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de los flavonoides de
la cerveza. Efecto
antioxidante “in vivo”
Febrero 2005
Dra. Victoria Valls Bellés
Dra. Pilar Codoñer Franch
Dra. Mª Luisa González San-José
Dra. Pilar Muñiz Rodríguez
Tfno: 91 383 30 32
Internet: www.cervezaysalud.com
e-mail: info@cervezaysalud.com
Madrid 2005
Depósito Legal:
Autores:
Este trabajo ha sido realizado por el siguiente grupo de investigación:
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................6
1.1. Composición de la cerveza ...............................................................6
1.2. Estrés oxidativo y defensa antioxidante ...........................................13
3 RESULTADOS ..........................................................................................61
3.1. Ensayos “In Vitro” ........................................................................61
• BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................97
u n o
INTRODUCCIÓN
1.1.1. AGUA
El etanol se produce durante la fermentación del mosto por acción de las le-
vaduras, ejerciendo una gran influencia sobre el aroma y el sabor de la cerve-
za. Su concentración depende del extracto de mosto inicial, oscilando entre 3
y 6 %(v/v), en las cervezas “comunes” (Bulinski et al., 1986).
Durante la fermentación, además de etanol se producen cantidades varia-
bles de alcoholes superiores como el 3-metilbutanol, 2-metilbutanol, 2-metil-
propanol y 2-feniletanol. Los alcoholes superiores se forman por desamina-
6
u n o
1.1.3. CARBOHIDRATOS
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u n o
1.1.5. ÁCIDOS
1.1.6. LÍPIDOS
8
u n o
9
u n o
1.1.9. VITAMINAS
10
u n o
nidos finales de fenoles descritos en la bibliografía varían entre 150 y 350 mg/L
(Narziss et al., 1972), destacando por su abundancia las proantocianidinas (has-
ta 100 mg/L), seguido de las catequinas (hasta 20 mg/L) y de los otros grupos de
flavonoides y de los lignanos y elagitaninos (hasta 10 mg/L).
1.1.11. MELANOIDINAS
11
u n o
nas con un peso molecular superior variable desde 5.000 a 100.000 Da (Hoff-
mann, 1998).
En la mayoría de los países las bebidas como cerveza o vino son una parte in-
tegral de la dieta. La cerveza es una bebida muy popular en España con una in-
gesta de aproximadamente 150.4 mL de cerveza por día/por persona (Pulido et
al., 2003). Los efectos positivos de la cerveza sobre la salud están asociadas a la
presencia de compuestos como antioxidantes, minerales, vitaminas, fibra y bajos
niveles de etanol. En la tabla 1 se presentan la composición nutricional de la cer-
veza publicada por Bamforth et al. (2002) donde se observa el contenido de vi-
taminas B así como de ácido fólico y de selenio. Por otro lado la relativa relación
potasio sodio (4:1) está aconsejada con una dieta baja en sodio. Asimismo, po-
demos observar el contenido de calcio.
12
u n o
Aparte de los valores nutricionales de esta bebida, hay que considerar sus
propiedades funcionales y, de entre ellas, su actividad antioxidante; por tan-
to determinados componentes de la cerveza juegan un importante papel ante
el estrés oxidativo.
Los principales radicales libres son las especies oxigénicas reactivas del oxí-
geno (ROS) y del nitrógeno (RNS). Entre estas especies reactivas cabe destacar
los radicales como el ión superóxido (O .-), radical hidroxilo (.OH), alcoxilo
2
(RO.), peroxilo (ROO.) y óxido de nitrógeno (NO.) y los no radicales como el pe-
róxido de hidrógeno (H O ), oxígeno singlete (1O ) y peroxinitrito (ONOO-).
2 2 2
Junto a los radicales del oxígeno existen otros derivados o centrados en
átomos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, azufre, cloro, etc., que indiscuti-
blemente contribuyen a la propagación y mantenimiento de nuevas reaccio-
nes que conducen a la formación de radicales.
13
u n o
e- e- e- e-
O2 O2.- H2 O2 HO. H2 O
+ - +
2H OH H
O2.-
H2 O2
HO.
H2 O2, HO. O2.-
O2
Cyt c
O2 CoQ
I III IV
NADPH S-OH + H2 O
Citocromo P450 Reductasa P450-S
Fe2+
FAD
1e- P450-S O2.-
NADPH 3+
Fe P450
1e-
P450-S O2
NADP+
Fe2+
FADH2 1e-
P450-S
S
NADPH Fe3+ (esteroides y
Citocromo P 450 Reductasa
ácidos grasos)
14
u n o
O2 Arginina
CTE
NO Sintasa
(Reducción -)e
O2.- NO.
SOD
Catalasa
H2O H2O2
Fe+2 libre
ONOO-
Radiación +
H
.
OH
.
OH + NO2 NO3-
LP
O2
ROO. R RH
15
u n o
ATP
AK= Adenilato kinasa
HX= Hipoxantina
2ADP X= Xantina
AK XDH= Xantina DHasa
XO= Xantina Oxidasa
AMP
HX HX
NAD+ O2
XDH XO
NADH Proteasa O2.-
X X
NAD+ O2
XDH XO
NADH Proteasa O2.-
Ácido úrico
16
u n o
A bajas concentraciones, estos radicales libres son necesarios para el buen fun-
cionamiento celular pudiendo actuar como segundos mensajeros, estimulando la
proliferación celular y/o actuando como mediadores para la activación de las cé-
lulas. Sin embargo, en los procesos como fagocitosis, infección, inflamación, o so-
breexposición a un ambiente estresante pueden acumularse hasta niveles tóxicos,
produciéndose diversas acciones sobre el metabolismo de los principios inmedia-
tos, que pueden ser el origen del daño celular.
