Curso biologa Celular y molecular 1era Unidad: Flujo de Informacin Transcripcin y procesamiento

Alejandro Tapia P. IDIMI Facultad de Medicina Area centro

Dogma central de la Biologa Molecular

DNA

RNA

Protenas

Regulacin de la expresin gnica

1. Transcripcin 2. Procesamiento del RNA 3. Transporte del mRNA 4. Traduccin 5. Degradacin del mRNA 6. Degradacin de protenas

Control de requerimientos de la clula

Solucin a problemas comunes

No todos los genes son tiles en el mismo lugar o al mismo tiempo, lo cual implica que su expresin debe ser regulada (espacial y temporalmente) Los genes pueden ser tanto activados como reprimidos El control de la expresin procede mediante la interaccin de protenas al DNA Un porcentaje de lo genes deben permanecer en constante actividad transcripcional para mantener la integridad celular

Introduccin
Transcripcin es el primer paso en la expresin gnica Involucra dos conceptos fundamentales
1. La secuencia del DNA proveen la informacin
Indica qu reas del DNA son genes y que deberan expresarse
Slo el 10% del DNA humano

Indica donde debe comenzar y terminar la transcripcin

Sealiza el principio y el trmino de un gen

2. Protenas especficas reconocen estas secuencias y llevan a cabo el proceso

Ocurre en el ncleo de las clulas eucariontes

Generalidades de la transcripcin
Transcripcin literalmente significa el acto o proceso de hacer una copia
Una hebra de un gen en el DNA (de doble hebra) se copia a una molcula de RNA de una sola hebra. Un cido nucleico (DNA) se copia en forma de otro cido nucleico (RNA) Muy pocos cambios en el lenguaje qumico

La estructura del DNA no se altera como resultado de este proceso

Permanece almacenando la informacin Un gen puede ser copiado muchas veces

Transcripcin en Eucariontes
Muchos de los aspectos bsicos de la transcripcin gnica son similares entre bacterias y eucariontes La transcripcin gnica en eucariontes es ms compleja
Organismos ms grandes Complejidad celular (ms genes) E. coli tiene 4.377 genes H. sapiens tiene cerca de 25.000 genes Multicelularidad (diferentes tipos celulares con diferentes funciones).

Estructura del gen

Un gen puede ser definido como una regin discreta del DNA que es copiada (transcrita) a RNA
Por lo tanto un gen tambin puede llamarse unidad transcripcional La molcula de RNA fabricada a partir del gen se llama transcrito

(transcript)

Durante la expresin gnica, la secuencia del DNA en el gen o cerca de l permite definir:
Cuanto debe expresarse este gen Cuando debe expresarse este gen Donde (en qu tejidos o clulas) debe expresarse este gen

La transcripcin es llevada a cabo por un gran complejo proteico llamado RNA polimerasa La mayora de las veces, la RNA polimerasa se une a una secuencia especfica en el DNA que est antes del gen llamada promotor
El promotor recluta la RNA polimerasa hacia el gen, sealizando la proximidad a este.

Promotores de genes eucariontes

En genes estructurales, podemos identificar al menos tres elementos presentes en la mayora de los promotores
Sitio de inicio de la transcripcin Caja TATA Elementos reguladores

El promotor ms importante es relativamente corto: Consiste en una caja TATA

Importante en la determinacin del punto preciso para el inicio de la transcripcin

Este promotor por s mismo produce un bajo nivel de transcripcin

Esto se denomina transcripcin basal

 Elementos reguladores pueden afectar la unin de la RNA polimerasa al promotor Existen dos tipos: Enhancers (o potenciadores)
Estimulan la transcripcin

Silenciadores (o represores)
Inhiben la transcripcin

Tienen ubicacin variable pero generalmente se encuentran en posiciones 50 a 100 (ej. cajas GC y CAAT)

Control estructural de la expresin gnica en eucariontes

La expresin gnica puede ser controlada por secuencias de DNA o protenas Elementos de accin cis
Son secuencias de DNA que afectan slo a genes cercanos ejemplo: caja TATA, enhancers y silenciadores

Elementos de accin trans

Son protenas que se unen a secuencias de DNA (factores de transcripcin)

