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INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL DELEGACIN SUR DEL DISTRITO FEDERAL HOSPITAL GENERAL REGIONAL N 1
DR. CARLOS MAC GREGOR SNCHEZ NAVARRO
UNIDAD DE INVESTIGACIN EN EPIDEMIOLOGA CLNICA Curso precongreso terico corto: Coagulacin anticoagulacin. La perspectiva desde el laboratorio clnico para su evaluacin. Pasado, presente y futuro. MSc Adriana Aurelia RuizdeChvezOchoa OBJETIVO DEL CURSO: Presentar a los alumnos el estado actual del laboratorio de hemostasia en Mxico y las necesidad de implementar nuevas pruebas para el diagnstico, tratamiento y seguimiento de pacientes con alteraciones en la hemostasia. Su aplicacin como mtodos profilcticos para la prevencin de infartos y/o trombosis, as como de complicaciones con las presencia de inhibidores en otros pacientes (hemoflicos y pacientes con autoanticuerpos, estados transitorios). Se presentarn las ventajas y desventajas de la automatizacin del laboratorio y su aplicabilidad en los laboratorios pequeos, medianos y grandes. Al final del curso el alumno tendr las nociones bsicas sobre la fisiolgica esencial del sistema de coagulacin, los modelos que la explican y su trascendencia en la medicina clnica actual. Debido a que este curso es introductorio al Laboratorio de Coagulacin, se desconoce si los asistentes tienen o no experiencia en el laboratorio de coagulacin, Se hablar de los problemas bsicos con las pruebas de rutina que se emplean en la mayora de los laboratorios en Mxico, es decir el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), para posteriormentehacer un anlisis de otros ensayos que se pueden implementar en los laboratorios para un diagnstico de certeza. La idea es que los alumnos adquieran los conocimientos bsicos y tengan nociones sobre las pruebas que en la actualidad se deben realizar. Debido a que los problemas de salud que se generan con las alteraciones de la hemostasia y su alta incidencia en poblacin mexicana (puesto que ya se les reconoce como la primera causa de muerte) es necesario que se implementen en un futuro cercano en los laboratorios de anlisis clnicos en nuestro pas. Adems tambin son enfermedades con un alta tasa de sobrevida (muchas veces con secuelas incapacitantes), por lo que, el manejo por parte de laboratorio, tanto de pacientes con medicamentos (anticoagulantes en el caso de pacientes con trombosis y concentrado de factores o crioprecipitados en el caso de hemoflicos con inhibidores) o sin ellos, es especial e indispensable para los mdicos tratantes, por lo que se requiere que el personal que realiza la toma de productos de stos pacientes est conciente de todas las normas de control de calidad que se deben tener en consideracin para estos ensayos.

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INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL DELEGACIN SUR DEL DISTRITO FEDERAL HOSPITAL GENERAL REGIONAL N 1
DR. CARLOS MAC GREGOR SNCHEZ NAVARRO
UNIDAD DE INVESTIGACIN EN EPIDEMIOLOGA CLNICA Resumen del curso terico corto: Coagulacin anticoagulacin. La perspectiva desde el laboratorio clnico para su evaluacin. Pasado, presente y futuro. MSc Adriana Aurelia RuizdeChvezOchoa
En Mxico al igual que en otros pases el incremento de decesos debidos a problemas hemostticos es la primera causa de morbimortalidad en su poblacin. Los problemas trombticos y hemorrgicos causan la muerte, pero tiene tambin un alta tasa de sobrevivencia muchas veces dejando secuelas de discapacidad, con o sin, dependencia total o parcial, lo que genera una carga social, econmica, familiar, moral y fsica para su entorno. De los padecimientos que se presentan en el sistema de coagulacin (hemorragia o trombosis) existen las dos posibilidades: los congnitos y los adquiridos; los hay severos, moderados y leves. Tambin se debe pensar en la posibilidad de tener predisposicin congnita que no se manifiesta como una enfermedad, pero que al aunarse una condicin de riesgo, las cosas se complican gestando la aparicin de las manifestaciones clnicas del padecimiento. Siempre es ms frecuente que cuando se presenta una hemorrgia el paciente acuda de inmediato a la consulta mdica, mientras que en los procesos trombticos es menos frecuente, es comn que pasen algunos das despus del evento antes de recurrir en busca de ayuda profesional, salvo en las condiciones en que genera dolor agudo. Despus de la consulta mdica donde se realiza historia clnica y exploracin del paciente con hemorragia o trombosis el mdico necesariamente selecciona y decide qu herramientas auxiliares emplear para corroborar o descartar el diagnstico de sospecha. Con respecto al men del laboratorio, hasta este momento no existen pruebas hemostticas simples y completamente efectivas para evaluar la hemostasia, seguramente, por la gran complejidad del sistema de coagulacin. Para individuos con hemorragia los pacientes pueden estar en alguna de estas categoras: con tendencia hemorrgica grave, con tendencia hemorrgica leve, con tendencia hemorrgica moderada, con tendencia hemorrgica dudosa y sin tendencia hemorrgica. Las causas de las enfermedades hemorrgicas pueden estar: a nivel del vaso, por ejemplo: algunas hemorragias pueden deberse a deficiencia de la vitamina C, que genera una mala calidad de colgeno y causa la ruptura de los pequeos vasos o capilares. en las plaquetas, en la fase fluida de la coagulacin, en el sistema fibrinoltico. A excepcin de la Enfermedad de von Willebrand, las alteraciones hereditarias afectan a una sola de las vas. Las alteraciones adquiridas pueden afectar a estos tres componentes del sistema de coagulacin. Es ms frecuente que en edades tempranas se acuda al mdico por hemorragia, las alteraciones por trombosis generalmente no se sospechan, por lo que los comentarios que se hacen a continuacin se refieren a pacientes con padecimientos hemorrgicos, que a ltimas fechas se denominan de manera genrica Hemofilias, aunque nicamente se reconocen tres tipos de Hemofilia (Hemofilia A, Hemofilia B y Hemoficilia C), sin embargo, las otras deficiencias de factores de la coagulacin se engloban tambin dentro del trmino general de Hemofilia. Los individuos que presentan alteraciones severas de una una enfermedad generalmente tienen manifestaciones clnicas evidentes que hacen que de inmediato recurran con un mdico, es por ello que en los padecimientos congnitos severos el diagnstico temprano del padecimiento es de suma importancia, as como la seleccin y aplicacin del tratamiento teraputico idneo es forzoso, por lo que se hace inminente que en los hospitales de gineco-obstetricia y peditricos existan los mtodos de diagnstico y personal capacitado para realizarlos. Sin embargo, en nuestra sociedad la cantidad de individuos con manifestaciones clnicas moderadas o leves no recurren a la consulta mdica, menospreciando, restando y minimizando la importancia de los eventos hemorrgicos.

