Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 18(4): 594-599, Out./Dez.

2008

Received 27 August 2008; Accepted 5 October 2008

Artigo

Mtodo espectroscpico para determinao de cumarina em xarope de Mikania glomerata Sprengel

Cleinils R. da Silva, Vctor S. Gomes, Irene C. Kulkamp, Luiz A. Kanis*
Grupo de Pesquisa em Tecnologia Farmacutica, Curso de Farmcia, Universidade do Sul de Santa Catarina, Av Jos Accio Moreira 787, Caixa Postal 307, 88704-900 Tubaro-SC, Brasil
RESUMO: Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia analtica por espectroscopia UV, para doseamento de cumarina em xaropes de Mikania glomerata. A tcnica foi baseada na extrao da cumarina utilizando solventes como o clorofrmio e hexano. Aps a seleo do solvente, o comprimento de onda foi denido atravs da sobreposio dos espectros da cumarina, metil parabeno, diluio do xarope e soluo extrativa do xarope. Foram preparadas curvas analticas de cinco solues de cumarina com concentrao variando de 0,002 a 0,03 mg/mL. Para anlise da exatido do mtodo, foram preparados trs lotes de xarope de Mikania glomerata Sprengel e o teor de cumarina determinado pela tcnica espectrofotomtrica foi comparado a tcnica por cromatograa lquida de alta ecincia. O solvente selecionado para extrao foi o clorofrmio, o comprimento de onda 320 nm. A curva analtica apresentou R2 de 0,99978, demonstrando linearidade. A comparao estatstica do doseamento da cumarina pela tcnica espectrofotomtrica estudada com a tcnica cromatogrca desenvolvida por Celeghini et al. (2001) demonstrou no existir diferenas signicativas, indicativo de exatido da tcnica. Unitermos: Mikania glomerata, Asteraceae, cumarina, espectrofotmetro, metil parabeno, xarope.

ABSTRACT: Ultraviolet spectroscopy method for coumarin quantication in Mikania glomerata Sprengel syrup. A spectrophotometric procedure for coumarin determination in Mikania glomerata Sprengel (guaco) syrup is described in this work. Due to the high number of constituents in guaco syrups, the coumarin was extracted with apolar extractors (chloroform and hexane), in which chloroform was selected, because of its higher capacity of extraction. After the solvent choice, the wavelength at 320 nm, region where there is the lower interference of syrup constituents, was selected. The calibration curve showed linearity, R2 of 0.99978. The spectrophotometric assay of coumarin in three samples of Mikania glomerata Sprengel syrup showed accuracy compared with the HPLC method. The results presented suggest that the spectrophotometric method may be useful for the quantitative analysis of coumarin in Mikania glomerata Sprengel syrup. Keywords: Mikania glomerata, Asteraceae, coumarin, spectrophotometer, methylparaben, syrup.

INTRODUO A Mikania glomerata Sprengel pertence a famlia Asteraceae, popularmente conhecida como guaco, cip-caatinga, guaco-cheiroso e erva-deserpente. uma planta nativa da Amrica Tropical e facilmente encontrada no Brasil sendo muito utilizada na medicina popular na forma de xaropes, para tratamento de afeces pulmonares devido ao seu efeito broncodilatador (Moura et al., 2001; Leite et al., 1993; Silva et al., 2006; Soares et al., 2006; Agra et al., 2008; Carvalho et al., 2008). Alm de possuir outras atividades farmacolgicas comprovadas experimentalmente como antioxidante (Vicentino & Menezes, 2007), antidiarrica (Salgado et al., 2005) e antimicrobiana (Duarte et al., 2004). A importncia dessa planta levou sua incluso na Farmacopia Brasileira I e IV (Brando et al., 2006 594

