BIOMONITORAMENTO DE MUTAGNESE AMBIENTAL

Renata Maria Augusto da Costa

PESQUISA

Aluna do programa de doutorado do Depto. de Biologia/Gentica Instituto de Biocincias/USP recosta@usp.br

Carlos Frederico Martins Menk

Professor titular do Depto. de Microbiologia Instituto de Cincias BiomdicasII/USP cfmmenck@usp.br

Emprego de plantas transgnicas em mutagnese ambiental

Fotos cedidas pelos autores

s organismos vivos esto freqentemente expostos a agentes ambientais que podem induzir modificaes qumicas no DNA, a molcula responsvel pela informao gentica das clulas. As leses no DNA podem ser induzidas por agentes qumicos, provenientes do meio ambiente ou resultantes de reaes qumicas que ocorrem nas prprias clulas; ou ainda por radiaes, tais como a luz ultravioleta (UV) e raios-X. Estas modificaes na estrutura do DNA so prejudiciais s clulas, uma vez que podem prejudicar processos vitais, tais como a duplicao do DNA e a transcrio gnica. Elas tambm podem causar mutaes e aberraes cromossmicas, fenmenos estes que podem levar ao desenvolvimento de processos cancerosos e morte celular. Pelo fato de causarem leses no material gentico e potencialmente gerarem tumores em seres humanos, esses agentes so normalmente conhecidos como genotxicos ou carcinognicos. A presena de produtos qumicos carcingenos no meio ambiente vem sofrendo um crescente aumento, devido atividade humana, tanto rural e industrial, quanto urbana . A deteco destes produtos e seus provveis efeitos nos organismos importante no estudo do impacto que eles podem trazer s populaes animal, vegetal e humana. Uma boa alternativa no emprego de bioindicadores a utilizao de organismos fenotipicamente mais sensveis s leses no DNA. O objetivo do nosso trabalho tem sido a obteno de um indicador vegetal sensvel uma grande variedade de produtos lesivos ao DNA.
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Figura 1Arabidopsis thaliana adulta

O organismo estudado foi Arabidopsis thaliana (figura 1), que apesar de no ser nativa da flora brasileira e no apresentar interesse econmico, ideal para estudos em laboratrio. O pequeno porte, a alta produo de sementes (cerca de 10.000 por indivduo) e o rpido ciclo de vida de cinco semanas facilitam a anlise gentica e a identificao de mutantes.

Para a obteno de uma planta mais sensvel, optamos pelo emprego de uma variedade que apresentasse alterao em alguma via de reparo das leses no DNA. Todos os organismos vivos apresentam mecanismos que reparam, revertem, ou simplesmente toleram a persistncia da leso. O reparo por exciso de nucleotdeos (NER- nucleotide excision repair) uma via de reparo geral, que reconhece e remove leses que distorcem a dupla hlice em um processo multi-enzimtico (para reviso, Petit and Sancar, 1999). Aps o reconhecimento, o segmento de DNA ao redor da leso removido (~30 nucleotdeos), formando uma lacuna que preenchida por meio da polimerizao de uma nova fita, usando como molde a fita no danificada e sua posterior ligao (veja figura 2). Devido esta atuao bastante abrangente, optamos pela obteno de uma planta deficiente no reparo por exciso de nucleotdeos. A obteno dessa planta no uma tarefa fcil, uma vez que o estudo do reparo de DNA em plantas est apenas comeando a despertar interesse cientfico recentemente Vornarx et al., 1998; Britt, 1999). Desta forma, iniciamos a clonagem de genes envolvidos nesta via em Arabidopsis thaliana. Para isso, escolhemos uma protena de funo essencial na remoo de leses no DNA e bastante conservada entre diferentes organismos. Essa protena uma helicase, componente do fator de transcrio da RNA polimerase II, denominada XPB (veja figura 2). A protena vegetal deduzida a partir da seqncia de DNA clonado por ns (atXPB1) apresentou cerca de 50% de homologia com as protenas humana e de levedura (Ribeiro et al., 1998). Entretanto,

diferindo de outros organismos, a protena vegetal est representada em duas cpias gnicas, expressas em todos os tecidos e todas as fases do desenvolvimento. A ao da protena vegetal atXPB1 na remoo de leses no DNA foi inicialmente verificada por meio de ensaios de complementao em leveduras mutantes para o gene rad 25, homlogo XPB. Aps exposio doses crescentes de luz UV, as leveduras que expressavam a protena vegetal apresentaram significativo aumento no nvel de sobrevivncia. Este resultado sugere que atXPB1 atua na remoo das leses induzidas por UV. Aps a primeira indicao de que a protena clonada estaria, de fato, envolvida no reparo por exciso de nucleotdeos, prosseguiu-se o estudo atravs da obteno de uma planta mutante transgnica para esse gene, e portanto, mais sensvel aos compostos genotxicos. Para a obteno de mutantes, a metodologia mais utilizada em organismos animais e em leveduras a insero de um fragmento de DNA conhecido no gene de interesse. Entretanto, essa mutagnese dirigida ainda no possvel em plantas, uma vez que requer recombinao somtica, a qual quase inexistente em clulas vegetais (Leehan e Feldmann, 1997). Dessa forma, a integrao de um DNA de transferncia (T-DNA) um sistema alternativo para mutagnese em A.thaliana. O TDNA o segmento de um plasmdeo indutor de tumorognese de Agrobacterium tumefaciens, delimitado por seqncias de repeties imperfeitas. Como mostrado na figura 3, o T-DNA, incluindo qualquer seqncia inserida entre as bordas, pode ser transferido por meio de Agrobacterium s clulas vegetais e ser inserido aleatoriamente no genoma. Vale lembrar que nesta metodologia a seqncia de T-DNA foi modificada geneticamente atravs da eliminao do promotor de tumorognese. No lugar desta seqncia indutora de tumores, est presente um marcador de resistncia ao

