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ISBN 978-85-60322-03-9

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1º Edição

Instituto de Química de Araraquara

Araraquara

2008

Marcelo Aparecido da Silva

Sobre os Autores

Farmacêutico com habilitação em Fármacos e Medicamentos, formado pela Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas MG. Mestre em Ciências Farmacêuticas: área de concentração Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-Unesp. Doutor em Química, área de concentração Química Orgânica de Produtos Naturais pelo Instituto de Química de Araraquara IQ-Unesp.

Wagner Vilegas

Químico formado pela Universidade de São Paulo. Mestre em Química Orgânica:

área de concentração Química Orgânica de Produtos Naturais, pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Doutor em Química Orgânica: área de concentração Química Orgânica de Produtos Naturais pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Pós-Doutorado na Universitá Degli Studi Di Salerno, UDSS, Itália. Livre docência obtida na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, IQ-UNESP. Professor de Química Orgânica do Departamento de Química Orgânica do Instituo de Química de Araraquara IQ-Unesp.

Lourdes Campaner dos Santos

Química formada pela Faculdade Auxilium de Filosofia Ciências e Letras-FAL. Graduada em Pedagogia pela Faculdade Auxilium de Filosofia Ciências e Letras-FAL. Mestre em Química: área de concentração Química Orgânica de Produtos Naturais, pelo Instituto de Química de Araraquara IQ-Unesp. Doutora em Química: área de concentração Química Orgânica de Produtos Naturais, pelo Instituto de Química de Araraquara IQ-Unesp. Professora de Química Orgânica do Departamento de Química Orgânica do Instituo de Química de Araraquara IQ-Unesp.

Apresentação

Nos últimos anos, os métodos cromatográficos tornaram possíveis as separações de misturas complexas, tanto em escala preparativa como em escala analítica. A cromatografia em contracorrente (CCC) se baseia na partição líquido-líquido, na qual a fase líquida estacionária é retida dentro da coluna do aparelho usado no processo cromatográfico. A CCC, portanto não usa suportes sólidos como fase estacionária, sendo assim, evita adsorções irreversíveis de compostos

polares. Esta é a principal característica da CCC. Na maioria das cromatografias em contracorrente, uma das fases do sistema de solvente bifásico permanece fixa na coluna do aparelho. Já a outra fase

é passada através da fase fixa. Atualmente, a CCC vem sendo uma técnica preparativa amplamente aplicada em

laboratórios de universidades e indústrias. No campo dos produtos naturais, pode ser usada para fracionar extratos brutos, assim como frações semipuras, em quantidades que variam de miligramas

a gramas. A CCC é muito utilizada nas separações de substâncias com polaridade elevada. Além

destas aplicações, a técnica é bastante promissora na obtenção de padrões químicos de alta pureza,

com rapidez, eficiência e economia de solventes. Diante deste cenário, percebemos a necessidade de um livro, em português, que trate da técnica de cromatografia em contracorrente, não apenas voltado ao ensino teórico da CCC, mas que pudesse conter as necessidades do dia a dia de um laboratório de separação de produtos naturais. É com essa perspectiva que vemos a importância deste livro por abordar aspectos práticos e teóricos da cromatografia em contracorrente. Uma obra que ajudará muito o ensino da CCC em aulas para a graduação e pós-graduação das universidades brasileiras.

