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BIOTECNOLOGÍA
APLICADA
7ª Edición
ÍNDICE
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Proteómica y Medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
2
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción
INTRODUCCIÓN
U
n año más nos complace presentar una nueva edición
del curso de Biotecnología Aplicada. La buena acogi-
da y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos
previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta
edición.
El rápido avance que durante los últimos años han experi-
mentado nuestros conocimientos en los múltiples campos de la
Biología y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una infor-
mación abundante y crítica que crece de manera exponencial. Nunca anterior-
mente habíamos podido observar, desde una perspectiva tan múltiple y diversa,
el complejo escenario existente en la investigación y el desarrollo de nuevos
tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora más que
nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para la consecución
de nuevos tratamientos eficaces y seguros.
La búsqueda de nuevas aproximaciones en investigación y desarrollo se ha
beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre
las que la Biotecnología brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por pri-
mera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulación genéti-
ca los compuestos deseados y crear o modificar nuevos fármacos, siguiendo un
diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas.
Los productos biotecnológicos han pasado de ser una parte minoritaria en
el arsenal terapéutico, a ser cada vez más indispensables en el tratamiento de
millones de pacientes. Gracias a esta incorporación de la Biotecnología a la
práctica clínica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy día tratadas con
éxito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus
tareas cotidianas.
La Biotecnología alcanza hoy múltiples campos de la investigación médi-
ca, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. Así ha ocurrido
por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dia-
nas celulares, en la potenciación de proteínas naturales y en la mejora de trata- 3
mientos previos biotecnológicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili-
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción
dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologías que han permitido de-
sarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeñas moléculas de síntesis
química que actúan sobre múltiples dianas terapéuticas.
La Biotecnología ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que
puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre to-
das las partes implicadas hace de la buena combinación de esfuerzos y siner-
gias entre todas estas partes el factor, probablemente, más importante para se-
guir avanzando. El reto está en potenciar la innovación y la defensa de la
calidad de los productos biotecnológicos. Sólo a través de la continua y estre-
cha interacción entre los diferentes sectores de la investigación, tanto públicos
como privados, con profesionales del ámbito clínico, será posible encontrar
nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro país logre ser puntero en
este sector, todo ello deberá estar potenciado por un ambiente de apoyo a la in-
novación dentro del marco macroeconómico.
En el marco de esta colaboración, el Curso de Biotecnología Aplicada en
su 7ª edición que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que pro-
fesionales de diversos sectores: centros de investigación, farmacia hospitalaria,
clínicos y la industria biofarmacéutica se reúnan en una plataforma de forma-
ción sobre los aspectos más relevantes ligados con la investigación biotecnoló-
gica, especialmente desde el punto de vista más básico y técnico en busca de
nuevas perspectivas y aplicaciones prácticas de la investigación biotecnológica,
y explorar las nuevas líneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nue-
vas opciones terapéuticas de relevancia científica y clínica.
Agradecemos su interés por esta nueva edición del curso y esperamos que
encuentren esta iniciativa útil y provechosa.
4
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
SNPs
CGH-Arrays
PCR CUANTITATIVA
usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja
reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso
como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contra-
er enfermedades específicas17,18.
APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
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13
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Proteómica y Medicina
PROTEÓMICA Y MEDICINA
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
INTRODUCCIÓN
PROTEÓMICA CLÍNICA
Identificación de biomarcadores
Los fundamentos del SIMS-TOF Imaging son muy semejantes a sustituye por una fuente
de iones (bismuto) y que
los descritos anteriormente para MALDI Imaging, siendo la princi-
las moléculas liberadas del
pal diferencia las fuentes de ionización. Los iones primarios se gene- tejido corresponde a
ran utilizando un dispositivo denominado "liquid metal ion gun", compuestos de bajo peso
siendo seleccionados los clústeres de iones incidentes en base a su molecular (<2000 Da). No
masa y carga, focalizándolos en la muestra. El impacto de los iones es necesario aplicar la
primarios en cada punto de la muestra (corte de tejido) genera iones matriz sobre el tejido.
de la misma (secundarios), que son extraidos mediante un campo
eléctrico entre la muestra y las lentes de extracción. Cuando los iones secunda-
rios alcanzan el detector son convertidos en señales digitales y representados
en forma de un espectro de masas para cada posición de la superficie de la
muestra (x,y). Para cada ion detectado se puede representar su intensidad a lo
largo del tejido en forma de imagen tridiemensional, mostrando su abundancia
relativa, utilizando el mismo software que en el MALDI Imaging (Figura 7).
Con lo expresado hasta aquí, parece obvio que la proteómica clínica debe
llevarse a cabo por equipos multidisciplinares, con médicos clínicos y anato-
mopatólogos, químicos de proteínas, expertos en MS, bioinformáticos, farma-
cólogos, etc. Con frecuencia, los análisis proteómicos proporcionan una avalan-
cha de datos de difícil evaluación. Una de las funciones esenciales de los
equipos multidisciplinares es la priorización de patrones candidatos que han de
ser validados. La fiabilidad de los datos, avalados en las bases de datos, su po-
tencial valor clínico y un riguroso análisis bioinformático, son algunos de los
29
criterios que deben seguirse en la priorización.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Proteómica y Medicina
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30
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
INMUNOTERAPIA HUMORAL
Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
INTRODUCCIÓN
ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS
Neoplasias hematológicas
dad, siendo algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e
intermedio, las respuestas fueron de un 30% con independencia de la dosis em-
pleada. En combinación con quimoterapia CHOP, el índice de respuestas es
mayor del 90% con hasta un 55% de respuestas completas de larga duración.
Es importante resaltar que pacientes con translocacion del gen blc2 negativiza-
ron dicho marcador en sangre medido por PCR. En pacientes ancianos, el trata-
miento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad
al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamien-
to combinado de rituximab y fludarabina resultó en un 93% de respuestas glo-
bales, con una duración de más de 14 meses. Una observación importante en el
desarrollo clínico del rituximab es que la presencia de células CD-20 positivas
circulantes puede afectar a la actividad del fármaco, actuando como un santua-
rio en el que se deposita el anticuerpo, pudiendo necesitar dosis más altas del
mismo. De hecho, en otros estudios se ha observado una relación entre niveles
séricos del anticuerpo y actividad clínica, de forma que pacientes con enferme-
dad avanzada puedan necesitar una dosis de anticuerpo más alta. En casos oca-
sionales, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la prolifera-
ción de poblaciones linfocitarias sin expresión del antígeno. En estas
situaciones se puede considerar la combinación de este agente con otros fárma-
cos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores sólidos
sultó ser superior a cetuximab sólo en pacientes con cáncer de colon avanzado
que habían progresado al tratamiento con irinotecan. El fármaco tiene también
actividad en otros tumores tanto como agente único como en combinación con
quiotereapia y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demos-
trado que este fármaco tiene actividad como agente único en pacientes con tu-
mores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición de cetuximab al tratamiento
con quimioterapia basada en platino en pacientes con carcinoma de cabeza y
cuello resistentes a esta quimioterapia resultó en un aumento de las respuestas
objetivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinación de cetuximab con
radioterapia resultó superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con
este fármaco cutanea y se manifiesta como acne. En estudios clínicos se ha ob-
servado, de forma muy interesante que los pacientes que desarrollan toxicidad
cutanea tienden a evolucionar mejor.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico es panitumumab.
Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual dis-
minuye la indicencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio
fase III en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con qui-
mioterapia, el panitumumab resultó en un aumento significativo en el tiempo a
la progresión frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobación clí-
nica de panitumumab para pacientes con carcinoma de colon refractario a qui-
mioterapia.
Edrecolomab: El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce el antígeno Ep-
CAM. El anticuerpo desarrollado clínicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a
observaciones preclínicas que indican una mayor actividad del anticuerpo
cuando se combina con citokinas como interferón, interleukinas y factores de
crecimiento hematopoyéticos, este anticuerpo se ha desarrollado en combina-
ción con estos otros agentes. Los estudios clínicos realizados con esta molécula
han dado resultados conflictivos. La combinación con citoquinas ha resultado
en mejores respuestas inmunólogicas, pero no en mejores respuestas clínicas.
Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cáncer de colon demostra-
ron un aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al
control. Estudios posteriores en pacientes con estadio II de cáncer de colon y
36 en combinación con quimioterapia en pacientes con estadio III no han confir-
mado dicha actividad.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Inmunoterapía humoral
RADIOINMUNOTERAPIA
Radioinmunoconjugados
CONCLUSIONES
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
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39
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?
Figura 2. Figura 4.
Figura 5. Figura 6.
Figura 7. Figura 8.
las células renales por los linfocitos T alogénicos (Figura 5). Como dichos
linfocitos expresan CD25 para su expansión (Figura 6), el tratamiento los
elimina eficazmente sin dañar a otros linfocitos T. Los linfocitos T, en es-
te caso autorreactivos, son los responsables de la síntesis de un importante
mediador de la inflamación (TNFα) en patologías autoinmunitarias como
la esclerosis múltiple (Figura 7) o la artritis reumatoide. Es dicho media-
dor el que bloquean los anticuerpos anti-TNFα, que tanto éxito han tenido
en esta enfermedad. En realidad, los mecanismos implicados en la inmu-
noterapia de la aloreactividad podrían aplicarse a todas las inmunopatías
(Figura 8), ya que en todas existen linfocitos "malos" (alo, auto o alerre- 43
activos).