Frente a la acción tóxica de los radicales libres los organismos han desarrolla-
do numerosos mecanismos de defensa conocidos como antioxidantes que permi-
ten su eliminación o transformación en moléculas estables (Davies, 1995).
Los sistemas biológicos están en un estado de equilibrio entre prooxidantes y
la capacidad antioxidante de los sistemas biológicos (Sies, 1985). El desequilibrio
a favor de la acción prooxidante es lo que se conoce como estrés oxidativo. De
hecho, el daño oxidativo solamente se produce cuando los mecanismos oxidantes
superan la capacidad de los sistemas de defensa. Por lo tanto, la supervivencia de
las células aeróbicas precisa de mecanismos que contrarresten los efectos negati-
vos de los radicales libres donde los sistemas antioxidantes permitan mantener un
balance favorable entre los productos deletéreos y antioxidantes celulares.
Son muchas las especies oxigénicas que actúan como oxidantes biológicos. La ca-
pacidad de cada radical o especie oxigénica reactiva viene determinada, desde el
punto de vista químico, por cuatro características básicas como son: reactividad,
especificidad, selectividad y difusibilidad. El HO . es el mayor reductor, la simple
2
adición de un protón da lugar a la formación de O2.-, convirtiéndose en un agen-
te oxidante muy activo, selectivo y específico (Figura 5). El O .- no es particular-
2
mente reactivo con lípidos, glúcidos o ácidos nucleicos y exhibe reactividad limi-
17
u n o
tada con determinadas proteínas. Esta evidencia constata que el O2.- reacciona
con proteínas que contienen metales en su grupo prostético. El OH., sin embar-
go, reacciona con cualquier molécula que tenga cerca, sin especificidad alguna y
el peligro radica en la importancia funcional del compartimento celular en el que
se origina o la molécula a la que ataque. Así pues, si ataca al DNA puede produ-
cir o generar graves alteraciones. Por el contrario, si la producción del radical tie-
ne lugar en un entorno como el plasma y la molécula dañada es una enzima que
se encuentra presente en gran cantidad, el daño biológico real será prácticamen-
te imperceptible. Los tres componentes con mayor capacidad de difusión son O .- 2
< H2O2 < OH., capaces de reaccionar con moléculas que se encuentran alejadas
del lugar de origen incluso con capacidad de atravesar membranas celulares.
O2.- + H+ + e- HO2.
18
u n o
3. Sobre los glúcidos, alterando las funciones celulares tales como las asociadas a la
actividad de las interleuquinas y la formación de prostaglandinas, hormonas y neu-
rotransmisores.
19
u n o
de escisión y excreción del DNA oxidado “in vivo”. En la actualidad, son muchas
las bases modificadas que se pueden detectar mediante técnicas de HPLC con de-
tección electroquímica, pero una de las más estudiadas e indicativa de daño oxi-
dativo es la 8-hidroxideoxiguanosina. (Demple and Harrison, 1994).
PROBLEMAS CARDIOVASCULARES
20
u n o
No cabe duda que todos los sistemas biológicos en ambientes oxigenados han de-
sarrollado mecanismos de defensa, tanto a nivel fisiológico como bioquímico. Los
sistemas antioxidantes se encuentran prácticamente en la totalidad de las células
aeróbicas en mayor o menor cantidad; su misión consiste en disminuir la produc-
ción de especies reactivas.
En su definición del termino "antioxidante", Halliwell y Gutteridge (1989) lo
definieron como “cualquier sustancia que presente a bajas concentraciones, cuan-
do se compara con su sustrato oxidable, disminuye significativamente o inhibe la
oxidación”. Un buen antioxidante se caracteriza por su alta efectividad, su varia-
bilidad operativa y versatilidad para poder combinarse con una importante varie-
dad de especies radicales libres. Así pues, entre los sistemas antioxidantes cabe
destacar:
Los organismos aerobios han desarrollado enzimas antioxidantes tales como: su-
peróxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y DT-diafo-
rasa. La SOD es la responsable de la reacción de dismutación del O .- a H O , que
2 2 2
una reacción posterior catalizada por la catalasa o GPx detoxificará formando H2O
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u n o
22
u n o
Sistemas reparadores
(Mg, Zn, Folato, Vit. B12, Dienos conjugados
riboflavina, niacina) Epóxidos
GPx GR
Carbonilos
(Se) (Riboflavina)
Daño a DNA y Proteínas
GSSG NADPH Hexosas Ubiquinol
ROH
Fe, Cu GSH NADP (ácido lipóico)
OH.
O2.- ROO. Vit E Vit C.
O2.-
Activación ROOH Vit E. Vit C
SOD
(Cu/Zn, Mn) NO ONOO- GSSG
H2O2 1 DIETA "Scavengers"
Catalasa O2
(Fe) Vitamina A
GPx Vitamina C
(Se) Carotenoides
Licopeno
H2O Flavonoides
β-caroteno
Isoflavonoides
Activación Melanoidinas
Sistema enzimático carotenoides Etc,
antioxidante
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u n o
Ascorbato
α-tocoferol Radical
dehidroascorbato
ROO.
