Aulas Prticas de Microbiologia

Professora Pricilla Matos

ndice

Introduo: Normas de segurana no Laboratrio de Microbiologia........ 03 Introduo: Esterilizao e Desinfeco .................................................... 04 Aula I: Meios de Cultivo e Tcnicas de Semeadura ,,,,,,,,,,,,,,,,,,................. 06 Aula II: Microscopia de Gram .................................................................... 09 Aula III: Antibiograma .................... ........................................................... 10

INTRODUO
NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas prticas de Microbiologia tm como objetivo ensinar ao acadmico os princpios gerais e mtodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactrias, sendo algumas patognicas para o homem, portanto essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminaes acidentais. 1- O uso do jaleco OBRIGATRIO. 2- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes e equipamentos. 3- Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula prtica. 4- Fazer anti-sepsia das mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que for necessrio. Se for portador de algum ferimento nas mos, procurar no tocar no material. 5- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise. 6- Utilizar exclusivamente material estril para a anlise. 7- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfeco e esterilizao. O mesmo procedimento dever ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 8- No comer, beber ou fumar no laboratrio. 9- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 10- No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 11- Avisar ao professor em caso de contaminao acidental. 12- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada. 13- Flambar as alas, agulhas e pinas de metal antes e aps o uso. 14- Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na estufa ou despejar na pia. 15- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias inflamveis por perto. 16- Trabalhe sempre prximo ao fogo. OBS: A utilizao do Bico de Bunsen essencial pois visa a diminuio de microorganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 1 3

INTRODUO
DESINFECO E ESTERILIZAO

ESTERILIZAO: Processo que visa destruio total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos.

- A melhor maneira de garantirmos a destruio de micro-organismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. - As tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. - Os mtodos de esterilizao mais empregados so os que utilizam o calor, seja este mido (autoclave) ou seco (estufa), sendo que o desempenho do calor mido (autoclave) melhor. I.1- Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilizao realizado a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos micro-organismos. A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, mas como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco o preferido. indicado para esterilizar instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. I.2- Esterilizao pelo Calor mido Vapor dgua O vapor dgua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE. um processo mais eficiente para destruir os microorganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos micro-organismos, e por este motivo mais rpido.

Funcionamento da autoclave: 1- A cmara de parede dupla da autoclave lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor dgua, porque se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave usualmente operada na temperatura de vapor de 121C.

A eficincia do processo de esterilizao depende de alguns fatores: Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. A distribuio do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.

DESINFECO: Consiste na destruio, remoo ou reduo dos micro-organismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local. Este processo pode ser realizado de forma fsica (Pasteurizao) e qumica (Desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfeco de alto, intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.

II.1- Desinfeco por agentes fsicos: Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C) Pasteurizao: o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de micro-organismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos. II.2- Desinfeco por agentes qumicos:

a) Mtodo de Desinfeco de alto nvel: Glutaraldedo 2%, Formaldedo, cido Peractico

b) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio: Compostos Clorados, lcool 70%, Iodforos c) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel: lcool 70%, Compostos Clorados, Iodforos (em concentraes menores)

ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local. ANTI-SEPSSIA: Desinfeco de tecidos vivos, como pele e mucosas. LIMPEZA: Remoo de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao.

Aula Prtica I: Meios de Cultivo e Tcnicas de Semeadura

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Meios de Cultivo Os meios de cultivo, tambm chamados meios de cultura, so complexos que se destinam ao cultivo artificial de micro-organismos. As tcnicas de semeadura permitem que o cultivo destes micro-organismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas: - crescimento bacteriano; - isolamento bacteriano; - estudo da morfologia colonial; - pesquisa de patogenicidade; - pesquisa das caractersticas bioqumicas. Os meios de cultivo devem conter as substncias exigidas pelas bactrias para o seu crescimento e multiplicao. Para que possam fazer a sntese de sua prpria matria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (protenas, acares), fontes de nitrognio (peptonas) e fontes de energia. So tambm necessrios alguns sais inorgnicos, vitaminas e outras substncias favorecedoras do crescimento. Classificao dos meios de cultivo: - Quanto consistncia: Meios lquidos: so aqueles em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvao. Meios semi-slidos: so aqueles que possuem na sua composio, alm dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacardeo chamado gar. So geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura possvel observar a motilidade bacteriana. Meios slidos: so aqueles que possuem uma porcentagem maior de gar (cerca de 15 g/litro de gua destilada), alm dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Atravs do meio slido em placas de Petri possvel, utilizando-se a tcnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colnias bacterianas e, portanto, o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. J a cultura em gar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obteno de uma biomassa de micro-organismos. - Quanto funo: Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de micro-organismos pouco exigentes. Ex: caldo simples. Meios de enriquecimento: so adicionadas ao meio simples substncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: gar sangue. Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos em detrimento de outros, geralmente pela adio de substncias inibidoras. Ex: gar Salmonella-Shigella. Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com caractersticas relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espcie de micro-organismo. Ex: gar MacConkey. 6

Os meios de cultivo so preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade at o momento de sua utilizao.
NA AULA PRTICA IREMOS FAZER UM MEIO SLIDO SIMPLES EM PLACA DE PETRI

Tcnica de Semeadura A escolha da tcnica para o cultivo de micro-organismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porm algumas regras devem ser seguidas nas inoculaes: - A agulha e ala de nquel-cromo (tambm chamada de agulha e ala de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e aps qualquer cultivo. Tome cuidado de esfri-las antes da coleta. - Os recipientes devem sempre ser abertos prximos chama do bico de Bunsen. - Deve-se evitar ao mximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo. Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao mximo perfurar ou rasgar o gar, pois poder ocorrer acmulo de bactrias neste setor do meio alm de alterar as condies de crescimento bacteriano. Tcnica I: Meio Lquido 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo e agite a ala.

