TCNICAS DE INVESTIGACIN EN CNCER CURSO 2007/2008

Javier Sez Castresana Unidad de Biologa de Tumores Cerebrales-CIFA Facultad de Ciencias jscastresana@unav.es

Ayudantes Mnica Enguita Jana Balbuena Paula Schiapparelli

ESQUEMA DE TRABAJO LUNES 9-10 10-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 RFLP (correr gel de agarosa) Preparar gel para PCR diferencial SSCP (tincin de plata) SSCP (tincin de plata) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (correr gel de agarosa) MSP (correr gel de agarosa) Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Examen. Aula 4 Los Castaos Examen. Aula 4 Los Castaos Examen. Aula 4 Los Castaos Clase terica Clase terica RFLP (digestin producto PCR y preparar gel de agarosa) PCR diferencial SSCP (preparar gel de acrilamida) SSCP (cargar gel de acrilamida) PCR diferencial (correr gel de agarosa) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (tratamiento con bisulfito) MARTES MIRCOLES JUEVES Examen Saln de Actos de Ciencias Clase terico-prctica Clase terico-prctica Clase terico-prctica VIERNES Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1,2,7

MSP (PCR y preparar gel de Clase terico-prctica agarosa)

Si no se especifica ningn lugar, la clase se imparte en el laboratorio de prcticas de Gentica en la 4 planta del edificio de Ciencias.

CGH Se realizar la tcnica de CGH para determinar el perfil de ganancias y prdidas de material gentico de las lneas celulares de neuroblastoma IMR-32 y SK-N-MC. PROTOCOLO Marcaje del DNA por nick translation (CGH Nick Translation Kit, Vysis) 1- Marcar por separado 500 ng de DNA normal (S-101) y 1 g de DNA tumoral (IMR-32 o SK-N-MC). Para ello aadir a un tubo de 0,2 ml (volumen final de reaccin 50l): - Buffer 10X - dNTPs 0,1 mM - dTTP 0,1 mM - dUTP 0,2 mM - Mezcla de enzimas - DNA - Agua estril 5 l 10 l 5 l 2,5 l (Spectrum Green para el DNA tumoral y 10 l x l hasta completar 50 l

Spectrum Red para el DNA normal)

2- Mezclar con vrtex e incubar 2 horas a 15C. 3- Poner los tubos a 4C para que las enzimas no acten. 4- Cargar 5l del producto de reaccin en un gel de agarosa al 1% en TAE. Correr el gel a 100V durante 40 min. 5- Los fragmentos de DNA observados en el gel deben tener entre 250 y 2000 pb (si fuera necesario incubar un poco ms de tiempo a 15C) 6- Pasar todo el volumen de reaccin restante a un tubo de 1,5 ml. Ruptura de las enzimas a 70C durante 10 min. 7- Poner en hielo. Purificacin del DNA (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen) 1- Poner agua estril a calentar a 65C. 2- Aadir 5 volmenes (225l) de buffer PB y mezclar. 3- Ponerlo en una columna y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 3

4- Descartar el sobrenadante. 5- Aadir 750l de buffer PE y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 6- Descartar el sobrenadante y volver a centrifugar para eliminar bien los restos. 7- Pasar la columna a un tubo limpio de 1,5 ml. 8- Aadir 50l de agua estril a 65C, incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 9- Volver a aadir 50l de agua estril a 65C, incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 10- Poner en hielo. Precipitacin del DNA 1- Mezclar los DNAs normal y tumoral marcados y purificados anteriormente. 2- Aadir 30g de DNA humano CotI. 3- Aadir 1/10 volmenes de acetato sdico 3M pH 5,2 y 2,5 volmenes de etanol absoluto. 4- Precipitar 1 hora a -80C o toda la noche a -20C. 5- Centrifugar a 13000 rpm 30 min a 4C. 6- Retirar bien el sobrenadante y dejar secar el DNA en oscuridad de 5 a 10 min. 7- Aadir 7l de buffer de hibridacin (LSI/WCP hybridization buffer, Vysis) y 3l de agua estril. Resuspender bien. Desnaturalizacin de las sondas (DNAs marcados) 1- Incubar la mezcla de hibridacin a 80C 10 min. 2- Posteriormente incubar a 37C 30 min. Desnaturalizacin de las metafases (durante la incubacin de la sonda a 37C) 1- Deshidratar las metafases introduciendo los portas en copling con etanol de gradacin creciente (70%, 80% y 100%) durante 3 min a temperatura ambiente en cada uno de ellos. 2- Desnaturalizar las metafases introduciendo los portas en un copling (35 ml de formamida desionizada, 5 ml de 20X SSC y 10 ml de agua MiliQ todo a pH 7) a 80C durante exactamente 1 min 30 s.

