Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica Cincia e arte nas frias

Projeto: Oxidao qumica e enzimtica de cetonas cclicas

Aluna: Mayara Beatriz T. Moreira Monitoras: Bruna Zucoloto da Costa Francisca Diana da Silva Arajo

Campinas, janeiro 2011

Endereo: rua Athos Astolfi n 345 JD. San Diego

1- Introduo Lactonas so utilizadas comercialmente nas industrias de fragrncias. Inicialmente eram utilizados aromas extrados diretamente da natureza, mas com o tempo essa fonte de extrao poderia se esgotar, foi com essa ideia que os qumicos sintticos descobriram uma maneira de sintetizar os mesmos. As lactonas so obtidas a partir da oxidao de cetonas cclicas. Industrialmente a obteno de lactonas feita quimicamente pela oxidao de Baeyer-Villiger, utilizando cido meta-cloroperbenzico na reao. Porm, tal cido caro, sensvel ao choque, potencialmente explosivo, higroscpio e se degrada, o que limita suas aplicaes. A oxidao qumica no a nica forma de se realizar a oxidao de Baeyer-Villinger, pode-se realiz-la atravs do uso de enzimas monoxigenases e clulas ntegras de microorganismos, mas ambos os processos possuem desvantagens. Uma alternativa para esta reao a gerao in situ de percido mediada por lipase, na presena de peroxido de hidrognio. A utilizao de perxido de hidrognio altamente atrativa, pois de fcil manuseio, seguro, com um alto teor de oxignio ativo e baixo custo, alm de ser ambientalmente limpo, gerando somente gua como co-produto da reao. Assim, a gerao de concentraes catalticas de percido, atravs da peridrlise de cidos carboxlicos na presena de perxido de hidrognio catalisada por lipases pode ser realizada, em solventes orgnicos adequados, sob condies praticamente neutras o que torna atrativa para reaes de oxidao em larga escala, j que condies brandas so empregadas e o processo mais seguro.

2- Objetivos

Obter lactonas de interesse comercial por meio enzimtico , utilizando a lipase Candida cylindracea, e por meio qumico utilizando o cido metacloroperbenzico . Comparar as vantagens e desvantagem de ambos os mtodos de sntese e suas metodologias. Aprender as tcnicas bsicas de um laboratrio de qumica orgnica e biocatlise, assim como as normas de segurana. Aprender a elaborar um relatrio tcnico-cientfico , assim como o painel a ser apresentado

3- Parte experimental

A fim de realizar um trabalho eficaz e obter total entendimento da pesquisa, realizamos algumas atividades extras. Antes de comear a interao com o laboratrio tivemos aula de segurana no laboratrio, dos equipamentos bsicos, reviso geral de qumica orgnica e algumas das funes orgnicas focando nas que iremos utilizar, conceitos sobre polaridade das molculas, as diferentes tcnicas de cromatografia e tcnicas bsicas de um laboratrio de qumica. Alm da realizao de experimentos ldicos que aprimoram nosso interesse pela qumica.

3.1-pesagem Foram pesados trs reagentes diferentes com massas distintas, para treinar a pesagem. Utilizamos 1,335 g de cloreto de sdio, 0,6134 g de carbonato de clcio e 1,25 g de cloreto de sdio. 3.2- destilao foi realizada a destilao do solvente diclorometano. Para tanto montamos o sistema de destilao , preparamos uma soluo de 400 mL de diclorometano com hidreto de clcio em um balo de fundo redondo. Esperamos o balo com a soluo aquecer, a soluo evaporar e condensar um pouco antes de comear a separao (30 min aproximadamente). Aps isso esperou-se a separao de pouco mais de 200 mL de solvente para coletar. 3.3- evaporao de solventes Em dois bales de fundo redondo de 50 mL adicionamos 0,2 g de piperonal no primeiro balo e 0,5 mL de cido octanico no segundo balo. Apos este procedimento esperamos o solvente esfriar antes de colet-lo para no pegar umidade, depois pegou-se 20 mL de solvente e fizemos uma soluo do solvente com os reagentes que j estavam nos bales. Com as solues prontas evaporamos o solvente para concentrar os produtos, colocamos o balo em um conector prendendo com garras para fixar, ligamos o sistema de vcuo para diminuir o ponto de ebulio e vaporizar mais rpido, o balo gira e conforme ele gira esquenta a soluo, o vapor passa pelo conector, condensa e cai em outro balo. 3.4- CCD cortou-se plaquinhas de 4:7 com 0,5 cm de margem ( superior e inferior apenas), marcouse os pontos a serem aplicados as amostras. Em um bquer preparou-se o eluente , hexano com 10% de acetato, colou-se um papel de filtro para saturar o ambiente e tampou-se o bquer. Com o auxilio de um capilar foram aplicadas as amostras e aps secar colocou-as dentro do bquer. Aps retira-las do bquer foram reveladas em anisaldedo e secados. 3.4.1- Analise de pigmentos de pimentes por CCD

