Revista Cincias & Tecnologia

Obteno de consrcio de microrganismos a partir de amostra de petrleo

COSTA, Andra Fernanda de Santana1; SILVA, Jos Roberto Rocha da1; SANTOS, Roberto Csar Mendes Marques dos1; FARIAS, Charles Barbosa B.2; SARRUBO, Leonie Asfora3, JORDO, Roziana Cunha Cavalcanti3,4; SALGUEIRO, Alexandra Amorim3 Mestrando em Desenvolvimento de Processos Ambientais, Centro de Cincias e Tecnologia (CCT), Universidade Catlica de Pernambuco (UNICAP); 2 Graduando em Engenharia Ambiental, CCT, UNICAP; 3 Professora-Pesquisadora, Ncleo de Pesquisas em Cincias Ambientais (NPCIAMB), CCT, UNICAP; aas@unicap.br; 4 Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade de Pernambuco.
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Resumo A biodegradao e a biorremediao de petrleo e seus efluentes industriais podem ser realizadas por populaes naturais de microrganismos. Os consrcios microbianos podem ser utilizados como inculos em tratamentos biolgicos, visando a reduzir o tempo de degradao de resduos. So constitudos por uma complexa populao de espcies que, em sinergismo, so potencialmente aplicados na biodegradao de poluentes derivados do petrleo. O objetivo deste trabalho foi obter consrcios de microrganismos a partir de amostra de petrleo e investigar o potencial biotecnolgico para aplicao na biodegradao de contaminantes ambientais oriundos da indstria petrolfera. Dois reatores com volume til de 1,5 L foram inoculados com amostra de petrleo e gua na proporo de 1:1, a 30C, 1 vvm e 250 rpm, sendo adicionados nutrientes a um dos reatores. O crescimento microbiano foi avaliado por contagem padro de bactrias e contagens de fungos filamentosos e leveduras. O potencial biotecnolgico dos consrcios foi avaliado por atividades oxidases e produo de biossurfactantes. Nos dois consrcios investigados (enriquecidos ou no), ficou evidenciado, at o nono dia de cultivo, o crescimento exponencial de microrganismos, atingindo 105 UFC.mL-1 para bactrias, 102 UFC.mL-1 para fungos filamentosos e 103 UFC.mL-1 para leveduras. Nas amostras dos consrcios investigados, foram detectadas atividades oxidases na presena de cido tnico e cido glico. Foi observada atividade de emulsificao com a mistura petrleo-gua durante a obteno dos consrcios microbianos. A presena de bactrias e fungos nas amostras de petrleo que, sob condies adequadas, desenvolvem-se com formao de consrcios de microrganismos tem potencial aplicao na biodegradao de poluentes derivados do petrleo. Palavras-chave: petrleo, biodegradao, consrcio de microrganismos. Microbial consortia production from petroleum Abstract Biodegradation and bioremediation of petroleum and its industrial wastes can be reached by microorganisms. Microbial consortia can be used as inocula in biologic treatments to reduce the period of degradation of the residues. They are constituted by a complex population of synergic species with potential of application in the biodegradation of petroleum derivates. The aim of this work was to obtain consortia of microorganisms from a petroleum sample and to investigate the biotechnological potential for application in the biodegradation of environmental pollutants from the petroleum industry. Two reactors with 1.5 L capacity were inoculated with a sample of petroleum and water (1:1 v/v) with and without nutrients at 30 C, 1 vvm and 250 rpm. The microbial growth was determined by cell counts of bacteria, filamentous fungi and yeasts. The biotechnological potential of the consortia was evaluated throughout determination of oxidase activity and biosurfactant production by using emulsification activity analyse. For both consortia investigated (with and without nutrient supplementation) after nine days of cultivation, exponential growths of 105 CFU.mL-1 for bacteria, 102 CFU.mL-1 for filamentous fungi and 103 CFU.mL-1 for yeasts were observed. Oxidase activities were detected for both consortia in the presence of tannic and gallic acids. An emulsification activity was detected. The results show the presence of bacteria and fungi in the petroleum samples that grow under specific conditions thus forming microbial consortia with potential of application in the biodegradation of petroleum pollutant derivates. Key-words: petroleum, biodegradation, microbial consortium.