GSH
GSSG
ROOH
QH2
Radical
tocoferoxilo QH.
Prooxidante
PL
LDL LDL
Ácido ascórbico
QH2
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u n o
H2O + ROH
NADH
antioxidante
DHA H 2O 2 ROOH
NAD
DHA reductasa
NADPH NADP
ASC O2.- ROO.
2GSH
H 2O 2
+
Fe2
GSSG
prooxidante
+
Fe3
Daño celular
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u n o
pO2
ROO. VIT. A
O2 pO2
ROO.
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u n o
cas tras la inducción de un estrés oxidativo producido por ella (González San-José et
al., 2001). Por otra parte, estos compuestos presentes en la dieta pueden favorecer
la defensa de antioxidantes endógena a través de los elementos de respuesta a an-
tioxidantes (ARE) encontrados en los promotores de algunos genes, que son induci-
bles por el estrés oxidativo. Algunos quimiopreventivos cancerígenos se piensa que
actúan a través de los ARE, al incrementar los antioxidantes y la detoxificación.
OH OH
OR4´
OH B OH
OH O OH O R5´ OH O
A C Flavonas
Flavonoles
(quercitina, mirecitina, R6 (luteonina, apigenina)
kaempferol) R3
R3´ R5 R4 OH
R3´ OH
R4´
OH OH O R5´
OH O R5´
OH O+ R5´
OH
OH O
OH O OH
Flavononas OH Flavonoles
(naringenina, hesperetina) (catequina, epicatequina)
Antocianidinas
(cianidina, pelargonidina,
malvidina) OH O
OH
OH O
OH O OH OH
Isoflavonas
(daidzeina, genisteina)
OH
OH
OH
OH O OH
OH Procianidinas
OH
OH
OH O OH
OH
28 OH
u n o
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u n o
Directo: Reducción de los grupos (S-S) de los aminoácidos azufrados de las proteí-
nas por enzimas específicos como la disulfuro reductasa y la sulfóxido reductasa.
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u n o
tan antioxidantes como vitaminas y otros fitoquímicos, los cuales son una importan-
te fuente exógena capaz de aumentar la respuesta celular al estrés oxidativo.
Los estudios realizados con suplementos farmacológicos de antioxidantes en el ser
humano, en contraste con los datos obtenidos en la experimentación animal, no
muestran una evidencia consistente sobre los efectos beneficiosos de esta suplemen-
tación. Según los estudios llevados a cabo en la Unión Europea en el proyecto EU-
ROFEDA, 2002 (Lindsay and Astley, 2002), en el cual se han llevado a término y/o re-
copilado muchos estudios epidemiológicos sobre suplementación farmacológica de
antioxidantes, concretamente sobre vitaminas tales como la vitamina E, C y beta-ca-
roteno, se plantean problemas en cuanto a la relación causa-efecto, ya que la mayo-
ría de estudios son a largo plazo y están interferidos por patologías crónicas o agu-
das. Además, hay que tener en cuenta que el abuso de suplementos es peligroso de-
bido a su posible papel como prooxidantes. Por otra parte, faltan estudios prospecti-
vos y controlados. Por tanto, la falta de datos no permite la recomendación de forma
sistemática de suplementos de antioxidantes.
Sin embargo,en los estudios epidemiológicos de Gey et al. (WHO/Proyecto Móni-
ca, 1991), donde determinaron los antioxidantes plasmáticos (α-tocoferol, ascorba-
to, vitamina A, carotenoides y selenio) en 16 poblaciones europeas, la incidencia de
mortalidad por cardiopatía isquémica muestra una relación inversa con el nivel de α-
tocoferol (P=0,002). Los estudios realizados sobre ingesta de frutas y vegetales en Eu-
ropa pone de manifiesto la alta diferencia en el consumo entre el norte y sur de Eu-
ropa. Estos estudios han demostrado una menor incidencia de enfermedades cardio-
vasculares y cáncer, en los países del sur de Europa, donde se consume una dieta me-
diterránea, en relación a los países nórdicos, efecto atribuido en la hipótesis de par-
tida a las vitaminas. Hoy se sabe que las frutas y verduras contienen otros compues-
tos, incluso con mayor actividad antioxidante que las vitaminas, los flavonoides
(Van´t Veer et al., 2000). En el estudio Rotterdam se investigó la relación entre el
consumo alimentario de flavonoides y vitaminas antioxidantes y el riesgo de acciden-
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u n o
32
u n o
cesos tecnológicos durante la elaboración de la misma, los cuales determinan las ca-
racterísticas de las distintas variedades de cerveza (negra, rubia o sin alcohol). Entre
los componentes de la cerveza que están implicados en la actividad antioxidante es-
tán: compuestos fenólicos, ácidos fenólicos (ferúlico, gálico o siríngico), flavonoles,
catequina, procianidinas, taninos y calconas (Lugasi, 2003), carotenoides y vitaminas
que, aunque muy abundantes en la materia prima, sus niveles se ven disminuidos a
consecuencia del procesamiento al que se ven sometidos, estando presentes en can-
tidades variables, y melanoidinas que se forman a partir de azúcares y aminoácidos
por la reacción de Maillard resultado del tratamiento térmico.