Foram picados os pimentes verde, amarelo e vermelho em pedaos pequenos. Pesou-se 30 g dos pedaos de cada pimento e foram adicionados 10 mL de acetona e 50 mL de hexano. Macerou-se separadamente cada amostra utilizando gral de porcelana com pistilo,e,em seguida, deixou-se em repouso por 30min. Aps esse perodo, foi filtrado as misturas em funil comum, utilizando papel de filtro pregueado, em seguida, foram separadas as fases aquosas dos filtrados em funil de separao. Lavou-se as fases hexnicas com gua (15 mL), foi agitado lentamente separou e descartou a fase aquosa. Repetiu-se o processo de lavagem. Realizou o processo de secagem com sulfato de sdio, filtrou-se e evaporou o solvente em rota- evaporador at a obteno de aproximadamente 1mL de amostra. Foi aplicado as amostras de cada extrato em uma placa de CCD, efetuou-se a eluio dos extratos em hexano com 5% de acetato. A revelao das placas ocorreu com a utilizao de iodo. 3.5- Experimentos ldicos 3.5.1- Desidratao de acar com cido sulfrico Colocou-se uma quantidade significativa de acar em um bquer de 250 mL, foram adicionados, cuidadosamente, 50 mL de cido sulfrico concentrado. 3.5.2- Dissoluo de isopor em acetona utilizou-se trs bqueres e foram adicionados 50 mL de acetona, hexano e diclorometano respectivamente, colocou-se um pedao de isopor em cada bquer aos poucos. 3.5.3- Estudo da atividade proteoltica de enzimas presentes em frutos Utilizando o suco de abacaxi, mamo e morango preparou-se uma sequencia de 4 tubos de ensaio, cada qual contendo 3mL de um dos sucos com 10 mL de gelatina, um dos quatro tubos s adicionou-se a gelatina, aps isso foram colocados no freezer para a geleificao. 3.5.4- A qumica do refrigerante Em um bquer adicionou-se 200 mL de refrigerante, mediu-se o pH inicial do refrigerante, adicionou-se, aos poucos, com esptula o bicarbonato de sdio. Esperou-se cessar o desprendimento de gs antes da nova adio, quando a adio de bicarbonato no produziu mais gs, mediu-se o pH do liquido. 3.5.6- Garrafa azul Em um frasco de penicilina adicionou-se 180 mL de gua destilada e 3,5 g de hidrxido de sdio e agitou-se at que o hidrxido estivesse totalmente dissolvido, adicionou-se 6,0 g de glicose na soluo e agitou-se para que toda a glicose fosse dissolvida. Foram acrescentadas 70 gotas de uma soluo aquosa de azul de metileno, e, realizou-se a sequencia agitao/imobilizao/agitao da soluo resultante. 3.6 - Reao enzimtica