& 2008). A cumarina (1,2-benzopirona), um dos principais constituintes da Mikania glomerata Sprengel (guaco) (Oliveira et al., 1985; Peregrino & Leito, 2005; Taleb-Contini et al., 2006). denida como o marcador qumico para controle de qualidade de formulaes a base de guaco, conforme a Lista de registros simplicado de toterpicos da ANVISA, Resoluo RE n 89, de 16 de maro de 2004 (Anvisa, 2004). As principais tcnicas para doseamento de cumarinas em Mikania glomerata e seus derivados so por cromatograa lquida de alta ecincia (CLAE) e por cromatograa gasosa (Vilegas et al., 1997; Aboy et al., 2000; Celeghini et al., 2001,). Entretanto, as cumarinas apresentam espectro ultravioleta caracterstico, devido natureza e posio dos substituintes qumicos, favorecendo sua identicao e o desenvolvimento
ISSN 0102-695X

* E-mail: luiz.kanis@unisul.br, Tel. +55-48-36213283, Fax +55-48-36213105

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de tcnicas analticas espectrofotomtricas para o seu doseamento (Bruneton, 1991). A forma farmacutica mais utilizada para administrao de extratos de Mikania glomerata Sprengel o xarope contendo em sua composio constituintes como metil parabeno, sacarose, gua, entre outros. Alm da complexidade de constituintes encontrados no prprio extrato de Mikania glomerata Sprengel que podem interferir em um doseamento espectrofotomtrico, pode-se destacar como potencial interferente o metil parabeno, que possui absoro mxima no comprimento de onda de 250 nm, prximo ao pico de absoro da cumarina, 275 nm (Lozhkin & Sakanyan, 2006), alm de apresentar-se nos xaropes em concentrao em torno de 1 mg/mL (0,1%), valor muito superior a concentrao do marcador qumico cumarina. O presente trabalho tem como objetivo desenvolver uma tcnica por espectroscopia na regio do ultravioleta para doseamento de cumarina em xaropes de Mikania glomerata Sprengel. MATERIAL E MTODOS As matrias-primas utilizadas foram, padro secundrio de 1,2-benzopirona (cumarina), de procedncia Chromadex S.A. (USA) com um grau de pureza de 99,9%, metil parabeno de grau farmacutico (Galena Qumica Farmacutica Ltda), clorofrmio (F. MAIA Indstria e Comrcio Ltda), etanol 96 GL (Quimex Ltda), hexano (Vetec Qumica Fina LTDA), acetonitrila grau CLAE (Vetec Qumica Fina LTDA), e xarope de guaco contendo em sua formulao: acar (60%), 0,1% de metil parabeno, 10% tintura de Mikania glomerata Sprengel (Phitolabor Laboratrio de Produtos Naturais Ltda) contendo 0,8 mg/mL de cumarina, gua qsp. Os equipamentos utilizados para realizao das anlises foram, balana analtica (QUIMIS Q-500 L210C), espectrofotmetro de UV/visvel Hitachi modelo U2010 e CLAE composto por bomba Shimadzu - LC 10AD; sistema de dados LC - Work Station Class LC -10; detector UV Shimadzu - SPD 10A e forno CTO10AS. Seleo do solvente para extrao da cumarina Devido complexidade da matriz optou-se por realizar a extrao da cumarina da amostra. Para tanto, foi utilizado o mtodo de Shake-ask para determinar o coeciente de partio da mesma em dois solventes extratores, clorofrmio e hexano (Martin et al., 1993). Foi preparada uma soluo teste de 0,05 mg/ mL de cumarina em gua, pr-solubilizada em etanol. Alquota de 10 mL da mesma foi adicionada em um funil de separao juntamente com 10 mL de clorofrmio, manteve-se em leve agitao por 12 horas, separou-se a fase aquosa da fase clorofrmica. A concentrao de cumarina na fase aquosa aps partio, foi determinada por cromatograa lquida de alta ecincia (CLAE)