Los mecanismos de absorción gastrointestinal de los polifenoles no están total-
mente conocidos. Por su naturaleza hidrofílica se piensa que tienen que estar impli-
cados transportadores de membrana que faciliten su absorción, aunque en la actuali-
dad solamente se ha identificado un mecanismo de transporte activo dependiente de
Na+, implicado en el transporte de ácidos fenólicos (Ader, 1996).
En el caso de los flavonoides, con excepción de los flavanoles, se encuentran en
la forma glicosilada y la glicosilación influye en su absorción. Las agliconas pueden
ser absorbidas desde el intestino delgado (Hollman and Katan, 1999) y los glicósidos
que resisten la hidrólisis del estómago, no pueden ser absorbidos en su forma nativa
y deben de ser hidrolizados por las enzimas intestinales o por la microflora del colon
para ser absorbidos (Day et al., 2000). En muchos casos cuando la flora está implica-
da, la eficiencia de absorción puede verse reducida porque tiene lugar una degrada-
ción de las agliconas que son liberadas en forma de ácidos aromáticos. Una excepción
en cuanto a su absorción son aquellos flavonoides conjugados con glucosa que pue-
den utilizar el sistema de transporte activo de la glucosa dependiente de Na+ (SGLT1)
a nivel del enterocito para ser absorbidos y posteriormente hidrolizados en el interior
de las células por una b-glucosidasa (Hollman, 1995; Day, 1998). Otra vía implicada
en la hidrólisis de algunos glucósidos es por acción de una enzima glucosidasa que se
encuentra en la membrana de las microvellosidades de las células intestinales y cata-
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38
u n o
D C B A
OH
Me – O O OH
O
O
NH2
OH
39
u n o
condrial (Davies and Doroshow, 1986) (Figura 13) o por el complejo P450 microso-
mal (Goodmand and Hochstein, 1977) dando lugar a una liberación del anión su-
peróxido y peróxido de hidrógeno, produciéndose finalmente una inactivación en la
cadena de transporte electrónico. Otra vía de formación de los radicales libres es la
mediada por metales como el Fe o el Cu en estado oxidado, que reaccionan con la
adriamicina y, a través de una reacción redox, reduce el oxígeno e induce la forma-
ción de especies oxigénicas activas como el radical superóxido, oxígeno singlete o
peróxido de hidrógeno (Wallace, 1986).
Cyt c
Antraciclina (AH) CoQ
I III IV
Antraciclina II
O2
FADH2 H2O ADP + Pi
Radical (A.) NAD+
NADH
O2
. Succinato Fumarato
O2.- H2 O2, HO ATP
40
u n o
ADRIAMICINA ATP
maquinaria
Membrana productora de
interna ADN Complejo energía
molecular
DAÑO CELULAR
41
u n o
antitumoral, reduciendo así únicamente los efectos tóxicos. Entre los estudios rea-
lizados en este campo se encuentran los llevados a cabo por el grupo de van Acker
et al. (1997, 2000), que demostraron que flavonoides sintéticos de la subclase de
los flavonoles como el mono-HER (7-monohydroxietilrutoside) aportan una protec-
ción dosis dependiente contra la cardiotoxicidad inducida en ratones por la doxo-
rrubicina. Estos autores observaron que la administración del flavonoide sintético
monoHer intraperitonealmente una hora antes de la doxorrubicina disminuía signi-
ficativamente la cardiotoxicidad del antibiótico sin verse afectados sus efectos an-
titumorales. Sadzuka et al. (1997) observaron que el incremento en el nivel de pe-
róxidos lípidos y las disminución de la enzima antioxidante, glutation peroxidasa,
inducida por la doxorrubicina se ve normalizada por la acción combinada de flavo-
noides como la rutina y luteolina. De todas formas, no todos los flavonoides mues-
tran un efecto cardioprotector, algunos incluso muestran toxicidad moderada por sí
mismos. Por lo tanto, además de la capacidad antioxidante o quelante de estos
compuestos es necesario que presenten otras características como baja citotoxici-
dad, facilidad del transporte a través de membrana, etc. Otros efectos también re-
lacionados con los flavonoides es su actividad antiproliferativa, o la capacidad de
incrementar la actividad antitumoral de la doxorrubicina potenciando los efectos
quimioterapéuticos de la droga (Bagchi, 2003).