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
44
Figura 11. Figura 12.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
45
Figura 14. Figura 15.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Introducción a la inmunoterapia celular
46
Figura 17. Figura 18.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 19.
Figura 20.
este control permitiendo la proli-
feración de los linfocitos B in-
fectados, que con el tiempo pue-
Figura 21. den acumular mutaciones que
los hacen tumorales (Figura 20). La Figura 21 explica el mecanismo de las vacunas
antitumorales con idiotipos del BCR del linfoma, que se convierten por sobreex-
presión en antígenos tumorales (de distribución mucho más restringida que CD20,
por cierto, y por tanto mucho más específicos). Sin embargo, pocas veces hay un
buen antígeno tumoral (ver último párrafo del siguiente apartado).
Figura 23.
Figura 22.
Figura 24.
Linfocitos alogénicos
alogénicos, que son los responsables de la reacción injerto contra huésped en los tras-
plantes de médula no purgada de linfocitos. Esta reacción es más peligrosa que la re-
acción alogénica de los linfocitos T del receptor contra el injerto de médula y su pro-
genie (que puede provocar el rechazo del injerto), ya que puede comprometer la vida
del receptor. Por esa razón se suele purgar la médula alogénica con monoclonales an-
ti- CD2, CD3, CD5, CD7 o CD52 en el caso de pacientes sin cáncer. Pues bien, esa
misma actividad anti-huésped aparentemente indeseable es la responsable del efecto
injerto contra leucemia, que elimina con efectividad a todas las células tumorales por
razones alogénicas, las mismas que operan en el rechazo renal (Figura 27), pero aho-
ra dirigidas contra el tumor. Este efecto antitumoral de las células T alogénicas ha si-
do claramente demostrado en dos enfermedades: leucemia mieloide crónica (CML) y
la enfermedad linfoproliferativa de linfocitos B inducida por el virus de Epstein-Barr
(EBV). Pero, en este caso, la razón por la que el
tumor es eliminado es porque, en realidad, no
es propio. También se ha demostrado el efecto
beneficioso del rechazo del huésped en algunas
enfermedades autoinmunitarias (Sykes 2005).
50
Figura 31. Figura 32.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
Figura 36.
Figura 35.
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Introducción a la inmunoterapia celular
55
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
INTRODUCCIÓN
59
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qué enfer-
medades se beneficiarán de la nueva técnica y cuándo será posible su aplica-
ción.
En primer lugar, las células ES de ratón forman teratocarcinomas al ser
implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema
desaparece si se implantan después de su diferenciación total o parcial in vitro,
por lo que cualquier protocolo de transferencia de células ES deberá incluir un
paso previo de diferenciación in vitro.
Un segundo problema para la aplicación terapéutica de las células ES re-
side en la dificultad de obtener células diferenciadas a un linaje celular puro.
Cuando se estimula su diferenciación, las células ES son capaces de originar
60 cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homogénea, sino
que dan lugar a poblaciones de células en que se mezclan distintos tipos es-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
simple o por clonación, no sería eficaz. Por otro lado, el trasplante de célu-
las sanas ajenas plantearía los problemas de rechazo antes mencionados. De
nuevo, el modelo experimental de ratón ofrece una posible solución idónea
a este problema. La tecnología de células ES en el ratón se ha explotado
fundamentalmente como una vía para la producción de animales modifica-
dos genéticamente14,15. La repercusiones de esta aplicación han sido, y se-
rán en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de
modelos de ratón que reproducen patologías humanas como el cáncer, la es-
clerosis múltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cómo
los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el orga-
nismo. Gracias a esto, las técnicas de modificación dirigida del genoma del
ratón se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar
de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustitu-
ciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etc…El poten-
cial terapéutico de estas aproximaciones sería extraordinario en el caso de
que se pudieran aplicar a la reparación del genoma en células ES humanas.
La reparación genética mediante estas técnicas representaría la terapia géni-
ca idónea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de añadir material
genético de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genéticas se
han realizado extensivamente en células ES de ratón, pero se pueden reali-
zar en cualquier línea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no
se ha tenido éxito al intentar aplicarlas en células troncales humanas, ya sea
adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas técnicas en
células troncales, existiría un argumento añadido en favor de la utilización
de la clonación terapéutica, ya que se podría realizar la corrección genética
en una línea establecida de células somáticas y utilizar sus núcleos como
donadores para obtener, primero blastocistos y luego células troncales co-
rregidas. En un experimento paradigmático, que supera todas las limitacio-
nes previsibles a la aplicación terapéutica de las células ES16, se han com-
binado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artículo para
sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutación en el gen Rag-2.
Mediante biopsia, se obtuvieron núcleos celulares de los ratones adultos in-
munodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos genética-
mente idénticos al ratón original. Posteriormente, de estos blastocistos se
62 derivaron células ES y se corrigieron por modificación dirigida, reparando
el defecto en el gen Rag-2. A continuación, se utilizó una combinación de
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Células embrionarias pluripotentes
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En resumen, la disponibilidad de células ES humanas representa un gran
avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a
su proceso de diferenciación. De manera inmediata, representan un modelo
excelente para el estudio de los procesos de generación de diversidad celular
en nuestro organismo y para la caracterización de fármacos que puedan diri-
girlos. Los resultados de los ensayos terapéuticos realizados en animales mo-
delo permiten pensar en la aplicación a corto/medio plazo de la tecnología
de células troncales embrionarias en terapia humana. Una de las
perspectivas más prometedoras en este campo es la combinación
del uso de células troncales embrionarias con la reparación genó- Figura 3. Esquema
mica dirigida, lo que representaría la terapia génica ideal. En cual- propuesto para la
aplicación de nuevas
quier caso, existen limitaciones técnicas a la aplicación terapéutica
estrategias en terapia
de las células troncales embrionarias que impiden determinar con
celular.
certeza qué enfermeda-
des se van a beneficiar
de las nuevas terapias y
en qué plazos. La com-
binación de la tecnolo-
gía de células troncales
embrionarias con la clo-
nación terapéutica per-
mitirá, al menos, elimi-
nar los problemas de
rechazo, y además, pue-
de ser esencial para
conseguir la reparación
genómica dirigida (Fi- 63
gura 3).
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Células embrionarias pluripotentes
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
INTRODUCCIÓN
CÉLULAS MADRE
Se conoce desde hace muchos años que distintos tejidos del organismo tienen
la capacidad de auto-regenerarse, gracias a la existencia de células madre residen-
tes en dichos tejidos. Estas células madre obtenidas de tejidos adultos poseen las
dos características de auto-renovación y diferenciación que hemos mencionado
anteriormente. Sin embargo, a diferencia de las células madre embrionarias, se
considera que su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación es signi-
ficativamente menor9. Se han identificado células madre adultas en la médula
ósea, músculo esquelético, epidermis, intestino, testículo, hígado, y de forma más
reciente en tejidos como el sistema nervioso central o el corazón.
Las células madre adultas se consideran multipotenciales, es decir, capaces
de diferenciarse a un número limitado de tejidos, principalmente en función de
su origen embrionario (células de origen mesodérmico pueden diferenciarse a te-
jidos derivados mesodérmicos etc.). Sin embargo, cada vez parece más evidente
que las células madre adultas son capaces de generar células maduras de tejidos
derivados de capas embrionarias distintas, siendo el caso más típico el de las cé-
lulas madre hematopoyéticas capaces de diferenciarse a hepatocitos, músculo
cardíaco, endotelio o incluso a tejidos derivados de las tres capas embrionarias9-
12. Este fenómeno, denominado versatilidad o capacidad de transdiferenciación
de las células madre adultas no está exento de controversia, ya que mientras al-
gunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientes cuestionan la existencia de esta
capacidad de transdiferenciación de las células, justificando algunos de los ha-
llazgos de versatilidad en función de fenómenos de fusión celular13,14 o incluso
cuestionando abiertamente los resultados experimentales15.
Las células madre tienen un enorme potencial como células capaces de re-
construir las neuronas y estructuras dañadas en enfermedades como la enferme-
dad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, es-
clerosis en placas, infartos cerebrales o las lesiones medulares, por mencionar
algunas. El sistema nervioso central añade una dificultad adicional a la terapia
celular. Al ser un órgano con una sofisticada organización estructural, las célu-
las implantadas han de ser capaces no sólo de injertarse, sino también de esta-
blecer nuevas conexiones sinápticas e integrarse con el resto del tejido circun-
dante.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa
que afecta a más del 2% de la población mayor de 65 años. Se caracteriza por
una degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia ne-
gra20 que origina la aparición de los signos y síntomas característicos de la en-
fermedad. A pesar del tratamiento farmacológico, la evolución de la enfermedad
conlleva complicaciones motoras y psiquiátricas que disminuyen la calidad de
vida de los pacientes y dificultan su manejo clínico. La utilización de células
con capacidad de sintetizar y liberar dopamina y restablecer los circuitos neuro-
nales dañados se perfila como nuevas expectativas en el tratamiento de la EP21.
