Atividades de apoio em Biologia Celular e Molecular Roteiro para o professor Eletroforese em gel: migrao de fragmentos de DNA PLANO DE AULA

Introduo Nas ltimas quatro dcadas, nosso conhecimento sobre a estrutura e funo do DNA e sobre os processos bioqumicos que as clulas utilizam para modificar essa estrutura e cumprir suas funes tem crescido consideravelmente. Esse vasto conhecimento nos permitiu a manipulao do DNA fora do ambiente celular. Por exemplo, podemos clivar o DNA em fragmentos especficos, separar e isolar esses fragmentos, uni-los novamente, copiar o DNA e determinar sua seqncia de bases. Estamos fazendo uso de nossa experincia em manipulao de genes para aprofundarmos ainda mais nossos conhecimentos sobre como os processos bsicos da vida so executados e como podemos fazer uso destes produtos em nosso cotidiano. Nas prximas aulas, usaremos modelos e simulaes para aprender as tcnicas utilizadas pelos cientistas para analisar o DNA e produzir molculas recombinantes: digesto por restrio, eletroforese em gel etc. A eletroforese em gel pode ser utilizada para se fazer mapas de restrio, que um diagrama de uma molcula de DNA mostrando as posies relativas dos stios de clivagem das vrias enzimas. O mapa pode ser feito clivando o DNA com duas ou mais enzimas de restrio, individualmente e em mistura. Depois, comparam-se suas migraes eletroforticas, possibilitando assim a construo de mapas de restrio. Uma outra aplicao bastante conhecida na identificao de pessoas: em testes de paternidade, identificao de criminosos etc. O DNA das pessoas, depois de tratado (por clivagem), pode ser separado pela eletroforese, e comparado com outros DNAs, como o do suposto filho ou pai, DNA recolhido na cena de um crime etc. Como a informao gentica contida em cada DNA nica para qualquer indivduo, se as amostras de DNA apresentarem idntico padro eletrofortico significa que so da mesma pessoa.

Pr-requisitos Para estas atividades necessrio que o aluno conhea a composio do material gentico, principais funes e estruturas. Durao Aproximadamente 100 minutos.

Pblico alvo Segundo e terceiro ano do ensino mdio.

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Atividade prtica - Tcnicas de manipulao de DNA: Tesouras de DNA e Eletroforese em gel

Parte A: Tesouras de DNA As enzimas de restrio so protenas produzidas por bactrias para prevenir ou restringir a invaso de um DNA estranho, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos sem funo. Elas reconhecem e cortam locais especficos da molcula de DNA (chamados de stios de restrio). O stio geralmente formado por uma seqncia de 4 a 6 pares de bases nitrogenadas, chamados palndromo (iguais em sentidos opostos). Em biotecnologia, elas podem ser usadas para cortar (digerir) um DNA de interesse. Por exemplo: 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 A seqncia acima corresponde ao stio de restrio da enzima EcoRI. Ela corta a fita do DNA entre as bases G e A. Veja o esquema abaixo: 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5

Stios de clivagem:

DNA separado:

Exemplos de stios de restrio de algumas enzimas: HindIII: 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 5 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 5 GCGC 3 3 CGCG 5

BamHI:

SmaI:

HbaI:

DRAI

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Atividades de apoio em Biologia Celular e Molecular Simulao 1 O esquema abaixo representa duas molculas de DNA dupla fita. As linhas verticais entre os pares de base representam as pontes de hidrognio. 1. Vamos simular a atividade da enzima EcoRI. Procure ao longo da seqncia da fita de DNA (tira 1) o stio de restrio da EcoRI (use como referncia a lista antes citada para saber a seqncia). Simule cortes usando o lpis para fazer o contorno do referido corte, exatamente entre o G e primeiro A do stio de restrio em ambas as fitas. 2. Repita o procedimento com a tira 2, desta vez simulando a atividade da DRAI.