Os Autores

Índice

História da cromatografia líquido-líquido

01

Classificação dos instrumentos de cromatografia em contracorrente

05

Sistema de equilíbrio hidrostático

05

Sistema de equilíbrio hidrodinâmico

05

Cromatografia em contracorrente de alta velocidade – HSCCC

08

Escolha do sistema de solvente

10

Sistemas de solventes usados em CCC

12

Figuras e esquemas dos equipamentos de CCC

15

Bibliografia

29

História da cromatografia líquido-líquido

Em meados da década de 40, dois químicos ingleses, Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge, elaboraram um aparelho capaz de manter em contato uma mistura de líquidos imiscíveis (Maciuk, 2005). O contato entre os líquidos acontecia de forma que as duas fases apresentavam, durante o processo de análise, fluxo contrário entre si. Este equipamento foi desenvolvido com o objetivo de separar aminoácidos de misturas complexas. No entanto as separações não foram muito promissoras, pois o aparelho era muito complexo, as fases saiam muito facilmente do sistema de separação e os processos de separações exigiam um longo tempo. Sendo assim, este equipamento foi rapidamente abandonado devido aos resultados não muito promissores apresentados. Lyman Creighton Craig (1906-1974), durante seu trabalho, o qual buscava substância antimalárica, resgatou a idéia já abordada por Martin & Synge, de colocar dois líquidos não miscíveis em contato entre si, mas agora de uma forma mais eficiente. O aparelho de Craig, (Fig. 2.1A), assim denominado, consiste de um aparato de vidro organizado de tal nodo que ele se encontra interconectado entre si ao longo de um eixo. Esta “ampola” de vidro, quando agitada, proporciona um maior contato entre os dois líquidos imiscíveis. Após a separação das fases, basta uma rotação para que haja a transferência de uma das fases para a “ampola” seguinte ou para fora do aparelho (Fig. 2.1B) (JBC, 2005; From et al, 1974).

A
A
B
B

Figura 2.1. (A) Foto do aparelho de Craig – tipo tubo. (B) Esquema do funcionamento do aparelho de Craig.

Os pesquisadores Martin & Synge, usaram o aparelho de Craig para separar diferentes tipos de N-acetil-aminoácidos, preparados por acetilação. Durante os experimentos, a transferência manual dos líquidos das “ampolas”, gerava dificuldades, dentre elas a perda de grande quantidade de solvente além do longo tempo gasto nas separações. Sendo assim, os pesquisadores começaram a pensar na possibilidade de fixar uma das fases em um suporte sólido, tentando com isso evitar os

transtornos ocasionados durante as análises. No decorrer do desenvolvimento, foram testados vários suportes sólidos como fibra, sílica, celulose entre outros. O suporte sólido, neste caso, é destinado a reter a fase estacionária (constituída pela fase aquosa de um sistema imiscível), enquanto que a fase orgânica entra em contato com o liquido que se encontra retido no suporte sólido. Com este mecanismo, há um aumento na superfície de contato entre as duas fases líquidas, e soluciona os problemas ocasionados pelo uso do aparelho de Craig (Maciuk, 2005). Com os experimentos descritos acima, o termo “cromatografia de partição” começou a ser empregado (Tab. 2.1). Por esta nova abordagem do mecanismo de separação cromatográfica, os pesquisadores Martin & Synge foram agraciados com o Prêmio Nobel de Química em 1952 (JBC, 2005; Maciuk, 2005). Concomitantemente aos experimentos de Martin & Synge, Lyman C. Craig desenvolveu um aparelho no qual apresentava 20 “ampolas” acopladas em série, chamado de extrator quantitativo. O mecanismo de separação deste equipamento seria como se fossem colocados 20 funis de separação acoplados em série simultaneamente (Fig. 2.2). Dezenove funis possuíam somente fase inferior enquanto que um apresentava as duas fases. O processo de agitação – decantação – transferência se repetia para todos os funis. Mas somente a fase superior era transferida para o funil subseqüente. Este processo é descontinuo, pois as fases passam pelas etapas de agitação – decantação – transferência durante todo o tempo necessário para o experimento. O processo descontinuo causa a perda de fases durante as transferências e proporciona um longo tempo de separação. Estes são os dois problemas ocasionados neste tipo de aparelho. A maior aplicação que Craig fez deste equipamento, foi em conjunto com Vincent du Vigneaud em 1947, onde eles extraíram e caracterizaram a Penicilina, além de estimaram o grau de pureza da Benzilpenicilina. Estas análises foram feitas em um sistema de solvente composto por éter e por uma solução aquosa tamponada (JBC, 2005).

por éter e por uma solução aquosa tamponada (JBC, 2005). Figura 2.2. Foto do aparelho de

Figura 2.2. Foto do aparelho de Craig – tipo tubo com 20 “ampolas” acopladas em série.

Em 1950, Craig acoplou 200 “ampolas” em série no aparelho de extração. No ano de 1958, fez o acoplamento de 1000 “ampolas” em série. A partir de então, o aparelho de Craig foi utilizado para extrair e examinar várias substâncias como, gramicidina, bacitracina, insulina, ácidos biliares, albumina sérica, hormônios da tireóide, RNA, ribonucleases, oxitocinas, vasopressina, adenocorticotropicos e hormônios lactogênicos (JBC, 2005). O aparelho de Craig foi usado por Robert Halley na Universidade de Cornell para o fracionamento do extrato bruto de RNA, obtendo após o fracionamento, tRNA puro. O tempo de fracionamento do RNA foi reduzido, implicando, assim, em uma redução do tempo gasto para o subseqüente sequenciamento do tRNA (JBC, 2005). Desde então a cromatografia em contracorrente vem sofrendo avanços siguinificativos. Estes avanços sempre buscaram a melhora da resolução cromatográfica e a diminuição do tempo das separações. As tabelas 2.2 e 2.4 descrevem a evolução dos aparatos usados nas extrações líquido- líquido, passando pelas cromatografias em contracorrente e chegando nas atuais técnicas de separações cromatográficas (Marston & Hostettman, 1991; Conway, 1989; Mandava & Ito, 1988).