En la EP se han utilizado células de origen fetal en ensayos clínicos en humanos
con resultados cuando menos controvertidos22,23. Estudios in vitro e in vivo han
demostrado que tanto las células madre embrionarias como las adultas (células
madre de médula ósea, células madre neurales) son capaces de diferenciarse a
neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, no está claro hasta que punto dichas cé-
lulas son capaces de restablecer los circuitos neuronales destruidos en la EP y,
por tanto, eliminar los síntomas de la enfermedad.
Las lesiones medulares, principalmente secundarias a traumatismos, son
una de las causas más frecuentes de patología neurológica en edades jóvenes.
70 No existe un tratamiento curativo para esta enfermedad incapacitante, por lo
que la posibilidad de utilizar células madre para restablecer las conexiones axo-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
La visión, junto con los otros sentidos, provee la relación con el mundo
exterior, y es de gran valor para la supervivencia de muchas especies animales
y tiene un gran valor para los hombres. A pesar de su importancia, sólo en al-
gunas especies de anfibios se conserva una capacidad de regeneración impor-
tante de los tejidos del ojo. Es, por tanto, de gran valor conocer en profundidad
los distintos tipos de células madre del ojo y sus mecanismos de renovación y
regeneración, para intentar terapias capaces de recuperar los distintos tejidos
oculares que se pueden dañar. Las estructuras que tienen más interés desde el
punto de vista de la Medicina Regenerativa son el epitelio corneal, el epitelio
conjuntival y la retina.
La fuente de células del epitelio corneal son las células madre que se en-
cuentran en la región del limbo corneal. Estas células, que se encuentran en la
zona de transición entre la córnea y la esclera, tienen todas las características
de las células madre, ya que poseen una gran capacidad de renovación, que se
mantiene a lo largo de la vida y son capaces de originar células hijas que pue-
den sufrir un proceso de diferenciación terminal a células especializadas (64).
Sin embargo, no se ha podido demostrar que estas células sean pluripotentes y
parece que sólo dan lugar a células del epitelio corneal y conjuntival. Actual-
mente no existe un marcador biológico definitivo de las células madre del lim-
bo corneal, aunque se han propuesto varios, como la alfa-enolasa, y más re-
cientemente el factor de transcripción p63, aunque ciertamente estos antígenos
pueden aparecer en otras células65.
En condiciones fisiológicas, las células madre del limbo corneal son capa-
ces de suplir la necesidad de renovación de la córnea. Sin embargo, en algunas
75
situaciones patológicas, como traumatismos, quemaduras, sustancias químicas,
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
estudios in vivo que hayan podido demostrar la eficacia de las células embrio-
narias en la regeneración hepática, existiendo además el problema de la genera-
ción de tumores a partir de dichas células embrionarias77.
La posibilidad de regenerar tejido hepático con células madre hematopoyéti-
cas se describió por primera vez por el grupo de Petersen78 en el que observaron
la contribución de células de médula ósea a la regeneración del hígado a través
de la diferenciación hacia células ovales. Utilizando un modelo de ratón transgé-
nico análogo a la tirosinemia humana tipo I, Lagasse demostró la capacidad de
las células madre hematopoyéticas de rescatar animales con dicha enfermedad,
con la consiguiente implicación clínica79. Aunque como ya hemos comentado no
existen estudios clínicos, sí que existen observaciones en pacientes sometidos a
trasplante de médula ósea en los que se ha podido demostrar que células deriva-
das del donante son capaces de adquirir características de células hepáticas, apo-
yando en humanos las observaciones de Lagasse y Petersen. La principal limita-
ción de estos estudios es que datos posteriores, obtenidos por diversos grupos de
investigación, sugieren que la mayor parte de los fenómenos de regeneración he-
pática, observados a partir de células madre hematopoyéticas, se deben realmente
a la capacidad de fusión de las células trasplantadas con los hepatocitos existen-
tes en el animal, y por tanto no a una auténtica transdiferenciación80. Aunque el
mecanismo que contribuye a la regeneración de los hepatocitos es de indudable
interés desde el punto de vista biológico, el hecho de que se trate de fusión celu-
lar o de auténtica transdiferenciación no disminuye su interés desde el punto de
vista clínico. Es decir, incluso en el caso de que las observaciones experimentales
de regeneración hepática se debieran mayoritariamente a fusión celular, sería po-
sible que resultaran clínicamente beneficiosas en pacientes.
La existencia de un compartimento hepático de células madre ya se sugi-
rió hace mas de 40 años81. Las células ovales fueron las primeras candidatas a
células madre hepáticas. Localizadas en los canales de Hering, son células ma-
dre multipotenciales capaces de diferenciarse a hepatocitos así como a epitelio
ductal, y poseen algunos antígenos comunes con células de médula ósea. Sin
duda esta población celular tiene cierta capacidad de regeneración hepática, pe-
ro a día de hoy permanece sin definir si realmente su origen está en el hígado
o, por el contrario, derivan de células de la médula ósea.
Estudios recientemente publicados sugieren que una población de células ma-
80 dre bien caracterizada, como las células madre mesenquimales, pueden contribuir a
la regeneración hepática. Como hemos mencionado anteriormente, la principal fuen-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
CONCLUSIONES
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
87
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
INTRODUCCIÓN
El término célula madre o célula troncal (stem cell) se utiliza para definir una
célula indiferenciada con capacidad de autorregeneración que, a su vez, puede dar
lugar a diferentes líneas de células especializadas. Es decir, son células con capa-
cidad de división asimétrica (Fig. 1). Se describieron inicialmente en el embrión y
son el origen de todas las líneas celulares somáticas y germinales que conforma-
rán el nuevo organismo (células madre embrionarias totipotenciales); desde el año
2001 se están describiendo células con características semejantes en diferentes te-
jidos del organismo adulto (células madre adultas) (Silvester et al 2004).
Se conoce como terapia celular al método que intenta curar enfermedades 89
con el uso de células vivas. El concepto de Medicina Regenerativa sugiere la
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
posibilidad de obtener
Autorrenovación en el laboratorio, a
partir de las células
madre, órganos con
todas sus funciones.
Sin embargo, existen
todavía barreras im-
portantes en este cam-
Célula madre
po; algunas de ellas
son puramente técni-
cas o de laboratorio
(desarrollo de mejores
Célula diferenciada procedimientos de se-
lección y cultivo de
Figura 1. Representación
células) y otras son las barreras que podríamos llamar fisiopatoló-
esquemática del concepto
de reproducción
gicas o médicas (como la posibilidad de inmunotolerancia de las
asimétrica que caracteriza células. Salvar este problema de inmunotolerancia supondría poder
a las células madre. realizar trasplantes celulares alogénicos sin necesidad de inmuno-
supresión).
En este artículo se intentará contestar a dos preguntas que resultan funda-
mentales para evaluar en qué momento se encuentra actualmente la terapia re-
generativa:
–¿Qué tipo de células madre son mejores para el uso terapéutico en humanos?
–¿Cuáles son los últimos avances en terapia regenerativa en humanos?
nias se ha visto asociado a efectos secundarios que aún hoy son difíciles de
predecir. El problema es que para obtener poblaciones celulares de la médula
ósea es necesario realizar varias punciones bajo anestesia, que comportan mo-
lestias y riesgos.
Desde 1980 ha sido posible movilizar estas células a la sangre periférica
donde pueden ser recogidas por aféresis, un procedimiento que es más prácti-
co, menos doloroso y asociado a menor riesgo que las punciones (Lewis et al.
2005). Por otro lado, se ha comunicado que las células madre procedentes de
sangre periférica desarrollan el injerto de neutrófilos y plaquetas más rápida-
mente reduciendo el riesgo de infección o hemorragia en el tratamiento de la
enfermedad hemato-oncológica.
El transplante de células de cordón umbilical en adultos presentan las si-
guientes ventajas respecto a las derivadas de médula ósea (Chao et al. 2004): 1.
Fácil disponibilidad (se pueden tener en depósito perfectamente testadas y con
la tipificación de HLA para su uso inmediato); 2. No existe riesgo para madres
y donantes; 3. Posibilidad escasa de transmitir infecciones, particularmente ci-
tomegalovirus; 4. Pocas posibilidades de desarrollar enfermedad de injerto con-
tra huésped; 5. Criterios menos estrictos para el cruce de HLA; 6. El donante
no sufre una agresión. Este tratamiento se ha utilizado sobre todo en enferme-
dades hematológicas como leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o sín-
dromes mielodisplásicos. El transplante de células madre del cordón umbilical
expandidas ex vivo está todavía en experimentación.
El crecimiento y la regeneración del músculo tras una agresión del mismo
denotan la existencia de células musculares progenitoras en este órgano (Jan-
kowski et al 2004). Se ha defendido la idea de que la miogénesis es atribuible
a precursores musculares circulantes, habiéndose demostrado en algunos traba-
jos que esta labor la realizan células madre dependientes del músculo y tam-
bién de la médula ósea. Esta vía sistémica todavía se encuentra en investiga-
ción, ya que no se ha logrado evitar las pérdidas celulares para conseguir que
las células cumplan su objetivo. En cualquier caso, la biopsia muscular se ha
mostrado como una buena fuente de células madre (Herreros et al 2003).
