo, Isolamento e Caracterizao Gentica de Leveduras Provenientes da Vagem da Algarobeira (Prosopis juliflora, Sw, DC) Para Uso em Processos

Fermentativos.
ALVES, M. F.; CAVALCANTI-MATA, M. E. R. M; SCOTTI, M. T. Departamento de Tecnologia Qumica e de Alimentos da Universidade Federal da Paraba. (2009). RESUMO

O caldo resultante da extrao da vagem da algarobeira (Prosopis juliflora, Sw, DC) foi usado como meio de cultivo para o crescimento de leveduras. Esta pesquisa foi desenvolvida com o objetivo de selecionar e isolar linhagens de leveduras com caractersticas alcoolgnicas para uso direto em processos de fermentao. Com base nos princpios biotecnolgicos, inicialmente foram realizados testes de propagao, cujas clulas provenientes da multiplicao, foram submetidas a diluies seqenciais em tubos e destes, para placas de Petri, de onde as leveduras foram criteriosamente selecionadas e isoladas. Foram ento isoladas 5 (cinco) leveduras denominadas ALG-1, ALG-2, ALG-3, ALG-4 e ALG-5, dentre as quais, duas se destacaram na produo de aguardente e lcool, a ALG-3 e ALG-4. Estas foram geneticamente identificadas como sendo dos gneros Saccharomyces e Zigosscharomyces respectivamente. As linhagens selecionadas e isoladas foram testadas em caldo de algaroba objetivando a obteno de bioprodutos como etanol, aguardente e fermento biolgico, sendo este ltimo, comparado com processo de produo tradicionalmente usado nessa linha de fermentao. As leveduras isoladas neste trabalho, ao que parece, so as primeiras deste gnero descritas em regies do semi-rido brasileiro.

Palavras-chave: Seleo, Fermentao, Biotecnologia.

ABSTRACT

SELECTION, ISOLATION AND GENETIC CARACTERIZATION OF YEAST STRAINS FROM THE ALGARROBO (PROSOPIS JULIFLORA, SW, DC) FOR USE IN FERMENTATIVE PROCESS.

ALVES, M.F.; CAVALCANTI-MATA, M. E. R. M; SCOTTI, M. T. Department of Food and Chemical Technology of Federal University Paraba (2009)

The juice resultant of the extraction of algarrobo(Prosopis juliflora, Sw, DC) was used how culture medium for growth of yeast. This research was developed with the objective of select and isole strains of yeast for use direct in alcohol fermentation. Though de microbiologic studies were made cellular propagation where the cells from the multiplication were exposed to serie dilutions in tube and these for Petri plate. With this behaviour the cells were criteriously selected and isoled of the medium. In step, five yeast strains were named ALG-1, ALG-2, ALG-3, ALG-4 and ALG-5. Two these strains, the ALG-3 and ALG-4 showed good performance in production of alcohol and firewater. These strains were genetically characterized with genus Saccharomyces and Zygossacharomyces respectively. The news yeast strains when tested in medium containing algarrobo juice was used in production of alcohol, firewater and yeast with yield comparatively higher than the commercial yeast used traditionally in this process. This work showed to be the first yeasts of this genus described in dried region of brazilian northeast.