Figura 2- Modelo para o reparo por exciso de nucleotdeos (NER) em eucariontes. Em amarelo so representados os componentes desta via de reparo j identificados em plantas

antibitico que permite a seleo de plantas transformadas. Ns empregamos uma biblioteca de Arabidopsis thaliana com cerca de 30.000 plantas contendo, em mdia, 1,5 insertos independentes por genoma (gentilmente cedida por D. Bouchez). A identificao da planta contendo o gene atXPB1 interrompido foi feita por meio de triagem via PCR (polymerase chain reaction, ou reao em cadeia por polimerase, tcnica que permite amplificao de seqncias especficas de DNA). A escolha dos iniciadores utilizados foi muito

importante para o sucesso da seleo e est esquematizado na figura 4. Foram desenhados oligos para o gene atXPB1 distantes entre si cerca de 1 Kpb, o que permitiu uma total cobertura do DNA genmico durante a triagem. Nas reaes de PCR foram empregados pares de iniciadores correspondentes ao gene em questo e s bordas do TDNA inserido. A identificao da planta contendo o gene interrompido foi realizada gradativamente, partindo de hiper pools com cerca de 750 plantas, reduzindo o nmero de plantas na amostra testada at a obteno da planta positiva. A confirmao da disrupo do gene atXPB1 foi obtida aps o sequenciamento de bases do fragmento gerado na reao de PCR. Como pode ser visualizado na figura 5, este est localizado na extremidade do ltimo domnio de helicase da protena, o que provavelmente resulta em perda da atividade enzimtica. Aps a obteno da planta mutante para o gene de reparo atXPB1 foram iniciados os primeiros testes de sensibilidade a agentes genotxicos. A sensibilidade da planta mutada foi testada para o agente qumico metilante, metil metano sulfonato (MMS), que lesa o DNA por insero de um grupo metila nas bases nitrogenadas dessa molcula. O tratamento foi realizado em plntulas de cinco dias e, aps alguns dias, as plntulas mutantes apresentaram sensvel reduo no crescimento em doses baixas do agente qumico. Em doses superiores de MMS, as plntulas mutantes apresentaram porcentagem de sobrevivncia muito inferior s plntulas selvagens (figura 6). Esse resultado sugere que a planta mutante para atXPB1 apresenta deficincia na remoo das leses no DNA, resultando em uma maior sensibilidade aos agentes genotxicos. Os dados apresentados indicam que dispomos de uma planta que pode servir de modelo como bioindicadora na deteco de mutagnese ambiental. O fato desta planta estar adaptada a climas temperados, limita o seu emprego no Brasil a estudos no laboratrio, isto , na deteco de agentes genotxicos. Por
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Figura 3- Esquema representativo da obteno de plantas transgnicas mutadas atravs da insero de seqncia de T-DNA. Plantas adultas com flores so co-cultivadas com Agrobacterium contendo a construo do DNA de transferncia (LB e RBseqncias repetitivas nas bordas esquerda e direita, respectivamente, da insero) mais o gene para resistncia antibitico (KAN). As sementes destas plantas so coletadas e crescidas em meio contendo o antibitico. As plntulas resistentes, portanto,portando a seqncia de interesse, so crescidas at o estgio maduro para obteno de sementes. A prognie crescida a fim de que se possa extrair o DNA para reao de PCR e identificao da planta contendo o inserto de T-DNA no gene de interesse

Figura 4- Esquema representativo da escolha e uso dos iniciadores empregados no PCR

Figura 5- Localizao da insero de T-DNA na protena vegetal at XPB1

exemplo, em amostras de solo potencialmente contaminado, ou resduos de filtrados a partir de poluio atmosfrica urbana. Entretanto, como Arabidopsis uma planta bastante conhecida geneticamente, sistemas que revelam mutaes j existem e podem ser incorporados este modelo por simples cruzamentos com a planta at XPB1. Como resultado, teremos uma linhagem de plantas altamente sensvel a agentes genotxicos, possibilitando a deteco de nveis menores de produtos mutagnicos. Dessa forma, esperamos que em breve esta e outras plantas que sero obtidas possibilitem o desenvolvimento de sistemas vegetais teis no monitoramento ambiental para a presena de produtos que sejam txicos e nocivos sade humana. Referncia Bibliogrfica Britt A.B.- Molecular genetics of DNA repair in higher plants- Trends in plant science. 4: 20-25 (1999). Leehan R.A., Feldmann K.A.-T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth- Trends in Genetics 13: 152-156 (1997). Petit C., Sancar A.- Nucleotide excision repair: From E.coli to man. Biochemie 81: 15-25 (1999). Ribeiro D.T., Machado C.R., Costa R.M.A., Praekelt U.M., Van Sluys M.A., Menck, C.F.M.- Cloning of a cDNA from Arabidopsis thaliana homologous to the human XPB gene- Gene 208: 207213 (1998). Vornax E.J., Mitchell H.L., Karthikeyrn R., Chatterjee I., Kunz B.A.- DNA repair in higher plants- Mutation Research 400: 187-200 (1998).

Figura 6- Sensibilidade das plantas araXPB1-/- ao MMS

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