CLASIFICACIN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS

Exgenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....

Segn el tipo de clula Germinales Somticas (cncer) Mutaciones puntuales Gnicas Inserciones y deleciones Segn el tipo de alteracin Cromosmicas numricas estructurales

Genticas

Segn el genoma y cromosoma afectados

nucleares

autosmicas Ligadas al sexo

mitocondrial

Complejas o multifactoriales: en parte exgenas y en parte genticas

ALCAPTONURIA

Archibald Garrod

Orina negra

ocronosis

1902 1945 1949 1953 1960-80 1977/1980 1985 1990-2004 20022008-

A. Garrod Beadle y Tatum Pauling e Ingram Watson y Crick varios Maxam y Gilbert/Sanger Mullis

estudios sobre la alcaptonuria Hiptesis "un gen-un enzima" bases moleculares de la anemia falciforme estructura de doble hlice del DNA tcnicas de DNA recombinante tcnicas de secuenciacin del DNA tcnica de PCR

Proyecto Genoma Humano Proyecto HapMap Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing)

Tipos de enfermedades genticas. Patrones de herencia.

Cromosomopatas Enfermedades monognicas o de herencia mendeliana autosmicas recesivas autosmicas dominantes ligadas al sexo. Enfermedades complejas o multifactoriales Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansin de tripletes) Genes con impronta gentica y disomas uniparentales Enfermedades de DNA mitocondrial Cncer hereditario

CROMOSOMOPATIAS
Se definen como cambios que resultan en una alteracin visible de los cromosomas Son muy frecuentes (1% de recin nacidos, principal causa de abortos espontneos, recin nacidos muertos...) Se producen por una mala reparacin de cromosomas rotos o daados o por fallos en la recombinacin o en la segregacin de los cromosomas durante mitosis o meiosis Se clasifican en : alteraciones numricas alteraciones estructurales Se identifican por observacin de los cromosomas del paciente mediante distintas tcnicas: bandeo cromosmico con distintos colorantes, FISH, CGH...

Preparacin de los cromosomas y anlisis

Obtencin de muestra (eg: sangre) Tratamiento de las clulas con mitgenos (eg: PHA) mnimo 3 das Adicin de colchicina para arrestar a las clulas en metafase Fijar las clulas Tratamiento con tripsina y Giemsa u otros colorantes

Caracterizacin de los cromosomas

Tcnicas citogenticas G bands (Giemsa) C bands (centrmero) Q bands (quinacrina, fluorescente equivalente a G) R bands (patrn opuesto a G y Q) Bandeo de alta resolucin (>400 bands) FISH (fluorescent in situ hybridization)

CROMOSOMOPATAS
ALTERACIONES NUMRICAS
POLIPLOIDIA (triploidia: 69XXX, XXY XYY) LETAL (Causa: dos espermatozoides o fallo en la 1 divisin cigtica) ANEUPLOIDIA
AUTOSMICAS CROMOSOMAS SEXUALES (Causas: edad avanzada, mala segregacin en meiosis o mitosis)

Alteraciones numricas autosomicas

Caractersticas generales: Retraso mental Retraso en el crecimiento Anomalas congnitas mltiples Viabilidad baja, alta letalidad Asociadas a abortos espontneos diagnstico prenatal posible

Alteraciones numricas autosmicas

Monosoma: letal Trisoma:usualmente letal (dosis gnica)
Excepciones:

Trisoma 21 - Down Syndrome (1:1000) Trisoma 13 - Patau Syndrome (1:20.000) Trisoma 18 - Edward Syndrome (1: 8.000)

Alteraciones numricas de los cromosomas sexuales

Caractersticas generales: Retraso en el crecimiento problemas reproduccin viabilidad alta Asociadas a abortos espontneos diagnstico prenatal posible Ejemplos: Monosoma X: Sndrome de Turner (45, X) Trisoma (47, XXY): S. de Klinefelter Trisoma (47, XYY)

QUANTITATIVE FLUORESCENT PCR (QF-PCR)

CUANTIFICACIN RELATIVA MICROSATLITES PARA DETERMINAR DOSIS GNICA

amplificacin microsatlites seleccionados con primers fluorescentes separacin por tamaos mediante electroforesis capilar cuantificacin relativa del rea de los picos
QF-PCR chr. 18: deteccin de una trisomia