Key-words: Selection, Fermentation, Biotechnology

1- INTRODUO Algaroba o nome dado ao fruto da algarobeira, planta largamente difundida e cultivada na regio do semi-rido do Nordeste brasileiro. Cientificamente, pertence famlia Leguminosae, subfamlia Mimosoideae sendo atualmente conhecidas cerca de 44 espcies. A algarobeira uma leguminosa, no oleaginosa que cresce razoavelmente bem nos desertos do continente americano e em alguns desertos africanos, sendo eminentemente xerfila. Trata-se de uma cultura nativa de regies ridas que vo do sudoeste norte-americano at a Patagnia, na Argentina. A espcie predominante no Brasil a Prosopis juliflora, originria do deserto do Piura no Peru. Todavia, outras espcies, ao longo das ltimas dcadas, foram selecionadas para diversos fins, por meio de estudos vinculados a empresas especializadas. Dentre estas, destacam-se principalmente, o Prosopis tamarugo, P. nigra, P. alba e P. chilensis, sendo as duas ltimas, destinadas especificamente fermentativa, conforme BARROS (1982). Esta planta foi introduzida no Nordeste, mais precisamente, na regio do semirido durante a dcada de 1940, onde apesar de algumas controvrsias, se adaptou muito bem a essa regio. As espcies do gnero Prosopis so, em geral, arbustos de tamanho mdio ou no muito raro, rvores de grande porte, que podem atingir uma altura de 20 metros, e seu tronco chega a medir pouco mais de um metro de dimetro. Alm disso, possui uma rede de razes laterais distribudas na superfcie, ligadas a razes pivotantes que penetram solo adentro em busca de guas subterrneas. Outros cultivares no muito comuns, chegam a atingir at 60 metros de profundidade. Essa planta tem se adaptado em reas inspitas onde outras plantas jamais se adaptariam, sendo bem caracterizadas pelas suas razes alongadas, capazes de captar guas a uma profundidade mdia de 30 metros, conforme reportado por AGIDE (1987). Alm das caractersticas peculiares, a sua vagem extremamente rica em protena e carboidratos cujo teor de acares, chega a 45%, em mdia, o que lhe confere o poder bioenergtico. Possuem protena bruta com teores acima de 12%, sendo constituda de protenas digestivas em quase toda sua totalidade, (FIGUEIREDO, 1984), alm de sais minerais. Quanto s dimenses das vagens, no h uma uniformidade em termos de comprimento e largura, em geral, o seu tamanho mdio de 25 cm de comprimento e 1 cm de largura. produo de aguardente e lcool por via

O presente trabalho teve como principal objetivo, pesquisar sobre as potencialidades biotecnolgicas da fermentativos. 2. MATERIAL E MTODOS O presente trabalho foi desenvolvido nos Laboratrios de Biotecnologia e Tecnologia de Alimentos do Ncleo de Pesquisa e Processamento de Alimentos NUPPA da Universidade Federal da Paraba e no Laboratrio de Engenharia Bioqumica da Universidade Federal de Alagoas. As vagens foram selecionadas ps colheita, ao atingir o estdio de maturao fisiolgica, depois submetidas a uma lavagem a quente. A extrao do caldo foi processada a partir da Triturao, Embebio, Infuso e Prensagem das vagens. O material embebido foi prensado a uma presso de 25,5 kgf/cm2. A prensa usada na extrao foi do tipo cilndrica com embolo vertical, Modelo Skay, 331F. Depois de filtrado, lmpido e puro, o caldo foi submetido a uma esterilizao e usado como meio de crescimento. Os procedimentos analticos foram feitos com base no ajuste do Brix,, conforme recomendado por OLIVEIRA (2005). O controle da fermentao foi feito dentro das condies ambientais de cultivo e as anlises de monitoramento, como pH que foi corrigido de 5,2 para 4,5; Temperatura de 28 C e concentrao de substrato na faixa de 25 g/litro na forma de acares redutores totais, A.R.T. e acares totais, A.T. foram feitos com base em procedimentos analticos oficiais da A.O.A.C. (2000). 2.1 Agente fermentativo Foram usadas leveduras selvagens onde o caldo extrado da vagem de algaroba serviu de fonte microbiana 2.2 Preparo dos meios de crescimento e de isolamento Os meios sintticos ou artificiais para o isolamento foram preparados em tubos e placas a partir do meio completo, conforme se segue: Peptona, 10g; Extrato de levedura, 10 g; K2HPO4, 0,5 g; Dextrose, 20 g; Agar, 20 g; gua destilada --------------------------- 1.000 ml pH = 4,5. Esterilizar a 121C / 15 minutos 2.3 Fases de propagao e de isolamento A anlise microbiolgica se restringiu a contagem de unidades formadoras de colnias - UFC, partindo de mtodos de diluio em srie e de transferncia de clulas. A seleo e o isolamento foram feitos a partir da placa contendo menor nmero de colnias possvel. Durante o perodo de 48 a 72 horas, em temperatura controlada a 3 algaroba como fonte de leveduras para uso em processos

32 C, foi desenvolvido o crescimento das culturas em tubos. Essas unidades foram quantificadas em contador de colnias digital, Micronal, Caracterizao e identificao gentica de leveduras da algaroba Para a caracterizao da tipagem gentica das leveduras isoladas, foi usado metodologia de amplificao de DNA por eletroforese, usando como iniciador (GTG) 5 conforme metodologia recomendada por SCAVUZZI (2006), sendo usada como padro, uma levedura do gnero Saccharomyces cerevisiae. modelo 125 LG.