utilizando fase mvel acetonitrila:gua (40:60 v/v), uxo 1,0 mL/min, temperatura de 30 C, deteco em 274 nm, coluna Supelcosil LC18, 25 cm x 4,6 mm, 5 m, volume injetado de 20 L (Celeghini et al., 2001). O coeciente de partio foi determinado dividindo a concentrao de cumarina na fase clorofrmica pela concentrao na fase aquosa. Este mesmo procedimento foi realizado com o solvente extrator hexano, sendo que todas as amostras foram analisadas em triplicata. O solvente selecionado foi aquele que apresentou maior coeciente de partio. Seleo do comprimento de onda Foram obtidos espectros na regio entre 400 e 210 das seguintes solues: A) cumarina 0,008 mg/mL; B) metil parabeno 0,006 mg/mL, ambos preparados utilizando o solvente selecionado para extrao; C) diluio do xarope de guaco em meio aquoso com concentrao nal de cumarina 0,008 mg/mL; D) diluio obtida do seguinte procedimento extrativo: 10 mL do xarope de Mikania glomerata Sprengel contendo 0,08 mg/mL de cumarina (determinado por CLAE; Celeghini et al., 2001), foi adicionado a um funil de separao e em seguida foram extradas trs fraes de 10 mL utilizando o solvente selecionado. Cada frao foi mantida em contato com o xarope por dez minutos. As trs fraes foram acondicionadas em balo volumtrico de 100 mL e completou-se o volume com o solvente selecionado. O comprimento de onda selecionado para o estudo foi aquele onde se observou sobreposio dos espectros da soluo de cumarina 0,008 mg/mL e da soluo obtida da diluio das fraes extradas do xarope de Mikania glomerata Sprengel. Curva analtica de cumarina Foram pesados 50 mg de padro de cumarina e transferidos para um balo volumtrico de 100 mL, completando o volume com o solvente selecionado. A partir desta soluo, foram preparadas amostras com concentraes de 0,002, 0,005, 0,008, 0,02 e 0,03 mg/ mL. As absorbncias foram determinadas em triplicata no comprimento de onda selecionado. Foram traadas curvas analticas de concentrao versus absorbncia para avaliar a linearidade das mesmas. Seletividade do processo de doseamento de cumarina na presena de metil parabeno Foram preparadas solues contendo, 0,08 mg/ mL de cumarina mais 1 mg/mL de metil parabeno, e outra soluo contendo 0,08 mg/mL de cumarina mais 1,5 mg/mL de metil parabeno. O teor de cumarina nas trs solues foi determinado utilizando o processo extrativo descrito no item Seleo do comprimento de onda com o solvente e comprimento de onda
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previamente selecionado, utilizando espectrofotmetro Hitachi U2010. Comparao entre as tcnicas CLAE e UV na quanticao de cumarina no xarope de Mikania glomerata Amostra de 10 mL do xarope de Mikania glomerata Sprengel contendo 0,08 mg/mL de cumarina (determinado por CLAE conforme mtodo descrito por Celeghini et al., 2001) foi adicionado a um funil de separao e em seguida foram extradas trs fraes de 10 mL utilizando o solvente selecionado. Cada frao foi mantida em contato com o xarope por dez minutos. As trs fraes foram acondicionadas em balo volumtrico de 50 mL e completou-se o volume com o solvente selecionado. Em seguida foram determinadas as absorvncias no espectrofotmetro Hitachi U2010, e atravs das curvas analticas foi estimado as concentraes de cumarina nos xaropes. Para avaliar a preciso do procedimento as amostras foram analisadas em triplicata em trs lotes de xarope. A mdia dos teores de cumarina determinados pelos mtodos espectrofotomtrico e por CLAE foram comparados por teste t de Student e as precises entre os mtodos pelo teste F, utilizando software Origin 7.0. RESULTADOS E DISCUSSO Seleo do solvente Os xaropes de Mikania glomerata Sprengel, alm de cumarina possuem outros constituintes que podem interferir na anlise espectroscpica, e por este motivo optou-se trabalhar com um processo extrativo da cumarina utilizando solventes como clorofrmio e hexano, visto que o logaritmo do coeciente de partio octanol/gua (log P) da cumarina igual a 1,39 (Yourick & Bronaugh, 1997). O coeciente de partio determinado para cumarina em hexano e clorofrmio est apresentado na Tabela 1. O clorofrmio apresentou capacidade de extrao 36,4 vezes maior que o hexano. Por este motivo, optou-se por utiliz-lo para desenvolvimento da tcnica. Seleo do comprimento de onda Para determinar o comprimento de onda de menor interferncia do metil parabeno e dos outros constituintes do xarope sobre a cumarina, foram sobrepostos os espectros de solues clorofrmicas de cumarina, metil parabeno, diluio do xarope de Mikania glomerata Sprengel antes do processo extrativo e diluio da fase clorofrmica extrada a partir do xarope, Figura 1. 596
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O pico mximo de absoro da soluo contendo apenas metil parabeno encontra-se em 250 nm (B), sendo que o espectro da soluo com 0,008 mg/mL de cumarina (A) apresentou dois picos de absoro, um em 275 nm e outro em aproximadamente 317 nm. O espectro da diluio do xarope de Mikania glomerata Sprengel (C) contendo concentrao idntica de cumarina 0,008 mg/mL (determinada por CLAE cromatograma na Figura 2) soluo do espectro (A), demonstrou elevada interferncia dos constituintes do xarope, impossibilitando uma anlise direta entre 400 a 240 nm. Entretanto, o espectro (D) referente as diluies das fraes clorofrmicas extrada a partir