Tabela 2.1. Cronograma do desenvolvimento das técnicas cromatográficas.

Sistema de separação

Autores que desenvolveram

Ano do desenvolvimento

Cromatografia de partição

Martin & Synge

1941

Cromatografia de papel

Consden & Gordon & Martin

1944

Distribuição em contracorrente

Craig

1944

Cromatografia por troca iônica

Mayer & Thompkins

1947

Eletroforese

Haugaard & Kroner

1948

Cromatografia em camada delgada

Ismailov & Shraiber

1951

Cromatografia de exclusão molecular

Barrer

1945

Cromatografia em fase gasosa

Claesson

1946

Cromatografia líquida de alta eficiência

James & Martin

1952

Tabela 2.2. Desenvolvimento das técnicas de separações cromatográficas líquido-líquido.

Equipamento

Autores que

Ano do

Número

desenvolveram

desenvolvimento

da figura

U – Tube cascade unit

Jantzen

1932

01

Partition chromatography

Martin & Synge

1941

---

Cascade percolator train

Kies & Davis

1951

2A e 2B

Compartmental perculator column

Keppes

1954

03

High efficiency continuous mix settle

Hietala

1960

04

Coil planet centrifuge

Ito e colab.

1966

05

Countercurrent distribution centrifuge

Tavel & Bollinger

1968

06

Helix CCC

Ito & Bowman

1970

07

Dopler CCC

Tanimera e colab.

1970

08 e

Locular CCC – rotation and gyration

Ito & Bowman

1970

09A a 09C 10A a 10C

Flow-through coil planet centrifuge-pelley drive

Ito & Bowman

1971

11A e 11B

Eluition centrifuge-planetary pulley drive

Ito e colab.

1972

12A a 12C

Angle rotor CCC

Ito & Bowman

1975

13

Preparative CCC-slow rotating helix

Ito & Bowman

1977

14

Horizontal flow-through cail planet

Ito & Bowman

1978

15A a 15C

centrifuge Nonsynchronous coil planet centrifuge

Ito e colab.

1979

16A e 16B

Toroidal coil planet centrifuge

Ito

1980

17A e 17B

Rotating coil assembly

Ito & Bhatnagar

1981

18

Centrifugal partition chromatography cartridge

Ito e colab.

1981

19A a 19C

High-speed CCC

Ito

1982

20A e 20B

,

Classificação dos instrumentos de cromatografia em contracorrente (Fig. 2.3)

I) Em sistema de equilíbrio hidrostático (HSES). II) Em sistema de equilíbrio hidrodinâmico (HDES).

Sistema de equilíbrio hidrostático

No sistema de coluna estática (com campo gravitacional constante), a coluna é preenchida de fase estacionária, obtida de um sistema de solvente imiscível (Fig. 2.4). A fase móvel, obtida do mesmo sistema de solvente imiscível, é bombeada para a coluna com uma vazão adequada. Com o bombeamento da fase móvel para a coluna, há uma saída de fase estacionária. Esta saída ocorre até um determinado momento, isto acontece quando aproximadamente 50 % das duas fases se encontram dentro da coluna (Hostettmann et al, 2001; Foucault, 1994; Conway, 1989; Mandava & Ito, 1988). Neste momento o aparelho esta apto para receber a amostra. Desvantagens deste tipo de técnica:

- Processos lentos de separações.

- Pouca retenção da fase estacionária dentro da coluna.

- Baixa resolução nas separações.

- Alto consumo de solventes.