3. Resultados e discusses
3.1. Seleo e isolamento de linhagens de leveduras do caldo de algaroba. O mapeamento agrcola delimitado por microrregies consideradas importantes do ponto de vista de produo do Estado da Paraiba permitiu selecionar a vagem de composio mais adequada para atender o desenvolvimento desta pesquisa. A tabela 1 mostra a composio centesimal dos principais componentes da vagem pesquisada em municpios do semi-rido paraibano. Tabela 1 - Composio centesimal dos principais componentes da vagem de algaroba. Localidade C. Grande Picu S. Branca Patos Sousa Sum PB(%) 10,63 c 7,68 e 11,42 b 12,50 a 9,20 d 8,93 d FB(%) 15,94 a 15,24 c 15,02 d 14,52 e 15,50 b 14,35 f ART(%) 3,21 a 2,58 d 3,05 b 2,86 c 2,30 e 3,10 b ANT(%) 38,14 c 37,34 d 41,30 a 41,20 a 34,00 e 38,74 b AT(%) 41,35 d 39,92 e 44,35 a 44,06 b 36,30 f 41,84 c V.C.T. (*) 361,50 a 331,20 f 349,15 c 343,20 d 342,10 e 358,73 b

PB = Protena Bruta, %, PB (g/100g) x 100 FB = Fibra Bruta, %, FB (g/100g) x 100 ART = Acares Redutores Totais, %, ART (g.glicose/100ml) x 100 ANT = Acares no Redutores, %, ANT (g.sacarose/100ml) x 100 AT = Acares Totais, % (ART + ANT) *VCT = Valor Calrico Total, Calorias Os componentes analisados cujos valores so seguidos das mesmas letras, estatsticamente, no apresentam diferenas significativas. Embora, as vagens de

algaroba coletadas nos demais municpios tenham apresentado valores prximos dos encontrados na literatura, observa-se que estes so significativamente diferentes. A seleo de leveduras selvagens do caldo de algaroba, resultou no isolamento de 5 (cinco) linhagens, assim denominadas: ALG-1, ALG-2, ALG-3, ALG-4 e ALG-5, cujas culturas foram mantidas sob refrigerao a 4C de acordo com as tcnicas

usuais de conservao (SETTE, 2003). Dentre as 5 (cinco) leveduras selecionadas, 2 (duas), a ALG-3 e ALG-4 se destacaram em testes preliminares, para uso em processos de fermentao ligados produo de aguardente, lcool e fermento. Os aspectos fsico e microbiolgico, como formao de espumas e formas de reproduo assexuada mostraram que as linhagens de leveduras provenientes do caldo de algaroba tem todas as caractersticas e o mesmo comportamento daquelas ligadas ao gnero Saccharomyces. Por outro lado, as culturas de leveduras onde o meio

completo YEPD (Extrato de lvedo, peptona e dextrose) foi acrescido de caldo algaroba, mostraram boas perspectivas de crescimento tanto em placas, quanto em tubos de ensaio, o que comprova uma melhor adaptao das leveduras com o meio. As linhagens caracterizadas pelas suas particularidades como, a forma de