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Introduo

s problemas da poluio ambiental decorrem do aumento populacional do planeta e do processo de industrializao, gerando resduos que poluem o solo, a atmosfera e a gua. Dentre as atividades de industrializao, a explorao, produo, refino, transporte e comercializao do petrleo apresentam risco ambiental por serem produzidos resduos txicos. A indstria do petrleo responsvel pela gerao de grande quantidade de resduos oleosos e viscosos de significativa recalcitrncia, dificultando o reaproveitamento desses poluentes. Na ltima dcada, bioprocessos para o tratamento desses efluentes tm sido investigados visando a minimizar ou prevenir os impactos causados ao meio ambiente (URURAHY; PEREIRA JR; MARINS, 1998). A complexa mistura do petrleo apresenta, dentre os principais componentes, alcanos, aromticos e naftnicos, que podem ser degradados por microrganismos. Queiroga, Nascimento e Serra (2003) observaram a produo de diferentes tipos de agentes de superfcie ativa, sintetizados por uma larga variedade de microrganismos a partir de petrleo. Muitas bactrias so capazes de emulsificar hidrocarbonetos em solues aquosos, facilitando a biodegradao dessas substncias (KIRCHMANN; EWNETU, 1998). O processo de biodegradao dos componentes do petrleo ocorre na interface leo/gua. Os microrganismos biodegradadores aderem superfcie do leo e exploram esse microambiente, que rico em compostos orgnicos e nutrientes inorgnicos da gua do mar. Aumentam as taxas superfcie/volume das gotas de leo pela reduo do tamanho das gotas, tanto pelo processo de aderncia superfcie quanto pela excreo de surfactantes (BRAKSTAD; FAKSNESS; MELBYE, 2002). A degradao do petrleo depende da natureza qumica e do estado fsico dos compostos existentes, alm das condies ambientais: temperatura, nutrientes, salinidade, presso, oxignio (HAMME; SINGH; WARD, 2003). Em reas contaminadas com petrleo, foi detectada uma grande populao de microrganismos de vrios gneros que, individualmente, metabolizam um limitado nmero de hidrocarbonetos. Na biodegradao de hidrocarbonetos complexos, necessria a cooperao sinrgica entre espcies distintas de microrganismos para a completa mineralizao dos compostos do petrleo em gs carbnico e gua ou gs metano e gua (URURAHY; PEREIRA JR; MARINS, 1998). Os consrcios de microrganismos apresentam atividades enzimticas relacionadas degradao de substncias xenobiticas, usualmente presentes em guas industriais oleosas. Nos processos aerbicos, o oxignio requerido para o processo de biodegradao, envolvendo o catabolismo dos hidrocarbonetos por ao de oxidases (GHAZALI et al., 2004). O processo de biodegradao pode ser acelerado pela utilizao das tcnicas de bioestimulao e de bioaumentao. Na bioestimulao, nutrientes so adicionados e as condies ambientais otimizadas visando ao desenvolvimento de populaes nativas de microrganismos. Pela bioaumentao, so adicionados microrganismos capazes de degradar rapidamente os contaminantes especficos (FENIMAN et al., 2006). O objetivo deste trabalho foi obter consrcios de microrganismos a partir de amostra de petrleo e investigar o potencial biotecnolgico para aplicao na biodegradao de contaminantes ambientais oriundos da indstria petrolfera. Material e mtodos Obteno de consrcios Dois reatores de vidro com circulao de gua e volume til de 1500 mL (figura 1) foram inoculados com amostra de petrleo e gua na proporo de 1:1, com adio dos nutrientes 4 g.L-1 de glicose
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e 1 g.L-1 de sulfato de amnio (consrcio A) ou sem os nutrientes (consrcio B), a 28 - 30 C, 1 vvm e 250 rpm, durante 30 dias. Aps 7 dias de cultivo, pulsos de petrleo foram realizados semanalmente.