3/18 Un problema comn es el paciente con tendencia hemorrgica que no tenga alteraciones francas en las pruebas de laboratorio, muchas veces se debe a que el reactivo que se emplea en las pruebas no es el indicado, generando que en algunas ocasiones los resultados entre laboratorios son discordantes, uno confirmando una posible deficiencia y el otro con resultados totalmente normales. En estos pacientes el diagnstico se vuelve indispensable por lo que todo laboratorio debe conocer la susceptibilidad del reactivo que emplea para detectar deficiencias y ese reactivo es el que debe emplear cuando un mdico solicita pruebas para descubrir posibles deficiencias de factores de la coagulacin. Algunos individuos con sangrados leves poco frecuentes, como los pacientes con hemofilia moderada, con algunos subtipos de enfermedad de von Willebrand o con trastornos plaquetarios cualitativos por lo general suelen tener pruebas de laboratorio normales, el problema reside entonces estos pacientes debutan con una hemorragia grave cuando son sometidos a situaciones especiales como puede ser una ciruga. En lo que respecta a las trombosis, stas se presentan en la misma proporcin en la edad adulta que en las etapas tempranas de la vida, sin embargo, sobre todo en pediatra se sospecha poco. Muchas veces el diagnstico se hace post mortem. Usualmente se habla de trombofilia y despus de que ha habido un evento trombtico no se recomienda hacer estudios de laboratorio de inmediato para conocer las causas que generaron esa trombosis, es comn que los mdicos recomienden el empleo de anticoagulantes profilcticos por un determinado tiempo despus, sin embargo, hay condiciones que requieren de que el paciente se anticoagule de por vida, pero esas desiciones las toma el mdico de acuerdo a la historia clnica, el tipo y sitio del evento, la severidad, etc. Actualmente en el mundo occidental se le reconoce como la primera causa de mortalidad. En 1856 Virchow establece lo que se conoce como Triada de Virchow o Triada de la Trombosis: cambios en la pared vascular, stasis venosa y cambios en la composicin de la sangre. Durante las etapas de evolucin del ser humano, se desarrollaron los mecanismos de defensa y de supervivencia que le permitieron adaptarse a las necesidades de su entorno. Es por ello, que curiosamente al sistema de coagulacin se le empieza a denominar de esa manera, porque las manifestaciones evidentes es que la sangre se coagula cuando se expone a la intemperie (como lo es en una herida), pero en realidad, el sistema de coagulacin es un mecanismo de defensa cuya accin fundamental es mantener la sangre en estado lquido, porque es como se requiere para la vida ya que ella es la encargada de distribuir a los nutrientes a toda la economa. Es el endotelio el gran orquestador de la hemostasiaEl endotelio recubre venas, arterias y capilares es la barrera fsica que delimita y contiene en su interior la sangre fluda, por debajo del mismo todo el entorno es procoagulante. Esta capa unicelular que recubre los vasos sanguneos es un rgano verdadero de gran longitud que sirve como barrera entre el estado lquido y slido del organismo, tiene como funcin mantener la integridad vascular, el tono arterial y la sangre en estado lquido, regulando el paso de clulas y molculas a la matriz extracelular, adems modula el crecimiento y desarrollo de la pared vascular, cuando es necesario dirige y modula la formacin del cogulo, hacia la luz del vaso contiene los elementos formes de la sangre y el plasma, su contenido no se comporta como un lquido Newtoniano, por lo que hacia la parte central corren los elementos ms pesados y hacia la periferia ms lentamente se mueven los elementos de menor tamao y peso, por eso las plaquetas giran exactamente sobre el endotelio, sin activarse ya que el endotelio tiene una funcin: anticoagulante con antitrombina, cofactor II de la heparina, el inhibidor de la va del Factor Tisular, el dematn y el heparn sulfato (las heparinas humanas), la protena S y la trombomodulina. antiplaquetaria con la liberacin de xido ntrico, prostaglandinas y ADP asas.

profibrinoltico, por la liberacin del activador tisular del plasmingeno y el activador de la pro-urocinasa Los medicamentos que se emplean como tratamiento tratan de remedar esta actividad del endotelio. Con fines didcticos, la hemostasia suele dividirse en dos: la hemostasia primaria y la hemostasia secundaria, ambas son simultneas. Por debajo del endotelio se encuentra un ambiente netamente procoagulante, rico en colgeno tipo III (Col-III), Factor de von Willebrand (FvW) y Factor Tisular (FT). El xido ntrico que libera el endotelio impide que se activen y sirve como lubricante para que estas giren libremente y prcticamente vayan rodando sobre la membrana de las clulas del endotelio, cuando ste pierde continuidad las plaquetas de inmediato detectan que no hay xido ntrico y se encuentran expuestas las molculas mencionadas (Col-III, FvW, FT), lo que de inmediato genera que se activen y se adhieran al sitio de lesin, sta activacin genera que literalmente se expriman generando una degranulacin de la plaqueta con una consecuente secrecin de su contenido al entorno, la liberacin de estos agonistas plaquetarios genera que a ese sitio concurran mayor nmero de plaquetas y substancias que se requieren para formar y consolidar el cogulo, de tal manera que el reconocimiento entre plaquetas y su unin a travs de puentes de fibrina se le conoce como agregacin plaquetaria (Figura 1).

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FIGURA 1. MODELO DE ACTIVACIN ADHESIN, DEGRANULACIN Y AGREGACIN DE LAS PLAQUETAS


(QBP VIRGINIA GIRN RAMREZ, QFB ADRIANA AURELIA RUIZ DE CHVEZ OCHOA).

FASE FLUDA DE LA COAGULACIN. Al mismo tiempo en que las plaquetas se activan se inicia la fase fluda de la coagulacin, la secuencia las reacciones que la constituyen ha sido determinada in vitro y a pesar de que la sucesin qumica ha quedado bien dilucidada, la importancia fisiolgica de algunas de estas reacciones no lo est, porque individuos con alteraciones en algunas de estas reacciones no manifiestan cambios hemostaticos. El tapon plaquetario no tiene la estabilidad suficiente para sellar el sitio lesin por donde se fuga la sangre, es por ello que se requiere de la formacin de la fibrina, que va a proporcionar adems de estabilidad, consistencia para que se reestablezca el flujo de la sangre por un lado mientras que por el otro, se reparen los tejidos y endotelio lesionados, de tal manera que cuando es innecesario mantenerlo en ese sitio, los mismos componentes que se encuentran hacia la luz del vaso se activen y disuelvan el cogulo sin afectar la circulacin sangunea o causar lesiones en los pequeos vasos. Para comprender e interpretar las pruebas de laboratorio las cascadas de coagulacin son tiles, por lo que, se sigue dividiendo como va intrnseca y va extrnseca de la coagulacin, aunque en fechas recientes se les han asignado otros nombres: la va extrnseca as llamada por que el nico factor de la coagulacin que no se encuentra dentro de la luz de las venas es el factor tisular y por tanto es un elemento extrnseco, tambin se le llama va del factor tisular o via primaria y es la encargada de generar las microdosis de trombina, que es rpidamente inactivada por el inhibidor del factor tisular. La va intrnseca tambin se le llama va accesoria o secundaria, es la encargada de generar las macrodosis de trombina, es por ello que la deficiencia de los Factores IX y VIII causantes de la Hemofilia B y la Hemofilia A respectivamente, causan sangrados ya que no se puede mantener la generacin de fibrina. Se considera que hay dos factores clave en la coagulacin el Factor VIII y el Factor V, considerados cofactores en el complejo enzimtico en que actan, son considerados factores clave de la fase fluda de la coagulacin ya que tienen un rol preponderante al incrementar significativamente la eficiencia cataltica del Factor activado junto con el cual actan, aumentando la afinidad del complejo por su sustrato. Al igual que las plaquetas, la fase fluda se activa al exponerse el subendotelio donde se encuentra abundante colgeno tipo III, Factor de von Willebrand y Factor Tisular, de tal manera que el Factor VII activado (siempre circula un uno por ciento activado) reconoce de inmediato al Factor Tisular expuesto, formando un complejo (complejo diezasa extrnseco) que es capz de activar al Factor IX (del complejo diezasa intrnseco) y al Factor X (del complejo protrombinasa). Se reconoce que durante la coagulacin hay una activacin secuencial de los Factores de coagulacin por accin de otro Factor de la coagulacin previamente activado, de tal manera que las cascadas de coagulacin se transformaron en una nueva teora de los complejos enzimticos (Figura 1), donde estos complecos actan en forma concatenada, secuencial y sistemtica para la formacin de microdsis de trombina, enzima de la coagulacin que tiene una gran diversidad de funciones en el organismo humano, pero que en el caso que nos ocupa su efecto en la coagulacin es de suma importancia ya que: transforma el fibringeno en fibrina, activa al factor XIII que va a estabilizar a la fibrina formada,