reproduo, o aspecto morfolgico associado a presena de clulas-filhas observada a todo instante, foram suficientes para comparar as atividades fermentativas dessas clulas. Os 5 (cinco) isolados referentes a amostragem da linhagem ALG-03 foram identificadas como sendo Saccharomyces cerevisiae e as 5 (cinco) da ALG-4 como No-Saccharomyces. Na Tabela 2 pode ser visto, a identificao e a tipagem gentica das linhagens ALG-3 e ALG-4, isoladas do caldo de algaroba. Tabela 2 - Amplificao de DNA iniciador (GTG)5 Isolado ALG3 01 ALG3 02 ALG3 03 ALG3 04 ALG3 05 ALG4 06 ALG4 07 ALG4 08 ALG4 09 ALG4 10 Morfologia da colnia Rugosa e pequena Rugosa e pequena Rugosa e pequena Rugosa e pequena Rugosa e pequena Lisa e pequena Lisa e pequena Lisa e pequena Lisa e pequena Lisa e pequena Tipagem Gentica Saccharomyces cerevisiae P1 Saccharomyces cerevisiae P1 Saccharomyces cerevisiae P1 Saccharomyces cerevisiae P1 Saccharomyces cerevisiae P1 No- Saccharomyces cerevisiae No- Saccharomyces cerevisiae No- Saccharomyces cerevisiae No- Saccharomyces cerevisiae No- Saccharomyces cerevisiae

As linhagens at ento pesquisadas, apresentaram especificidades intimamente ligadas s leveduras selvagens como rugosidades e bordas irregulares, diferentemente das leveduras puras que apresentam bordas regulares e lisas. A fluorescncia observada a partir da levedura padro localizada na parte central, apresentada na Figura 1-b, mostra

da esquerda para direita, a semelhana e igualdade da levedura pura com as leveduras selvagens denominadas ALG-3. A Figura 1 mostra a identificao das leveduras selecionadas e isoladas.

b a b Figura 1 - Levedura Saccharomyces cerevisiae padro (a) Tipagem gentica das leveduras selvagens do caldo de algaroba (b)

Em ltima anlise, pode-se constatar que se trata de leveduras do mesmo gnero pela similaridade do aspecto apresentado. A tipagem gentica da linhagem ALG-3, pelas caractersticas fisiolgicas apresentadas, apenas confirmou que as leveduras observadas ao microscpio, eram realmente do gnero Saccharomyces. O mais importante que a espcie desse gnero, ficou evidenciada por meio de anlise de amplificao de DNA. Esta anlise, permitiu conferir, a caracterizao gentica da linhagem ALG-3 pesquisada. As No-Saccharomyces foram identificadas posteriormente como sendo do gnero Zygossaccharomyces. A identificao dessas linhagens, comprovou tambm o que havia sido observado experimentalmente, em relao a produo de aroma e sabor agradvel durante o processo de fermentao. Leveduras com estas caractersticas so encontradas comumente nas fermentaes com grau alcolico abaixo de 7 GL e, quando se tem uma acidez total acima do normal. Essas caractersticas so observadas nos processos que usam caldo de cana irrigada com vinhaa e/ou quando a cana atacada pela cigarrinha, (RAMALHO NETO, 2005). As linhagens denominadas ALG-4, pelas caractersticas apresentadas, so da espcie Zigossaccharomyces mellis. Esta levuriforme encontrada geralmente em zonas litorneas e vrzeas, de acordo com SCAVUZZI (2005). Surpreendentemente, o

resultado da identificao gentica da linhagem ALG-4, dentro das amostras analisadas, mostrou a possibilidade de que sejam as primeiras leveduras desse gnero, descrito em regies do semi-rido brasileiro. O cultivo in vitro das linhagens ALG-3 e ALG-4, j na forma de cultura pura, preservada sob refrigerao, apresentou todas as caractersticas possveis, como

crescimento e viabilidade celulares dentre outras, para uso direto em processos fermentativos. A Figura 3 mostra a viabilidade celular da linhagem ALG-3 isolada da vagem de algaroba ao longo de 4 meses.
0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 94,45 88,61 81,55 76,8 71,2 1 2 3 4

meses

Figura 2 Viabilidade celular da linhagem ALG-3 Em sintese, pode-se observar que as linhagens de leveduras pesquisadas a partir do caldo de algaroba apresentaram elevada viabilidade celular durante um perodo de 4 meses, cujas culturas, de acordo com testes comprobatrios em nvel de bancada, so passveis de aproveitamento em processos de fermentao.