APLICACIONES: Diagnstico prenatal de aneuploidias ms comunes en 24 h: trisomia 21 (Down), trisomia 13 (Patau), trisomia 18 (Edwards), S. Turner (X), S. Klinefelter (XXY)

Chromosomopatas
Alteraciones estructurales Deleciones e.g.46,XY, del(4) (p16.3) Translocaciones e.g.46,XX, t(2;6) (q35;p21.3) Inversiones e.g.46,XY, inv(11) (p11p15) Duplicaciones e.g.46,XX, dup(1) (q22q25) Cromosomas en anillo e.g.46,XY, r(7) (p22q36) Isocromosomas (se pierde 1 brazo, crom. Simtricos) Causas: reparacin defectuosa de roturas en el DNA, o fallos en la recombinacin) Efectos: variables, segn punto de ruptura y prdida o ganancia de material gentico)

Translocacin Robertsoniana (se fusionan dos cromosomas)

break break

21 21 14 14

14

21

14/21

ENFERMEDADES GENMICAS (GENOMIC DISORDERS)

-Producidas por reordenamientos genmicos -Se caracterizan por la presencia de duplicaciones segmentarias flanqueantes (>1kb, >90% identidad)que son sustrato de recombinacin homloga no allica (NAHR) lo que origina deleciones, duplicaciones e inversiones -Pueden dar lugar a enfermedades mendelianas, predisponer a enfermedades complejas o ser polimorfismos neutros (CNV) -Patognesis: dosis gnica interrupcin gnica fusin de genes efecto posicional manifestacin de mutaciones recesivas (para deleciones)

SINDROMES DE MICRODELECIN Cri du chat Williams-Beuren Prader-Willi/Angelman Rubinstein-Taybi DiGeorge 5p14 7q11.23 (elastina) 15q11-q13 16p13.3 22q11.21-q11.23

DUPLICACION Charcot-Marie-Tooth INVERSION Hemofilia A Factor VIII 17p12 (mielina)

FISH:FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION

mFISH: multiplex FISH Otra tcnica: Spectral karyotyping (SKY)

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH)

ARRAY CGH

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION

MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION: MLPA

SONDAS

HIBRIDACION region A region B

LIGACION region A region B

PCR

MLPA
www.mlpa.com

Fragment Analysis
Sample

deletion

Control

Anlisis y cuantificacin por electroforesis capilar Cuantificacin relativa a una muestra control Areas de los picos normalizadas con la suma de todas las areas de esa muestra

EJEMPLO: DETECCION DE TRISOMIAS

MLPA
www.mlpa.com

Current applications of MLPA:

Detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X and Y Detection of large chromosomal deletions or duplications: DiGeorge syndrome, Williams syndrome, CMT1 / HNPP, Pelizaeus-Merzbacher disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA), subtelomeric regions etc Detection of gains and losses of genes in cancer tissues: Her2-neu (ERBB2), TP53, MYC etc. Detection of deletions / duplications of single exons: BRCA1 and 2, MSH2, MLH1, VHL, SHOX, MECP2, APC and NF2, PAH.

ENFERMEDADES MONOGNICAS
frecuencia estimada de 10:1000 Defecto en un nico gen Se clasifican segn el patrn de herencia en : autosmicas recesivas autosmicas dominantes ligadas al sexo

Enfermedad autosmica recesiva

(el individuo heterocigoto o portador no se distingue del homocigoto normal)
Padres portadores con fenotipo normal 75% probabilidad de hijos normales 25% probabilidad de hijos afectados 50% de probabilidad de hijos portadores Hombres y mujeres afectados en igual proporcin Generalmente enzimas A veces asociadas con regiones geogrficas o grupos tnicos Consanguinidad entre los padres

Enfermedades AR en grupos tnicos y geogrficos fibrosis cstica Tay-Sachs Anemia falciforme Thalasemias Caucasianos Judos Ashkenazi Africanos Mediterraneo

SIMBOLOS MAS COMUNES EMPLEADOS EN LOS PEDIGREES

VARN HEMBRA

AFECTADOS (ENFERMOS) NO AFECTADOS

SEXO DESCONOCIDO

PORTADORES (Enf. AR o XR) Matrimonio consanguineo Muerto

Pedigree AR
PATRON HORIZONTAL

EJEMPLOS: ENF. AR

Autosmica Dominante (AD)