5/18 activa al inhibidor del activador del Factor Tisular (FT), retroalimenta a la coagulacin misma por activacin directa de otros Factores de la coagulacin (XI, VIII, V),

modula la formacin del cogulo a travs de la activacin del sistema de la protena C. Con la aparicin del inhibidor del activador del FT se extingue casi de inmediato la llamada va extrnseca de la coagulacin, pero, como el mismo complejo diezasa extrnseco (Factor VII:FT) ha activado al Factor IX que entra a formar parte del complejo diezasa intrnseco hechando a andar la llamada va intrnseca de la coagulacin. Inicialmente se forman con la va extrnseca microdosis de trombina capaces de retroalimentar la llamada va intrnseca de la coagulacin (activa al Factor XI, VIII y V). La activacin del primer complejo de la llamada va comn de la coagulacin (complejo protrombinasa Factor Xa:Factor Va:Fosfolpidos:Iones calcio), hace que esta vas (la va extrnseca y la va comn) permanezcan activas para generar suficiente fibrina porque esto permite la formacin de macrodosis de trombina capaces de formar y estabilizar el cogulo sanguneo que interrumpe la prdida de sangre.

FIGURA 2. MODELO MODIFICADO DE LA GENERACIN DE TROMBINA. MANN KG. TROMBIN FORMATION. CHEST 2003;124:4S-10S

Durante la formacin de la molcula de fibrina, la liberacin de los fibrinopptidos por accin de la trombina expone sitios del fibringeno que son complementarios a los sitios de otro fragmento activado del fibringeno, esto permite un crecimiento longitudinal y lateral de los polmeros de fibrina generando un cogulo de fibrina reorganizable que puede ser fcilmente disociado por algunos agentes como la urea, necesitando una modificacin final que le proporcione

6/18 estabilidad ante las agresiones del medio (recuerde usted que la sangre sigue moviendose en las capas superiores en donde esto ocurre, por lo que se genera turbulencia que puede restarle estabilidad al taponamiento que se requiere para evitar que la sangre siga saliendo del interior del vaso) por lo que es indispensable asegurarse de una mayor estabilidad. Simultneamente la trombina activa a otra protena plasmtica, el factor XIII, que activado cataliza la formacin de enlaces covalentes irreversibles entre el cido glutmico y los residuos de lisina en monmeros de fibrina adyacentes; esto convierte al cogulo soluble de fibrina en una molcula alta y firmemente entrecruzada, insoluble e indivisible que mantiene el cogulo plaquetario firme e inamovible del sitio en donde se form. La generacin del cogulo defibrina es un proceso dinmico. A pesar de que hay un nfasis especial en la fase de iniciacin del cogulo y los elementos que conllevan a la formacin de trombina, los mecanismos que limiten este proceso al sitio del dao fascular son igualmente importantes. El hecho de que la circulacin permanesca y la sangre se mantenga fluda nos hace olvidar que el este estmulo intenso para la formacin de un cagulo como en un trauma masivo pone a prueba la eficacia de este mecanismo. Los inhibidores del proceso de coagulacin dependen del flujo sanguneo o de las reacciones bioqumicas especficas. El flujo sanguneo a travs de un rea de lesin limita el proceso de coagulacin por medio de dos mecanismos: Primero por la concentracin local de los factores de coagulacin activados est continuamente disminudo por el influjo de sangre fresca.

Segundo, los Factores activados son eliminados por el hgado ya que tiene la capacidad para remover selectivamente los factores de coagulacin activados del plasma dejando en circulacin Factores inactivos. Inhibidores bioqumicos. Los mecanismos que se han evolucionado para inhibir la coagulacin son dedos tipos: inhibidores plasmticos e inhidores de retroalimentacin. Inhibidores plasmticos. Una variedad de inhibidores circulantes en la sangre para limitar la difusin de factores activados del sitido en donde he ha formado el cogulo. El inhibidor principal en el plasma es la antitrombina, hasta hace poco llamada antitrombina III es mejor conocida por que media la actividad anticoagulante de la heparina. La antitrombina inactiva enzimas que tienen una serina en su sitio activo como la trombina, Factores Xa, IXa, XIa y XIIa, plasmina, tripsina y quimotripsina. El Factor VII a aparentmente es relativamente resistente a esta inhibicin. El efecto inhibidor del la antitrombina III solamente requiere de 25 a 45 segundos, mientras despus de la unin de la heparina a la antitrombina, la accin anticoagulante de la antitrombina es virtualmente instantnea. Un segundo inhibidor plasmtico es la 2-macroglobulina que tambin forma un complejo irreversible con la trombina, a pesar de que lo hace a una menor velocidad que la antitrombina, se cree que contribuye realizando una cuarta parte de la actividad antitrombinica del plasma. Otros inhibidores plasmticos que tambin pueden inactivar a las protenas de la coagulacin son al 1-antitripsina que inactiva al Factor XIa y el inhibidor de la C1-esterasa, el cual inhibe al Factor XIa, XIIa y la calicrena. En 1993 se describi una va enzimtica nica que inactiva ambos factores, el V y el VIII. Esta va es clnicamente importante porque algunos individuos con deficiencias hereditarias son susceptibles a presentar trombosis. Estea va genera una proteasa llamada protena C activada que inhibe al Factor V activado y el Factor VIII activado .La protena C sola es un zimgeno vitamina K dependiente, que por accin de la trombina se activa. La habilidad de la trombina para activar a la protena C esta modulada por una protena especfica de la superficie endotelial llamada trombomodulina. Cuando la trombina se une a la trombomodulina, la protena C es activada rpidamente con lo que se impide que se siga generando ms trombina, por lo que es capz de autorregular la formacin de trombina y con ello la formacin del cogulo. En Europa se considera que la resistencia a la protena C activada es la principal causa de trombofilia ya que la formacin del cogulo no se autolimita; sin embargo, en Mxico en el grupo de investigacin en donde colabor encontramos en el grupo de pacientes con trombosis venosa profunda o con trombosis arterial y de testigos sanos una muy baja incidencia de la resistencia a la protena C activada dependiente de Factor V, as mismo, en ste ao se public por ste grupo el artculo , sin embargo, en la tesis de maestra de Manuel Moreno Hernndez en un grupo de pacientes que ya haba sufrido trombosis y tenan el panel de trombofilia negativo, encontramos un alta incidencia de resistencia a la protena C activada dependiente de Factor VIII, especialmente en pacientes con trombosis de repeticin y con prdida fetal recurrente, sta informacin est pendiente de ser publicada en alguna revista de difusin, pero por ejemplo en la carta al editor de Andre E, Hacquard M, Alnot Y, de Maistre E y Lecompte T publicada en septiembre de 2007 se reconoce este hecho como una nueva aportacin para ser evaluada en los pacientes de riesgo trombotico (Activated protein C resistance test using factor VIII-deficient plasma: a new approach to the venous thrombotic risk? Thrombosis & Haemostasis 2007;98[3]:693-694).

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FIGURA 3. INACTIVACIN DEL FACTOR V ACTIVADO Y DEL FACTOR VIII ACTIVADO, POR ACCIN DE LA PRROTENA C ACTIVADA.

El hecho de que la trombina quede inactiva, hace que la formacin del cogulo se pare.