Sistema de equilíbrio hidrodinâmico

Para solucionar as desvantagens causadas pelo sistema hidrostático, foram desenvolvidas técnicas de sistema de equilíbrio hidrodinâmico (Fig.2.4). Neste sistema, através de um campo gravitacional variável, consegue-se reter uma maior quantidade (± 80 %, depende do sistema de solvente) de fase estacionária dentro da coluna cromatográfica. Com o aumento da retenção de fase estacionária, há uma melhora siguinificativa na resolução das separações. Além do tempo de análise ser reduzido, quando o equipamento utiliza este sistema de equilíbrio. Neste tipo de sistema há uma força centrífuga atuando na coluna do aparelho. E é justamente esta força centrífuga que evita a perda excessiva da fase estacionária (Ito, 2005; Hostettmann et al, 2001; Conway, 1989; Mandava & Ito, 1988). Além deste processo proporciona uma contínua partição do soluto entre as duas fases imiscíveis.

CCC

CCC Campo gravitacional Campo gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o
CCC Campo gravitacional Campo gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o
CCC Campo gravitacional Campo gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o
CCC Campo gravitacional Campo gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o

Campo gravitacional

Campo gravitacional

constante

variável

Gravidade

Força

gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o v i m e n
gravitacional constante variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o v i m e n

DCCC

RLCCC

centrífuga

variável Gravidade Força DCCC RLCCC centrífuga CPC M o v i m e n t o

CPC

Movimento

planetário HSCCC
planetário
HSCCC

Figura 2.3. Classificação dos diferentes instrumentos de CCC segundo Hostettmann et al, 2001. DCCC: Cromatografia em contracorrente de gotejamento. RLCCC: Cromatografia em contracorrente de rotação locular HSCCC: Cromatografia em contracorrente de alta velocidade. CPC: Cromatografia de partição centrifuga.

Coluna gira
Coluna gira

Figura 2.4. Sistemas de cromatografia em contracorrente baseado em Hostettmann et al, 2003.

O sistema de equilíbrio hidrodinâmico, onde a força centrifuga pode ser variada (Fig. 2.4), recebe o nome de cromatografia em contracorrente de partição centrífuga – CPC. As colunas utilizadas pelos equipamentos deste sistema podem ser de duas maneiras: Em espiral (“Coil Planet Centrifugal”) ou em cartucho (“Centrifugal Partition Chromatography”) (Fig. 2.5). Na coluna em espiral, dos equipamentos mais modernos, o equilíbrio hidrodinâmico dos solventes ocorre devido ao movimento planetário. Já nas colunas em cartucho o equilíbrio se da pelo movimento axial central (Fig. 2.5), (Conway, 1989).

CCC

Campo gravitacional variável

Força centrífuga

Coluna

Cartucho Espiral "Centrifugal Partition Chromatography" "Coil Planet Centrifugal"
Cartucho
Espiral
"Centrifugal Partition
Chromatography"
"Coil Planet Centrifugal"
A B
A
B

C

E

D

"Coil Planet Centrifugal" A B C E D F Figura 2.5. Classificação do aparelho segundo o
F
F

Figura 2.5. Classificação do aparelho segundo o tipo de coluna. (A) Aparelho FCPC Kromaton Technologis ® , velocidade de rotação 200-2000 rpm, capacidade da coluna 200 mL, (B) Detalhe da coluna do Kromaton, (C) Esquema do sistema de partição da coluna do equipamento, (D) Aparelho de HSCCC P.C.Inc ® , capacidade da coluna 325 mL, velocidade de rotação 0-1200 rpm, (E) Detalhe da coluna e do contra peso do equipamento de HSCCC, onde ocorre o movimento planetário, (F) Esquema do sistema de partição da coluna do equipamento de HSCCC.

Entre os equipamentos que usam o sistema hidrodinâmico, como principio de separação, o mais utilizado nas separações de produtos oriundos de plantas, fungos e organismos marinho, é a cromatografia em contracorrente de alta velocidade (High Speed Countercurrent Chromatography, HSCCC).

Cromatografia em contracorrente de alta velocidade - HSCCC

Cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC), é uma técnica baseada na partição de um soluto entre dois líquidos imiscíveis. A proporção do soluto que passa para cada uma das fases é determinada pela constante de distribuição (K D ) de cada uma das substâncias presentes na amostra. A constante de distribuição é uma constante física, característica de cada substância, e é dada pela formula:

= [S] da substância de interesse na fase orgânica

da substância de interesse na fase orgânica

[S]

(K D ) S =

(K D

)

S

[S] da substância de interesse na fase aquosa

da substância de interesse na fase aquosa

[S]

Cada substância dissolvida reparte-se em equilíbrio entre as duas fases líquidas não miscíveis de uma forma constante e reprodutível. Nas condições ideais, esta constante depende, além do sistema de solvente, da temperatura. Daí a importância da constante de distribuição na cromatografia líquido/líquido, pois a constante de distribuição pode ser considerada a principal ferramenta usada nas otimizações dos sistemas de solventes utilizados nas separações cromatográficas (Hostettmann. et al, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Thomas & Kleiman, 1991). O HSCCC é um método de separação que emprega apenas líquidos durante as separações, com ausência de suporte sólido e, por isso, tem algumas vantagens em comparação com outras técnicas cromatográficas:

- Não ocorre adsorção irreversível da amostra.