El tejido adiposo, como la MO, deriva de la hoja embrionaria mesodérmi-
ca y contiene estroma que puede ser aislado fácilmente. Aquí se han identifica-
do células madre denominadas células madre derivadas de lipoaspirado
92 (CMDL) (Zuk et al. 2001 y 2002). El proceso de aislamiento de esta población
de células madre fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964. Más tarde
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
el procedimiento fue
mejorado por varios
grupos de investiga-
ción y, finalmente, las
células fueron caracte-
rizadas como células
madre por el equipo
de Hedrick del "Labo-
ratorio de Bioingenie-
ría y Reparación Rege-
nerativa" del Servicio
de Cirugía de la Uni-
versidad de California
de Los Ángeles (Zuk
et al. 2001).
Figura 2. Células
Estas células, al igual que las células madre mesenquimales de
mesenquimales
la MO, pueden evolucionar hacia líneas osteogénicas, adipogéni- procedentes de
cas, miogénicas y condrogénicas. Lo más sorprendente es que tam- lipoaspirados en cultivo.
bién pueden diferenciarse en células de características neuronales
(Ashjian et al. 2003). Muestran una caracterización muy similar a
las derivadas de MO (CD29, CD44, CD71, CD90, CD13, CD105, SH-3 y
STRO-1) pero también algunos marcadores específicos (CD49d, CD106,
CD54, CD 34) (De Ugarte et al. 2003). No se han observado diferencias sig-
nificativas entre los dos tipos de células respecto a la adherencia estromal, el
crecimiento, la senescencia celular, la capacidad de diferenciarse en diferen-
tes líneas celulares y la eficiencia en la transducción genética (De Ugarte et
al. 2003). El proceso de obtención se inicia con una liposucción al paciente
que se realiza bajo anestesia local o sedación. El lipoaspirado se somete a un
proceso de laboratorio mediante el cual se aíslan las células adecuadas; éstas
se cultivan a 37º C hasta que el crecimiento alcanza la subconfluencia (Fig.
2). En ese momento pueden emplearse terapéuticamente o ser criopresevadas
para su uso posterior. Este método presenta las siguientes ventajas respecto al
necesario para obtener células de médula ósea: 1. Es seguro; 2. La grasa es
un tejido de fácil acceso; 3. Es menos molesto y agresivo que las punciones
medulares; 4. Puede realizarse bajo anestesia local; 5. Las células pueden 93
criopreservarse (Mizuno et al. 2003).
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
Por todo esto, desde nuestro punto de vista de clínicos, las células madre
derivadas de lipoaspirado superan incluso a las de médula ósea a la hora de
utilizarlas en terapia humana. Como cirujanos, el método de obtención nos
resulta sencillo y cotidiano, pero puede ser igualmente alcanzable para cual-
quier especialista que cuente con un cirujano plástico o general en su centro
de trabajo.
Al revisar la literatura actual sobre las células madre derivadas de lipoas-
pirado, se observa que la mayoría de los trabajos publicados se centran en su
caracterización en el laboratorio o en ensayos realizados en animales. De he-
cho, sólo se ha comunicado un ensayo clínico realizado en humanos (García
Olmo et al. 2005). Esto significa que, a pesar de su manejabilidad y fácil ob-
tención, el clínico todavía no se ha acostumbrado a este tipo de células, posi-
blemente por desconocimiento o rutina.
Ahora bien, este modelo celular se está analizando ampliamente en mode-
los experimentales. Se han comunicado estudios en animales que utilizan
CMDL como vehículo de determinados genes. Dragoo y cols. (Dragoo et al.
2003, 2005) aislaron células madre derivadas de lipoaspirado de la grasa sub-
cutánea y de la almohadilla infrapatelar y las cultivaron en un medio osteogé-
nico. La mitad de estas células fueron transfectadas con un adenovirus con el
cDNA para la proteína morfogenética básica (BMP-2). Las células, inmersas en
una matriz de colágeno I, fueron inyectadas en una pata trasera de ratones in-
munodeficientes; la otra pata fue inyectada con CMDL no modificadas genéti-
camente. Tras 6 semanas se comprobó que en la pata donde se inyectaron las
células transfectadas, el hueso tenía una mineralización adecuada y comenzaba
a establecer la cavidad medular.
Por otro lado, Martinez-Estrada y cols. (Martinez-Estrada et al. 2005) con-
siguieron diferenciar CMDL en EPC (células progenitoras endoteliales postna-
tales) cultivándolas en un medio hematopoyético. El primer marcador que ex-
presaron fue Flk-1, y progresivamente Ve-caderina y factor de Von Willebrand.
Dado que el bajo número de EPC en la circulación limita su uso en Medicina,
las CMDL pueden ser un gran apoyo.
Además, es muy prometedor el efecto anti-inflamatorio que presentan las
CMDL. Se ha comparado (Puissant y cols. 2005) el efecto de las células madre
derivadas de médula ósea con las CMDL. Las CMDL no provocaron in vitro
94 "alorreactividad" frente a linfocitos incompatibles, es más, lograron suprimir la
reacción linfocitaria mixta (MLR) y la proliferación linfocitaria como respuesta
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Avances en terapia regenerativa
a mitógenos. Cuando las CMDL y los linfocitos fueron separados por una
membrana permeable estos hallazgos no se repitieron, lo que hace pensar que
es necesario el contacto celular para desencadenar esta reacción. Aquí surge
una nueva idea respecto a la posibilidad de utilizar estas células de manera alo-
génica a partir de un banco de donantes.
En esta línea, otro estudio (Aust et al 2004) investigó el rendimiento celu-
lar por milímetro cúbico de lipoaspirado y los marcadores de superficie que de-
terminan su fenotipo. Se recogió el producto de lipoaspirado de 18 donantes
mujeres, registrando su edad e índice de masa corporal (BMI). El rendimiento
celular medio fue de 404.000±206.000 células por milímetro de lipoaspirado,
de manera inversamente proporcional al BMI pero no a la edad. Las CMDL
eran positivas homogéneamente para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e,
CD59, CD90 y HLA-ABC; y homogéneamente negativas para CD11b, CD45 y
HLA-DR. La ausencia del marcador panhematopoyético CD45 indica que las
células no derivaban de células madre circulantes. El hecho de obtener una po-
blación tan homogénea procedente de múltiples donantes refuerza también la
idea del empleo alogénico en un futuro.
Por último, Morizono y cols. (Morizono et al. 2003) examinaron la infec-
ción de las CMDL con vectores como adenovirus, oncoretrovirus y lentivirus,
demostrando la posibilidad de transfectarlas con lentivirus. Las células mantie-
nen la expresión transgénica tras diferenciarse en líneas adipogénicas y osteo-
génicas. Así, las CMDL y un vector como el lentivirus pueden ser una buena
combinación como vehículo de la terapia génica.
Para utilizar las células en humanos se han desarrollando ensayos de biosegu-
ridad. Para llegar a realizar estudios en humanos las células se han sometido a es-
tudios de caracterización por inmunofluorescencia y de crecimiento. Existe un tra-
bajo en la literatura en el cual se ha comunicado que, tras mantenerlas en cultivos
durante mucho tiempo, las CMDL pueden experimentar una transformación neo-
plásica capaz de desarrollar tumores en el ratón (Rubio et al. 2005). La posibili-
dad de transformación neoplásica de CMDL humanas in vitro se vio en cultivos
en los que se permitió el crecimiento más allá de la subconfluencia, manteniéndo-
los incluso más de dos meses después del aislamiento celular. En estas células se
demostró la transformación neoplásica mediante el estudio del cariotipo, que con-
firmó la existencia de cambios en el DNA. Se observó, además, que eran células
de crecimiento anómalo o no controlado, capaces de desarrollar tumores al inocu-
95
larse en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, de manera paralela, se cultiva-
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Avances en terapia regenerativa
ron CMDL evitando el crecimiento más allá del 85% de confluencia celular. En
estas células también se estudió el cariotipo y se inocularon después en ratones
deficientes, observándose ausencia de alteraciones en el DNA y de desarrollo de
tumores en los animales. Ésta es la razón por la cual nuestro grupo siempre ha uti-
lizado células del pase 3 o menor, antes de que las células lleguen a la subcon-
fluencia. No hemos observado ningún caso de reacciones de rechazo ni transfor-
mación tumoral. Por otro lado, la terapia con células madre derivadas de
lipoaspirado, que nuestro grupo utiliza en el tratamiento de fístulas en humanos,
se ha demostrado tan segura que ha sido aprobada por la Agencia Europea del
Medicamento (EMEA) para que este "producto" sea considerado un medicamento
huérfano ("orphan drug"). Además, este ensayo clínico está registrado en Clinical-
trials.gov, ID: NCT00115466) para el tratamiento de la fístula perianal compleja.