3- Inmediatamente deshidratar en etanol de gradacin creciente (70%, 80%, 100%) preenfriado a -20C durante 3 min a -20C en cada uno de ellos introduciendo los coppling en el congelador. 4- Dejar secar el porta hasta que la sonda est preparada. Hibridacin 1- Aadir la sonda sobre las metafases. 2- Cubrir con un cubre pequeo teniendo cuidado de no formar burbujas. 3- Envolver en parafilm. 4- Incubar bocabajo en una cmara hmeda en oscuridad en una estufa a 37C durante 72 horas. Lavados 1- Lavar en copling con 0,4X SSC, 0,3% NP40 a 75C 2 min. 2- Lavar en copling con 2X SSC, 0,1% NP40 5 min a temperatura ambiente en agitacin. 3- Lavar en copling con PBD 1X, 2 min a temperatura ambiente. 4- Dejar secar en oscuridad a temperatura ambiente 10-15 min. Montaje de las preparaciones 1- Mezclar DAPI II con Antifade en proporcin 1:1 y aadir 20l de la mezcla por porta. 2- Poner cubre grande y sellar con rubbert cement. 3- Meter unos minutos en la nevera. 4- Visualizar los resultados.

ESTUDIO DE HIPERMETILACIN A NIVEL DE PROMOTOR Determinacin del grado de hipermetilacin a nivel del promotor del gen RASSF1A en las lneas celulares de neuroblastoma SK-N-MC, SIMA, MC-IXC e IMR-32 mediante MSP. PROTOCOLO TRATAMIENTO CON BISULFITO SDICO (CpGenomeTM DNA Modification Kit, Chemicon) PASO 1. Preparacin de los reactivos. - Preparar una solucin de NaOH 3M (preparar en el momento antes de usar) Disolver 1 g de NaOH en 8.3 ml de agua destilada autoclavada. - Preparar una solucin de 20 mM NaOH/90% EtOH (preparar en el momento antes de usar) Para preparar 1 ml de solucin mezclar 900 l de EtOH absoluto, 93.4 l de agua estril y 6.6 l de NaOH 3M. - Disolver el reactivo I (preparar en el momento antes de usar) Para cada muestra a modificar pesar 0.227 g de reactivo I y aadirles 0.571 ml de agua destilada estril. Ajustar el pH a 5.0 con aproximadamente 20 l de NaOH 3M por muestra. Medir el pH con tira o con pHmetro. - Disolver el reactivo II Aadir 1 l de -mercaptoethanol a 20 ml de agua desionizada. Para cada muestra a modificar aadir 750 l de esta solucin a 1.35 g de reactivo II. Este reactivo una vez preparado puede conservarse a temperatura ambiente protegido de la luz hasta un mximo de 6 semanas. PASO 2. Modificacin con bisulfito Modificar las muestras: S-101 (sangre normal), SK-N-MC, SIMA, MC-IXC, IMR-32 e IMD (DNA metilado in vitro) 6