- Há recuperação total da amostra introduzida na coluna do aparelho.

- Redução do risco de degradação das substâncias.

- Rapidez e eficiência do método.

- Apresenta uma versatilidade na escolha dos sistemas de solventes usados nas separações.

- Economia de solventes e colunas.

- Boa resolução em separações semi-preparativa.

- Aumento da área de interfase entre as duas fases.

PTFE

(“polytetrafluoroethylene”) enrolados em torno de um suporte central para formar camadas múltiplas (Fig. 2.6) (Ito, 2005)

No

equipamento

de

HSCCC,

a

bobina

(coluna)

é

construída

com

tubos

de

de HSCCC, a bobina (coluna) é construída com tubos de Figura 2.6. Esquema de distribuição dos

Figura 2.6. Esquema de distribuição dos tubos PTFE em torno de um eixo central (Shinomiya et al, 2002).

A coluna gira em torno do eixo central da centrífuga e, simultaneamente, gira ao redor do seu próprio eixo (Fig. 2.7). O movimento da coluna provoca uma agitação vigorosa das fases do sistema de solvente, provocando um processo de mistura repetitiva, além de proporcionar zonas de mistura e separação das fases (Foucault & Chevolot, 1998; Mandava & Ito, 1988). Este intercâmbio rápido explica porque são possíveis separações eficazes com pequeno volume de solvente. Um dos parâmetros experimentais mais importante (β) é definido como a proporção entre o raio da coluna (r) e o raio do giro da coluna no movimento planetário (R), (Fig.2.7).

do giro da coluna no movimento planetário (R), (Fig.2.7). Figura 2.7. Esquema do movimento da coluna

Figura 2.7. Esquema do movimento da coluna e a distribuição dos solventes em HSCCC (Hostettmann et al, 2003).

Atualmente, o HSCCC tem sido uma técnica preparativa amplamente aplicada em laboratórios de universidades e indústrias. No campo dos produtos naturais, o HSCCC pode ser usado para fracionar extratos brutos, assim como frações semipuras, em quantidades que variam de miligramas a gramas (Hostettmann. et al, 2001; Marston et al, 1990). O HSCCC é muito utilizado nas separações de substâncias com polaridade elevada. Isto é possível, pois a técnica evita a adsorção irreversível da amostra na fase estacionária, como acontece freqüentemente na sílica, causando com isso uma perda de massa ou até mesmo a perda total da amostra. Além destas aplicações, a técnica é bastante promissora na obtenção de padrões químicos de alta pureza, com rapidez, eficiência e economia de solventes (Leitão, 2005; Zhang et al, 2003).

Escolha do sistema de solvente

A correta escolha dos sistemas de solventes é crucial para o êxito das separações no

HSCCC. As combinações de solventes mais eficazes são aquelas que proporcionam uma constante de distribuição próxima de 1 (Foucault & Chevolot, 1998; Conway, 1989). A escolha tem que obedecer alguns pré-requisitos para que a separação seja eficiente, estes são:

- As misturas têm que formar sistemas imiscíveis.

- O sistema de solvente tem que solubilizar a amostra.

- As duas fases têm que se separar rapidamente após agitação (< 30 seg.).

- Se possível, formar volume igual de fase superior e inferior.

- Proporcionar uma constante de distribuição próxima de 1.

- Não formar emulsão.

- Formar mistura pouco viscosa.

- Apresentar pequena diferença de densidade entre a fase aquosa e a fase orgânica.

As misturas de solventes podem ser binária (pouco usada, por causa da grande diferença de

polaridade dos solventes), terciária, quaternária entre outras. A adição de um terceiro ou de um quarto solvente, miscível com os outros componentes da mistura, diminui a diferença de polaridade

entre as duas fases (Hostettmann et al, 1984). Assim consegue-se aumentar a seletividade do sistema, permitindo as separações de substâncias com Rf’s próximos. A adição de um solvente auxiliar provoca, ainda, uma diminuição da tensão interfacial e da viscosidade do sistema (Ito, 2005; Mandava & Ito, 1988). A figura 2.8 apresenta alguns solventes auxiliares usados nas otimizações de sistemas de solventes para HSCCC.