FIGURA 2. MODELO MODIFICADO DE LA INHIBICIN DE LA GENERACIN DE TROMBINA. MANN KG. TROMBIN FORMATION. CHEST 2003;124:4S-10S

8/18 Una de las modificaciones que se ha hecho a los esquemas, es debido a que ah representamos ahora tambin a la Proteina Z de la coagulacin, que durante el procesos de formacin del cogulo funciona como una molcula que ayuda a mantener a la trombina adherida a la membrana plaquetaria para reforzar el hecho de que en ese sitio es donde se requiere que se genere la maya de fibrina, en el momento en que esto debe cesar, la Protena Z deja de anclar a la Trombina y se une al Factor X activado para inactivarlo. Cuando las molculas de fibringeno se entrelazan para formar el fibringeno insoluble, atrapan en su interior activador del plasmingeno, cuando el cogulo se empiesa a debilitar porque ya no es necesario, se empiezan a exponer estas molculas del activador del plasmingeno, que actan de inmediato al activar el plasmingeno que se encuentra circulando en la sangre, ste al encontrarse en un medio rico de fibrina empieza a destruir la maya de fibrina generando los monmero, dmeros, trmeros, tetrmeros de fibrina, fragmento E, fragmento DY, de inmediato la plasmina que sale de este entorno es inacativada por la antiplasmina ya que, al ser una enzima LABORATORIO. Las pruebas hemostticas pueden dividirse en grupos: pruebas de escrutinio y especficas. PRUEBAS DE ESCRUTINIO: CUENTA DE PLAQUETAS. En la actualidad la mayora de los laboratorios realizan la cuantificacin de plaquetas de manera automatizada. No se debe olvidar que el mtodo de referencia de la mayora de los procedimientos en Hematologa son los mtodos manuales (a excepcin de la cuenta de eritrocitos) En trminos generales la incorporacin del anticoagulante a la muestra debe de hacerse de manera inmediata, por lo que es importante mezclar la sangre con el anticoagulante de la manera ms rpida posible, si por alguna razn esto no se realiza se inicia la formacin de cogulos y acumulos plaquetarios, lo que suele originar una trombocitopenia ficticia. Otras causas de pseudotrombocitopenia ficticia son: la debida a una aglutinacin de las plaquetas inducida por el anticoagulante, el que ms frecuentemente se ha reportado es el EDTA, el citrato de sodio, se recomienda siempre revisar el frotis (extendido) de sangre perifrica, ste se debe realizar inmediatamente despus de haber obtenido la sangre; la presencia de plaquetas gigantes, el satelismo plaquetario (leucocitos rodeados de abundantes plaquetas)

y los microcogulos de plaquetas, condiciones para las cuales tambin se exhorta a la revisin del frotis. La trombocitopenia puede tener mltiples causas. Con excepcin de los traumatismos, la trombocitopenia representa la causa ms frecuente de hemorragia por lo que su identificacin es el paso inicial, por lo que una biometra hemtica es indispensable teniendo en siempre en consideracin las interferencias mencionadas en el prrafo anterior. Las hemorragias debidas a defectos en la funcin plaquetaria se evidencan con el TIEMPO DE HEMORRAGIA, en donde se evala in vivo la respuesta del organismo hacia una lesin. Lamentablemente el dispositivo que se recomienda para realizar este estudio de manera confiable ya no se comercializa en nuestro pas, por lo que cualquier otra forma no estandarizada de realizarlo es poco confiable. Aunque parece una prueba muy simple, tiene mltiples variables. Esta es la prueba hemosttica ms difcil de estandarizar pero si se hace as este estudio ofrece resultados altamente reproducibles ofreciendo informacin muy importante para la evaluacin del paciente.

FIGURA 3. PRUEBAS DE LABORATORIO Y FACTORES DE LA COAGULACIN.

9/18 TIEMPO DE PROTROMBINA (TP). Se llama as porque en cuando Quick en 1943 describe la prueba no se conocan los factores V, VII y X, se crea que la prueba nicamente dependa de la concentracin de protrombina. Esta prueba mide la formacin del cogulo por la va extrnseca y la va comn de la fase fluida de la hemostasia, aunque hoy en da se sabe que ambas vas (la extrnseca y la intrnseca) se interrelacionan, sta separacin es til con fines de enseanza e interpretacin de resultados. Se reporta como el tiempo en segundos que tarda en coagular la muestra cuando se adiciona la muestra a la mezcla de reaccin. La prueba utiliza una tromboplastina completa (equivalente a la tromboplastina tisular). Hasta hace unos aos se comercializaba sin el calcio adicionado, pero desde 1990 todas las tromboplastinas traen adicionado el cloruro de calcio, por lo que para la realizacin de la prueba suele realizarse colocando el reactivo en la copilla de reaccin, la cual se inicia cuando se adiciona el plasma citratado del paciente (previamente incubado a 37C). Si cuando se realizan las pruebas de escrutinio nicamente el TP se prolonga se debe sospechar de una deficiencia de Factor VII, pero si ambas pruebas estn afectadas, el TTPa y el TP puede deberse a una deficiencia de los factores V, X, II y fibringeno (de la va comn). El TP no requiere de la fase de contacto y por lo tanto no se altera en los casos con deficiencia de PK, CAPM o de los factores VIII, IX, XI y XII. Hoy sabemos que la prueba es muy sensible a la deficiencia de los factores V, VII y X, pero en la actualidad hay tanta diversidad de reactivos que es preferible que el laboratorio verifique la susceptibilidad del sistema de diagnstico en sus condiciones de trabajo (reactivo, equipo y muestra). Al igual que el TTPa, el TP puede estar prolongado por deficiencia de un factor o por la presencia de un anticoagulante circulante, sin embargo esta es una prueba que pocas veces se ve afectada cuando existe el denominado anticoagulante lpico circulante, pero en algunos casos ambas pruebas reflejan la presencia de este tipo de anticuerpos. Cuando ocurren este tipo de hallazgos suceden es importante que el laboratorio realice los estudios denominados correcciones y diluciones para definir si el tiempo est prolongado debido a la deficiencia de factores de la coagulacin o bien a la presencia de un inhibidor o anticoagulante circulante. Esta es la prueba que fue seleccionada para el monitoreo de la terapia oral anticoagulante ya que los anticoagulantes orales inhiben la carboxilacin de los factores vitamina K dependientes lo que prolonga el TP, cuando el paciente esta perfectamente bien anticoagulado no suelen detectarse alteraciones en los resultados del Tiempo de tromboplastina parcial (TTP), lo que hace al TP la nica prueba til para el seguimiento del tratamiento. Debido a la gran discrepancia que exista en la preparacin de reactivos y el reporte de resultados de laboratorio surgi la necesidad internacional de generar reactivos e informes de calidad que hicieran equiparables los resultados en cualquier parte del mundo para el manejo de los pacientes bajo terapia oral anticoagulante a fin de poder monitorear la terapia, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) dise un mtodo de calibracin internacional basndose en la calibracin de los reactivos con respecto a una preparacin de referencia (actuamente son dos las soluciones terciarias de referencia internacional que se encuentran en uso, la RBT/90 de conejo y la rtF/95 de origen humano) la correlacin que existe entre los resultados con ambos reactivos se conoce como ISI (ndice de Sensibilidad Internacional), que no es otra cosa que una calificacin de la calidad de la tromboplastina. Si se conoce el ISI de la tromboplastina, entonces el TP puede ser expresado en un nmero estandarizado internacional mejor conocido como INR. El INR se correlaciona con la intensidad de la anticoagulacin oral independientemente de los segundos que se requieren para la formacin del cogulo que a su vez dependen de la sensibilidad (calidad) de la tromboplastina. Entre ms cercano a uno el ISI la tromboplastina es de mejor calidad, los segundos requeridos para formar un cogulo sern menos que si se utiliza una tromboplastina menos sensible. El INR permite que los segundos que tarda la muestra en coagular ya no sean factor importante en el manejo del paciente ya que el valor se ha transferido a un factor estandarizado para todo el mundo. En 1984 el Comit cientfico y de estandarizacin (SSC) de la Sociedad Internacional en Trombosis y Hemostasia (ISTH) que forma parte de la Organizacin Mundial de Salud (OMS) establece las guas para estandarizar los resultados que permitan realizar de manera confiable esta tarea ya que, se observ una gran discrepancia entre los mismos debidas a las diversas calidades y composiciones de los reactivos, ahora se sabe que adems tambin se afecta por la instrumentacin y por la concentracin de citrato empleado para anticoagular la muestra problema. En trminos generales los proveedores entregan ya los reactivos con la informacin del ndice internacional de sensibilidad (ISI) correspondiente (considerando que todos los laboratorios emplean citrato 3.2% para la preparacin de las muestras biolgicas), el ISI se determina usando la tcnica manual comparando los resultados entre los obtenidos empleando una tromboplastina de referencia y los que se logran usando el reactivo a estandarizar, esta cotejo debe realizarse con los resultados de 60 muestras de pacientes que consumen anticoagulantes orales y 20 muestras de voluntarios sanos que no consumen medicamentos; el problema es que la actualidad hay muchos laboratorios que ya no emplean la tcnica manual, sino que realizan ste tipo de estudios empleando una variedad de instrumentos automatizados o semiautomatizados, de tal manera que los valores del ISI de las diversas tromboplastinas se modifican considerablemente por la instrumentacin y como consecuencia, los resultados del INR que no son confiables, por lo que en la actualidad se ha propuesto que cada laboratorio verifique el ISI de su reactivo o bien estandarice la obtencin del INR de manera local, mediante el empleo de plasmas certificados (plasmas calibradores), para calibracin del ISI recomiendan que se realice por cuadruplicado en la misma sesin de trabajo al

