PRACTICA 8 LAS ENZIMAS DEMOSTRACIN DE LA PRESENCIA DE PEROXIDASA EN TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES. ACTUACIN DE LA -AMILASA.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LAS ENZIMAS

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas siempre que sean termodinmicamente posibles. Una enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas, necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reaccin que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada. Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio qumico. Sin embargo, las enzimas difieren de otros catalizadores por ser ms especficas. Las enzimas catalizan alrededor de 4.000 reacciones bioqumicas distintas. La estructura tridimensional de una protena en condiciones fisiolgicas se conoce como estructura nativa, y se considera la estructura ms estable de todas las estructuras posibles. Adems la estructura nativa es la funcionalmente activa. Si cambiamos las condiciones ambientales, la estructura nativa se pierde, este proceso se denomina

desnaturalizacin.

Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija. Estado nativo Estado desnaturalizado

En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada. La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: 1. cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin 2. una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie 3. prdida de las propiedades biolgicas Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la informacin necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuracin. El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas las protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita. La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso sea irreversible.

Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:

la polaridad del disolvente la fuerza inica el pH la temperatura

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.

DEMOSTRACIN DE LA EXISTENCIA DE PEROXIDASA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES. EFECTO DE LA TEMPERATURA La funcin normal de la peroxidasa es convertir el agua oxigenada o peroxido de hidrgeno (H202), producido en ciertas reacciones metablicas en agua (H2O) y oxgeno molecular (O2): 2H2O2------------- 2 H2O + O2 Prcticamente todas las peroxidasas son hemoprotenas y tienen como sustrato comn el H2O2 o perxido de hidrgeno. La peroxidasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en H2O y O2. Material Agua oxigenada Hgado, corazn, patata, pltano Tubos de ensayo. Bao Mara Placa de Petri Tijeras, pinzas, escalpelo Procedimiento Tomamos dos muestras idnticas de cada tejido. Poner separadamente, en una placa de Petri la mitad de cada uno de los trozos de los diferentes tejidos. Poner el otro trozo de los tejidos en un tubo de ensayo (un tubo para cada tejido) y aadir agua, hervir al bao Mara durante 10-15 minutos. Retirar el agua. Sacar con las pinzas cada uno de los trozos hervidos y enfrentarlos con los correspondientes trozos frescos aadiendo unas gotas de agua oxigenada a cada uno de ellos. ANOTAR LOS RESULTADOS Y RAZONAR LA RESPUESTA

ACTUACIN DE LA -AMILASA. EFECTO DE LA TEMPERATURA Material Extracto de malta Almidn Tubos de ensayo Lugol

Procedimiento En 2 tubos de ensayo Ay B ponemos: 2ml de almidn + 3 gotas de lugol y los dejamos en la gradilla. En otro tubo de ensayo aadimos extracto de malta y lo llevamos al bao Maria, mantener la ebullicin durante 10-15 minutos. Pasado el tiempo indicado se retira el tubo del bao y se lleva a la gradilla. Al tubo A se aaden 2ml de extracto de malta fresco. Al tubo B le aadimos 2 ml de extracto de malta hervido. ANOTAR LOS RESULTADOS Y RAZONAR LA RESPUESTA