RNA Polimerasa
La enzima responsable de la sntesis de RNA es la RNA polimerasa DNA-dependiente En eucariontes existen tres tipos de RNA polimerasas, cada una de las cuales es una protena con mltiples subunidades y se encargan de transcribir diferentes tipos de RNAs

RNA polimerasas de eucariontes

El DNA nuclear se transcribe por tres RNA polimerasas distintas:
RNA pol I
Transcribe todos los genes rRNA (excepto para el rRNA 5S)

RNA pol II
Transcribe todos los genes estructurales
Por lo tanto, sintetiza todos los mRNAs

Transcribe algunos genes snRNA

RNA pol III

Transcribe todos los genes de tRNA y el gen del rRNA de 5S

RNA-polimerasas de eucariontes
RNA-pol I II III
5S rRNA tRNA snRNA moderada

productos

45S rRNA

Pre-mRNA

Sensibilidad a Amanitina

No

alta

La Amanitina es un inhibidor especfico de RNA-pol.

Nomenclatura

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Estados de la Transcripcin

Iniciacin
Los factores de transcripcin reconocen al promotor. Estos permiten que la RNA polimerasa se una al promotor formando un complejo y el DNA es denaturado.

Elongacin
La RNA polimerasa se desplaza por el DNA sintetizando del transcrito de RNA.

Terminacin
Una seal de trmino hace que la RNA polimerasa se disocie del DNA.

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RNA mensajero

La RNA polimerasa II y sus factores de transcripcin

Se requieren 3 tipos de protenas o complejos de protenas transactivadoras para que ocurra la transcripcin basal en el promotor (caja TATA)
RNA polimerasa II Factores generales de transcripcin (cinco) Un complejo de protenas llamado mediador

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12-39

Factores generales de transcripcin: TFIID: 2 subunidades (TBP (factor de transcripcin universal) y 1 complejo de 10 TAFs) TFIIB: (1 protena) media la interaccin entre TFIID y la Polimerasa TFIIF: (4 protenas) estabiliza el complejo DNA-TBP-TFIIB. TFIIE: (4 protenas) regula TFIIH y en conjunto promueven la adicin del primer nucletido del RNA. TFIIH: es el complejo de mayor tamao (9 subunidades) actividad helicasa y de reparacin del DNA. RNA polimerasa: (12 subunidades) requiere de estos factores para: -Posicionar correctamente la enzima -Para regular su actividad

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Unin de TATA-binding protein (TBP) a caja TATA

Regulacin del complejo a travs de factores de transcripcin

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Estructura de algunos factores de transcripcin

Cremallera de Leucina

Hlice-bucle-hlice

Dedos de Zn2+

Hlice-vuelta-hlice

Activacin de la transcripcin va mediador

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Modificaciones del RNA

El anlisis de los genes de bacterias mostr que:
La secuencia del DNA en la hebra codificante corresponde a la secuencia de nucletidos del mRNA Esta ltima corresponde a la secuencia de aminocidos del polipptido

Esto se denomi colinearidad de la expresin gnica El anlisis estructural de los genes eucariontes mostr que estos no siempre tenian colinearidad con sus respectivos mRNAs

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Modificaciones del RNA

Las secuencias codificantes, llamadas exones, son interrumpidas por secuencias llamadas intrones Durante la transcripcin se copia el gen completo
Los intrones deben se removidos posteriormente Los exones deben ser empalmados

Este proceso se denomina splicing (o maduracin) del RNA

Es un proceso gentico comn en eucariontes

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Modificaciones del RNA

Aparte del splicing, los transcritos de RNA pueden experimentar otras modificaciones Por ejemplo:
Trimming de los transcritos de rRNA y tRNA 5 Capping y la adicin en 3 de una cola de poli A en los transcritos de mRNA

Capping
La mayora de los mRNAs maduros poseen una 7metil guanosina (caperuza) covalentemente unida en su extremo 5
Este proceso se llama capping