10/18 menos por tres sesiones o tres das diferentes para verificar el control da a da e intercorridas. El empleo de los plasmas cerificados para determinaciones directas del INR deben efectuarse por lo menos durante tres sesiones o das. Las lneas de correlacin para la calibracin del INR y para la determinacin directa del INR deben ser realizadas y calcularse por medio de la regresin ortogonal; el control de calidad para el INR con plasmas certificados debe realizarse de manera regular y debe ser repetido siempre que haya un cambio en los lotes de reactivo o los equipos. El hecho de que los reactivos para la realizacin del estudio de tiempo de protombina tengan un ISI asignado por el proveedor, hace que dicho reactivo tenga una trazabilidad con respecto a un estndar internacional de referencia. Para el INR se calcula primero un cociente conocido como el ndice de protrombina (IP) que resulta de dividir el Tiempo de protrombina en segundos del paciente entre el Tiempo de protrombina en segundos del pool de plasmas, (IP = TP del paciente/TP del pool), en las tablas que generalmente aaden los fabricantes en la caja de los reactivos este ndice se acota en la mayora como R; el INR es ese ndice de protrombina elevado a la potencia sealada por ISI del reactivo empleado en la determinacin, de tal manera que es: INR = (IP)ISI. En la actualidad con la modernizacin, es suficiente que en los equipos que se emplean se registre el ISI del reactivo y el tiempo de protrombina en segundos del pool para que en el informe automticamente aparezca el dato del INR correspondiente, si no se hace de esta manera, es importante que si se hace el clculo por el personal de laboratorio se emplee calculadora cientfica o bien se empleen las tablas que vienen incluidos en los reactivos. De tal manera que si se conoce el ISI de la tromboplastina el TP puede ser expresado en un cociente estandarizado internacional mejor conocido como INR. El INR permite conocer la intensidad de la anticoagulacin oral independientemente de los segundos que se requieren para la formacin del cogulo que a su vez dependen de la sensibilidad (calidad) de la tromboplastina. Entre ms cercano a la unidad es el ISI de la tromboplastina (mejor calidad), los segundos requeridos para formar un cogulo sern menos que si se utiliza una tromboplastina menos sensible. El INR permite que los segundos ya no sea el factor importante a evaluar en el paciente ya que el valor se ha transferido a un factor estandarizado para todo el mundo. Hirsh y colaboradores desde el cuarto consenso del Colegio Americano de Cirujanos del Trax (ACCP) en 1998 prepararon un documento de revisin que fue publicado con el ttulo Anticoagulantes orales: mecanismos de accin, efectividad clnica y rango teraputico ptimo (Oral Anticoagulants: Mechanism of Action, Clinical Effectiveness, and Optimal Therapeutic Range) en la revista Chest 108(4): 231S-246S, haciendo varias revisiones del mismo que se han publicado en esa misma revista en que han sido publicadas en 2001, 2004 y la ltima en este mismo ao junio de 2008. En estas recomendaciones o guas, hay un cuadro con respecto a las posibles causas de error que pueden originar problemas en el reporte incorrecto del INR, la traduccin es la siguiente:
PROBLEMA 1. Indice de protrombina incorrecto debido a determinacin errnea del tiempo de protrombina debido a variables preanalticas (problemas en el muestro y recoleccin de la sangre) 2. Valor incorrecto del testigo normal DESCRIPCIN Concentracin de citrato de sodio (recomiendan emplear citrato 3.2). Tiempo y temperatura de almacenamiento. Efectos por el tubo al vaco. Muestra inadecuada. Variaciones en el procedimiento de la toma. Por no emplear el valor de la media del normal del tiempo de protrombina originada por : (1) seleccin no representativa (2) errores tcnicos (3) no emplear la media geomtrica Seleccin incorrecta del ndice de protrombina. Poca actividad del anticoagulante a lo largo del tratamiento en el paciente. Nmero inadecuado de muestras de prueba en la calibracin del ISI. Transformacin incorrecta del IP de la muestra a INR.

3. Valor del ISI incorrecto para el sistema de determinacin empleado (reactivo de tromboplastina/sistema de prueba debido a una falta de veracidad en el ISI determinado por el fabricante.

4. Desviacin del ISI desde la calibracin del ISI 5. Efectos del coagulmetro (instumento) en el sitio local 6. Efecto del anticoagulante lpico con algunas tromboplastinas 7. Falta de reproducibilidad del sitema de INR cuando se unas en las etapas iniciales del tratamiento con warfarina y para las pruebas de escrutinio para coagulopatas en pacientes con enfermedad heptica. 8. Baja reproducibilidad relativa a INR mayores de 4.5 ya que estos valores son excludos en las calibraciones del ISI. 9. Ingesta de medicamentos, remedios y alimentos que potencan o inhiben el efecto del anticoagulante. Alimentos ricos en vitamina K (hojas verdes, aceite de oliva, soya, coliflor, aguacate, te verde, tabaco). Complementos vitaminicos y complementos alimenticios. Medicamentos nuevos. Mango (potenca al anticoagulante).