Tabla 1. Resumen de los resultados clínicos el fase I. NE, no evaluable; NI, no implantado
Nº Nº Tipo de Nº Días Nº células
implante paciente fístula pase cultivo (x106) Resultado
1 001 Rectovaginal 1 6 6.1 Curado
2 002 Enterocutanea 1 9 9.0 Curado
3 002 Enterocutanea 1 7 8.0 NA
NI 003 Perineal 1 NE NI NA
4 002 Rectovaginal 2 14 10.0 No curado
5 002 Enterocutanea 2 8 3.5 Curado
6 001 Rectovaginal 1 12 20.0 Curado
7 004 Enterocutanea 2 16 30.0 No Curado
8 005 Perineal 2 31 20.0 Curado
9 002 Enterocutanea 3 12 15.0 Curado
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101
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
NANOBIOTECNOLOGÍA: HERRAMIENTAS
DIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICAS
Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica (IMM-CNM). CSIC
está avanzando en
conseguir materia-
les de mayor dure-
za y resistencia,
ordenadores más
veloces y con ma-
yor capacidad gra-
cias a los micro-
procesadores con
componentes nano-
tecnológicos, diag-
nósticos médicos
más eficaces o
energía abundante
a bajo coste y res-
Figura 1. Comparativa de petuosa con el me-
tamaños entre el mundo dio ambiente. Actualmente ya existen productos “nanotecnológicos”
natural y el mundo artificial en el mercado como cosméticos más eficaces y protectores, raquetas
desarrollado mediante
de tenis más flexibles y resistentes o gafas que no se rayan, por citar
Micro y Nanotecnología.
algunos ejemplos.
La irrupción de la Nanotecnología en la Biotecnología y en la Medicina ha
dado lugar a una nueva disciplina que se denomina Nanobiotecnología y que sin
duda constituirá uno de los pilares básicos de esta nueva revolución industrial.
La Nanobiotecnología se define como la aplicación de herramientas, com-
ponentes y procesos de la Nanotecnología al campo de la salud, lo que fre-
cuentemente se denomina también como Nanomedicina, permitiendo el desa-
rrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando
están todavía en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La Na-
nomedicina estudia interacciones a la nanoescala (1 a 100 nm) y para ello utili-
za dispositivos, sistemas y tecnologías que incluyen nanoestructuras capaces de
interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para inte-
raccionar a nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el
desarrollo de “nanoterapias”, dirigidas específicamente a los tejidos y órganos
enfermos, evitándose dañar a las células sanas circundantes.
104 En nuestro mundo industrializado se está observando un progresivo aumento
de graves enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
NANOMEDICINA
Nanodiagnóstico
Biosensores
madamente útiles como marcadores biológicos. Los puntos cuánticos con diferentes propiedades
de emisión según su
más empleados son los de CdSe, ya que son fáciles de fabricar con el
tamaño utilizadas en
tamaño deseado mediante procesos químicos, se pueden producir en
nanodiagnóstico. Puede
gran variedad de colores, tienen una emisión excelente (mejor que los observarse el detalle de
marcadores fluorescentes habitualmente usados en biología), y no se una nanopartícula obtenido
desestabilizan ya que son fotoestables. La emisión de fluorescencia mediante microscopia
de estos puntos cuánticos es tan brillante que incluso es posible ob- electrónica (Foto cortesia
del Prof. L.Liz-Marzán,
servar una célula que contenga una única de estas nanopartículas.
Univ. Vigo).
Hoy en día los puntos cuánticos son comerciales y se ha demostra-
do ampliamente su utilidad para la localización de tumores en los pri-
meros estadios, lo cual significa que se podría proceder a su extirpación inmediata.
Pero los puntos cuánticos no funcionan por sí mismos, es preciso indicar-
les cómo localizar el tumor y para ello hay que recubrir la superficie del punto
cuántico con moléculas biológicas (biorreceptores) con afinidad hacia un com-
puesto específico de la célula cancerosa. Por ejemplo, hay ciertas proteínas o
moléculas que se encuentran en mayor proporción en la superficie de las célu-
las cancerosas (como los receptores de ácido fólico o la hormona luteinizante)
y ésto va asociado con cada tipo de cáncer en particular. Cuando los puntos
cuánticos recubiertos con el biorreceptor se acercan a una muestra que contiene
dicha proteína, ambos se unen. Ahora se puede detectar la interacción ilumi-
nando los nanocristales con luz ultravioleta y observando su emisión caracterís- 109
tica. Hay ya numerosos ejemplos de como los puntos cuánticos localizan célu-
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
Biosensores plasmónicos
Biosensores nanofotónicos
Biosensores nanomecánicos
Nanomedicina regenerativa
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118
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
VECTORES DE TRANSFERENCIA
EN TERAPIA GÉNICA
Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones Oncólogicas
INTRODUCCIÓN
VECTORES VIRALES
Los vectores de tipo viral son actualmente los más efectivos, fueron los
primeros en utilizarse en ensayos clínicos a comienzos de 1990 y continúan
siendo los más utilizados en dichos ensayos. Los virus son, de hecho, sistemas
naturales de transferencia genética. Para modificar un virus y transformarlo en
un vector con potencialidad terapéutica, el primer paso es bloquear su capaci-
dad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. Nor-
malmente, se suelen establecer líneas celulares que incorporan parte del geno-
ma vírico y que permiten completar el ciclo reproductivo del virus, cuando son
transfectadas con plásmidos que introducen el material genómico complemen-
tario. Estas líneas celulares se denominan "empaquetadoras" y son las herra-
mientas de producción de los vectores virales. El segundo paso en el proceso
de obtención de un vector viral es la eliminación de parte del genoma viral pa-
ra crear espacio donde introducir el material terapeútico (gen o genes, más los
elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales y, espe-
cialmente, aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para la célula a
tratar.
En general, los vectores virales presentan como ventaja su gran eficacia de
124 transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgén en el
genoma de la célula huésped. Sin embargo, arrastran importantes limitaciones
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus RNA con envuelta y fueron elegidos inicialmente
como prometedores vehículos de transferencia génica debido a su elevada efi-
cacia de transducción en un gran número de tipos celulares, a que son capaces
de integrarse de forma estable en el genoma de la célula que infectan, sin ex-
presar ninguna proteína viral inmunogénica, y a que son relativamente poco
patogénicos, con populares excepciones como el virus del SIDA (HIV, Human
Immunodeficiency Virus). La mayoría de ellos derivan del virus de la leucemia
murina (MuLV). El virus parental posee tres genes, gag, pol y env, que codifi-
can proteínas responsables de la replicación, encapsidación, transcripción re-
versa e infección. Estos tres genes pueden ser utilizados en trans (facilitados
por las células empaquetadoras), permitiendo la generación de vectores que li-
mitan el genoma retroviral a la señal de empaquetamiento y las secuencias ter-
minales necesarias para la integración (LTRs, Long Terminal Repeats). De esta
forma se minimiza el componente genómico viral y se maximiza la capacidad
de incorporación de material genético heterólogo, aunque el límite sigue siendo
discreto, unas 7-8 kilobases (kb).
Su mayor limitación reside en el hecho de que sólo son capaces de trans-
ducir eficazmente células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo
125
de preintegración requiere la ruptura de la membrana nuclear. Ésto inicialmente
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Vectores de transferencia en terapia génica
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA sin envuelta con un genoma bicatenario de
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de vec-
tores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumo-
res en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celula-
res distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una eficacia
muy elevada. Sin embargo el genoma viral se mantiene episómico, lo que per-
mite solo una expresión genética transitoria.
La primera generación de vectores adenovirales se obtuvo mediante delec-
ción de la región E1, que bloqueaba su capacidad replicativa y la E3, aparente-
126 mente no esencial. Sin embargo, posteriormente se demostró que la presencia
de E3 incrementaba significativamente la expresión del transgen y disminuía la
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Vectores de transferencia en terapia génica
célula huésped en una ubicación específica (el brazo q del cromosoma 19) eli-
minando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja adicional es la
carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Sus mayores limitaciones se centran en su reducida capacidad de transpor-
te (unos 4.5 kb) y en su tediosa producción, que requiere la presencia de virus
de apoyo (adenovirus o herpesvirus), dificiles de eliminar completamente. Una
complicación adicional surgió al comprobar que la eliminación de parte del ge-
noma viral para permitir la introducción del transgén se tradujo en la pérdida
de la capacidad de integración específica. Reciéntemente se ha descubierto que
la proteina Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integra-
ción específica en el genoma celular y podría ser la clave que solucionara este
problema.
Finalmente, como hemos visto en los vectores anteriores, la falta de espe-
cificidad celular ha sido también tratada empleando la estrategia de moléculas
biespecíficas.
Tabla 1.
V. Retrovirales V. Adenovirales V. Adenoasociados
Características
Una opción interesante, que cada día se está explotando con mas fre-
cuencia, es la combinación de varios vectores para compensar las limitacio-
nes que presentan cada uno por separado, a la vez que se aprovechan las ven-
tajas más destacables que aportan individualmente. Existen diversas
estrategias experimentales de estas quimeras, pero sólo voy a mencionar, a tí-
tulo de ejemplo, la quimera adenovirus-retrovirus. Consiste en la utilización
simultánea de dos tipos de vectores adenovirales: uno que incorpora la ma-
quinaria de empaquetamiento retroviral (gag, pol y env) y otro que introduce
el material genético equivalente a un vector retroviral (LTRs, señal de empa-
quetamiento y material terapéutico). Se aprovecha la elevada eficacia de
transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vec-
tores, transformando las células dianas en células productoras de vectores re-
trovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar las células ve-
cinas e integrarse en su genoma.