Figura 1. Sobreposio dos espectros obtidos entre 400 e 240 nm de: (A) cumarina 0,008 mg/mL; (B) metil parabeno 0,006 mg/mL; (C) diluio do xarope de guaco em meio aquoso com concentrao nal de cumarina 0,008 mg/mL; D) diluio das fraes clorofrmicas extradas do xarope de Mikania glomerata Sprengel.

5000000

NIPAGIN

4000000

3000000

mA

2000000

1000000

CUMARINA

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (min.)
Figura 2. Cromatograma da diluio do xarope de Mikania glomerata Sprengel com concentrao de cumarina 0,008 mg/ mL.

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do xarope de Mikania glomerata Sprengel apresentou sobreposio ao espectro da cumarina (A) entre 350 e 300 nm, demonstrando que o processo extrativo foi eciente para reduzir nveis aceitveis a concentrao dos interferentes para o desenvolvimento da tcnica. Baseado nestes resultados, o comprimento de onda selecionado foi de 320 nm. Curva analtica e linearidade Na tabela 2 esto apresentados os valores de coeciente de correlao, da interseco da reta (a) e os valores da inclinao da reta (b) de duas curvas analticas

obtidas em 320 nm para cumarina em clorofrmio. Os coecientes de correlao citados na tabela 2, demonstraram que as curvas analticas apresentaram relao linear entre a concentrao e a absorbncia, sendo que o critrio mnimo aceitvel, segundo RE n 29 de maio de 2003, de 0,99 (Anvisa, 2003). Seletividade do processo de doseamento de cumarina na presena de metil parabeno O metil parabeno utilizado geralmente a 0,1% em xaropes, concentrao 12,5 vezes maior que a de cumarina encontrada no xarope teste (0,08 mg/mL),

Tabela 1. Coecientes de partio da cumarina entre fase aquosa e as fases clorofrmica e hexnica. Solvente Hexano Clorofrmio P: partio Tabela 2. Valores de coeciente de correlao, interseco da reta (a) e inclinao da reta (b) obtidos da regresso linear das curvas analticas obtidas. Anlise 1 2 R 0,99989 0,99988 Mdia DP R2 0,999780 0,99976 a 4,69 . 10
-3 -4