CUADRO 1. MODIFICACIN DEL CUADRO DE ERRORES POTENCIALES EN LA DETERMINACIN DEL INR (CHEST 2008;133[6]:168S)

Como se puede observar la mayora de estas causas son imputables a laboratorio y son cuestiones que el personal de laboratorio debe vigilar. Lamentablemente en nuestro medio es comn que los artculos escritos en ingls sean

11/18 traducidos al espaol por personas que no manejan el lenguaje de laboratorio y quienes laboramos empleemos esas traducciones sin compararlas con el artculo original, ello ha llevado a errores como el haber traducido el normal del tiempo de protrombina por control normal, en esos aos 1983 1985 los controles comerciales casi no eran empleados en el rea de coagulacin, as que esto trajo como consecuencia la apertura de esta parte de laboratorio para la introduccin de controles para el control de calidad del rea, pero errneamente se empez a utilizar el resultado del control normal para calcular el INR de los pacientes, en vez de emplear el resultado del pool de plasmas. Otra cuestin, es que por ejemplo el mismo artculo original para informar y difundir las recomendaciones para el reporte del tiempo de protrombina en el control de la anticoagulacin oral se difundi ampliamente en diversas publicaciones cientficas a fin de asegurar que hasta al sitio ms recndito llegaba la informacin que interesaba divulgar, dentro del texto hace referencia a la media del normal de TP y en la tabla que presenta le llama normal de protrombina, ah se plantea que una frmula que escrita en el lenguaje que empleamos los qumicos de este Pas sera: normal del TP que traducido al lxico nuestro es TP del pool, adems posteriormente otras asociaciones han tomado cartas en el asunto. INR =

TP paciente TP pool

ISI

El Colegio Americano de Cirujanos del Trax en la revista Chest de 1995 recomienda el empleo de otras frmulas, sealando por ejemplo que en vez del TP del pool se emplee la mediana del rango normal del TP, para 1998 recomiendan la media del normal del TP. Para quienes trabajamos empleando el mtodo de promedios diarios para los grficos de Levey-Jennings para el programa interno de control de calidad y solamos correr uno o varios pooles en da, sabemos que casi siempre coincidan el promedio diario y al menos un pool, recientemente han surgido sugerencias en donde se seala que la media debe de calcularse no por medio de la media aritmtica, sino empleando media geomtrica, hasta el momento en mi humilde experiencia la diferencia entre ambas es mnima, de dcimas o milsimas, lo que hace irrelevante si se emplea una u otra para el clculo. Lo que es verdaderamente importante es sealar que el valor del pool debe reportarse siempre como el testigo normal del TP y que ese es el dato que debemos emplear para los clculos del INR ya que los controles normales por definicin han sido diseados profesionalmente para corroborar que el lmite entre los valores normales y los patolgicos altos se encuentra bien delimitado en nuestro sistema y el resultado de este control caer en el rango normal no en el anormal; esto genera que entre ambos haya por lo menos entre 2 y 2.5 segundos ms, lo que ocasiona que el valor de INR que se reporta al mdico sea menor que el real. Reitero que lo recomendable es emplear el pool de plasmas normales y si se tiene curiosidad corroborar que ste valor siempre coincide y es estadsticamente semenjante al de la media de los pacientes normales. La concentracin de citrato se ha demostrado que es de suma importancia para el manejo de pacientes anticoagulados, es por ello que se recomienda emplear citrato 3.2% (0.105 0.109 M) en las clnicas de anticoagulantes. Es trascendental que cuando en pacientes que no estn tomando anticoagulantes orales los tiempos de coagulacin como el TP, salen alargados, se realicen las denominadas pruebas de correcciones y diluciones que en otros lados de habla hispana se llaman pruebas de mezcla. En Mxico se llaman correcciones a la mezcla en diluciones progresivas de la muestra problema (del paciente) con pool de plasmas normales o bien con otras muestras biolgicas como son el plasma deficiente de factor (que en el caso del TP deberan ser deficiente de Factor VII, X, V, II), plasma envejecido (deficiente de Factor V y de Factor VIII), plasma adsorto (deficiente de Factor II, Factor VII, Factor IX y Factor X), el pool de sueros citratado (deficiente de fibringeno, Factor II, Factor V y Factor VIII), en caso de no contar con ninguno de estos es posible emplear un control comercial normal o bien un plasma calibrador, pero por el costo no sera recomendable. Estas pruebas son tiles para discernir entre la deficiencia de factores de la coagulacin o bien la presencia de un anticoagulante circulante. Lo importante de esto, es que se debe verificar la sensibilidad analtica del reactivo que estamos empleando para la deficiencia de los factores que intervienen en esta va extrnseca de la coagulacin que valoramos con el tiempo de protrombina, es decir, debemos hacer los ensayos pertinentes para la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor X. la deficiencia del Factor V y la deficiencia del Factor II (protrombina); la realidad es que cada laboratorio debe realizar estas pruebas para conocer esta informacin en sus condiciones de trabajo, en general se dice que mientras ms cercano a 1 es el ISI del reactivo el mismo es ms sensible a la deficiencia de factores vitamina K dependientes, no as para el Factor V. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa). Con esta prueba se evaluan la va intrnseca y la va comn de la fase fluida de la hemostasia. Existen tromboplastinas parciales como la cefalina que tienen una actividad equivalente a la del factor plaquetario 3. La prueba originalmente descrita (el tiempo de tromboplastina parcial, TTP), consista en agregar una de estas tromboplastinas parciales a un plasma citratado a 37 oC. La mayora de las personas ignora que en esencia tanto el reactivo de TP como de TTPa son el mismo, la diferencia estriba en que para el TTPa se hace una extraccin orgnica, eliminando una apolipoprotena, haciendo que el tejido que se emplea para elaborarlo quede de manera parcial, por lo que es parcial es la tromboplastina y dado que en el castellano el adjetivo calificativo va despus del objeto o sujeto, el nombre correcto de la prueba es Tiempo de Tromboplastina parcial