Pesamos 0,006g e 0,007g de lipase e adicionamos em dois frascos de penicilina respectivamente, deixamos um terceiro frasco sem lipase afim de ser a reao controle. adicionamos ento 1,5mL de peroxido de hidrognio, 15mL de tolueno, 100microL de cido octanoico, 25microL da 2- heptilciclopentanona e agitamos a soluo. Retiramos uma aliquota de 2mL da fase orgnica de cada uma das trs reaes para serem amostras de tempo 0, tampamos o frasco, envolvemos a tampa com papel filme para no correr o risco da tampa se abrir ao colocar os frascos no Shaker. Levamos os frascos para serem agitados no Shaker, na temperatura de 37 C e a agitao para 200 rpm. Com as alquotas de tempo zero realizamos a extrao de boa parte do cido octanoico, pois para uma analise no CG-EM, a amostra no pode conter nenhum tipo de acido, porque o acido ao entrar em contado com a coluna reage e danifica a coluna. Antes da extrao do cido realizamos uma CCD para analisar a quantidade de cido antes e aps a extrao. Preparamos uma soluo saturada de bicarbonato de sdio, adicionamos 1mL dessa soluo em cada alquota e agitamos, podemos observar a separao das fases. Retiramos com uma pipeta volumtrica automtica a fase mais densa que aquosa e repetimos o procedimento. Apos isso realizamos um processo de secagem , adicionando sulfato de magnsio anidro para retirar a gua restante, filtramos e realizamos um novo CCD. Esses procedimentos tambm foram executados com as amostras retiradas em 24h e em 72h. Com as amostras de tempo 0, 24 e 72 horas aps a extrao do cido foram adicionadas 3 gotas de Diazometano em cada amostra para reagir com o possvel retante de cido , formando ster. As amostras foram colocadas no CG para serem analisadas. 3.7- CG Foram pesadas cada uma das amostras obtidas em tempo zero e 24 horas, preparou-se solues de cada uma das amostaras na concentrao de 1 mg/mL, injetou-se no CG. 3.8- Reao qumica Destilou-se 100 mL de diclorometano, pesou-se 1,64 g de bicarbonato de sdio, 1,64g de m-CPBA, 1,40 mL da 2- heptilciclopentanona de interesse e adicionou-se ao balo de fundo redondo. Colou-se o balo de fundo redondo contendo a cetona ciclica (1,0g) em um banho de gelo, adicionou-se 30 mL de diclorometano e iniciou-se a agitao magntica, sob agitao foram adicionados o bicarbonato de sdio e o m- CPBA .Acompanhou-se a reao por meio de CCD , e interrompeu-a aps 18horas. Afim de extrair o cido meta- cloroperbenzico e o bicarbonato de sdio, preparou-se uma soluo saturada de bicarbonato de sdio e hipoclorito de sdio, filtrou-se a reao em um sistema de filtrao consistindo de kitassato, funil de buchner e papel de filtro, colou-se o filtrado em um funil de separao.

Adicionou-se 10 m L da soluo saturada de bicarbonato de sdio, agitou-se e esperou-se as fases separarem, e retornou-se a fase orgnica para o funil, repetiu-se esse procedimento duas vezes. O mesmo procedimento foi repetido para as solues de hipocloreto de sdio e gua destilada. Colocou-se a fase orgnica em um becker e adicionou-se sulfato de magnsio, e foi filtrada a soluo em um funil com algodo tratado, colocou-se o filtrado em um balo de fundo redondo, acoplando-o ao sistema do rota- evaporador, aps o solvente ter evaporado retirou-se o balo do rota- evaporador e armazenou-o para posterior purificao. Para purificao foi realizada a pesagem da amostra a ser purificada (0,78 g) e calculou-se a quantidade de slica necessria para realizar a separao (20 g ), realizou-se a CCD para verificar o melhor eluente a ser utilizado ( 8:2), foi realizado o empacotamento da coluna ( dimetro: 2,5 cm) utilizando hexano como solvente. Aplicou-se a amostra bem centralizada e foram adicionados 40 mL de hexano e acetato 9/1, para iniciar a separao. Comeou-se a coletar em frasquinhos de penicilina as fraes do composto , enchendo-os aproximadamente at a metade. Aps a passagem de quase todo o solvente adicionou-se mais 40 mL de hexano e acetato 8/2 para aumentar a polaridade da fase mvel e terminar a separao do composto. Aps coletar todo o composto , total de 35 frasquinhos , realizou-se a CCD para identificar os frascos com as porcentagem da lactona. Identificadas as fraes desejadas, foram unidas em um balo de fundo redondo para realizar a evaporao do solvente. O balo foi acoplado ao sistema do rota- evaporizador , aps 30 min o balo foi retirado contendo somente o produto desejado. Foi pesado a sua massa e calculado o rendimento.

4- Resultados e discusses 4.1- Conceitos aprendidos 4.2- Segurana no laboratrio A segurana em um laboratrio depende do uso de alguns equipamentos pessoais, de ateno e de conhecimento. Os equipamentos pessoais que devem ser utilizados so: guarda-p de algodo de mangas compridas, na altura dos joelhos, calados fechados, luvas, culos de proteo. A ateno muito importante dentro de um laboratrio, devemos estar sempre atentos, nunca testar amostras ou reagentes pelo odor ou sabor, sempre realizar o devido descarte dos reagentes, o que requer um conhecimento do reagente em questo, sempre identificar reagentes e solues, dentre outras. 4.3- Equipamentos bsicos Os equipamentos bsicos utilizados em um laboratrio so: almofariz com pistilo, balo de fundo redondo, balo de fundo chato, balo volumtrico, Becker, bico de Bunsen,