1. Mezclar 1 g de DNA con 2 l de reactivo IV en un volumen final de 100 l de agua estril, en tubos de 1,5-2 ml con tapn de rosca. Aadir 7 l de NaOH 3M y mezclar. 2. Incubar 10 min a 37C. 3. Aadir 550 l de reactivo I y mezclar con vortex. 4. Incubar 16 h a 50C. 5. Resuspender el reactivo III con vortex hasta que no quede ningn grumo. 6. Aadir 5 l de reactivo III. 7. Aadir 750 l de reactivo II y mezclar brevemente. 8. Incubar a temperatura ambiente durante 5-10 min. 9. Centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm) para precipitar del reactivo III con el DNA (debe observarse un pequeo precipitado blanco). Descartar el sobrenadante. 10. Aadir 1 ml de EtOH al 70%, mezclar con vortex, centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm) y descartar el sobrenadante. Repetir este paso un total de 3 veces. 11. Una vez descartado el sobrenadante del tercer lavado centrifugar 2 min a 13000 rpm y eliminar los restos de sobrenadante con una micropipeta. 12. Aadir 50 l de 20 mM NaOH/90% EtOH. 13. Resuspender el precipitado dndole un vortex breve e incuba a temperature ambiente 5 min. 14. Centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm). Aadir 1 ml de EtOH al 90% y dar un vortex para lavar el precipitado. Centrifugar de nuevo y decantar el sobrenadante. Repetir este paso una vez ms. 15. Despus de eliminar el sobrenadante del segundo lavado, centrifugar la muestra a 13000 rpm 3 min. 16. Eliminar TODO el sobrenadante con una micropipeta y dejar secar a temperatura ambiente entre 10-20 min. 17. Aadir 25 l de agua estril y dar un vortex para resuspender bien el precipitado. (Al aadir este volumen de agua si partimos de 1 g de DNA la concentracin final ser de 40 ng/l) 18. Incubar las muestras 15min a 50-60C para eluir el DNA. 19. Centrifugar 2-3 min a 13000 rpm y transferir la muestra (el sobrenadante) a un tubo limpio. 20. Realizar la MSP o la secuenciacin, o guardar las muestras a -20C durante mximo 2 meses o a -80C durante mximo 6 meses. 7

MSP Realizacin de una PCR para determinar el grado de hipermetilacin a nivel del promotor del gen RASSF1A. Realizar dos PCRs por separado utilizando oligonucletidos para DNA no metilado (U) y para DNA metilado (M) respectivamente. Condiciones de PCR. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig. Sentido (U/M) o Olig. Antisentido (U/M) o DMSO 5% 1U 60 25l 0,2 mM 2,5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles

o AmpliTaq Gold (5U/l) o DNA (ng) Volumen final -

Condiciones del termociclador RASSF1A-U

Desnaturalizacin Desnaturalizacin Emparejamiento Extensin N de ciclos Extensin 94C 10 min 94C 1 min 62C 45 s 72C 45 s 38 72C 10 min 4C

RASSF1A-M
94C 10 min 94C 1 min 58C 45 s 72C 45 s 35 72C - 10 min 4C

Visualizacin de los resultados. Correr 10 l de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 2,5% en TAE a 100V durante 35 min.

PCR diferencial Determinacin de deleciones homocigticas a nivel de la regin STS intrnica g14 del gen DMBT1 en las lneas celulares de neuroblastoma SK-N-MC, SIMA, MC-IXC e IMR32 Muestras: S-101, S-102, S-103, S-104, SK-N-MC, SIMA, MC-IXC e IMR-32. PROTOCOLO Condiciones de PCR. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig. Sentido - g14 - c12 o Olig. Antisentido - g14 - c12 o BioTaq DNA Pol (5U/l) o DNA (ng) Volumen final 25l 20 pmoles 10 pmoles 1U 50 20 pmoles 10 pmoles 0,2 mM 2,5 mM 1X

Condiciones del termociclador

Desnaturalizacin Desnaturalizacin Emparejamiento Extensin N de ciclos 95C 5 min 94C 30s 59C 30 s 72C 30 s 28

