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En la espectroscopia de fotoluminiscencia lo que se cuantifica es la emisin de fotones despus de la absorcin.

Las formas ms importantes de fotoluminiscencia con fines analticos corresponden a la espectroscopia de fluorescencia y de fosforescencia.

Mtodos de fotoluminiscencia (fluorescencia y fosforescencia). La fluorescencia y fosforescencia resultan de la absorcin de radiacin electromagntica seguida de disipacin de energa por emisin de radiacin. La absorcin puede causar la excitacin del analito a los estados energticos 1 o 2. Una vez excitado, el exceso de energa puede perderse por emisin de un fotn (luminiscencia, lnea continua) o por procesos no radiantes (lneas discontinuas). La emisin ocurre en todas direcciones, y las longitudes de onda emitidas corresponden a las diferencias de energa entre los niveles de energa. La distincin principal entre la fluorescencia y la fosforescencia es la escala de tiempo de emisin, ya que la fluorescencia se emite ms rpido que la fosforescencia. La fluorescencia y fosforescencia son procesos de emisin con importancia analtica, en los que se excitan tomos o molculas por la absorcin de un haz de radiacin electromagntica. Posteriormente, la excitacin se relaja hasta el estado fundamental, con lo que libera su exceso de energa en forma de fotones. La fluorescencia ocurre mucho ms rpidamente que la fosforescencia y, en general se completa en casi 10-5s despus del momento de excitacin. La emisin fosforescente puede continuar minutos o inclusive horas despus de que cese la radiacin. Fluorescencia atmica Los tomos gaseosos pueden emitir fluorescencia cuando estn expuestos a la radiacin por una longitud de onda que es exactamente igual a la de una de las lneas de absorcin (o emisin) del elemento qumico en cuestin. Cuando la longitud de onda de excitacin y emisin es la misma, la emisin resultante se llama fluorescencia de resonancia. Fluorescencia molecular La vida de una especie excitada es breve, ya que existen diversos mecanismos por los que el tomo o molculas excitados liberan su exceso de energa y se relajan al estado fundamental. Dos de los ms importantes mecanismos son la relajacin no radiante y la emisin de fluorescencia:

Radiacin no radiante. La desactivacin vibratoria o relajacin se debe a las colisiones entre las molculas excitadas y las de disolvente. En esas colisiones, el exceso de energa vibratoria se transfiere a las molculas del disolvente en una sucesin de pasos. La ganancia de energa vibratoria solamente se refleja en un pequeo aumento de la temperatura del medio. La relajacin vibratoria es un proceso tan eficaz que la vida promedio del estado vibratorio excitado es de apenas 10-15s. Tambin es posible la relajacin no radiante entre el nivel vibratorio mnimo de un estado electrnico excitado y el nivel vibratorio superior de otro estado electrnico. Este tipo de relajacin, llamado conversin interna es mucho menos eficaz que la relajacin vibratoria, de modo que la vida promedio de un estado electrnico excitado es de 10-9 a 10-6s. Aun se est estudiando este mtodo pero el efecto neto es de nuevo un aumento de temperatura del medio. Fluorescencia. El nmero relativo de molculas que emiten fluorescencia es pequeo, ya que la fluorescencia requiere caractersticas estructurales que desaceleran los procesos de relajacin no radiante e intensifican la tasa de relajacin fluorescente. Muchas molculas carecen de estas caractersticas y experimentan relajacin no radiactiva a una velocidad que es significativamente mayor que la velocidad de relajacin radiactiva por lo que no ocurre fluorescencia. Casi siempre implica una transicin desde el estado electrnico excitado ms bajo E1 hasta el estado fundamental, E0. La fluorescencia tambin puede ocurrir nicamente desde el nivel vibracional mnimo E1 hasta los distintos niveles vibracionales de E0. Esto se debe a que la conversin interna y la relajacin vibracional son procesos ms rpidos que la fluorescencia. Las bandas de fluorescencia molecular constan principalmente de lneas de longitud de onda mayores que la banda de radiacin absorbida a la que se debe su excitacin. Este cambio de longitud de onda a veces se llama desplazamiento de Stokes. Las bandas de fluorescencia molecular se componen principalmente de lneas de longitud de onda ms larga, frecuencia ms baja y, menor energa si se comparan con la banda de radiacin absorbida que origina su excitacin. Esta desviacin o desplazamiento a longitudes de onda mayores se denomina desplazamiento de Stokes.

La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los tomos y molculas se excitan con la absorcin de la radiacin electromagntica. Despus, la especie excitada se relaja al estado fundamental y emite su exceso de energa como fotones. La caracterstica ms atractiva de la fluorescencia molecular es su sensibilidad inherente, de uno a tres rdenes de magnitud mayor que con la espectroscopia de absorcin. Otra ventaja es su amplio intervalo de concentracin lineal mayor que en la espectroscopia de absorcin. Sin embargo los mtodos de fluorescencia tienen menos aplicaciones que los de absorcin dado el nmero relativamente limitado de sistemas qumicos que presentan fluorescencia apreciable. Adems se ve sujeta a muchos ms efectos de interferencia ambiental. Teora La fluorescencia molecular se cuantifica al excitar la muestra a la longitud de onda de absorcin, tambin llamada longitud de onda de excitacin, y al medir la emisin a una longitud de onda mayor, denominada longitud de onda de emisin o fluorescencia. La emisin de fluorescencia se mide en ngulo recto al haz incidente, para no medir la radiacin incidente. La emisin que tiene un tiempo de vida ms corto se denomina fluorescencia, mientras que la luminiscencia que permanece por ms tiempo se llama fosforescencia.