bureta, cadinho, condensador, erlenmeyer, esptulas, estante para tubo de ensaio, funil, funil de buchner, funil de separao, kitassato, pera de borracha, pipeta graduada, pipeta volumtrica, pisseta, proveta, pinas, suporte universal, tela de amianto, trip, tubo de ensaio e vidro de relgio. 4.4- Qumica orgnica A qumica orgnica a qumica que estuda os compostos de carbono, dentre estes as funes orgnicas, que so de grande importncia para a classificao de compostos. Dentre as quais esto os hidrocarbonetos, ster, ter, acido carboxlico, percido, amina, amida, sulfeto, sulfnico, dentre outras. 4.5- Cromatografia Cromatografia uma tcnica de separao das molculas de uma mistura. Existem diferentes tipos de cromatografia, que so classificadas da seguinte maneira: pela forma fsica, fase mvel, fase estacionaria e modo de separao. Existem dois tipos de separao a analtica, que possui a funo de analisar a amostra e a preparativa que tem a funo de isolar a amostra. Na classificao pela forma fsica podemos observar dois tipos de configurao, a cromatografia planar e a cromatografia em coluna. Cromatografia planar pode ser realizada em papel ou em camada delgada. Cromatografia em coluna realizada em coluna clssica, em coluna para cromatografia gasosa e em coluna preparativa. Na classificao pela fase mvel, temos a cromatografia liquida a cromatografia gasosa, que so identificadas pela fase mvel. Na classificao pela fase estacionaria identificamos pela forma da fase estacionaria que pode ser solida (cromatografia gssolido) e liquida (cromatografia gs-liquido). Na classificao pelo modo de separao, podemos utilizar a separao por adsoro, troca inica, excluso, partio e bioafinidade. Na separao por adsoro, o soluto fica adsorvido na fase estacionaria. A troca inica baseada na troca de nions ou ctions, a excluso feita pelo tamanho das molculas, as molculas maiores so excludas primeiro, depois as mdias e as menores. A partio acontece pela interao do soluto pela fase mvel ou estacionaria. Na bioafinidade uma mistura de molcula complexa atrada covalentemente pela fase estacionaria. Para analise de nossas amostras utilizamos a cromatografia em cama delgada (CCD) e a cromatografia a gs (CG). A CCD faz a separao dos componentes de uma mistura atravs da interao da fase estacionaria (solido) e a fase mvel, realizada em escala analtica e preparativa, pelo processo de adsoro. O CG uma tcnica de separao de gs ou lquidos volteis, possui alto poder de resoluo, muito atrativa, pois podem ser usadas pequenas quantidades da soluo. 4.6- Pesagem

O trabalho em um laboratrio envolve o conhecimento de tcnicas bsicas, como por exemplo, a pesagem, evaporao de solventes e destilao de solventes. A pesagem realizada por meio de uma balana. As balanas mais utilizadas em laboratrio so as analticas e as de preciso. 4.7- evaporao de solventes A evaporao de solventes na maioria das vezes realizada utilizando rotaevaporadores,colocamos a mistura em um balo de fundo redondo e acoplamos no sistema, o sistema roda, mantido sobre vcuo e esta acoplado a um condensador, quando se aquece o balo faz-se uma emerso parcial, a maneira mais fcil de se evaporar um solvente. 4.8- Destilao de solventes A destilao de solventes geralmente usada para purificar o solvente. A separao dos compostos feita pela diferena no ponto de ebulio, colocamos o sistema sobre aquecimento, acoplando um condensador, a substncia com menor ponto de ebulio, ebuli mais rpido, assim coletamos o liquido. 4.9- analise de pigmentos de pimentes por CCD Ao realizar a CCD podemos observar que em todas as mostras tem-se trs manchas distintas. As mais prximas da base so mais polares,pois adsorvem na slica, as dos meio tem polaridade mediana e as que foram mais arrastadas pelo solvente so as menos polares. 5- experimentos ldicos 5.1- Desidratao de acar com cido sulfrico Pode-se observar que a adio de cido sulfrico em acar, faz com que a sacarose esquente, fique amarelada, depois caramelizada at se transformar em carvo. 5.2- Dissoluo de isopor em acetona observou-se que o isopor se dissolve melhor em diclorometano, em acetona ele plastifica e em hexano ele no interage. Pode-se concluir que o isopor tem polaridade similar ao diclorometano por esse motivo se dissolve completamente. 5.3- Estudo de atividades proteolticas de enzimas presentes em frutos Pode-se observar que as frutas que possuem enzimas proteolticas so o mamo e o abacaxi, pois impediram a geleificao da gelatina. O Mamo possui a enzima denominada papaya e o abacaxi a enzima denominada promelina. 5.4- A qumica do refrigerante