12/18 (TTP); cuando a ese reactivo se le adiciona un activador aquiere el nombre de Tiempo de Tromboplastina parcial activada (TTPa), esta activacin previa se hace para evitar que la fase de contacto influence los resultados de la reaccin, por lo que esta variacin consiste en activar la prueba al mximo mediante la adicin de una sustancia de carga negativa (kaoln, celite, cido elgico, etc.) al plasma antes de que se adicione el calcio con el que se dar inicio a la formacin del cogulo. Esta nueva prueba es lo que en la actualidad se denomina TTPa, la cual, por sus ventajas ha desplazado casi completamente al TTP que ha cado propiamente en desuso y casi no hay casas comerciales que lo preparen. Esta prueba mide en segundos el tiempo que tarda en formarse el cogulo cuando se adiciona el calcio a la mezcla de reaccin (reactivo y muestra). La muestra de plasma ha sido descalcificada por el citrato de sodio al tomar la muestra. Como con todas las pruebas, la recoleccin de la muestra tiene que ser cuidadosa ya que se puede activar la fase de contacto en cualquier momento. Sin embargo, una ventaja de realizar tanto el TTPa como el TTP en un enfermo es que se tiene una evaluacin inmediata de la fase de contacto ya que es posible sospechar una anormalidad de esta fase cuando un TTP prolongado no se acorta significativamente luego de la activacin. En algunos pacientes resulta sumamente importante el tipo de activador que se emplea para la realizacin de esta prueba, ya que por ejemplo es mucho mejor emplear un reactivo que tenga kaolin como activador en las muestras (espeicialmente de mujeres) en las que se sospecha que hay anticoagulante lpico. Hay diferencias entre las muestras por el tipo de activador que se emplea, es por ello que el personal de laboratorio debe verificar si el reactivo que emplea es capaz de detectar la deficiencia leve, moderada o severa de los Factores (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, Fibringeno), asi como: ciningeno de alto peso molecular (KAPM) y precalicrena (PK). Cuando se emplea anticoagulacin con heparina no fraccionada esta es la prueba que el mdico emplea para ajustar la dosis. El TTPa se prolonga si existe una disminucin en la concentracin o en la actividad de los factores hemostticos o si existe algn tipo de anticoagulante. Todos los factores hemostticos (a excepcin del calcio y el fibringeno), estn normalmente presentes en el plasma en una concentracin de 100 U/dL CORRECCIONES Y DILUCIONES. Si se mezcla el plasma de un paciente con alguna de estas dos pruebas TP y/o el TTPa prolongado con plasma de un individuo normal, al momento de volver a realizar la prueba es posible distinguir si el paciente tiene deficiencia de factores o si existe un anticoagulante presente. Cuando al mezclar un volumen igual de los plasmas normal y control no existe correccin del alargamiento del resultado, el diagnstico es que existe un anticoagulante. Si existe correccin parcial o absoluta del resultado, es posible que exista entonces deficiencia de uno o varios factores. En el rubro del TP ya se expusieron los reactivos necesarios para la realizacin de estas pruebas y que aporte de Factores hacen el pool de plasmas, el pool de plasmas envejecido, el plasma adsorto y el pool de sueros. Si el patrn de las pruebas sugiere que el alargamiento es debido a deficiencia de factores, es posible establecer con certeza cul es el factor deficiente utilizando plasmas que han sido repletados artificialmente de un factor especfico. Existen numerosas tcnicas para repletar al plasma de uno o varios factores. La identificacin certera del factor deficiente en el plasma del paciente se lleva a cabo mezclando el plasma problema con un plasma normal. Para asegurar ms todava que el plasma normal no tenga, por casualidad, alguna deficiencia silenciosa de algn factor, se prefiere el uso de una mezcla de plasmas de individuos aparentemente sanos (lo que se conoce como pool o testigo). El principio de las pruebas que utilizan un plasma deficiente en un factor especfico para mezclarlo con el plasma del paciente se basa en que los plasmas con diferentes deficiencias de factores se corrigen unos a otros cuando son mezclados. Es decir, un plasma deficiente en FX se corrige siempre en relacin a la concentracin de FX que el plasma del paciente tenga. Por ejemplo, si el paciente tiene 5% de FX, slo corregir muy discretamente al plasma deficiente de FX que se utiliz en la prueba. Si no existe correccin, se asume que ambos plasmas tienen la misma deficiencia. Debe conocerse la sensibilidad del tipo de TTPa que se utiliza ya que con una tromboplastina parcial sensible los resultados de la prueba se hacen anormales cuando la concentracin del FVIII disminuye por debajo de 40 U/dL. Si se tiene una prueba menos sensible, algunos casos de hemofilia moderada pueden no ser detectados. DOSIFICACIN O CUANTIFICACIN DE FACTORES. En lo personal recomiendo emplear el plasma deficiente del factor para la dosificacin del factor que sospechamos que le falta a la muestra. La Federacin Mundial de Hemofilia (FMH) recomienda en su manual (disponible va Internet en la pgina de la FWH por sus siglas en ingls) que las muestras que se van a emplear para dosificacin de factores (especialmente los termolbiles) se separen lo ms rpido posible del paquete globular y se conserven en frio hasta el momento de la dosificacin, recomiendo la lectura del artculo de Woodhams (Blood coagulation and fibrinolysis 2001;12(4):229-236) para la estabilidad de cada uno de los Factores de coagulacin en muestras congeladas. La FMH recomienda que tanto del calibrador como las muestras problema y el mismo plasma deficiente que se va a emplear para procesar las muestras, se diluyan 1:10, 1:20 y 1:40 con buffer salino de Owren, de tal manera, que las tres diluciones se procesen para determinar el tiempo que tarda en segundo en coagular la muestra. Si el factor que se va a determinar se puede detectar con el TP (VII, V, X, II) se prepara una mezcla de 150 microlitros de la dillucin del plasma problema con 150 microlitros del el plasma deficiente que se incuba. En la copilla de

13/18 reaccin se colocan 200 microlitros de reactivo y se arranca la reaccin adicionando 200 microlitros de la mezcla de plasmas, se mide el tiempo que tarda en coagular la muestra. Empleando papel semilogaritmico se coloca la escala logaritmica en el eje de las X, que ser la concentracin, considerando la dilucin 1:10 del calibrador como 100% de actividad (o el porcentaje de actividad sealado en el calibrador para el Factor que se est determinando), 1:20 es 50% de actividad y la dilucin 1:40 equivale al 25% de actividad. Si el paciente est bien su trazo ser paralelo al del calibrador y la curva del plasma deficiente comercial deber tener una concentracin realmente baja para ser til en los pacientes con deficiencia severa de factores. Si la curva del paciente no es paralela esto indica la presencia de un inhibidor. Si el factor que se va a determinar se puede detectar con el TTPa (XII, XI, IX, VIII, V, X, II) en la copilla de reaccin se prepara una mezcla de 100 microlitros de la dillucin del plasma problema con 100 microlitros del el plasma deficiente y 100 microlitros del reactivo que se incuba, se arranca la reaccin adicionando 100 microlitros de cloruro de calcio a la concentracin recomendada por el fabricante, se mide el tiempo que tarda en coagular la muestra. Se sigue el mismo procedimiento para realizar el grfico correspondiente.

T T Pa s eg

140 120 100 80 60 40 20 0

0.1

10

100
% actividad

1000

GRFICA 1. GRFICO PARA LA

CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD DE LOS FACTORES DE COAGULACIN.

TIEMPO DE TROMBINA (TT). Lamentablemente aunque esta prueba aunque recomendable se considera que no es esencial como parte del escrutinio de un paciente. La prueba consiste en adicionar una solucin de trombina a una muestra de plasma anticoagulado con citrato para producir un cogulo. Gerneralmente se dice que esta prueba est prolongada slo en cuatro situaciones: en hipofibrinogenemia que es cuando el fibringeno plasmtico est bajo, en las disfibrinogenemias, donde puede haber concentraciones normales de fibringeno pero no es funcional, en presencia de productos de degradacin del fibringeno

y cuando existe heparina en el plasma del enfermo. Sin embargo, hay reportes que sealan que cuando el fibringeno est sumamente elevado los mismos productos de degradacin del fibringeno que se generan en la copilla de reaccin interfieren en la prueba y suele dar TT prolongados, es por ello que se recomienda que cuando se sospecha de concentraciones altas de fibringeno se diluya la muestra y se cuantifique el fibringeno multiplicando por el factor de dilucin, ya que la dosificacin de fibringeno por el mtodo de Clauss emplea un reactivo concentrado de trombina. Ocasionalmente, un paciente con fibringeno anormal puede tener un TT alargado con TP o TTPa normales o discretamente prolongados. Esto significa que, a menos que se realice el TT cierta proporcin de pacientes con disfibrinogenemias no se diagnostican. Como todas las pruebas, el TT tiene falsos negativos. La otra utilidad prctica del TT es en la deteccin de heparina en los pacientes que tienen hemorragia luego de ciruga cardiaca de corto circuito. Con el TT es posible identificar dosis muy bajas de heparina que normalmente no podran modificar el TP o el TTPa. Si el paciente tiene un discreto incremento en el TT pero el TTPa y el TP son normales, se puede concluir que la heparina circulante es mnima y por lo tanto, es poco probable que sea la causa de la hemorragia. Si el TT est prolongado se puede practicar un tiempo de reptilasa o un tiempo de Ancrod. Para ambas pruebas se utilizan venenos de serpiente que tienen la capacidad de coagular el fibringeno al escindir de su molcula sus fibrinopptidos A mientras que el fibrinopptido B se mantiene unido. Las pruebas son tiles para diferenciar la