Figura 1 Reatores utilizados na obteno de consrcios microbianos

Avaliao do crescimento microbiano O crescimento microbiano foi avaliado por contagens viveis de colnias de acordo com o Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater (APHA, 1992): contagem padro de bactrias heterotrficas mesfilas a 35 C por 48 h; contagem de fungos filamentosos e leveduras a 20 C por 5 a 7 dias. Teste de atividade de emulsificao Foi utilizada a metodologia de Cooper e Goldenberg (1987) na investigao da capacidade de emulsificao das amostras de consrcios microbianos. Atividades oxidases Nas amostras dos consrcios microbianos, foram investigadas as atividades oxidases na presena do cido tnico e do cido glico a 5 % por tcnica de difuso em placas, utilizando extrato de malte 15 g.L-1 e gar 20 g.L-1 nas temperaturas de 30 e 45 C durante 7 dias (FLOTT; GILBERTSON, 1991). Resultados e discusso Amostras de petrleo in natura e gua adicionadas em reatores de vidro na presena ou no de nutrientes foram cultivadas na temperatura ambiente (28 oC) sob agitao e aerao. A obteno dos consrcios microbianos foi confirmada pela avaliao do crescimento dos microrganismos. A tabela 1 ilustra os comportamentos dos consrcios obtidos a partir de petrleo bruto. Os nmeros mximos de bactrias 106 UFC.mL-1 e de fungos filamentosos 104 UFC.mL-1 foram determinados com 16 dias de cultivo pelo consrcio bioestimulado (A). O nmero mximo de leveduras 106 UFC.mL-1 foi determinado com 23 dias de cultivo nesse mesmo consrcio (A) cuja presena dos nutrientes glicose e sulfato de amnio estimularam a reproduo desses fungos unicelulares. O consrcio sem nutrientes (B) apresentou menor produtividade de biomassa. O nmero mximo de bactrias 106 UFC.mL-1 foi atingido apenas com 30 dias de incubao, enquanto foi determinado 103
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UFC.mL-1 de leveduras com 16 dias de incubao. Os crescimentos dos microrganismos nos consrcios esto ilustrados na tabela 1. Os nmeros mximos de bactrias 106 UFC.mL-1 e de fungos filamentosos 104 UFC.mL-1 foram determinados com 16 dias de cultivo pelo consrcio bioestimulado (A). O nmero mximo de leveduras 106 UFC.mL-1 foi determinado com 23 dias de cultivo na presena de nutrientes. O consrcio sem nutrientes (B) apresentou menor produtividade de biomassa, atingindo o nmero mximo de bactrias 106 UFC.mL-1 com 30 dias de incubao.
Tabela 1 Contagens de microrganismos nos consrcios com e sem nutrientes

Legenda: consrcio A = na presena de nutrientes consrcio B = na ausncia de nutrientes

A figura 1 ilustra a curva de crescimento bacteriana para os dois consrcios de microrganismos obtidos a partir de petrleo. No foi observada a lag fase. Na fase logartmica, a taxa de crescimento foi mxima at o quinto dia de incubao. Considerando a adio de pulsos de petrleo durante todo o experimento, no foi observada a fase estacionria mxima at 30 dias de incubao. Comparando os dois tipos de consrcios obtidos neste trabalho, a bioestimulao por glicose e sulfato de amnio acelerou a reproduo celular das bactrias observada na cintica de crescimento do consrcio A. Um outro fator positivo desse consrcio microbiano foi o nmero de leveduras mximo determinado: mil vezes maior do que no consrcio B. Por outro lado, o consrcio B obtido na ausncia dos nutrientes, dependendo apenas de agitao e de aerao apresenta maior praticidade para futuras aplicaes em derramamentos de petrleo no meio ambiente. Considerando que a populao microbiana existente no petrleo atua em sinergismo na natureza, os microrganismos presentes no petrleo bruto metabolizam os compostos presentes, utilizando-os como fonte de carbono e de energia. Conseqentemente, os consrcios microbianos obtidos diretamente do petrleo in natura so constitudos por espcies microbianas que, em sinergismo, so potencialmente aplicados na biodegradao de poluentes derivados do petrleo (GHAZALI et al., 2004). Pineda-Flores et al. (2004) obtiveram um consrcio de bactrias a partir do petrleo, atingindo 105 6 a 10 UFC.mL-1 na fase estacionria, aps 10 semanas de cultivo. Foi avaliada a biodegradao de asfaltenos por microrganismos presentes no petrleo in natura na presena de 100 ppm de sais, temperatura ambiente, pH 7,4 e aerao de 1 L.min-1.

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Figura 2 Curvas de crescimento dos consrcios microbianos

Foram detectadas as atividades oxidases na presena de cido tnico e de cido glico a partir do segundo dia de incubao a 30 C. Halos de colorao caracterstica (marrom) esto ilustrados na figura 3, confirmando a presena de enzimas que oxidaram os dois substratos investigados a 30 C. No foi determinada nenhuma atividade oxidase a 45 oC na presena de cido tnico e de cido glico.

Figura 3 Atividades oxidases de consrcio microbiano

O cido tnico foi oxidado por todas as amostras dos dois consrcios cujos halos se mantiveram constantes at o quarto dia de incubao. Os melhores resultados foram obtidos por oxidao do cido glico por terem os halos de colorao marrom aumentado gradativamente at o stimo dia de incubao. O maior halo determinado foi de 4 cm, utilizando o consrcio obtido sem nutrientes (tabela 2).
Tabela 2 Halos (cm) de oxidao do cido glico pelos consrcios microbianos incubados a 30 oC

Legenda: (-) = teste negativo.