Concentrao na fase orgnica (mg/mL) 0,0275 0,0489

Concentrao na fase aquosa (mg/mL) 0,0225 0,0011

P 1,2222 44,4545

b 37,700 38,485 38,092 0,392

5,32 . 10-3 2,900 . 10 0,002

Tabela 3. Seletividade do processo de doseamento de cumarina na presena de metil parabeno. Concentrao terica de Cumarina (mg/mL) 0,0800 0,0800 0,0800 Concentrao de metil parabeno (mg/mL) 0,0 1,0 1,5 Concentrao de cumarina quantificada (mg/mL) DP 0,079 7,100 . 10-4 0,079 4,553 . 10-4 0,078 7,953 .10-4 tc tt

0,302 0,406

9,925 9,925

DP: desvio padro n = 3; p < 0,05; tc : valor de t calculado; tt : valor de t tabelado. Tabela 4. Concentrao de cumarina detectada nos xaropes de Mikania glomerata sprengel por cromatograa lquida de alta ecincia (CLAE) e pela tcnica espectrofotomtrica (UV), e valores de teste t de Student e teste F. Amostra Concentraes CLAE DP (mg/mL) Concentraes UV DP (mg/mL) 0,0728 0,0002 1 0,0730 0,0002 0,0722 0,0001 0,0738 0,0004 0,0726 0,0002 2 0,0740 0,0002 0,0735 0,0001 0,0745 0,0002 0,0766 0,0002 3 0,0760 0,0001 0,0761 0,0001 0,0758 0,0002 DP = desvio padro; t = 4,60 para nvel de signicncia de 0,01, F crtico = 21,20 para nvel de signicncia de 0,01.
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Mdia (CV%) 0,0729 (1,10)

tc

Fc

0,139

16,33

0,0735 (1,30)

0,832

22,58

0,0762 (0,52)

0,693

16,33

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alm de apresentar mximo de absorbncia em 250 nm, fatores que o tornam um potencial interferente da tcnica de doseamento. Na tabela 3, esto representados os valores da concentrao de cumarina determinados atravs das absorbncias em 320 nm de amostras em solues contendo diferentes concentraes de metil parabeno. O resultado do teste t com (p<0,05) da comparao entre os teores de cumarina detectados nas amostras com ausncia e presena de metil parabeno em concentraes 12,5 e 18,75 vezes maiores que as de cumarina nas solues, demonstrou que esta substncia no interfere signicativamente no doseamento. Comparao entre as tcnicas CLAE e UV na quanticao de cumarina no xarope de Mikania glomerata Na tabela 4, esto apresentados os valores das concentraes de trs lotes de xarope de Mikania glomerata Sprengel com teor de cumarina determinado pela tcnica cromatogrca descrita por Celeghini et al., (2001) e os valores das concentraes obtidas pelo doseamento espectrofotomtrico em 320 nm. Atravs do teste t de Student para um nvel de signicncia de 0,01, foi demonstrado no existir diferenas signicativas entre as mdias do teor de cumarina detectado pela tcnica espectrofotomtrica em 320 nm comparada a tcnica por CLAE, indicativo de exatido do mtodo. Os coecientes de variao para as quanticaes de cada amostra analisado apresentaram valores inferiores a 1,30%, demonstrando preciso na anlise espectrofotomtrica. Os valores calculados para o teste F demonstram que para a anlise da amostra 1 e 3 no foram observados diferenas entre as precises dos mtodos, entretanto para amostra 2 ocorreu diferena signicativa. Este comportamento devido a baixa variao das quanticaes realizadas por CLAE, enquanto que para o preparo das amostras para anlise espectrofotomtrica necessrio a extrao da cumarina, fator que pode gerar maior desvio entre os resultados. CONCLUSO Os resultados demonstraram que a metodologia de doseamento da cumarina atravs de extrao com clorofrmio e deteco por espectrofotometria em 320 nm apresenta-se como uma alternativa exata e precisa CLAE para doseamento em xarope de Mikania glomerata Sprengel contendo como conservante metil parabeno. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a FAPESC, UNISUL e PHITOLABOR Laboratrios de Produtos Naturais, pelo suporte nanceiro. 598
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