14/18 causa del alargamiento del TT, ya que el tiempo de reptilasa es normal en presencia de heparina pero est prolongado en presencia de productos de degradacin del fibringeno. Prueba del Factor XIII (estabilizador de la fibrina). Todas las pruebas antes mencionadas no son sensibles a la deficiencia de FXIII. Este Factor es activado por la trombina y se convierte en una enzima capaz de formar enlaces covalentes entre las molculas de fibrina. Esta reaccin estabiliza la malla de fibrina y si este es sumergido en una solucin 5 M de urea o 1% de cido monocloroactico, no desaparece el cogulo, por lo que se le conoce como prueba de solubilidad del cogulo. Por lo tanto, la solubilidad del cogulo en estos recativos es utilizada para evaluar la actividad del FXIII, aunque el mtodo es ciertamente poco sensible ya que slo detecta las deficiencias graves (< 2U/dL). Sin embargo, se sabe que una concentracin de FXIII tan baja como 2 U/dL es suficiente para una hemostasia adecuada. DIAGNSTICO DIFERENCIAL. Como las pruebas de escrutinio ms populares son el TP y el TTPa haremos referencia fundamentalmente a estas pruebas. Si nicamente el TP est prolongado debe sospecharse de una deficiencia de Factor VII, esta es la nica condicin en la que este patrn se aprecia es en la deficiencia de FVII tanto hereditaria (muy rara), como adquirida (deficiencia de vitamina K, tratamiento con anticoagulantes orales, etc.). El Factor VII es la protena de origen heptico que tiene la vida media ms corta (4-6 horas) lo que hace esta prueba, la prueba de eleccin para monitorear la falla heptica es por ello que se recomienda que al menos esta determinacin se incluya en el panel denominado: Pruebas de Funcin Heptica. Si nicamente el TTPa est prolongado debe sospecharse de una deficiencia de Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, o bien una deficiencia en la fase de contacto. En mi experiencia personal este es el patrn que presentan los pacientes que tienen anticoagulante lpico, aunque he ledo referencias en donde tambin se altera el TP. Si ambas pruebas estn prolongadas se dice que la deficiencia puede estar en la va comn por lo que se recomienda cuantificar: Fibringeno, Factor X, Factor V y Factor II. con TT normal o anormal. Estos pacientes o tienen una deficiencia funcional hereditaria (fibringeno, FII, FV o FX), o tienen una deficiencia funcional adquirida como deficiencia de vitamina K, coagulacin intravascular diseminada, presencia de anticoagulantes circulantes o insuficiencia heptica. En la deficiencia de los factores vitamina K dependientes (por anticoagulantes orales, terapia antibitica, ictericia obstructiva o malabsorcin), los factores II, IX, VII y X se encuentran reducidos mientras que el FV est normal. En muchos pacientes con enfermedad heptica el fibringeno es anormal lo que lleva a un alargamiento pronunciado del TT mientras que el FVIII puede estar elevado. Si se realiza el TT puede sospecharse directamente de una alteracin en el fibringeno. Hasta hace unos aos sola decirse que las deficiencias de factores solan ser nicas, ahora se sabe de la existencia de deficiencias mixtas de factores, por lo que es recomendable cuantificar los factores de toda la va que presenta alteracin para detectar las deficiencias combinadas. Alteracin CAPM deficiente PK deficiente FXII deficiente FXI deficiente FIX deficiente FVIII deficiente Factor de von Willebrand deficiente FVII deficiente FV deficiente FX deficiente FII deficiente Fibringeno deficiente FXIII deficiente Anticoagulante lpico TTPa prolongado + + + + + + + + + + + + TP prolongado + + + + + (+) Patrn No relacionado No relacionado Trombosis 33% hemorragia, 33% sin alteracin, 33% trombosis Hemorragia Hemofilia B Hemorragia Hemofilia A Hemorragia Enfermedad de von Willebrand Hemorragia Hemorragia Hemorragia Hemorragia Hemorragia (pocos con trombosis) Hemorragia tarda Trombosis

CUADRO 2. RESULTADOS DE LABORATORIO

15/18 Los pacientes con las alteraciones de la fase de contacto tienen actividad anormal de los factores en los primeros estadios de la fase fluida. Este gran grupo de alteraciones puede subdividirse en dos grupos en base a los hallazgos clnicos. Las deficiencias de CAPM, PK y FXII no se asocian a hemorragia, mientras que la deficiencia de los otros tres, s. Ya se mencion que debe sospecharse una alteracin del sistema de contacto cuando un TTP muy alargado no se acorta considerablemente cuando se practica el TTPa. La deficiencia de los otros factores es clnicamente importante. Los pacientes con hemofilia A o B tienen un tipo de herencia ligada al cromosoma X, en contraste con los pacientes con deficiencia de FXI. Los pacientes con deficiencia de FVII o FX tienen prolongado el TP el cual corrige a la adicin de plasma envejecido. La prueba del tiempo del veneno de vbora de Rusell ayuda a diferenciar entres estas dos deficiencias. Este veneno puede activar al FX en ausencia de FVII. Por lo tanto la prueba se prolonga en la deficiencia de FX pero es normal en la deficiencia de FVII. Esta prueba tambin requiere FV y factor plaquetario 3 por lo que se prolonga tambin en los estados con deficiencia de FV. Asimismo, la prueba se utiliza para analizar al factor plaquetario 3. Los pacientes con alteraciones en las pruebas de coagulacin con el TT prolongado, pero con TP y TTPa normal o prolongado pueden tener hipofibrinogenemia, disfibrinogenemia o la presencia de productos de degradacin del fibringeno o de heparina. Cuando existe una deficiencia completa de fibringeno ninguna de las pruebas descritas tiene fin. En los estados de hipofibrinogenemia moderada el TT tiende a estar ms prolongado que el TP y el TTPa. La hipofibrinogenemia puede ser hereditaria pero ms frecuentemente se debe a CID descompensada o a insuficiencia heptica. En la disfibrinogenemia el TT puede estar prolongado y puede haber muy poco efecto sobre el TTPa o el TP. La causa ms frecuente de disfibrinogenemia es la insuficiencia heptica. PRUEBAS ESPECIALES: HEMOFILIA. Adems de las pruebas de escrutinio deben realizarse las correcciones y diluciones. Independientemente del resultado debe realizarse la dosificacin de Factores. Cuando es necesario y se deba a otra fase que no sea la fase fluda de la coagulacin se recomienda hacer Agregometra plaquetaria, determinacin de Factor de von Willebrand y en la actualidad tambin suele hacerse citometra de flujo. TROMBOFILIA. En el caso especfico del anticoagulante lpico, en donde las pruebas de escrutinio pudiesen estar prolongadas, este efecto de las pruebas in vitro es sumamente diferente a lo que sucede in vivo, en donde el paciente suele manifestar trombosis. Las pruebas de correcciones, no acortan los tiempos de coagulacin y a menudo en las diluciones con solucin salina los tiempos se acortan por dilucin del inhibidor. Se recomienda realizar la determinacin de anticoagulante lpico para lo cual existen los ensayos de escrutinio y los ensayos confirmatorios, as como el estudio de lpidos hexagonales, otras pruebas relacionadas son: anticuerpos antifosfolpidos, anticuerpos anti cardiolipina, anticuerpos 2 glicoprotena 1, que suelen realizarse en los laboratorios de inmunologa. Para poblacin mexicana recomiendo especialmente para mujeres empesar por el anticoagulante lpico, cuando esta causa ha sido descartada se debe realizar el panel de trombofilia que se compone de: Homocistena basal y post carga oral de metionina. Dosificiacin de factores de coagulacin (especialmente Factor VIII y Factor XII) Protena C Protena S Antitrombina Plasmingeno Resistencia a la protena C activada dependiente de Factor VIII Resistencia a la protena C activada dependiente de Factor V Mutacin Leyden Protena Z (mutacin Leyden) Activador tisular del plasmingeno Inhibidor del activador tisular del plasmingeno Alteraciones en la protrombina (protrombina 20210)

Alteraciones en la tetrahidrofolato reductasa COAGULACIN INTRAVASCULAR DISEMINADA. Esta es una condicin que en cualquier parte del mundo genera discusiones. Hay desde los equipos multidisciplinarios de salud que dicen que con el TP, el TTP y el fibringeno es suficiente para manejarla hasta aquellos grupos de trabajo que insisten en la necesidad de otras pruebas, es por ello que se han generado reactivos para realizar otras pruebas: Pruebas tiles para detectar la formacin del cogulo: fibrinopptidos, fragmento 1+2 de la protrombina, complejo trombina:antitrombina, factor 4 plaquetario

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