Purificacin de bacterifagos con gradientes discontinuos de cloruro de cesio

Precipitacin de fagos con Polietilenglicol 8000 (PEG-8000) 1. A 25 ml de lisado fgico con un titulo mnimo de 1x1010 ufp se le agrega DNasa y RNasa a una concentracin final de 1g/ml y se incuba durante 30 min a 37 C para eliminar el DNA y RNA de la bacteria liberado durante su lisis por el fago. 2. Se agrega PEG-8000 y cloruro de sodio a una concentracin final del 16% y 1.37 M respectivamente (4 g. de PEG-8000 y 2 gramos de NaCl). 3. Se disuelven el PEG-8000 y el NaCl para dejar en hielo durante toda la noche en el cuarto fro para dejar que las partculas fgicas precipiten. 4. Centrifugar a 10,509 g durante 30 min, decantar el sobrenadante y re suspender la pastilla obtenida (partculas fgicas) en 1 ml de SM y dividirla en dos tubos eppendorf. 5. Agregar un volumen de cloroformo y agitar en vortex, centrifugar a 8,944 g y tomar la fase acuosa que contiene a los fagos. Pasar a un nuevo tubo y almacenar a 4C. De esta manera concentramos el fago en 1 ml de SM que se utilizara para su purificacin por ultracentrifugacin. En este paso se elimina el PEG-8000 remanente en la pastilla de fagos, al centrifugar queda precipita como una capa blanca que se deposita entre la fase orgnica y la fase acuosa. Purificacin por ultracentrifugacin en gradiente discontinuo de cloruro de cesio 6. Prepara un gradiente discontinuo de cloruro de cesio de la siguiente manera: En un tubo Beckman Ultraclear (No. Cat: 344060) se agregan de abajo hacia arriba: 3.5 ml de una solucin de ClCs con densidad de 1.720, 2.5 ml de una solucin con densidad de 1.513, 2.5 ml de una solucin con densidad de 1.311 y 2.5 ml de una solucin con densidad de 1.0877. Finalmente 2 ml de la muestra del fago a purificar. 7. La muestra de fago a purificar obtenida en el paso 5 (1ml) se le agrega un volumen de la solucin de ClCs con densidad de 1.0877 para obtener as 2 ml totales que se colocan al final del gradiente. 8. Una vez preparado el gradiente se ultracentrfuga a 22,000 rpm durante 2:30 hrs a 4C utilizando el rotor SW40 Ti de beckman y sin freno. 9. Una vez que la centrifuga para se sacan los tubos y se extrae la banda del fago como especifica el Maniatis Vol. 1 pag. 2.75. Yo no utilizo freno para parar la centrifuga cuando termina el tiempo de centrifugacin para evitar que el gradiente se fuera a romper pero pueden probar utilizar freno y acortar tiempo. Si despus de centrifugar no ven una banda blanca en la densidad de 1.5 es porque la cantidad de fago que se obtuvo en la precipitacin del fago con PEG-8000 fue poca. En mi experiencia he visto que loas fagos de la familia Siphoviridae y Podoviridae bandean en la solucin con densidad 1.5 y los de la familia Myoviridae en la solucin con densidad de

1.3. En ocasiones se pueden apreciar bandas en el gradiente, las cuales corresponden de abajo hacia arriba: el fago integro, cabezas del fago con DNA y cpsides fgicas sin DNA. Para preparar las soluciones de ClCs utilizo un refractmetro para medir el ndice de refraccin correspondiente a las densidades deseadas. La siguiente tabla es muy til ya que proporciona los ndices de refraccin y la molaridad de cada solucin con cierta densidad, lo que da pie a preparar las soluciones y confirmar solo con el refractmetro.