VECTORES NO-VIRALES
Métodos físicos
Tabla 2.
M. Físicos Lipoplexes Poliplexes Peptiplexes
Características
Policationes (Poliplexes)
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135
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
INTRODUCCIÓN
humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos básicas en las que se
fundamentan los protocolos
años, y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se 137
de transferencia y terapia
recogen en la Figura 1.
génica.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
138 La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año
2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
en fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III.
Los vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más fre-
cuente en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando
en un 25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza
DNA desnudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre
ensayos que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 ti-
pos diferentes de vectores.
Inmunodeficiencias genéticas
Entre las inmunodeficiencias consideradas para su tratamiento genético
son de destacar las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a muta-
ciones en los genes de la Adenosina Deaminasa (ADA) y la inmunodeficiencia
SCID-X1.
La ausencia de la ADA implica una acumulación del sustrato desoxiadeno-
sina trifosfato en las células, resultando particularmente tóxico para los linfoci-
tos T (Figura 3). Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas me-
diante protocolos de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de
Estados Unidos (Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital
S. Raffaelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiuti
et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-
nético de esta enfermedad estuvie-
ron basadas en la transferencia del
gen ADA en las células T de pa-
cientes y también en células madre
hematopoyéticas (CMH). En todos
los casos se comprobó la presencia
de células transducidas en los pa-
cientes y evidencias de mejora en
su inmunocompetencia. Muy re-
cientemente se ha comunicado que
pacientes con deficiencia de ADA,
Figura 3.
que fueron acondicionados con protocolos poco agresivos y trasplan-
Inmunodeficiencia
tados con células de médula ósea corregida genéticamente, han podi- severa combinada ADA.
do hacerse independientes de la administración exógena del ADA
bovino y recuperado su función inmune (Aiuti et al 2002).
Como conclusión
a los estudios realiza-
dos para tratar genéti-
camente pacientes con
enfermedades mono-
génicas, la Figura 6
muestra el número de
pacientes con inmu-
nodeficiencias seve-
ras, así como los que
han mostrado eviden-
cias de mejoría clíni-
ca. De estos estudios
se pone de manifiesto
que existe un número
de enfermedades mo-
nogénicas, para las Figura 5. Granulomatosis
cuales la terapia génica co- crónica.
Enfermedades
de acumulación
de sustratos tóxicos
Un número relativa-
mente elevado de genes se
han asociado a este tipo de
Figura 6. Beneficio clínico
enfermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la
de pacientes con
más frecuente, por lo que ésta es la enfermedad de acumulación li- inmunodeficiencias
sosomal que ha sido objeto de más estudios de TG. La enfermedad tratados mediante
143
de Gaucher está asociada a una deficiencia en glucocerebrosidasa terapia génica.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Hemofilia
Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-
ducción del factor VIII de coagulación, como la hemofília B, asociada al defecto
en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clí-
nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clí-
nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este
estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia
B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse
en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco
frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen
desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de
médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la
aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia me-
dia de estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enferme-
dad que la hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica
en la ventaja selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las
células defectivas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutacio-
nes o deleciones en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe
están implicados en una función celular relacionada con la estabilidad del ge-
noma de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados
en fase I no manifiestan beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No
obstante, nuevos ensayos con protocolos optimizados de transducción están ac-
tualmente en marcha.
Fibrosis quística
El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y
posee un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ la
enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como conse-
cuencia de las deficiencias de este gen se produce una alteración física y
química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pan-
creáticas. Como consecuencia del defecto en el transporte del cloro entre
las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión
del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos difíciles de
eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del
gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han desa-
rrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovira-
les, adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con
vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de trans-
ducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifies-
to su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores adenovirales. Es de esperar que los protocolos
actuales, con vectores menos inmunogénicos y más eficaces, faciliten la 145
mejoría clínica de estos pacientes.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
vencia. Los tumores primarios crecen autónomamente hasta que sus necesi-
dades nutricionales les obligan a reclutar más recursos. Este es un momento
crítico (denominado angiogenic switch) en el que el tumor se estructura
atrayendo células de soporte, promueve la neovascularización de su entorno
(angiogénesis) y atrae células inmunes circulantes y las estimula para que
secreten metaloproteasas (p.e.) para favorecer su expansión y extravasación
(Figura 8).
Terapia génica
del cáncer
Lo primero a
tener en cuenta es
que los tratamientos
clínicos contra el
cáncer son tremen-
damente eficaces,
eliminando un altí-
simo porcentaje de
las células maligni-
zadas. Los proble-
mas fundamentales
derivan bien de la
agresividad de los
Figura 9. Definición
tratamientos, de la
de dianas en terapia aparición de quimioresistencias cruzadas, o bien de la existencia de
génica antitumoral. pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la rea-
148 Adaptada de Hanahan parición de los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría
y Weinberg (2000). de los procedimientos desarrollados en base a la utilización de TGC
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las expec-
tativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico presentan
con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma avanzados. El
tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores (revisado por
Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair y col. han com-
parado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores retrovirales, bien con
adenovirus (Sandmair y col. 2000). Sus resultados demuestran claramente que los
efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y que los pacientes tratados
con vectores adenovirales han mostrado una duplicación del tiempo de supervi-
vencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los pacientes tratados con vectores
retrovirales, 7.4 meses, y el grupo control, 8.3 meses.
De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos
(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y me-
tastásico, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expresando
HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman et al.,
1998; Morris et al. 2000). En estos estudios se pretende determinar la dosis máxi-
ma de GCV que puede ser administrada en combinación con la administración au-
torizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensayo y determinar si
existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al punto de tratamiento.
Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos in-
convenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resisten-
tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de
inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).
De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia
con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-
rapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distin-
tas aproximaciones que se pueden resumir en las siguientes:
1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos
casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,
LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-
huis R.L. y Gratama J.W., 1998).
2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en
el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).
3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inacti-
150 vadas, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o
potenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).
Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Mi-
ller y col. han demostrado que la administración intratumoral de células dendrí-
ticas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta in-
mune antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller
et al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante
técnicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito
de 33 pacientes afectados por melanoma metastásico, mediante su vacunación
con una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2
(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tu-
morales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,
2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.
Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los
tratamientos más convencionales que, al menos teóricamente, sería capaz de al-
canzar los reservorios residuales del tumor (santuarios) que no son eliminables
por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que los
tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con los
que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas aproxi-
maciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el arsenal te-
rapéutico en la lucha contra el cáncer.
Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con una
particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las células tu-
morales (conditional replication-competent vectors). Actualmente existen varios
modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999) que necesitarán
una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero que son muy interesan-
tes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo para controlar la produc-
ción de partículas infecciosas tras la infección con un vector adenoviral (Ad5dl312)
al que se le había delecionado la función E1A, y sustituido por una función de sín-
tesis activada por IL-6. La generación de partículas infecciosas depende de la pro-
ducción celular de IL-6, por lo que el modelo terapéutico tiene un gran interés en
tumores que poseen un ciclo autocrino de IL-6, como el cáncer de ovario.
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-
ve del metabolismo de aminoácidos -la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)- lo
que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se consi-
dera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del
gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepá-
ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de
estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de
experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento
de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó
efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la
dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática
y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en
coma del paciente. Lamentablemente el paciente falleció poco después, estando
todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de es-
te paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las
alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-
dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor
parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por
152 lo que se confía en que su uso prevenga de la generación de respuestas inmu-
nogénicas no previstas.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-
dos en el Hospital Necker, mediante terapia génica, han desarrollado leucemias
asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes
(Hacein-Bey-Abina et al. 2003). De particular significado ha sido la observa-
ción que en dos de estos pacientes la inserción se ha observado próxima al on-
cogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas. Como se recoge en la Figu-
ra 10, en ninguno de los otros protocolos en marcha, ni tampoco en los
pacientes X1-SCID tratados en Londres, se han observado efectos adversos se-
veros similares.
expansión de una nueva herramienta terapéutica para pacientes que con inmunodeficiencias
tratados con 153
no tienen otra opción terapéutica eficaz.
terapia génica.
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
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155
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
FARMACOCINÉTICA
medicamentos. La far-
macodinamia expresa
la variación del efecto
con la concentración y
asociada a la farmaco-
cinética constituye la
base para la definición
de la respuesta en los
tratamientos farmaco-
lógicos.
Figura 1. Relación de la La actividad intrínseca que presenta un fármaco es condición
farmacocinética y necesaria, pero no suficiente, para asegurar la eficacia terapéutica. El
farmacodinamia
fármaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de acción, no
con la respuesta
siempre bien definido, en ocasiones difícilmente accesible o cuya ac-
terapéutica.
cesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una
amplia distribución tisular o un lento aclaramiento plasmático. Unas propieda-
des farmacocinéticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial te-
rapéutico de un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción de los ensayos clíni-
cos programados en su desarrollo. La Figura 1 muestra esquemáticamente la
contribución de la farmacocinética y la farmacodinamia en la respuesta a un
tratamiento farmacológico3.
Es posible establecer distintos tipos de relaciones entre la farmacocinética
y la farmacodinamia de péptidos y proteínas de interés terapéutico. Así, los va-
lores del área bajo la curva de niveles séricos de algunos agentes trombolíticos
se correlacionan directamente con la permeabilidad en el infarto vascular. Un
modelo PK-PD ha sido utilizado para el diseño de las pautas de dosificación de
reteplasa, un agente trombolítico recombinante.