Extensin

72C 10 min 4C

Visualizacin de los resultados. Correr 10 l de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 2,5% en TAE a 100V durante 40 min. DETECCIN DE MUTACIONES POR SSCP

Deteccin de mutaciones a nivel del gen p53 en sarcomas. Muestras: DNA de sangre y tumor de un paciente afectado de sarcoma. PROTOCOLO Condiciones de PCR. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig. Sentido o Olig. Antisentido o BioTaq DNA Pol (5U/l) o DNA (ng) Volumen final 25l 0,2 mM 1,5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles 1U 50

Condiciones del termociclador

Desnaturalizacin Desnaturalizacin Emparejamiento Extensin N de ciclos Extensin 95C 10 min 94C 45 s 65C 45 s 72C 45 s 30 72C 10 min

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4C

Visualizacin de los resultados en gel de acrilamida (37.5:1 al 12%) * Gel de acrilamida Acrilamida:bisacrilamida (37.5:1) 40% TAE 10X: H2O MiliQ: 2,25 ml 350 l 4,5 ml

Verter en un vaso de precipitados, mezclar con suavidad, y poner a vaco 10-15 minutos. Una vez preparado el montaje del gel, aadir a la mezcla APS 10%: 70 l Temed: 3,5 l Agitar suavemente para que se mezcle, y, con una pipeta pasteur, verter entre los cristales. Una vez el borde quede rebasado, poner el peine. * Loading Buffer: Formamida: 950 l EDTA: 40 l Azul de Bromofenol y Azul de Xileno cianol: una punta de micropipeta de cada uno. * Preparacin de las muestras: Mezclar 2 l del producto de PCR con 6 l de Loading Buffer. Calentar a 95 C durante 15 minutos, y pasar a hielo de inmediato. * Electroforesis: Buffer de electroforesis: TAE 0,5X. Correr los geles a 300V durante 4h30min-5h a 4C. * Tincin de plata.

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 Separar los cristales, e introducir los geles 10 minutos en 10% etanol en agitacin, para fijarlos. A partir de aqu, todos los pasos se dan en agitacin, y a temperatura ambiente. A continuacin, HNO3 1%, durante 3 minutos. Es importante no exceder este tiempo. Lavar en agua destilada, dos veces, un minuto. Sumergir los geles en la solucin de nitrato de plata 1%, y dejar durante veinte minutos, protegido de la luz. Volver a lavar en agua destilada dos veces, un minuto. Aadir una pequea cantidad de solucin de revelado, (Na2CO3), agitar manualmente hasta que la solucin enturbie, y decantar por la fregadera. A continuacin, aadir mayor cantidad de solucin de revelado, y agitar suavemente, observando cmo van apareciendo las bandas. Detener la reaccin, aadiendo cido actico al 10%, y agitando. Decantar, y lavar con agua destilada.

DETECCIN DE PRDIDA DE HETEROCIGOSIDAD MEDIANTE RFLP Deteccin de prdida de heterocigosidad a nivel del exn 4 de p53. Muestras: S-102, S-103, 28, T98G. PROTOCOLO Condiciones de PCR. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig. Sentido o Olig. Antisentido o BioTaq DNA Pol (5U/l) o DNA (ng) Volumen final 25 l 0,2 mM 1,5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles 1U 50

Condiciones del termociclador

Desnaturalizacin 95C 10 min

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Desnaturalizacin Emparejamiento Extensin N de ciclos Extensin

94C 45 s 57C 45 s 72C 45 s 30 72C 10 min 4C

Ensayo de restriccin Mezclar en un tubo de 0,5 ml: - 3 l de producto de PCR - 2 l de Buffer NE2 - 1 l de enzima BSTUI (2 unidades) - 14 l de agua estril Incubar durante 2h30 min a 60C.

Visualizacin de los resultados Correr todo el volumen de la reaccin de restriccin en un gel de agarosa al 2,5% en TAE a 100V durante 40 min.

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