Pode-se observar que o refrigerante possui uma grande quantidade de cido em sua formulao, o que comprova que em grandes quantidades prejudicial para o sistema digestivo. 5.5- Garrafa azul Observou-se que ao agitar a soluo ela se tornava roxa e no azul , e ao deix-la em repouso tornava-se incolor. Isso ocorre, pois na presena de hidrxido de sdio, o cido convertido em gliconato de sdio. O azul de metileno catalisa a reao porque atua como um agente de transferncia de oxignio. Ao oxidar a glicose, o azul de metileno reduz-se a leuco- metileno, tornando-se incolor. 5.6- Sntese enzimtica Nesta reao utilizou-se peroxido de hidrognio ao invs do acido metacloroperbenzoico, mas o peroxido de hidrognio somente no consegue realizar a reao por esse motivo adicionamos o cido octanoico e uma lipase. A lipase atua como catalisador na reao, o acido octanoico juntamente com o peroxido de hidrognio reagem para a formao de percido in situ, assim sempre teremos mais cido que percido , o que facilita a reao. No primeiro CCD realizado (antes da extrao do cido) observamos uma grande concentrao de cido, com polaridade mediana. Na CCD realizada aps a extrao observamos que a quantidade de cido havia diminudo, pouco mais de 50% aproximadamente. Apesar de termos realizado as CCD para todas as alquotas ( tempo: 0h, 24h e 72h) no conseguimos observar a formao de produtos. Realizamos ento a CG-EM para uma melhor analise da nossa soluo afim de detectarmos a formao do produto esperado, no caso a lactona. Aps analisarmos todas as amostras no CG-EM, confirmamos que realmente no houve a formao de produtos, o que no era o resultado esperado, mas chegamos a concluso que possivelmente a lipase usada (Candida cylindracea) estava inativa, por isso no agiu como catalisador da reao fazendo com que ela no ocorre-se. Como esse estudo j havia sido realizado por uma de nossas monitoras , usamos os seus resultados obtidos para uma analise e concluso do processo. Pode-se observar o quanto a lipase importante para que a reao acontea. Pode-se concluir que esse processo altamente atrativo, pois conseguimos em um tempo de 24h 3,082% e em 72h 4,283% de rendimento, usando a 2- heptilciclopentanona ( delta- dodecalactona). Com a 2- pentilciclopentanona ( delta- decalactona)obtivemos no tempo de 24h 9,433% e em 72h 19,229% de rendimento, apesar de no ser uma porcentagem muito alta, conseguimos obter os mesmos produtos de uma maneira ambientalmente correta e com riscos reduzidos no processo.

5.7- Sntese qumica Nesta reao utilizou-se o cido meta- cloroperbenzoico para realizao da oxidao da cetona. Apesar da reao ser mais rpida utilizamos mais mtodos para purific-la pois seu co- produto reacional um cido. Pode-se observar a formao de produto, por meio de CCD aps 30 min do inicio da reao. Esse acompanhamento foi sendo feito em intervalos de 1h, e em cada hora passada observou-se um grande aumento na quantidade de produto. Aps a separao na coluna clssica com o acompanhamento por CCD, pode-se observar que os melhor eluentes utilizados foram o hexano e acetato 8/2 e 1/1 com uma polaridade superior ao 9/1 , pois os compostos comearam a aparecer aps a 13 amostra. As fraes do produto sairo entre a 23 amostra e a 35. Pode-se concluir que esse processo vantajoso em tempo de durao da reao e rendimento , pois em menos de 18h obteve-se 41% de rendimento com a 2- heptilciclopentanona ( delta- dodecalactona) e 47% com a 2- pentil- ciclopentanona ( deltadecalactona).

5.8- Concluso Conclui-se que, a sntese qumica mais eficaz em questo de rendimento e tempo de reao, enquanto a sntese enzimtica tem a obteno do mesmo produto de uma forma ambientalmente correta, pois tem a formao in situ de percido e como co- produto reacional gua. Ambos possuem desvantagens, o mtodo qumico alm de ser mais difcil a purificao do produto, libera gases txicos e como co- produto reacional um cido, o que prejudicial ao meio ambiente. J o mtodo enzimtico no to eficaz em tempo de reao e rendimento. Contudo, a sntese enzimtica ambientalmente correta, seu co- produto reacional a gua, tem-se a formao de percido in situ em concentraes catalticas, o que diminui os riscos no processo e pode ser aprimorada, afim de ser utilizada em escala industrial.