A constante de distribuição pode ser facilmente determinada analisando a fase superior e

inferior de uma mistura de solventes, após a dissolução da amostra. Para isso devem ser seguidas as

Figura 2.8. Solventes auxiliares usados nas otimizações de sistemas de solventes aplicados em HSCCC. Figura

Figura 2.8. Solventes auxiliares usados nas otimizações de sistemas de solventes aplicados em HSCCC.

otimizações de sistemas de solventes aplicados em HSCCC. Figura 2.9. Etapas para a determinação da constante
otimizações de sistemas de solventes aplicados em HSCCC. Figura 2.9. Etapas para a determinação da constante

Figura 2.9. Etapas para a determinação da constante de distribuição de uma amostra no sistema de solvente escolhido (Conway, 1989).

Aproximadamente 1 mg da amostra é dissolvido no sistema de solvente escolhido. Após

agitação e separação das fases (decantação), as duas fases são analisadas separadamente, em

proporções iguais. Várias técnicas podem ser utilizadas para esta análise, sendo a mais comum e

menos onerosa, a cromatografia em camada delgada (CCD). A fase inferior e superior são aplicadas

em proporções iguais na placa. Em seguida é feito a eluição da placa em um sistema de solvente

que proporcione uma boa resolução. Ocorrido a eluição, a placa é analisada em luz ultravioleta e

revelada com um reagente químico adequado. A constante de distribuição é obtida comparando-se

as proporções das substâncias em cada fase. Utilizando a formula (K D ) S = [S] na fase orgânica / [S]

na fase aquosa. A situação ideal é obter um (K D ) S igual ou próximo de 1 para cada substância (Fig.

09), (Ito, 2005; Hostettmann. et al, 2003; Foucault & Chevolot, 1998).

A tabela 03 arrola vários exemplos de sistemas de solventes usados em CCC, com destaque

para as fases usadas em DCCC, RLCCC e HSCCC.

Tabela 2.3. Exemplos de sistemas de solventes usados em CCC para as separações de produtos

naturais e outras amostras, transcritas segundo as literaturas: Ito, 2005; Hostettmann. et al, 2001;

Conway, 1989.

Amostras

Sistema de solvente (proporções)*

Agliconas de flavonóides

CHCl 3 :MeOH:H 2 O (4:3:2) 1 CHCl 3 :MeOH:H 2 O (13:7:4) 3 CHCl 3 :MeOH:n-BuOH:H 2 O (10:10:1:6) 2, 3 EtOAc:n-PrOH:H 2 O (140:8:80) 1

Isoflavonas

CHCl 3 :MeOH:H 2 O (7:13:8) 2, 3 EtOAc:EtOH:H 2 O (5:1:5) 1 EtOAc:n-BuOH:EtOH:H 2 O (30:6:10:50) 1 Hex:EtOAc:n-BuOH:MeOH:AcOH:H 2 O (1:2:1:1:1:5) 1

Flavonóides glicosilados

CHCl 3 :MeOH:H 2 O (7:13:8) 2 CHCl 3 :MeOH:iso-PrOH:H 2 O (5:6:1:4) 2 CHCl 3 :MeOH:n-PrOH:H 2 O (5:6:1:4) 2 CHCl 3 :MeOH:n-BuOH:H 2 O (10:10:1:6) 2 EtOAc:n-PrOH:H 2 O (140:8:80) 1 EtOAc:n-PrOH:H 2 O (4:2:7) 3 EtOAc:n-BuOH:H 2 O (3,5:1,5:5) 1 EtOAc:n-BuOH:H 2 O (1:4:5) 1 EtOAc:n-BuOH:H 2 O (2:1:3) 1 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (1:3:2:4) 1 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (1:4:3:4) 1 Hex:n-BuOH:MeOH:H 2 O (1:4:2:6) 1 n-BuOH:AcOH:H 2 O (4:1:5) 2

Catequinas

CHCl 3 :MeOH:iso-PrOH:H 2 O (8:7:1:6) 3 CHCl 3 :MeOH:H 2 O (7:13:8) 2, 3 EtOH:n-PrOH:H 2 O (4:2:7) 3

EtOAc:n-PrOH:H 2 O (140:8:80) 1 EtOAc:n-PrOH:H 2 O (4:2:7) 3 EtOAc:EtOH:H 2 O (25:1:25) 1 Hex:EtOAc:H 2 O (1:10:10) 1 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (1:1:1:1) 1 n-BuOH:n-PrOH:H 2 O (2:1:3) 2