Relacin entre espectros Las diferencias de energa entre estados vibracionales son semejantes a las que existen entre el estado fundamental y los estados excitados, de modo que el espectro de absorcin, o espectro de excitacin, y el espectro de fluorescencia parecen imgenes especulares una de la otra. Ambas empalman cerca del origen de transicin (nivel vibracional 0 a E1 con el nivel vibratorio 0 a E0). Son muchas las excepciones a esta regla, particularmente cuando los estados excitados y fundamental tienen geometra molecular distinta o si aparecen diferentes bandas de fluorescencia de distintas partes de la molcula. Especies fluorescentes. Todas las molculas absorbentes tienen potencial para ser fluorescentes; pero muchos compuestos no lo hacen porque su estructura permite otros mecanismos de relajacin sin radiacin que ocurren con mayor rapidez que la emisin de fluorescencia. El rendimiento cuntico de la fluorescencia molecular es simplemente el cociente o fraccin del nmero de molculas con fluorescencia sobre el nmero total de molculas excitadas, o bien la de fotones emitidos sobre fotones absorbidos. Las molculas muy fluorescentes, como la fluorescena poseen una eficiencia cuntica cercana a la unidad, mientras que en las especies no fluorescentes es cero.

F= rendimiento cuntico de fluorescencia kF= constante de primer orden para la relajacin por fluorescencia knr= constante de relajacin no radiante Fluorescencia y estructura Los compuestos con anillos aromticos tienen la emisin de fluorescencia molculas ms intensa y til. Tambin tienen fluorescencia ciertos compuestos de carbonilo alifticos y alicclicos, as como estructuras de doble enlace muy conjugados. Muchos hidrocarburos aromticos no sustituidos tienen fluorescencia en solucin, con eficiencia cuntica creciente a medida que aumenta el nmero de anillos y su grado de condensacin. Los heterocclicos ms sencillos como la piridina, furano, tiofeno y pirrol no presentan fluorescencia molecular; pero las estructuras de anillos fusionados que contienen estos anillos frecuentemente si la poseen. La sustitucin en un anillo aromtico produce desviacin en la longitud de onda de los mximos de absorcin y los cambios respectivos en los picos de fluorescencia. Adems afecta a la eficacia de fluorescencia. Efecto de la rigidez estructural La fluorescencia resulta favorecida en particular por la rigidez molecular. La rigidez disminuye la relacin de relajacin no radiante hasta el punto en el que la relajacin por fluorescencia cuenta con tiempo suficiente para ocurrir. La emisin frecuentemente ocurre cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie solida pro esta misma razn. La influencia de la rigidez tambin explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando forman complejos con iones metlicos. Efecto de la temperatura y de los disolventes

En la mayor parte de las molculas, la eficiencia cuntica de fluorescencia disminuye al aumentar la temperatura, debido a que la mayor frecuencia de colisiones aumenta las probabilidades de relajacin por colisin. La disminucin en la viscosidad de los disolventes produce el mismo efecto. Efecto de la concentracin en la intensidad de la fluorescencia. La energa de la radiacin de la fluorescencia F es proporcional a la energa radiante del haz de excitacin que absorbe el sistema: ( ) Donde P0 es la energa del haz incidente en la solucin y P es la energa de la radiacin despus de realizar un trayecto b del medio. La constante K depende la existencia cuntica de la fluorescencia. A fin de relacionar F con la concentracin c de especie fluorescente se debe escribir: ( ) Cuando bc=A<0.05, es posible escribir: Cuando la energa de radiacin incidente es constante: As pues, la grafica de la energa radiante fluorescente de una solucin en funcin de la concentracin de la especie fluorescente debe ser lineal si las concentraciones son bajas, cuando c aumenta lo suficiente para que absorbancia sea mayor que 0.05 (o la transmitancia sea menor que 0.9), la relacin pierde la linealidad y F se ubica bajo la extrapolacin de la grafica lineal. Este efecto es consecuencia de la absorcin primaria, en la que el haz incidente se absorbe con tanta fuerza que la fluorescencia ya no es proporcional a la concentracin. A concentraciones muy altas F alcanza un mximo e incluso podra empezar a disminuir con el aumento de la concentracin debido a la absorcin secundaria. Este fenmeno se debe a la absorcin de la radiacin emitida por otras molculas. Los efectos de absorcin primaria y secundaria, en ocasiones denominados efectos de filtro interno, tambin son posibles debido a la absorcin por molculas de la matriz de la muestra.

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