El estado beneficioso frente a la toxicidad de la adriamicina también se ha ob-
servado con extractos de compuestos de origen vegetal. En estudios con un extracto
de proantocianidinas de semillas de uva (Ray et al., 2000; Bagchi et al., 2003) se
observó que un pretratramiento a ratones con dicho extracto inhibía significativa-
mente la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina, apreciándose una disminu-
ción en la actividad de la creatina quinasa de suero, en el daño al DNA y cambios
histopatológicos en el tejido cardíaco de ratón. Nuestro grupo de investigación re-
cientemente valoró los efectos de un extracto de cerveza sobre la citotoxicidad de
la adriamicina en hepatocitos de rata. Los resultados mostraron que el extracto era
42
u n o
43
d o s
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MATERIALES
2.1.1. REACTIVOS
Los reactivos para las soluciones tamponadas, enzimas, coenzimas, DNA de timo de
ternera, 8-Hydroxydeoxyguanosina (8-OHdG), ácido L-ascórbico, ácido gálico, cate-
quina 6-hydroy-2,5,7,8, -tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) son propor-
cionados por Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA). La adriamicina fue suministra-
da por Pharmacia-Upjohn (Milan, Italia), el N, N-dimethyl-p-phenylenediamine dihy-
drochloride (DMPD) de Fluka (Seelze, Germany), la agarosa de Bio-Rad (Richmond,
CA, USA), disolventes y otros reactivos de ScharLau (Barcelona, España) y Merck
(Darmstadt, Germany). Los kits de antioxidantes totales son de Randox (United King-
dom, BT29 4QY), los de la 8-OHdG y MDA+ HAE son de OXIS, (OXIS Health Products,
Inc. 6040 N Cutter Circle, Suite 317 Portland, OR 97217-3935 USA) y los de la LDL
oxidada son de Biomédica Medizinprodukte (GMBH and Co KGA-1210, Wien). El agua
utilizada en todas las determinaciones es de grado Milli-Q (Millipore).
2.1.2. ANIMALES
Se utilizan ratas Wistar hembras de 3-4 meses de edad y peso comprendido entre 250-
300 g, instaladas en jaulas individuales y condiciones apropiadas del animalario (ci-
clos de 12h/12h luz y oscuridad a temperatura de 22ºC), alimentadas con dieta es-
tándar IPM R-20 comercializada por Panlab (Barcelona, España) y agua ad libitum.
2.1.3. CERVEZA
Las cervezas que empleamos, tanto rubia como sin alcohol, están comerciali-
zadas en España. Se mantienen refrigeradas hasta su utilización, e inmediata-
44
d o s
mente, antes de ella, se procede a su análisis para prevenir una posible oxida-
ción de los fenoles. Las muestras que se usaron como suplemento dietético se
obtienen a partir de una concentración en vacío a una temperatura inferior a
35ºC (10 veces concentradas de la cerveza original).
2.2. MÉTODOS
Las curvas de calibrado se calculan con soluciones estándar de Trolox (un análogo
de α-tocoferol), en un rango de concentraciones de 0,2 a 6 µg, y de vitamina C des-
45
d o s
46
d o s
47
d o s
cogiéndose el filtrado que contiene las melanoidinas solubles. Se lava el residuo dos
veces y se mezclan ambos lavados con el filtrado original, siguiendo el mismo pro-
cedimiento descrito para las cervezas. Posteriormente se liofiliza y conserva a –80ºC.
Se realiza el espectro UV-visible de una disolución de esta sustancia patrón en el
rango de 200-600 nm utilizando agua como blanco, teniendo que observarse un pico
característico a 345 nm (Pérez-Magariño et al., 2000). Por ello los valores de absor-
bancia a 345 se utilizan para cuantificar las melanoidinas presentes tanto en las cer-
vezas como en los dializados.
48
d o s
dos dosis de adriamicina de 5 mg/kg de peso por vía intraperitoneal (que es la dosis
establecida en humanos y utilizada en otros estudios) (Hong et al., 2002). Así pues,
el día 7 de la suplementación se administra la primera dosis de adriamicina y el día
14 la segunda, y el aporte dietético de cerveza se mantiene hasta el día 21, proce-
diendo en ese día a la toma de muestras biológicas.
Grupo adriamicina (Adriamicina + H2O): Durante los 21 días que dura el experi-
mento, a los animales se les suplementa con agua en vez de cerveza y se sigue el
mismo tratamiento con la adriamicina, igual que en el grupo anterior.
Grupo control (Suero fisiológico + H2O): Durante los 21 días las ratas se suple-
mentan únicamente con agua y en vez de adriamicina se administra suero fisiológi-
co.
Para tal objetivo se ha elegido a un grupo de humanos de sexo masculino con ni-
veles elevados de colesterol (hiperlipemias), a los cuales se les suplementa su die-
ta con 660 mL/día de cerveza sin alcohol durante un periodo de tiempo de 28 días.
49
d o s
50
d o s
4ºC (este paso se repite dos veces). Finalmente se resuspende el pellet con tam-
pón 2 y congelamos las mitocondrias obtenidas a -80ºC hasta que se realicen las
correspondientes pruebas bioquímicas.
51
d o s
Para la determinación del MDA + HAE se utilizó el kit de OXIS, BIOTECH HAE-586 AS-
SAY (OXIS Health Products, Inc. 6040 N Cutter Circle, Suite 317 Portland, OR 97217-
3935 USA)
La oxidación de los ácidos grasos da lugar a la formación de peróxidos lipídicos,
como malondialdehido (MDA) y alkanales. El método HAE-586 esta basado en la re-
acción del cromógeno N-metil-2-fenilindol (NMPI) con el MDA y 4-hidroxialkanales
(HAE) a 45ºC. Una molécula de 4-hidroxialkanal reacciona con dos moléculas de NMPI
y da como producto una molécula estable. Posteriormente, se mide espectrofotome-
tricamente a una λ 586 nm.
52
d o s
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d o s
mos 3 veces con 1 mL de etanol:acetato de etilo (1:1 v/v). Centrifugamos otra vez a
12.600 rpm durante 3 minutos y recogemos el pellet. Finalmente añadimos 1 mL de
Guanidina 6 N a pH: 2,3, centrifugamos a 12.600 rpm y medimos el sobrenadante a
una λ= 366 nm frente a una solución de guanidina.