Ácido gálico

CHCl 3 :MeOH:H 2 O (7:13:8) 2 EtOAc:n-BuOH:H 2 O (5:1,8:6) 1

Alcalóides

CHCl 3 :MeOH:H 2 O (7:13:8) 2 CHCl 3 :MeOH:H 2 O (5:5:3) 3 CHCl 3 :MeOH:NaAc pH 3,6 (9:12:8) 2 CHCl 3 :MeOH:HCl 5% (5:5:3) 2 CHCl 3 :MeOH:HCl 0,3M (4:1,5:2) 1 CHCl 3 :NaP 0,07M pH 6,4 (1:1) 1 CHCl 3 :NaP 0,07M pH 5,08 (1:1) 1 Hex:EtOH:H 2 O (6:5:5) 1 Hex:EtOH:MeOH:H 2 O (1:1:1:1) 1 Hex:EtOH:MeOH:H 2 O (3:7:5:5) 1 (C 2 H 5 ) 2 O:(CH 3 ) 2 CO:H 2 O (2:2:1) 3

Antraquinonas

CHCl 3 :MeOH:n-PrOH:H 2 O (5:6:1:4) 2 CHCl 3 :MeOH:H 2 O (4:3:2) 1 Hex:EtOH:MeOH:H 2 O (9:1:5:5) 1 Hex:EtAOc:EtOH:H 2 O (5:2:4:1) 2

Lignanas

CHCl 3 :MeOH:n-PrOH:H 2 O (5:6:1:4) 2 Hex:EtOH:MeOH:H 2 O (10:5:5:1) 1 Hex:EtOH:MeOH:NaCl 0,5% (7:3:5:5) 1 Hex:CHCl 3 :MeOH:NaCl 1,2% (1:4:4:2) 1

Esteróides

EtOAc:n-PrOH:H 2 O (6:6:1) 3 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (5:1:5:1) 1 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (12:24:16:9) 1 Hex:EtOH:H 2 O (6:5:2) 1 Hep:C 2 H 4 Cl 2 :MeOH (47:6:72) 2 Hep:Me 2 CO:MeOH (5:1:4) 2 Hep:CH 2 Cl 2 :CH 3 CN (10:3:7) 2

Saponinas

CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O (8:13:7) 2 CHCl 3 :MeOH:NH 3 1% (7:12:8) 2 CHCl 3 :MeOH:n-BuOH:H 2 O (5:6:1:4) 1 CHCl 3 :MeOH:iso-PrOH:H 2 O (5:6:1:4)2 CHCl 3 :MeOH:n-PrOH:H 2 O (5:6:1:4)2 CHCl 3 :MeOH:n-PrOH:EtOH:H 2 O (9:6:1:8:8) 2 EtOAc:n-BuOH:H 2 O (1:1:2) 1 EtOAc:EtOH:H 2 O (2:1:2) 3

Estilbenos glicosilados

EtOAc:EtOH:H 2 O (50:1:50) 1

Lipídios

Hex:EtOH:H 2 O (6:5:4) 1 Hex:MeOH:H 2 O (6:5:3) 1 Hex:CHCl 3 :CH 3 CN (5:1:4) 1 Hex:EtOAc:MeOH:H 2 O (6:5:5:5) 1 Hex:EtOAc:EtOH:H 2 O (3:5:3:4) 1 Hep:C 2 H 4 Cl 2 :MeOH (47:6:72) 2 Hep:CH 3 CN:AcOH:MeOH (4:5:1:1) 1

Açúcares

n-BuOH:AcOH:H 2 O (4:1:5) 1 n-BuOH:EtOH:H 2 O (4:1:4) 1

Vitaminas

Hex:CH 2 Cl 2 :CH 3 CN (20:7:13) 1 Hex:CHCl 3 :CH 3 CN (10:3:7) 1 n-BuOH:EtOH:KH 2 PO 4 0,15M (8:3:8) 1 iso-octano:MeOH (1:1) 1

*Fases usadas em HSCCC 1 ,DCCC 2 e RLCCC 3

Tabela 2.4. Esquemas e fotografias dos aparelhos de CCC e suas evoluções *.

e fotografias dos aparelhos de CCC e suas evoluções *. 01. Esquema do equipamento de contracorrente

01. Esquema do equipamento de contracorrente distribuição de Jantzen.

A B
A
B

02. (A) Esquema do aparato de Kies e Davis, no modo ascendente. (B) O mesmo equipamento no modo descendente.