5. CONCLUSES
Como a pesquisa teve como finalidade: a seleo e isolamento de leveduras, pode-se concluir que: O caldo de algaroba, diante das suas condies nutricionais o conferem como caldo nutriente, podendo ser considerado um meio de cultivo natural alternativo, comparvel aos usados tradicionalmente nos processos de fermentao; As leveduras selecionadas e isoladas do caldo de algaroba pelo que pde ser identificado geneticamente so dos gneros Saccharomyces e Zigossaccharomyces, tendo ambas fermentao; funes distintas, e que podem ser usadas nos processos de

As leveduras isoladas do caldo de algaroba, de acordo com os resultados apresentados em testes de bancada, podem ser aplicadas a sistemas de bioproduo que envolvam processos fermentativos. 6. RECOMENDAES E SUGESTES 1 Como as culturas apresentaram crescimento e viabilidade elevada,

recomenda-se que essas culturas sejam liofilizadas como forma de preservar melhor as caractersticas originais desse produto; 2 Sugere-se que as leveduras isoladas, sejam estudadas e testadas em microescala para que sejam avaliados os parmetros cinticos e operacionais assim como os custos de produo.

7- RERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AGIDE, G. N. Consideraes sobre a algaroba. Coletnea do Instituto de Tecnologia de Alimentos. Campinas, v.17, n.1, p.1-27 Jan./Jun., 1987. AMORIM, H. V. Seleo e identificao de leveduras do caldo de cana de acar. Revista Fermentec News. Piracicaba, SP, v.1, p.1-12, 2005. ANDRIETTA, M. G. S.; RODRIGUES, M. I. Controle da fermentao alcolica atravs de testes microbiolgicos e bioqumicos. Faculdade de Engenharia de Alimentos/Unicamp 2005 Disponvel em: http://www.fea.unicamp.br/extensao. Acesso em: 2005. ARAUJO, A.N. Biotecnologia: Tecnologia baseada nas clulas e em molculas biolgicas. Revista Cincia e Tecnologia Jovem. Ministrio da Cincia e Tecnologia, Novembro, 2005. ARAUJO, A.N. Biotecnologia: Tecnologia baseada nas clulas e em molculas biolgicas. Revista Cincia e Tecnologia Jovem. Ministrio da Cincia e Tecnologia, Novembro, 2005. BASSO, L. C.; AMORIM, H. V.; OLIVEIRA, A. J. Acompanhamento e seleo de leveduras do processo fermentativo pela tcnica de cariotipagem. In: ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA LUIZ DE QUEIROZ. Relatrio Anual de Pesquisa em Fermentao Piracicaba. 1995. p.1-46 CARL-GRAN, H.; ILLNI, T. New approaches to the identification of microorgnisms. Stockholm: Techniques in Pure and Applied Microbiology. Karolinska Institute, 1980. 102p. CHANG, L. T.; ELANDER, R. P. Long-term preservation of industrially important microorganisms. In: DEMAIN, A.L.; SOLOMON, N. A., (Ed) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Washington: CRC Press, 1996. Cap.5, p.49-55. 8

ESTRELA, C.; PCORA, J.C. Caracterizao de microrganismos. Brazilian Journal of Food Technology. v.3, n.11, p.1-6, 2003. Disponvel em: http://www.livronline.com/ servios. Acesso em: 16 de Novembro de 2006. OLIVEIRA, E. G. Isolamento de leveduras selvagens de vagens da algarobeira. Macei, AL 2003, 12p. ( Informativo do Centro de Tecnologia da Universidade Federal de Alagoas UFAL) RAMALHO NETO, C. E. Caracterizao e identificao gentica de leveduras Saccharomyces cerevisiae usada na produo de lcool. Macei, AL , 2005. 21p. (Informativo Laboratrio de Biotecnologia Avanada da UFAL) SETTE, L. D. Tcnicas de Preservao de Microrganismos. Campinas, SP 2003. 21 p. (Informativo CBMAI-CPQBA/UNICAMP).http://www.cpqba.unicamp.br SCAVUZZI, J. A. Cariotipagem de Leveduras Oriundas da Fermentao Alcolica. Recife, 2007, 21p. (Boletim Bioprodutividade/Incubao e Inovao Tecnolgica).