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-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE =
BASE
PENTOSE
GROUPE(s) PHOSPHATE(s)
Pyrimidine
Purine
Pyrimidine
Purine
-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE =
BASE
PENTOSE
GROUPE(s) PHOSPHATE(s)
NUCLEOSIDE
Ribose ARN
2 dsoxyribose ADN
Liaison N-osidique
-Les acides nucliques (ADN/ARN )sont des polymres linaires de nuclotides relis par des liaisons phosphodiesters
-NUCLEOTIDE =
BASE
PENTOSE
GROUPE(s) PHOSPHATE(s)
NUCLEOSIDE
Nucloside monophosphate
Liaison phosphomonoester
Nucloside triphosphate
orientation de la chaine
dsoxyribose
5-3
dA-dC-dT-dG 5 T-A-G 3 T
p p
A
p
Hlice droite dADN : molculaire double brin: -Antiparallle -Complmentarit des bases [A]=[T] et [C]=[G]
Il existe diffrents protocoles exprimentaux pour extraire les acides nucliques qui suivent approximativement le mme schma gnral:
-Dgradation protines: -hydrolyse enzymatique: -prcipitation des protines avec des agent s chaotropiques -Extraction des acides nucliques (Elimination protines et lipides) -extraction phnol /chloroforme (non miscible hydrophobe):
pH 8
Dbris lipidiques
A pH acide pH5
ADN
Dbris lipidiques
-Extraction des acides nucliques et concentration des acides nucliques -extraction par chromatographie dadsorption sur colonne de silice
lavage
SiO2
Principales tapes de purification des acides nucliques: miniprparation plasmidique Technique:LYSE ALCALINE
2 sortes dADN : LADN gnomique issu du ou des chromosomes des cellules (taille : + 106 pb ) LADN plasmidique ( molcule dADN circulaire double brin extra chromosomique rplication autonome) (petite taille environ 103 pb )
Lyse des cellules + -dtergent SDS (dodcyl sulfate de sodium) -soude pH 13 +Rnase Dnase free Neutralisation rapide de la solution
Rappariement des duplex dADN. LADN gnomique trs long ne peut se rapparier correctement. Il devient insoluble. LADN plasmidique se renature et reste en solution.
I0
A= log (1/T)=log
I0 I
Les nuclotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotes A,C,G,T, U
-Estimation de la concentration en acides nucliques - Estimation de la puret de lchantillon
Abs
Spectre dabsorbance
260 nm
C
Concentration M
Trajet optique cm
si le rapport est < 1,7 prsence de protines Si le rapport est > 2 prsence dARN
Pour dterminer approximativement des concentrations en acides nucliques de solutions pures , on peut assumer que:
Ce dosage est facile dutilisation et sensible (2-3 g/ml) mais ne peut pas tre utilis pour des concentrations infrieures 0,25 g/mL (Abs 260=0.005)
Le gel est constitu de polymres formant un maillage dagarose ou polyacrylamide, baignant dans un tampon conducteur.
La vitesse de migration des acides nucliques dpend: -leur masse molculaire donc de leur taille (bases ou pb) -du maillage du gel support de llectrophorse (concentration en agarose ou acrylamide)
Cas particulier de lADN et du BET: Electrophorse sur gel Llectrophorse permet aussi de sparer des molcules dacides nucliques suivant leur structure: par exple diffrentes formes dun plasmide (molcule dADN circulaire double brin extrachromosomique rplication autonome).
+
-forme relche
-forme linaire -forme surenroule
III
II
Forme I circulaire covalemment ferme Forme II circulaire relache (un brin coup) Forme III linaire (deux brins casss) Aprs une prparation plasmidique on rcupre les formes I et III. Aprs digestion par des enzymes de restriction la forme III
Des outils enzymatiques pour tudier les acides nucliques Les enzymes de restriction
-Endonuclases qui hydrolysent les liaisons phosphodiesters lintrieur dun ADN double brin des sites spcifiques palindromiques (4 8 pb).
G/AATTC
Ces enzymes catalysent la formation dune liaison phosphodiester entre un 5 phosphate et un 3OH adjacent. Elles permettent une liaison covalente entre deux molcules dADN (ligature-ligation). Elles ncessite nt le nuclotide ATP .
2 AMP + PPi
Phosphatase alcaline
CGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAA
T4 polynuclotide kinase + Adnosine -P-P-P32 (ATP P32) phosphorylation ADP
pCGATC----------GCATTTOH OHGCTAG-----------CGTAAAp
dNTPs
3 3
A-C-G-T-A-C-T-G-G-C-A-C-C-T-G-A-A-T-T-T-G-C-A-T-T-G-C-A
ADN polymrase
Mg2+
5 5
*
On peut marquer un ADN par synthse en ajouter un dNTP P32