03. Esquema do equipamento de Keppes. Tabela 2.4. Continuação 04. Aparelho de contracorrente de distribuição

03. Esquema do equipamento de Keppes.

Tabela 2.4. Continuação

Esquema do equipamento de Keppes. Tabela 2.4. Continuação 04. Aparelho de contracorrente de distribuição de Hietala.

04. Aparelho de contracorrente de distribuição de Hietala.

05. Equipamento de coil planet centrifuge. ( 1 ) Eixo responsável pelos diferentes angulos e

05. Equipamento de coil planet centrifuge. (1) Eixo responsável pelos diferentes angulos e velocidades das colunas. (6) Local da coluna.

Tabela 2.4. Continuação

colunas. ( 6 ) Local da coluna. Tabela 2.4. Continuação 06. Esquema do funcionamento do equipamento

06. Esquema do funcionamento do equipamento de Tavel e Bollinger.

07. Esquema do equipamento de helix CCC. Tabela 2.4. Continuação 08. Equipamento de DCCC.

07. Esquema do equipamento de helix CCC.

Tabela 2.4. Continuação

07. Esquema do equipamento de helix CCC. Tabela 2.4. Continuação 08. Equipamento de DCCC.

08. Equipamento de DCCC.

A C B 09. ( A ) Colunas do equipamento de DCCC. ( B )

A

A C B 09. ( A ) Colunas do equipamento de DCCC. ( B ) Detalhes
A C B 09. ( A ) Colunas do equipamento de DCCC. ( B ) Detalhes

C

B

09. (A) Colunas do equipamento de DCCC. (B) Detalhes das fases nas colunas do equipamento de DCCC. (C) Esquema geral do equipamento de DCCC nos modos ascendente e descendente. Tabela 2.4. Continuação

A B
A
B
C
C

10. (A) Esquema do equipamento de CCC locular de rotação. (B) Equipamento de CCC de rotação locular. (C) Esquema do equipamento de CCC de rotação locular, onde se pode variar a inclinação da coluna.

Tabela 2.4. Continuação

A
A
B
B

11. (A) Princípio do funcionamento do flow through coil planet centrifuge. (B) Equipamento de flow through coil planet centrifuge.

Tabela 2.4. Continuação

A B
A
B
C
C

12. (A) Princípio do funcionamento do elution centrifuge. (B) Esquema do equipamento. (C) Três diferentes tipos de colunas usadas no equipamento de elution centrifuge. Tabela 2.4. Continuação

13. Esquema do equipamento de angle CCC. Tabela 2.4. Continuação 14. Equipamento de preparative CCC-slow

13. Esquema do equipamento de angle CCC.

Tabela 2.4. Continuação

Esquema do equipamento de angle CCC. Tabela 2.4. Continuação 14. Equipamento de preparative CCC-slow rotating helix.

14. Equipamento de preparative CCC-slow rotating helix.

A
A
B
B
C
C

15. (A) Aparelho horizontal flow-through cail planet centrifuge. (B) Aparelho horizontal compacto de flow-through cail planet centrifuge. (C) Detalhes das colunas usadas no equipamento horizontal flow-through cail planet centrifuge.

Tabela 2.4. Continuação

A
A
B
B

16. (A) Princípio do funcionamento do equipamento de nonsynchronous coil planet centrifuge. (B) Fotografia do equipamento de nonsynchronous coil planet centrifuge. Tabela 2.4. Continuação

A
A
B
B

17. (A) Fotografia do aparelho de toroidal coil planet centrifuge. (B) detalhe da coluna do equipamento.

Tabela 2.4. Continuação

18. Fotografia do aparelho de rotating coil assembly. A B C 19. ( A )

18. Fotografia do aparelho de rotating coil assembly.

A
A
B C
B
C

19. (A) Esquema do funcionamento de centrifugal partition chromatography cartridge. (B) esquema do rotor com 12 cartuchos. (C) Imagem do aparelho

de centrifugal partition chromatography cartridge. Tabela 2.4. Continuação

A B
A
B

20. (A) Fotografia do high-speed CCC com a coluna na vertical. (B) Fotografia do high-speed CCC com a coluna na horizontal.

* Fonte das figuras 01 a 20 da tabela 2.4: Conway, 1989; Mandava, N. B.; Ito, Y, 1988.

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