El capping ocurre a medida que el pre-mRNA es sintetizado por la RNA pol II

Normalmente cuando los transcritos tienes entre 20-25 bases

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Capping
La caperuza en 5 se forma agregando una G a la base del extremo a travs de un enlace 55 La estructura de la caperuza es reconocida por protenas (cap-binding proteins) que influencian la estabilidad del mRNA, splicing, exportacin al citoplasma y traduccin

Capping

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Poli-adenilacin (tailing)
La mayora de los mRNAs maduros poseen una cola de poli-A en sus extremos 3 La cola de poli-A no est codificada en la secuencia del gen
Se agrega enzimticamente despues de que el gen es transcrito

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Poli-adenilacin (tailing)

El extremo 3 de los mRNAs son generados por clivaje y poliadenilacin

La secuencia AAUAAA es una seal para clivaje, lo cual genera el extremo 3 del mRNA que es posteriormente poliadenilado La reaccin requiere un complejo proteico que contiene una endonucleasa y una poli(A) polimerasa

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Splicing
Involucra:
La remocin de intrones del RNA El empalme de los exones en el RNA por un enlace fosfodister Catalizado por el splicesosoma

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 pre-mRNA El transcrito nuclear es procesado por una modifiacin y maduracin (splicing) para originar un mRNA Maduracin del RNA (splicing) Proceso por el cual se remueven intrones del RNA y se conectan enxones para originar un mRNA contnuo

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 RNA nuclear heterogeneo (hnRNA) RNA que comprende a los genes nucleares transcritos por la RNA polimerasa II (pre-mRNAs); posee una gran diversidad de tamaos y baja estabilidad hnRNP corresponde a la forma de ribonucleoprotena de hnRNA, en que el hnRNA forma complejo con protenas Pre-mRNAs no son exportados hasta que el procesamiento se haya completado; por lo que slo se encuentran en el ncleo.

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Los sitios de corte y empalme (splicing) son secuencias cortas

Los sitios de splicing son las secuencias inmediatamente al lado de la unin exn-intrn. Su denominacin se realiza en relacin a su posicin respecto del intrn El sitio de splicing 5 en el extremo 5 (izquierda) del intrn contiene una secuencia de consenso GU El sitio de splicing 3 en el extremo 3 (derecha) del intrn contiene una secuencia de consenso AG

Los sitios de corte y empalme (splicing) son secuencias cortas

La regla GU-AG (originalmente llamada la regla GT-AG en relacin a la secuencia del DNA) se refiere al requerimiento de la presencia de estos dinucletidos en las primeras y ltimas 2 posiciones en los intrones de premRNAs.

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Los sitios de corte y empalme (splicing) son secuencias cortas

Existen intrones menores en relacin a los intrones mayores que siguen la regla GU-AG. Los intrones menores siguen la regla general AU-AC, usando un set de secuencias de consenso diferentes en las uniones exon-intron.

Los sitios de corte y empalme se leen en forma de pares

El splicing depende slo del reconocimiento de pares en los sitios de corte y empalme Todos los sitios del corte y empalme 5 son funcionalmente equivalentes, y todos los sitios en 3 son funcionalmente equivalentes Otras secuencias conservadas en sitios de splicing en 5 y 3 pueden definir otros sitios de splicing entre muchos otros sitios potenciales en el pre-mRNA

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El splicing de pre-mRNAs ocurre a travs de un lazo

El splicing necesita los sitios de splicing en 5 3 y un sitio de ramificacin justo rio arriba del sitio de corte y empalme en 3. La secuencia de ramificacin es conservada en levaduras pero no tanto en eucariontes multicelulares Se forma un lazo cuando el intrn se cliva en 5, y el extremo 5 se une a en 2 en una A en el sitio de ramificacin del intrn.

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El splicing de pre-mRNAs ocurre a travs de un lazo

El intrn sale como un lazo lazo cuando se cliva en el sitio 3 y despus los exones de izquierda y derecha se empalman

Los snRNAs son requeridos para el splicing

small nuclear RNA (snRNA) Uno de los snRNA que se encuentra confinado en el ncleo; varios de ellos estn involucrados en el splicing u otras reacciones de procesamiento de RNA.

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Los snRNAs son requeridos para el splicing

Cinco tipos de snRNPs estn involucrados en el splicing y son U1, U2, U5, U4, and U6. Juntos con otras protenas, los snRNPs forman el spliceosoma.