Con frecuencia no es posible establecer, para péptidos y proteínas, una re-
lación directa concentración-efecto debido a que la variable medida suele ser la
resultante a dos o más procesos cinéticos que ocurren después de la fijación a
receptores. La Figura 2 recoge el modelo PK-PD con respuesta indirecta esta-
blecido para la hormona de crecimiento utilizando diferentes vías de adminis-
tración4. En algunos casos, se requieren modelos PK-PD complejos para poder
158 definir una relación entre las concentraciones séricas y la respuesta, como se ha
demostrado con interleuquina-2, eritropoyetina, etc.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
Los resultados
obtenidos en los estu-
dios farmacocinéticos
junto a los procedentes
de los ensayos de efi-
cacia y seguridad con-
figuran el perfil farma-
cológico de un nuevo
medicamento, permi-
tiendo establecer los
principios básicos para
Figura 2. Modelo
su correcta utilización en la práctica clínica.
farmacocinético-
La investigación de nuevos fármacos se orienta, con frecuencia, farmacodinámico
a mejorar algunas características farmacocinéticas, especialmente la establecido para la
absorción gastrointestinal, la distribución tisular y la velocidad de hormona de crecimiento.
eliminación. Ello se consigue mediante cambios en la estructura quí-
mica o en la formulación farmacéutica que puede modificar la cinética de libe-
ración, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excre-
ción5. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos bien
por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la administración y mejo-
rando el cumplimiento de la prescripción.
La estructura química que presentan la mayoría de los productos biotecno-
lógicos condiciona algunas propiedades, que pueden dificultar su utilización te-
rapéutica y que se refleja en su perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exigencias en la distribución tisular
y celular y un aclaramiento plasmático elevado.
MEDICAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS
BIODISPONIBILIDAD ORAL
Los péptidos y proteínas presentan una baja biodisponibilidad por vía oral,
generalmente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idóneos
para utilizar esta vía de administración. Ello es debido a su inestabilidad en el
medio fuertemente ácido del estómago, al efecto producido por las peptidasas
intestinales, y especialmente a su escasa permeabilidad como consecuencia del
tamaño molecular, la carga eléctrica y la elevada polaridad. La mayoría de las
proteínas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasi-
160 ficación biofarmacéutica; solamente algunas pertenecen a la clase IV y es ex-
cepcional que algunas biomoléculas se incluyan en la clase I. Es decir, los pro-
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
ADMINISTRACIÓN PARENTERAL
y se ha considerado
que dos cadenas rami-
ficadas de 20 kDa pro-
porcionaban un perfil
farmacológico idóneo
para el desarrollo clí-
nico13.
Durante los pasa-
dos 20 años han sido
estudiados numerosos
conjugados de proteí-
nas con PEG (citotóxi-
cos, antioxidantes, enzimas, trombolíticos, citoquinas y factores de Figura 6. Farmacocinética
de interferón y dos
crecimiento hematopoyético, etc.) aunque sólo algunos se encuentran
derivados pegilados.
en fase de desarrollo clínico. La conjugación con PEG ha sido apli-
cada también a oligonucleótidos y lípidos para aumentar su solubili-
dad, estabilizar las moléculas, incrementar la permeabilidad o dismi-
nuir el aclaramiento14.
Los glicoconjugados son aquellos compuestos resultantes de la unión co-
valente de una fracción glucídica con otro compuesto que puede ser protídico o
lipídico. La eritropoyetina recombinante es una glicoporteína utilizada desde
hace más de 10 años en el tratamiento de la anemia renal. Su excreción renal
es mínima, pero es ampliamente metabolizada en el hígado vía receptores de la
galactosa. Los residuos de ácido sialico eliminados en el proceso de biotrans-
formación aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biológica. El
metabolito desprovisto de ácido sialico es rápidamente eliminado, siendo la se-
mi-vida de eliminación de la eritropoyetina de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relación
directa entre el contenido de ácido sialico y la semi-vida de eliminación de
las glicoproteínas, lo que ha sido un estímulo para la búsqueda de nuevas
moléculas.
La darbepoetina alfa es un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que
presenta distintas propiedades físico-químicas y biológicas. La Figura 7 recoge
la estructura de ambas moléculas estimulantes de la eritropoyesis así como la
evolución de los niveles séricos obtenidos tras su administración por vía intra- 165
venosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacoci-
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
METABOLISMO Y EXCRECIÓN
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172
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
RECOMBINANTE VEGETAL A LA TERAPÉUTICA
HUMANA
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid
les transgénicos es que las modificaciones genéticas que se les han introducido
van dirigidas a mejorar características de las plantas que son de interés funda-
mentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. Así, plantas que
expresan constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de
una bacteria, que sobreexpresan una enzima que inactiva la acción de un herbi-
cida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la
producción en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un interés
obvio e inmediato para el productor primario. La OCDE, que ha venido estu-
diando intensamente el fenómeno de la Biotecnología desde muchos ángulos
en los últimos años, ha definido esta primera generación de cultivos transgéni-
cos como que "se ha centrado en características agronómicas para conferir ma-
yores rendimientos en las cosechas mediante la reducción de pérdidas y espa-
ciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la
disminución del uso de plaguicidas y herbicidas". Otras dos características de
los productos de la primera generación son su irrelevancia para el consumidor
final, así como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva,
de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que sus pa-
rientes no transgénicas y que no suponen cambios sustanciales para el consu-
midor, excepto quizá su menor precio, consecuencia de unos menores costes de
producción.
precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se va-
yan poniendo de manifiesto en la producción de fármacos en plantas según se
vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de producción presenta algu-
nas ventajas inherentes respecto de los métodos tradicionales de extracción de
tejidos humanos y animales o de procesos de fermentación. Queda ya mencio-
nado el probable menor coste, pero hay más. Por ejemplo, el de la seguridad
sanitaria del fármaco. La reciente crisis de las encefalopatías espongiformes
bovinas, y su probable relación con algunas enfermedades humanas del tejido
nervioso, ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar, desde teji-
dos animales en los procesos de extracción, patógenos de difícil detección o
eliminación. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que éstas no
permiten la multiplicación de estos patógenos (priones, virus del SIDA, virus
de las diferentes hepatitis, etc.). Además, las plantas pueden constituir el único
sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como
reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un im-
pacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultiva-
das en las que se expresaran. Otra consideración es la de capacidad de produc-
ción del fármaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso
citado con frecuencia de esta última situación es el del potencial tratamiento
del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos efectuados en los Estados Unidos
predicen que cada paciente puede llegar a necesitar 10-200 mg de anticuerpo
recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico de nuevos ca-
sos al año (650.000 de cánceres de mama, pulmón y colon sólo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por año en ese país.
Prácticamente, sólo la producción en plantas puede asegurar ese nivel de pro-
ducción a un precio razonable.
BIBLIOGRAFÍA
El número de trabajos que abordan de manera pública los temas referidos a la produc-
ción de fármacos en plantas mediante Biotecnología es aún limitado, dada su relativa
novedad. Además, bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de
investigación en plantas de menor difusión en los ambientes médicos o farmacéuticos.
Sin embargo, en los últimos años se han publicado un número importante de buenos ar-
tículos de revisión sobre este tema, que proporcionan un visión general y un buen nivel
de información al lector interesado. Se presenta a continuación, como orientación, una
lista de algunas de estas revisiones.
– Gomord, W., Sourrouille, C., Fitchette, A. C., Bardor, M., Pagny, S., Lerouge, P., Fa-
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
183
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
INNOVACIÓN TECNOLÓGICA Y
NUEVAS TERAPIAS. OBTENCIÓN
DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
TOTALMENTE HUMANOS:
PANITUMUMAB
José Luis Motellón. Amgen S.A.
INTRODUCCIÓN
producir las Ig murinas. Estas cepas de ratón se pueden utilizar para producir
hibridomas, con la diferencia de que los AcM producidos serán humanos y no
murinos (4).
PANITUMUMAB
Figura 2. Estimado
de Kaplan-Meiera
de supervivencia
libre de progresión
de panitumumab
más tratamiento de
soporte frente a
190
a Análisis
tratamiento de
primario, conjunto de todos los análisis aleatorizados, radiología
central. soporte solo15.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
había diferencias entre los dos grupos con un hazard ratio de 0,93 (IC 95%:
0,73, 1,19). Las mejores respuestas objetivas vistas en este estudio y en el estu-
dio cruzado se resumen en las Tablas 1 y 215.
Más pacientes en el grupo de panitumumab con tratamiento de soporte
frente al tratamiento de soporte sólo presentaron toxicidades cutáneas (91% vs
15% con exantema grado 3 /4 en el 14% y 0% respectivamente). También se
observaron: fatiga (24% vs 15%), dolor abdominal (23% vs 17%), náusea
(22% vs 15%), y diarrea (21% vs 11%) respectivamente. Doce pacientes (5%)
presentaron potenciales reacciones a la infusión (ninguna fue de grado 3 /4); 1
paciente interrumpió panitumumab debido a una reacción de hipersensibilidad
de grado 215.