HEMOGLOBINA EN HUMANOS
54
d o s
Para la determinación de la LDL oxidada se utilizó el kit OLAB anti oxidised LDL
de Biomédica. Añadimos 200 µL de tampón de ensayo en los pocillos de la pla-
ca incluyendo el blanco y 20 µL de la pre-dilución (1:5) de estándar/mues-
tra/control en cada pocillo excepto el blanco. Cubrimos bien la placa a incu-
bar a 37ºC durante 1,5 horas. Transcurrido el tiempo, lavamos los pocillos con
tampón de lavado diluido y añadimos 100 µL de conjugado en cada pocillo.
55
d o s
EN SUERO DE HUMANOS
Se aplicó el método descrito por Halliwell et al. (1987) que permite valorar la
degradación de la desoxirribosa en presencia del ácido ascórbico y del Cu (II)
dando como producto malondialdehido (MDA); el cual reacciona con el ácido
tiobarbitúrico (TBA) y forma un cromóforo de color rosa. La adición de un
agente barredor (“scavenger”) de los radicales hidroxilo compite con la deso-
xirribosa por estos radicales inhibiendo la formación de color.
56
d o s
% Inhibición= (1-Af/Ao)x100
Siendo Ao el valor de absorbancia de la desoxirribosa oxidada
y Af el valor de absorbancia de la muestra que evalúa el efecto protector.
Los radicales hidroxilo actúan sobre el enlace fosfato y provocan en el DNA la ro-
tura de la cadena. Esta degradación origina fragmentos más pequeños que pueden
ser separados en un gel de agarosa.
La oxidación del DNA de timo de ternera se llevó a cabo con ácido ascórbico
10 mM y Cu (II) 100 µM incubando durante 1 hora a 37ºC en ausencia y presen-
cia de la cerveza concentrada. Tras la incubación se tomaron 50 µL de cada mues-
tra y se mezclaron con 10 µL de una disolución compuesta por glicerol y azul de
bromofenol en tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,4. Posteriormente, se realizó
una electroforesis de las muestras en gel de agarosa al 0,7% preparado en tampón
fosfato sódico pH 7,4. Las condiciones fueron 400V, 400 mA y 100W. Las bandas
de los fragmentos de DNA se visualizaron con luz UV y se fotografiaron con cá-
mara digital.
57
d o s
La digestión del DNA se realiza siguiendo el método descrito por Floyd et al., en
1988 con ligeras modificaciones (Muñiz et al., 1995). Se diluyen 400 µg de ADN en
tampón Tris/HCl 10 µM pH: 7,0 hasta un volumen de 100 µL . Se añade ADNasa I
(1U/mg) y posteriormente se incuba a 37ºC durante 1 hora. Se añade 10 µl CH3-
COO-Na+ 0’5 M a pH: 5,1 y nucleasa P1 (1U/40 /µg), y nuevamente se incuba a 37ºC
durante 1 hora. Finalmente se agrega Tris/ClH a pH: 7,0 para que el volumen final
sea 200 µL y fosfatasa alcalina (1U/40 /µg), e incubamos a 37ºC durante 1 hora.
58
d o s
59
d o s
60
t r e s
RESULTADOS
61
t r e s
La tabla 2 muestra los valores medios, por grupos, de los resultados obtenidos
en un estudio cuantitativo, de los diferentes parámetros evaluados en las cer-
vezas estudiadas. Estadísticamente, el test de ANOVA mostró el efecto factor
“tipo de cerveza” para todos los parámetros evaluados. Analíticamente, los re-
sultados del test de LSD muestran que la cerveza con alcohol es significativa-
mente más rica en compuestos fenólicos; del mismo modo, presenta niveles
significativamente superiores de actividad antioxidante total (AOA) medido por
el test DMPD respecto a la sin alcohol. Los niveles de procianidinas, catequi-
nas y melanoidinas fueron similares en ambos tipos de cerveza.
Con Alcohol 1,49 ± 0,1b 2891 ± 133b 1936 ± 22,8a 393 ± 17,2a 6,11 ± 2,4a
Sin Alcohol 0,87 ± 0,03a 2257 ± 138a 1749 ± 4,0a 337 ± 12,2a 5,77 ± 1,2a
Los resultados se expresan en media ± SD de 6 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se
aplicó el test de ANOVA. Valores con diferente letra son significativos (p<0,05).
62
t r e s
63
t r e s
% Inhibición
120
**
100
**
80
**
60
40
20
0
Control o,5µl 1µl 5µl 10µl
Los resultados están expresados en media ± SD de 6 experimentos diferentes. Para la estadística se uso la ANOVA siendo
p< 0,0001 respecto al volumen. No existen diferencias significativas entre ambos tipos de cerveza.
Hemos estudiado el efecto protector de la cerveza con y sin alcohol tras la in-
ducción de un estrés oxidativo con ácido ascórbico y cobre (SO4Cu) sobre el ma-
terial genético.
