CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE DENSIDAD DE SACAROSA

( Objetivo: obtencin de cloroplastos)

TEORA 1. INTRODUCCIN La fotosntesis es el proceso por el cual las plantas convierten la energa luminosa en energa qumica. La siguiente ecuacin:

6 CO2 + 12 H2O

C6 H12 O6 + 6 O2 + 6 H2O

resume el proceso, pero da pocos detalles sobre su complejidad. Hay realmente 2 grupos de reacciones, las denominadas de la fase luminosa y las de la denominada fase oscura. Los productos de las reacciones de la "fase luminosa" son el oxgeno molecular, los transportadores de electrones reducidos (NADPH) y el ATP. El ATP y los transportadores reducidos se usan en las reacciones de la fase oscura para convertir el dixido de carbono en carbohidratos. La reaccin de Hill es una fase importante de las reacciones de la "fase luminosa" en la que los electrones son transportados del agua a un aceptor de electrones en presencia de luz y cloroplastos. El objetivo de esta prctica es seguir la velocidad de la reaccin de Hill usando cloroplastos aislados. Estudiaremos adems el efecto de un inhibidor. 1.1. REACCIONES LUMINOSAS DE LA FOTOSINTESIS Todos los componentes que participan en las reacciones de la fase luminosa se localizan en las membranas de los tilacoides de los cloroplastos, mientras que los enzimas de la fase oscura se localizan en el estroma. Figura 1. Esquema de los cloroplastos.

Figura 2. Esquema de la fase luminosa de la fotosntesis. Fotofosforilacin no cclica.

La figura 2 representa el flujo de electrones en las reacciones luminosas, mientras la altura de los distintos compuestos indica los niveles energticos relativos de los electrones en cada punto de la ruta. En el centro de las distintas series de reacciones hay dos fotosistemas denominados Fotosistema II (PS II) y Fotosistema I (PS I). Cada fotosistema es un conjunto formado por clorofilas a y b, carotenoides, citocromos y otros transportadores de electrones. Cada fotosistema tambin contiene una molcula de clorofila a especial que absorbe a un mximo de 680 nm en el PS II y a 700 nm en el PS I nm. Estas molculas especiales de clorofila se denominan P680 y P700 respectivamente. Los electrones excitados en P680 del PS II son transferidos a la plastoquinona y los de la P700 se transfieren a la ferredoxina. Los dos fotosistemas estn unidos por una cadena transportadora de electrones. A medida que los citocromos y otros transportadores de electrones de esta cadena se reducen y oxidan sucesivamente, parte de la energa se acopla a la sntesis de ATP. Los electrones liberados por P700 (en PS I) pasan a travs de otra cadena transportadora de electrones hasta el NADP+. Existe adems una tercera transferencia de electrones, concretamente del agua a la forma oxidada del P680 en el PS II. En un proceso denominado fotolisis, el agua se hidroliza: se descompone en protones, oxgeno y electrones. Estos electrones pasan mediante una corta cadena de transporte de electrones a la P680. El flujo de electrones del agua al NADP+ se denomina ruta no cclica (o esquema Z) puesto que los electrones empiezan en un compuesto (agua) y terminan en otro

(NADP+). La sntesis de ATP a travs de esta ruta se denomina fotofosforilacin nocclica. Los productos de la ruta no cclica de las reacciones luminosas son el oxgeno molecular, transportadores de electrones reducidos (NADPH + H+) y ATP. El ATP tambin se produce cuando los electrones siguen una ruta cclica, como se indica en la figura 3. Esta ruta implica el PS I y transportadores de electrones de la ruta principal de transporte de electrones. La sntesis de ATP a travs de esta va se denomina fotofosforilacin cclica.

Esquema de la fotofosforilacin cclica

Para estudiar estas reacciones se purifican los cloroplastos en un gradiente de densidad:

Al girar los tubos se produce una fuerza que se conoce como fuerza centrfuga relativa RCF que se mide en x g (veces la fuerza de la gravedad). Los rotores de las centrfugas giran y esa velocidad se mide en RPM (revoluciones por minuto). Influye tambin en la fuerza el radio de giro: r. Para medir los g que se producen se utiliza la siguiente frmula:

De esta forma podemos conocer la fuerza que se produce durante el proceso, lgicamente la centrifugacin depende tambin del tiempo.

1.- Homogeneizacin Materiales y reactivos Vaso de precipitados de 250 ml Balanza Gradilla Tampn Tris-NaCl pH= 7,5: Tris (hydroximetil)aminometano 0,02 M, NaCl 0,35 M ajustar el pH a 7,5 con HCl 6 N. Almacenar a 4C. Batidora Embudo Gasa

Procedimiento prctico: Se pesan 25 gramos de hojas de espinacas en el vaso de precipitados, se aaden 100ml del Tampn Tris-HCl y se introduce la mezcla en la batidora. Se homogeneiza durante 3 min. Se filtra en una doble capa de gasa. Se aprieta bien para obtener la mxima cantidad.

2.- Centrifugacin Materiales y reactivos: Centrfuga refrigerada Gradilla Tubos de centrfuga

Procedimiento prctico: 1. -Formacin del gradiente: A un tubo de centrfuga de 50 ml se le aaden las siguientes cantidades de sacarosa: 5ml de sacarosa en agua al 60% (peso/volumen) 5ml de sacarosa en agua al 50% (peso/volumen) 5ml de sacarosa en agua al 40% (peso/volumen) 5ml de sacarosa en agua al 30% (peso/volumen) 5ml de sacarosa en agua al 20% (peso/volumen)

Para que el gradiente salga bien hay que tomar las siguientes precauciones: Las disoluciones deben de estar fras (nevera). Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior, para evitar que se mezclen las disoluciones. Con cada disolucin se utiliza una pipeta Pasteur diferente. Sobre la ltima capa se deposita la muestra biolgica que consiste en un ml de un homogenado de clulas de espinaca, preparado previamente.

CENTRIFUGACIN

Los tubos se equilibran de dos en dos. Se colocan los tubos equilibrados uno en frente del otro en el rotor. El rotor debe de estar previamente enfriado y se coloca en la centrfuga.

CONDICIONES DE CENTRIFUGACIN El rotor que se va a utilizares el A8.24 que estar enfriado a 4C. La temperatura se ajusta a 4C. La velocidad se ajusta a 18.300 rpm. El tiempo se ajusta a 20 minutos. Cuando se para el rotor se sacan los tubos y se extraen la fracciones con pipetas Pasteur. En este caso nos interesa la fraccin verde que son los cloroplastos.

Densidad de los cloroplastos: Calculo de la densidad de los cloroplastos: Se pesan 10 veces 100l de agua destilada, este peso ser la densidad 1,000. Se pesan 10 veces fracciones de 100 l de los cloroplastos y el peso obtenido deber ser dividido por el peso del agua destilada, para obtener la densidad a la que sedimentan los cloroplastos.

Clculos numricos: Calcula la fuerza en g que se producen en la parte superior del tubo de centrfuga (r= 572cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte media del tubo de centrfuga (r= 826cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte inferior del tubo (r= 10,80cm).

Ejercicio: Haz un esquema de la prctica.

Para saber ms:

Fraccionamiento subcelular
Introduccin al fraccionamiento subcelular Tcnicas de rotura de clulas y tejidos Centrifugacin Centrfugas Centrifugacin diferencial Velocidad de sedimentacin Equilibro de sedimentacin : centrifugacin en gradiente de densidad Algunos recursos de utilidad en centrifugacin Protocolos de aislamiento de organelas de Protocol-Online