Estudio de fase 2
Este estudio llevado a cabo por Malik et al. era multicéntrico, abierto, de
un único brazo para evaluar la seguridad y la eficacia de panitumumab en mo-
noterapia en pacientes con CCRm que habían fracasado al tratamiento con 5-
Fu con o sin leucovorin e irinotecán u oxaliplatino o ambos. La cohorte A in-
cluyó pacientes con tinción de EGFr por inmunohistoquímica de 2+ ó 3+ en al
menos el 10% de las células tumorales y la cohorte B incluyó pacientes con
suma de las tinciones de EGFr de 1+, 2+ y 3+ en al menos el 10% de las célu-
las tumorales, pero con suma de 2+ y 3+ en menos del 10% de las células tu-
morales. Panitumumab se administró como infusión IV a 2,5 mg/kg/semana
durante 8 ciclos hasta progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o
191
muerte. Un total de 148 pacientes recibieron al menos una dosis de panitumu-
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Innovación tecnológica y nuevas terapias
mab con una media de edad de 59 años (21-88 años), 111 (75%) con un estado
funcional ECOG de 1, y 65 (44%) habían recibido 3 agentes quimioterápicos
previos. Se observó control de la enfermedad en 43 (41%) de los pacientes en
la cohorte A y 13 (30%) de los pacientes en la cohorte B. La duración mediana
de la enfermedad estable fue 18,3 semanas (IC 95% 16,7-26,4) para los pacien-
tes en la cohorte A y 26,1 semanas (IC 95% 16,3 - 35,9) para los pacientes en
la cohorte B. Los resultados de eficacia se muestran en la Tabla 316.
Los cuatro acontecimientos adversos grado 3/ 4 relacionados con el trata-
miento notificados con mayor frecuencia fueron exantema 5 (3%), fatiga 4
(3%), vómitos 2 (1%) y náusea 1 (1%). Acontecimientos adversos relacionados
con toxicidad cutánea fueron notificados por 141 pacientes (95%) y 5% eran
grado 3 y ninguno grado 4. Una reacción relacionada con la infusión se obser-
192 vó en un paciente que no requirió modificaciones de la dosis. No se observaron
anticuerpos anti-humanos en ninguno de los 145 pacientes testados16.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
CONCLUSIÓN
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Innovación tecnológica y nuevas terapias
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de 2006).
195
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS
BIOTECNOLÓGICOS EN LA AGENCIA EUROPEA
DE MEDICAMENTOS (EMEA)
BWP (GRUPO DE BIOLÓGICOS) Y CHMP
(COMITÉ DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO)
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo
Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
ABREVIATURAS
INTRODUCCIÓN
Desde 1995 hasta ahora el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones
anuales, de varios días de duración, en la sede de la EMEA. Este grupo está
formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representan-
te de la Comisión, un representante de la Farmacopea Europea, personal técni-
co de la EMEA y, desde febrero de 2000, un representante de Noruega y otro
de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes
desde 1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asistencia técnica al CHMP sobre
aspectos relacionados con la fabricación y control de medicamentos biotecno-
lógicos y de origen biológico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plas-
ma y productos inmunológicos. El BWP es también el grupo asesor del COMP
para productos de origen biológico o biotecnológico y de la OMS en aquellos
casos en que este organismo lo solicite.
Las actividades principales del BWP se describen a continuación:
• Elaboración de informes sobre los procesos de producción y control de
las solicitudes de comercialización de medicamentos humanos de origen
biológico y biotecnológico. Los aspectos relacionados con la calidad de
este grupo de medicamentos se discuten en la reunión correspondiente
del BWP y se emite un informe para su consideración por el CHMP
que, tras la discusión de los aspectos toxicológicos y clínicos del medi-
camento en cuestión, emitirá un dictamen final sobre la aprobación o re-
chazo de la solicitud correspondiente.
• Elaboración de directrices o recomendaciones europeas e internacio-
nales sobre temas específicos relacionados con productos biológicos
y biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de 205
las tareas fundamentales del BWP es la elaboración de directrices o
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
WEBLIOGRAFÍA
www.emea.europa.eu Información adicional sobre el BWP y actividades de la EMEA
en general (incluyendo los documentos elaborados por los gru-
pos de trabajo)
pharmacos.eudra.org Regulación relacionada con la autorización de medicamentos
en la Unión Europea
207
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
INTRODUCTION
When looking at the demographic evolution one can observe that there
has been an impressive increase in life expectancy of the population in the 209
developed world during the last century. Currently, it is not expected that, on
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
average, we can add many more years to the general population. The formi-
dable increase in life expectancy was caused by a general increase in stan-
dard of living, including better hygiene standards such as the availability of
clean (and thus safe) drinking water and a reliable sewage system in crowded
areas. Although difficult to quantify, improved medical care may have contri-
buted as well. With a traditional medical approach, we are able to cure infec-
tious diseases and postpone deleterious effects of systemic diseases like dia-
betes, hypertension, COPD, etc. However, we may have reached a plateau
with this rather crude and population-based approach. When treating risk fac-
tors (e.g. hypertension) medically, we are grossly overtreating the general po-
pulation; only a minority will actually benefit from these treatments. A good
measure to evaluate treatment effect is the Numbers Needed to Treat (NNT):
the total number of people that are exposed to treatment to prevent one inci-
dent. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension
should be treated to prevent one death. From this perspective, traditional
drug treatment is rather inefficient and causes a serious morbidity problem
(due to inherent side effects).
The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand
which patients will benefit from the treatment. For many drugs, the exact dose-
response relationship is uncertain. So, on top of inefficiency, there is also a cer-
tain degree of inaccuracy. Patients do not only show a considerable variation in
disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug
effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). As a result, some experts state
that only some 40% or less of all used drugs benefit individual patients (i.e.
60% or more of all drugs do not clearly benefit our patients).
The mapping of the human genome is slowly changing this scene. Based
on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients,
based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Ge-
netic predisposition can be spelled out: which patients carry a serious disease
risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most
from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically de-
termined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy
can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a
way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditio-
210 nal drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are
genetically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Impact of pharmacogenetics on drug use
the cell membrane and polymorphism of the cytochrome P450 family of drug
metabolising enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to as-
sess the sensitivity of target-tissues or even become possible to change it in a
desirable fashion.
GENETIC VARIATION
The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of
proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is
identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs
(on average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism
(SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed be-
tween individuals in the population. A polymorphism has been defined as the
minor allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations
are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences of genes
causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a ha-
plotype. Haplotypes are formed by recombination when the paternal and mater-
nal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The coinheritan-
ce of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles
(linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with
the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs
in a specific region will provide enough information to predict much of the in-
formation about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called
'tagSNPs' and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A
SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism
on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype
and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzy-
me activity or decreased enzyme activity. To simplify different combinations
the term semiquantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles ha-
ve a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5 211
for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Impact of pharmacogenetics on drug use
SOURCES OF VARIATION
Heterogeneity in disease
drug was already dead) is was found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect /
worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows
the potential promise of genome technology. Some drugs are very efficacious
in some patients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That
means that we have to study the origins of variability in drug response in more
detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and phar-
macodynamics.
On the other hand success stories are also know. The drug trastuzumab has
a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal
growth factor) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) fa-
mily of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In pa-
tients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breastcan-
cer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased invasive
and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treat-
ment with trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with cy-
totoxic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).
Heterogeneity in Pharmacokinetics
The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the MDR1 gene,
plays an important role in the export of substances from the inside of cells and
from membranes to the outside. PGP (P-glycoprotein) protects cells from toxic
substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through
the intestine and other epithelial barriers. To date at least 105 variants of the
MDR1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants
the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an
alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant allele) is
associated with a twofold lower MDR-1 expression level in the duodenum
compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a hig-
her digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low
213
bioavailability and a limited penetration in targets. Patients who were ho-
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Impact of pharmacogenetics on drug use
mozygous for the 3435TT genotype had low plasma concentrations of nelfi-
navir and efavirenz, but for not fully understood reasons, they had a better
antiviral response and CD4+ immune recovery than patients with the CC- or
CT genotype (Fellay et al; 2002). This can be explained by low PGP levels
in the membrane of (infected) cells and therefore enhanced concentration
build-up of anti-retroviral drugs in these cells. The frequency of the TT ge-
notype is very low in Africans comparing to Caucasians (25%), which ex-
plains the difference in response between Caucasians and black Africans to
these drugs.
Heterogeneity in Pharmacodynamics
the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases
(Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplifi-
cation could also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples that in literature relates to the
efficacy of cholesterolsynthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so ca-
lled B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than indivi-
duals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well
known effect from drugs like salbutamol. The 2-receptor has three main poly-
morphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the gene-
ral population. The two SNPs are in strong linkage disequillibrium and can be
considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers
of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and
Gln27Glu are associated with a decreased effect of 2-agonists.
Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxyge-
nase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor
activity, which leads to a decreased response to treatment with leukotriene an-
tagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).
CONCLUSION
tion structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approa-
ching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of
the formidable resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
ACKNOWLEDGEMENT
BACKGROUND READING
REFERENCES
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clinical practice: a case study of thiopurine methyltransferase genotyping in acute
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