(el individuo heterocigoto es enfermo)
Un progenitor afectado y el otro normal 50% probabilidad de hijos normales 50% de probabilidad de hijos afectados Hombres y mujeres afectados en igual proporcin Penetrancia Expresividad o variabilidad fenotpica

Pedigree AD
PATRON VERTICAL

EJEMPLOS: ENF. AD

Enfermedades AD: ejemplos

Marfans Syndrome Osteogenesis imperfecta Neurofibromatosis Braquidactilia Retinoblastoma Tuberous sclerosis Multiple polyposis of colon

ENFERMEDADES LIGADAS AL SEXO (AL CROMOSOMA X)

riesgo distinto segn el sexo Las mujeres pueden ser homocigotas o heterocigotas para el alelo mutante y pueden tener una expresin recesiva o dominante (aunque variable por la inactivacin del cromosoma X) Los hombres muestran el fenotipo completo Ausencia de herencia de hombres a hijos varones Todas las hijas de un hombre afectado heredan el alelo mutante Hombres no afectados no transmiten al enfermedad

Enf. Ligada al X recesiva (XR)

Madre portadora normal Padre normal 50% probabilidad de varones afectados 50% probabilidad de varones normales 100% probabilidad de nias normales 50% portadora 50% homocigotas normales Hombre y mujeres TIENEN DISTINTO RIESGO Padre afectado y madre normal:
100% hijas portadoras 100% varones normales

PATRON OBLICUO

Pedigree XR

EJEMPLOS: ENF. XR : Hemofilia, Lesh-Nyhan, def. piruvato DH)

Enf. Ligada al X dominante (XD)

Padres afectados: 100% probabilidad de hijas afectadas 0% riesgo de varones afectados Madres heterocigotas afectadas: 50% probabilidad de varones afectados 50% probabilidad de hijas afectadas

EJEMPLOS: ENF. XD

Raquitismo resistente a Vitamina D Albrights hereditary osteodystrophy

FACTORES QUE PUEDEN COMPLICAR LOS PATRONES DE HERENCIA

MUTACIONES NUEVAS MOSAICISMO DE LINEA GERMINAL RETRASO EN LA EDAD DE APARICION NO PENETRANCIA EXPRESIVIDAD VARIABLE PLEIOTROPIA DE EFECTOS HETEROGENEIDAD DE LOCUS NMD (nonsense mediated mRNA decay)

NMD : nonsense mediated mRNA decay

PTC:premature termination codon EJC:exon junction complex

Enfermedades complejas o multifactoriales:

-Causadas por >1 gen -Influencia de factores ambientales -Cada gen implicado puede tener un efecto pequeo -No hay una herencia clara en familias -Posibles interacciones entre los genes implicados (epistasis) -Posibles interacciones ambiente-genes -medida de la enfermedad (fenotipo) a veces dificil

Efecto acumulativo: los alelos de varios loci interaccionan de manera que el efecto de la combinacin de alelos es la suma de los efectos individuales. epistasis: interaccion entre genes en la que un gen interfiere con al expresin del otro. En general, el efecto combinado de alelos en ms de un locus es diferente de lo esperado segn sus efectos

Evidencias de que hay un componente gentico en una enfermedad compleja:

estudios familiares estudios de concordancia en gemelos estudios en hijos adoptados

Estudios en gemelos: Concordancia % Enfermedad G.Monocigoticos G. Dicigticos Cleft lip 35 5 Type I diabetes 50 5 Type II diabetes 100 10 Multiple sclerosis 20 6 Rheumatoid arthritis 50 8 Tuberculosis 51 22 Alcoholism 40 20 Autism 60 7 Schizophrenia 44 16

Estudios en hijos adoptados:

Padres biolgicos
Padre alcohlico Madre alcohlica Padre no-alcohlico Madre no alcohlica

muestra (n)
89 42 723 1029

% de hijos adoptados alcohlicos

39,4 28,6 13,6 15,5 34,0%

14,6%

Bonham 1978

Riesgo relativo: el cociente entre la frecuencia de una enfermedad compleja para un familiar de una persona afectada y la frecuencia de la poblacin general

r = frecuencia de los familiares del enfermo frecuencia en la poblacin

r = el grado de parentesco (r =5-10% para familia directa) Es un riesgo emprico

Riesgo relativo en familiares. Ejemplos:

Enfermedad RIESGO (segn grado de parentesco) Poblacin 1 2 3 1/1000 1/1000 1/1000 1/1000 1/500 35x 40x 20x 20x 8x 7x 4x 5x 5x 3x 1.5x 2x 2x 2x

Cleft lip/palate Congenital dislocation/hip Pyloric stenosis Clubfoot Anencephaly/spina bifida

Enfermedades producidas por expansin de tripletes (mutaciones inestables)

Descubierto en 1991 Causadas por expansin de trinucletidos por encima de un nmero Por encima de ese numero los tripletes son inestables y se expanden (aumenta el n de copias o repeticiones) No se transmite el mismo n de repeticiones a los hijos sino un n mayor (mutaciones dinmicas) El n de repeticiones est relacionado con la severidad y edad de aparicin de los sntomas: anticipacin

ANTICIPACION
La edad de aparicin de la enfermedad es menor y la severidad de la enfermedad peor en generaciones sucesivas, lo que se correlaciona con el aumento del n de tripletes

Edad aparicin sntomas

severidad

N repeticiones

Gatchel JR, Zoghbi HY (2005) Nature Reviews Genetics 6: 743-754.

Disoma uniparental
ambos cromosomas homlogos provienen del mismo progenitor Usualmente el origen est en una recuperacin o compensacin de una trisoma que sera letal

Disomia uniparental

IMPRONTA GENETICA
modificaciones del material gentico (silenciamiento gnico) que ocurren dependiendo de si el alelo proviene del padre o de la madre Resultan en una expresin diferencial segn sea la copia materna o paterna identificados en mamiferos y plantas superiores Mutaciones en los genes con impronta genetica dan un patron inusual de herencia Puede deberse a presin evolutiva en genes implicados en crecimiento y desarrollo????

CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN

Prdida de funcin de genes en el cromosoma 15 que slo se expresan del cromosoma paterno (PW) o materno (Angelman) La prdida de funcin puede deberse a deleciones, disomias uniparentales, mutaciones o errores en la impronta.

delecin 15q11-13 : PWS resulta de una delecin en el cromosoma paterno AS resulta de una delecin en el cromosoma materno

CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN

disomia uniparental : PWS resulta de dos crom. 15 maternos AS resulta de dos crom. 15 paternos

El genoma mitocondrial no es autnomo

mtDNA DNA nuclear

OTRAS PROTENAS NUCLEARES: LAS IMPLICADAS EN REPLICACIN, TRANSCRIPCION Y TRADUCCIN

Genoma mitocondrial

37 genes: 22 tRNAs 2 mt rRNA 13 mRNAs

- En el la matriz mitocondrial - cada mitocondria puede contener 2-10 copias de mtDNA - Hay miles de copias de mtDNA por clula

Enfermedades del DNA mitocondrial

~ 1/15000 adultos

Herencia materna Heteroplasmia = diferente % de mitocondrias normales

y mutantes en cada clula o tejido. Las clulas reciben diferentes poblaciones de mitocondrias normales y mutantes

Caractersticas de las enfermedades mitocondriales

Los sntomas se manifiestan sobre todo a nivel de tejidos muy dependientes de energa en forma de ATP - cerebro, corazn, msculo, odo Muy variables gentica y clnicamente (el mismo sndrome pude deberse a diferentes mutaciones o el mismo defecto gentico tener una presentacin clnica diferente) el fenotipo depender de: gen(es) implicados tipo de mutacin (missense/nonsense/delecin) % mitocondrias normales vs anormales tejido implicado

SOLO 20% DE LOS PACIENTES DEFICIENTES EN OXPHOS TIENEN MUTACIONES EN mtDNA

El resto de pacientes tienen defectos en genes nucleares:

Defectos en genes estructurales de los complejos Defectos en la comunicacin entre genomas nuclear y mt Defectos en ensamblaje, homeostasis o importe de las protenas de los complejos

The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. Smeitink et al (2001) Nat Rev Genet 2: 342-352 Mitochondrial disease-its impact, etiology and pathology. McFarland et al (2007) Curr Topics in Dev Biol 77: 113-143.