Los snRNAs son requeridos para el splicing

Factor de splicing Componente proteico del spliceosoma que no es parte de los snRNPs. Trans-esterificacin Reaccin de rompe y establece enlaces qumicos en forma coordinada por lo que no requiere energa

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Un spliceosoma alternativo usa snRNPs diferentes para procesar los intrones de clase menor
La va alternativa de splicing usa otro set de snRNPs con slo U5 snRNP en comn con el spliceosoma mayor. Los intrones blanco son definidos por secuencias de consenso ms largas en los sitios de corte y empalme, a diferencia de las secuencias de regla GUAG o AU-AC

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La snRNP U1 se aparea en el sito de splicing en 5 y las protenas BBP (branch-point binding protein) y U2AF (U2 auxilliary factor) reconocen el sitio puntual de ramificacin. La snRNP U2 desplaza a BBP y U2AF, aparendose con la secuencia de ramificacin. El tro U4/U6U5 snRNP s ingresan a la reaccin. En esta snRNP triple, las snRNAs U4 y U6 se mantienen apareadas. Luego algunos rearreglos crean un sitio activo para el spliceosoma y ubican los sitios del pre-mRNA para la primera reaccin fosforil-transferasa.

Otros rearreglos RNARNA rompen el apareamiento entre U4/U6 y permite que la snRNP U6 desplace a U1 en el sitio de splicing en 5 para formar un sitio activo para la segunda reaccin fosforil-transferasa que completa el splicing.

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Tipos de splicing

El splicing de pre-mRNA comparte el mismo mecanismo que los intrones autocatalticos

Estos intrones se remueven a s mismos por un evento de splicing autocataltico (autosplicing o self-splicing). Los sitios de corte y empalme; y el mecanismo de splicing de estos intrones son similares al del splicing de intrones nucleares. Se pliegan en una estructura secundaria que genera un sitio cataltico que se parece a la estructura U6U2-intron nuclear.

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El splicing es temporal y funcionalmente acoplado a mltiples pasos en la expresin gnica

El splicing puede ocurrir durante o despus de la transcripcin Las maquinarias de transcripcin y splicing estn fsica y funcionalmente integradas El splicing est asociado a la exportacin del mRNA y el control de la estabilidad Complejo de unin de exones (EJC) Es un complejo de protenas que se ensambla en las uniones exn-exn durante el splicing y asiste en el transporte de RNA, localizacin y degradacin

El splicing se requiere para la exportacin de mRNA

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El splicing es temporal y funcionalmente acoplado a mltiples pasos en la expresin gnica

El splicing en el ncleo puede influenciar la traduccin del mRNA en el citoplasma. nonsense-mediated mRNA decay (NMD) es una va que degrada el mRNA que posee una mutacin nonsense antes del ltimo exn.

Ventajas de poseer intrones?

Una ventaja de los genes con intrones es que permiten el splicing alternativo Un pre-mRNA con mltiples intrones puede ser madurado en diferentes puntos de su secuencia Esto genera mRNAs maduros con diferentes combinaciones de exones Esta variacin en el splicing puede ocurrir en diferentes tipos celulares o durante diferentes etapas del desarrollo

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Ventajas de poseer intrones?

La ventaja biolgica del splicing alternativo es que de un mismo gen se pueden originar dos (o ms) polipptidos Esto permite que un organismo posea pocos genes en su genoma pero igualmente es capaz de producir muchas protenas diferentes

El splicing alternativo es una regla en vez que la excepcin en los eucariontes multicelulares
Secuencias especficas de exones pueden ser excluidas o incluidas en los productos de mRNA usando sitios alternativos de splicing. El splicing alternativo contribuye a la diversidad estructural y funcional de los productos gnicos.

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Diferentes modos de splicing alternativo

El splicing alternativo es una regla en vez que la excepcin en los eucariontes multicelulares
La determinacin del sexo en la Drosophila involucra una serie de eventos de splicing alternativo en genes que codifican para sucesivos productos de una va.

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Secuencias en intrones o exones pueden modular la seleccin del sitio de splicing

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