64
t r e s
OD 532 nm
1.5
**a
1 **
0.5
**
** **
**aa
0
Asc-Cu 10 µl 50 µl 100 µl
El ensayo en material y métodos. Los resultados están expresados en media ± SD de 6 experimentos diferentes. Para el
cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student. *p<0.05 y **p<0.005 – Comparando Asc-Cu respec-
to a 10, 50, 100 µl de cerveza. ap<0.05 y aap<0.005 – Comparando cerveza con alcohol respecto a cerveza sin alcohol
El ácido ascórbico y el cobre dañan al DNA debido a que producen especies oxigé-
nicas altamente reactivas tal como .OH, responsable de su degradación. Cuanto ma-
65
t r e s
1 2 3 4 5 6 7 8
(1) DNA solo incubado 1h a 37º C, (2) DNA más ascórbico 1mM y cobre (II) 100 µM; Como la calle 2 más: (3) 100 µL
de cerveza rubia, (4) 50 µL de cerveza rubia, (5) 10 µL de cerveza rubia, (6) 100 µL de cerveza sin, (7) 50 µL de cerve-
za sin, (8) 10 µL de cerveza sin.
66
t r e s
8OhdG/105dG % Inhibición
DNA ND
DNA + Cer. con alcohol (100µL) ND
DNA + Cer. sin alcohol (100µL) ND
DNA + Asc-Cu 59,9 ± 1,8
DNA + Asc-Cu + Cer. con alcohol 29,3 ± 6,9* 51,6 ± 11,6
DNA + Asc-Cu + Cer. sin alcohol 22,7 ± 2,3* 62,0 ± 3,8
El ensayo en material y métodos. Los resultados están expresados en media ± SD de 10 experimentos diferentes. Para el
cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student. *p<0.05 – Comparando Asc-Cu respecto a 100 µl
de cerveza.
67
t r e s
1100
abc
1000
abbc
900
800
700
TO 30 60 90
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en media ±
SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student.
ap<0.05 y aap<0.005 Comparando T0 respecto a los tiempos 30, 60, 90, minutos tras la suplementación.
bp<0.05 y bbp<0.005 Comparando 30 minutos respecto a 60 y 90 minutos.
cp<0.05 y ccp<0.005 Comparando 60 minutos respecto a 90 minutos.
#p<0.05 Comparando cerveza con alcohol respecto a cerveza sin alcohol.
Tanto en el caso de la cerveza con alcohol, como de la cerveza sin alcohol, en-
contramos una diferencia significativa a los 90’ de la administración (T90), com-
parando tanto con la situación basal (T0) como a los 30’ postingesta (T30), en el
sentido de que existía un incremento en las cifras de polifenoles plasmáticos a los
90’. Estos resultados indican la eficacia de la absorción de los compuestos fenóli-
68
t r e s
69
t r e s
1000
900
800
800
700
TO 30 60 90
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en media ±
SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student.
ap<0.05 y aap<0.005 Comparando T0 respecto a los tiempos 30, 60, 90, minutos tras la suplementación.
70
t r e s
71
t r e s
## ##
300
* *
Actividad Complejo I
250
**
200
150
100
50
**aa
0
SU+H20 ADR+H20 ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
# p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
Complejo I = NADH:ubiquinona oxidoreductasa, ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
72
t r e s
400 ## ##
Actividad Complejo I
350
300 **
250
200
150
100
50
**aa
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y ##p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
ADR= Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
73
t r e s
##
##
Actividad Complejo IV
2000
1500 **
1000
500
**aa
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero +Cer).
# p<0.05 y # # p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H2O) respecto al grupo (ADR + Cer).
Complejo IV = Citocromo oxidasa; ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
74
t r e s
3000 #
#
Actividad Complejo IV
2500 **
2000
1500
1000
500
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
# p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H2O) respecto al grupo (ADR + Cer).
Complejo IV = Citocromo oxidasa; ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
75
t r e s
76
t r e s
son ligeramente menores en los animales suplementados con cerveza con alcohol
en comparación con los suplementados con cerveza sin alcohol. De todas formas,
ambos grupos de animales presentan diferencias estadísticamente significativas
(p<0,005) con respecto a los animales tratados con adriamicina y no suplementa-
dos, en el sentido de que los niveles de esta coenzima Q10 son superiores en el
caso de que las ratas hayan recibido el aporte dietético de cerveza.
##
10
aa
Niveles de CoQ9
**
6
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
a p<0.05 y aa p<0.005 – Comparando el grupo (cerveza sin alcohol) respecto a (cerveza con alcohol).
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
77
t r e s
1.2
0.2
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
78
t r e s
10 #
#
Niveles de CoQ9
**
4
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
*
10 ##
Niveles de CoQ10
8 ##
4 **
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Figura 29. Determinación de los grupos carbonilo en las proteínas del plasma de rata
3
2.5 **
(nmol/mg de proteínas)
# #
Grupos Carbonilo
1.5
0.5
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
80
t r e s
200
**
MDA + 4HNE
150
100
50
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
81
t r e s
**
200
(nmol/mg de proteínas)
150
MDA + 4HNE
##
100
50
50
50
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
82
t r e s
Y CORAZÓN DE RATA
12
#
Niveles de 80HG
#
10
8
6
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
83
t r e s
(ng/mg de DNAtotal)
30 ##
Niveles de 80HdG
##a
20
10
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
aP<0.05 y aaP<0.005 – Comparando el grupo (cerveza sin alcohol) respecto a (cerveza con alcohol).