Figura 1

Tcnica II: Meio semi-slido 1- Mergulhe a Agulha de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Faa uma injeo com a agulha carregada com bactrias no meio de cultivo semi-slido.

Figura 2

Tcnica III: Meio slido (gar inclinado) 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Encoste levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do gar.

Figura 3

Tcnica IV: Meio slido (Placa de Petri tcnica do esgotamento) FAA NA AULA PRTICA! 1- Divida a Placa de Petri em trs partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa. 2- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada e o swab na narina anterior de um colega. 3- EM DUAS PLACAS DISTINTAS, faa estrias em cada diviso, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possvel toda a superfcie da placa.

PLACA A: Material da cultura bacteriana

PLACA B: Swab nasal do aluno

Figura 4 OBS: Anote o nome do grupo, a data e a identificao da cultura nas placas. As placas sero incubadas a 37C (de forma invertida) da estufa por 24h.

Aula Prtica II: Microscopia de Gram

A parede celular de bactrias Gram-positivas difere-se das bactrias Gram-negativas pela presena de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausncia de uma membrana externa. Esta diferena de constituio da parede celular a base da colorao de Gram, uma tcnica primordial no diagnstico microbiolgico, visto que atravs dela se definem caractersticas morfolgicas e tintoriais da bactria em pesquisa. A colorao de Gram consiste em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta, lugol, lcoolacetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere colorao roxa tanto pelas bactrias Gram-positivas, quanto as Gramnegativas. Com a adio de lcool-acetona, as bactrias Gram-negativas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retm o complexo, permanecendo roxas. A adio de fuccina (ou safranina) no altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactrias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo lcool-acetona. Tcnica: -Esfregao de cultura bacteriana slida: 1- Retire uma gota da soluo salina e deposite sobre a lmina. 2- Flambe a ala, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura slida. 3- Leve a amostra at a gota de salina depositada sobre a lmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino. 1- Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. - Adio de Corantes: 1- Coloque a lmina com o esfregao sobre um suporte. 2- Cubra a lmina com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto. 3- Lave a lmina em jato fraco de gua corrente. 4- Cubra a lmina com lugol, deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lmina. 5- Cubra a lmina com a soluo de lcool-acetona, verifique a descolorao que deve ocorrer em cerca de 20 segundos. 6- Cubra a lmina com fuccina, deixe agir por 1 minuto, e, novamente lave a lmina. 7- Seque inicialmente o lado da lmina oposto ao esfregao com papel toalha, e a seguir seque o restante da lmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse cortando a chama). 8- Leve a lmina ao microscpio e observe em objetiva de imerso. (No esquea de colocar uma gota de leo para imerso sobre o esfregao)

1- Faa um desenho esquemtico do que foi visualizado no microscpio, mostrando a morfologia bacteriana e a reao tintorial.

PLACA A

PLACA B

Aula Prtica III: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)

Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactrias aos antimicrobianos. A proposta primria deste teste guiar o clnico na escolha do agente apropriado para a terapia. Alm disso, estes testes so utilizados para avaliar in vitro a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergncia de bactrias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensvel, intermedirio ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). Mtodo de DISCO DIFUSO: um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar uniformemente semeado com o microorganismo. A droga se difunde no gar e produz inibio do agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta tcnica, alguns fatores so essenciais: Meio de Cultura: normalmente utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas. Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactrias. A densidade do inculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padro de turbidez (Escala de MacFarland). Tcnica: Para cumprir os objetivos desta aula ser utilizado o mtodo de difuso: 1- Fazer a escala 0,5 Mac Farland: Retire 1 colnia pura da placa semeada e coloque em 3 mL de soluo salina a 0,85% SWAB 2- Sature um swab de algodo com a soluo bacteriana (na escala 0,5 Mac Farland) (Fig. 1). Remova o excesso de umidade girando o swab

Figura 1 contra a parede do tubo.

3- Semeie a suspenso sobre a superfcie estril de uma placa contendo gar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente trs direes para obter um inculo uniformemente espalhado sobre toda a superfcie do gar (Fig 2). 10

Figura 2 Distribua os discos de antibitico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfcie do gar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distncia de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco. Figura 3

4- Pressione levemente os discos para que no se desprendam durante a incubao. 5- Incube as placas por 24 horas a 37C. Anlise dos Resultados Atravs da anlise dos resultados poderemos classificar os micro-organismos testados em: resistente, intermedirio e sensvel, dependendo da formao ou no de halo inibitrio e tambm de seu dimetro (Fig 4).

Figura 4 No caso de formao de um halo inibitrio, este deve ter seu dimetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas. 1- Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactria utilizada, a formao ou no do halo de inibio para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificao da bactria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.

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