Anexo 1 Tira 1 5 T A G A C T G A A T T C A A G T C A 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 A T C T G A C T T A A G T T C A G T 5 Tira 2 5

Parte B: Eletroforese em gel Simulao 2 No anexo 2 observam-se duas representaes de uma molcula de DNA de 15.000 pares de bases. Cada representao mostra a localizao de vrios stios de restrio, com as linhas verticais representando os stios de clivagem. Os nmeros entre os stios de clivagem correspondem ao tamanho (em pares de bases) dos fragmentos gerados pela digesto do DNA com aquela enzima. Anexo 2 Stios da enzima EcoRI

4.000

3.500

2.500

5.000

Stios da enzima DRAI

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Atividades de apoio em Biologia Celular e Molecular Vamos imaginar que voc teria que digerir duas molculas de DNA (com o tamanho de 15.000 pares de bases cada uma), utilizando uma enzima diferente em cada DNA. Estas enzimas so a EcoRI e a DRA I, vistas na simulao 1, cujos stios de restrio foram vistos logo acima. Voc deve ter percebido que os pedaos de DNA originados a partir da digesto com estas enzimas tm tamanhos (em pares de bases) diferentes. Para separar estes pedaos voc poderia utilizar a tcnica de eletroforese em gel, j explicada na aula introdutria. Para isso, vamos utilizar o esquema que segue. Tente construir o perfil que suas digestes mostrariam no gel. Como voc j sabe o tamanho dos pedaos originados com a digesto das duas enzimas utilizadas (EcoRI e DRAI), indique-os no esquema do quadro abaixo, pintando com um lpis e tendo como referncia a escala de tamanho. Compare os dois perfis. O que voc observa? Esquema do gel de eletroforese EcoRI Poos de amostras Escala de tamanho em pares de bases 8.000 DRA I

6.000

4.000

3.000

2.000

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Atividades de apoio em Biologia Celular e Molecular Eletroforese em gel: migrao de fragmentos de DNA - procedimentos

Coloca-se o DNA e a enzima de restrio em um pequeno tubo e deixa a enzima agir. Como no possvel usar corantes qumicos para se verificar a digesto, utiliza-se o processo chamado eletroforese em gel, a fim de que se possa visualizar os fragmentos de DNA. Os grupos fosfato do DNA so carregados negativamente. Assim, quando as molculas so colocadas em um campo eltrico, elas migram para o plo positivo, pois possuem cargas opostas. Para que esta migrao ocorra, necessrio um gel de agarose. Dissolve-se o p de agarose em gua fervente, colocando-o em um suporte adequado e, depois de resfriado, endurece, como se fosse uma gelatina. Durante este processo, um pente colocado no gel ainda lquido para, aps o endurecimento, formem-se buracos no gel, onde sero aplicadas as amostras. Estes buracos so chamados de poos de amostra (fig. 1).

Fig. 1. Fazendo um gel de agarose. (A) Para fazer um gel, a soluo de agarose quente vertida em uma bandeja e o pente colocado no lugar adequado. (B) Depois que a agarose esfria e endurece, o pente removido, deixando marcas no gel, chamadas de poos de amostra. Amostras so aplicadas nos poos antes da eletroforese.

Na eletroforese, o gel solidificado colocado em uma cuba com uma soluo salina (tampo). Quando a corrente aplicada, entre as extremidades da cuba, as molculas de DNA comeam a migrar (fig. 2).

Fig. 2. Na eletroforese, o gel colocado em uma cuba com soluo salina e uma corrente eltrica aplicada. O DNA migra para o plo positivo. Programa de pesquisas aplicadas sobre a melhoria do ensino pblico no Estado de So Paulo - FAPESP Parceria USP-So Carlos e EESOR 5/6

Atividades de apoio em Biologia Celular e Molecular Em um mesmo intervalo de tempo, molculas maiores de DNA migram-se com mais dificuldade do que as menores. Desta forma, molculas menores correm mais rpido do que as maiores (fig. 3) .

Fig. 3. Em corridas de eletroforese, o DNA menor sempre ganha!

Aps um certo tempo, desliga-se a corrente eltrica e coloca-se o gel em uma soluo corante de DNA, ento ele pode ser observado sob a forma de faixas (bandas). Cada banda composta por um tamanho de molculas de DNA. Por fim, utiliza-se radiao ultravioleta para se observar s bandas de DNA. Molculas coradas com brometo de etdio, na presena de UV, brilham. Obs.: o brometo de etdio carcinognico. Use luvas quando manipular a soluo.

Referncia bibliogrfica: KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia Gentica e Biotecnologia. 2a. ed, Porto Alegre: ArtMed, 2002.

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