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
84
t r e s
taban significativamente más altos. Este efecto era, sobre todo, demostrable en los
animales suplementados con cerveza sin alcohol, donde los valores de α-tocoferol
permanecían al mismo nivel que los del grupo control, a pesar de haber recibido la
adriamicina. En los animales tratados que habían recibido la cerveza con alcohol,
los valores de α-tocoferol eran más elevados que en los que no habían recibido este
suplemento, pero se mantenían a un nivel más bajo que los del grupo control. Otro
hecho destacable, es que, en estas mitocondrias hepáticas, el nivel de la vitamina
E era más bajo en el caso de que los animales hubieran recibido cerveza con alco-
hol, aún sin haber sido tratados con el quimioterápico, en comparación al grupo
control. Este hecho no ocurría en caso de la administración de cerveza sin alcohol,
por lo que podría estar atribuido al contenido alcohólico de la cerveza.
##
2
α-tocoferol
1.5 ##a *a
**
0.5
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significación estadística se aplicó el test de la t´Student.
*p<0.05 y **p<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero + Cer).
#p<0.05 y # #p<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
a p<0.05 y aa p<0.005 – Comparando el grupo (cerveza sin alcohol) respecto a (cerveza con alcohol).
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
85
t r e s
1.5
1.2 ## ##
α-tocoferol
0.9
0.6
**
0.3
0
SU+H2O ADR+H2O ADR+CER SU+CER
Tratamiento de las ratas especificado en el apartado de material y métodos. Los resultados están expresados en me-
dia ± SD de 8 experimentos diferentes. Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student.
*P<0.05 y **P<0.005 – Comparando grupo control (Suero + H2O) respecto a los grupos (ADR+ H2O), (ADR + Cer) y
(Suero +Cer).
#P<0.05 y # #P<0.005 – Comparando el grupo (ADR + H O) respecto al grupo (ADR + Cer).
2
ADR = Adriamicina; Cer = Cerveza y H2O = Agua
86
t r e s
87
t r e s
3.3.1. DIETA
Los valores de triglicéridos (TG) en dichos pacientes oscilan entre 68-90 mg/dL an-
tes y 65- 85 mg/dl después de la suplementación y los de colesterol total entre 237-
330 mg/dl antes y 217-283 mg/dl después de la suplementación. Los niveles de las
HDL colesterol anteriores y posteriores al periodo de suplementación dietética fueron
de 48-92 mg/dl antes y 42-90 mg/dl después. En la Figura 36 están representados
los porcentajes de los niveles de triglicéridos (TG), colesterol total y de las HDL an-
tes y después del suplemento dietético, no observándose ningún cambio significati-
vo respecto a su control en los parámetros determinados.
100
mg/dl
80
60
40
20
0
CONTROL CERVEZA CONTROL CERVEZA CONTROL CERVEZA
88
t r e s
100 * *
mg/dl
80
60
40
20
0
CONTROL CERVEZA CONTROL CERVEZA
89
t r e s
Figura 38. Niveles de las sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico, pro-
cedentes de la peroxidación lipídica en plasma
50
TBARS (nmol/ml)
40
**
30
20
10
0
CONTROL CERVEZA
Tratamiento de las muestras especificado en el apartado de material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de15 pacientes.
Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student para muestras pareadas
**P<0.005 – Comparando grupo control respecto al grupo suplementado con cerveza sin alcohol.
90
t r e s
2.5
Grupos Carbonilo
1.5
0.5
0
CONTROL CERVEZA
Tratamiento de las muestras especificado en el apartado de material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de15 pacientes.
Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student para muestras pareadas
**P<0.005 – Comparando grupo control respecto al grupo suplementado con cerveza sin alcohol.
91
t r e s
8
80hdG/105
0
CONTROL CERVEZA
Tratamiento de las muestras especificado en el apartado de material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de15 pacientes.
Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student de muestras pareadas.
92
t r e s
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
CONTROL CERVEZA
Tratamiento de las muestras especificado en el apartado de material y métodos.
Los resultados están expresados en media ± SD de15 pacientes.
Para el cálculo de la significancia estadística se aplicó el test de la t´Student para muestras pareadas.
**P<0.005 – Comparando grupo control respecto al grupo suplementado con cerveza sin alcohol.
3.4. CONCLUSIONES
En el presente trabajo hemos valorado la capacidad antioxidante “in vitro” que pre-
senta la cerveza, analizando los compuestos responsables de esta actividad, estu-
diando, además, la biodisponibilidad de estos compuestos en el animal de experi-
mentación.
Hemos evaluado también, el papel protector que presenta la cerveza frente a un
estrés oxidativo producido en el animal de experimentación. Esto se ha realizado con
el tratamiento de un agente antineoplásico, la adriamicina, que se sabe que es un
potente agente inductor de radicales libres a nivel mitocondrial.
Por último, hemos analizado su posible efecto en una patología humana cuya pa-
togenia está mediada por la oxidación como es la arteriosclerosis, efectuando el es-
tudio en pacientes afectos de hiperlipemia y con riesgo familiar de enfermedad co-
ronaria.
93
t r e s
94
t r e s
Por tanto, la cerveza con y sin alcohol ejerce un efecto protector ante el estrés
inducido por el antibiótico antitumoral adriamicina.
95
t r e s
96
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