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Embora no tenha sido detectada atividade de emulsificao nas amostras dos consrcios, a mistura gua-petrleo no reator ficou visualmente separada no incio do experimento e, aps 2 dias, foi observada uma nica fase da mistura todas as vezes que a agitao era desligada. Essa observao comprovou a produo de surfactante com propriedade de emulsificar leo e gua pelo consrcio microbiano obtido, apesar de no ter sido detectada atividade de emulsificao de acordo com a metodologia especificada. As bactrias, fungos filamentosos e leveduras so agentes transformadores eficazes, face sua habilidade em degradar ampla gama de substncias orgnicas, utilizando-as como fontes de carbono e energia durante o crescimento. Devido complexidade dos processos metablicos necessrios degradao do petrleo, apenas consrcios de microrganismos com diferentes gneros e espcies conseguem degradar as fraes do leo (TIBURTIUS; PERALTA-ZAMORA; LEAL, 2004). Foram biodegradados por consrcios de bactrias e leveduras 100 % de alcanos de cadeias lineares, 85 % de cicloalcanos, 44 % de alcanos ramificados e 31-55 % de aromticos. Gallego e colaboradores (2007) confirmaram experimentalmente que a biodegradao pelo consrcio de microrganismos obtidos a partir do petrleo ou de solo contaminado com petrleo foi mais eficiente que utilizando os microrganismos isolados. O tratamento biolgico utilizando microrganismos vem sendo apresentado como uma poderosa alternativa biotecnolgica, apresentando-se tcnica e economicamente vivel na recuperao de grandes reas poludas. Geralmente, utiliza-se esse tratamento combinado a outros processos para aumentar a remoo de poluentes (KUNZ et al, 2002). Concluso Os consrcios de microrganismos formados por bactrias, leveduras e fungos filamentosos com atividades oxidases, obtidos a partir de amostra de petrleo sob cultivo submerso e aerado na presena ou no de nutrientes, apresentam potencial para aplicao na biodegradao de poluentes derivados do petrleo. Referncias
APHA - American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18. ed., Washington: APHA, 1992. 1268 p. BRAKSTAD, O. G.; FAKSNESS, L. G.; MELBYE, A. G. Depletion of compounds from thin oil films in seawater. Proceedings of the twenty-fifth Artic and marine oil spill program (AMOP). Calgary-Canad. v. 2, 2002. COOPER, D. G.; GOLDENBERG, B. G. Appl. Environm. Microbiol. v. 53, p. 224-229, 1987. FENIMAN, D. P. G.; et al. Biodegradao Ambiental: Petrleo e Pesticidas. Disponvel em: http: //www.herbario. com.br/bot/toxicologia/biodegre.htm. Acesso em: 14 set 2006. FLOTT, J. J.; GILBERTSON, R. L. Cultural studies of four North American species of Perenniporia (Apphyllophorales: Polyporaceae). Mycol. Res. v. 95, p. 1113-1122, 1991. GALLEGO, J. L. R.; et al. Biodegradation of oil tank bottom sludge using microbial consortion. Biodegradation. v. 18, p. 269-281, 2007. GHAZALI, F. M.; et al. Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium. Internacional Biodeterioration & Biodegradation. v. 54, p. 61-67, 2004.

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Revista Cincias & Tecnologia HAMME, J. D. V.; SINGH, A.;WARD, O. P. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 67, n. 4, p. 503-549, 2003. KUNZ, A.; et al. Novas tendncias no tratamento de efluentes industriais. Qumica Nova. v. 25, n. 1, p. 78-82, 2002. KIRCHMANN, H.; EWNETU, W. Biodegradation de desperdcios petrleo-baseados do leo com composting. Biodegradation. v. 9, p. 151-156, 1998. PINEDA-FLORES, G., et al. A microbial consortium isolated from a crude oil sample thats uses asphaltenes as a carbon and energy source. Biodegradation. v. 15, p. 145-151, 2004. QUEIROGA, C. L.; NASCIMENTO, L. R.; SERRA, G. E. Evaluation of paraffins biodegradation and biosurfactants production by Bacillus subtilis in the presence of crude oil. Brazilian Journal of Microbiology. v. 34, p. 321-324, 2003. TIBURTIUS, E. R. L.; PERALTA-ZAMORA, P.; LEAL, E. S. Contaminao de guas por BTXs e processos utilizados na remediao de stios contaminados. Qumica Nova. v. 27, n. 3, 2004. URURAHY, A. F. P.; PEREIRA JR, N.; MARINS, M. D. M. Desempenho de um biorreator do tipo CSTR no processo de degradao de borra oleosa. Boletim Tcnico da Petrobrs. v. 41, p. 125-132, 1998.

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