Bioqumica Geral

Bioqumica Geral 2009/2010 Licenciatura em Biologia Celular e Molecular

1 Srie de problemas

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Propriedades dos aminocidos, pptidos e protenas

1. a) b) c) d) e) 2. a) b) c) d) 3. a) b) c) d) e) 4. a) b) c) d) 5. a) b) c) d) 6. a) b) c) d) e) 7. A formao da ligao peptdica entre dois aminocidos um exemplo de uma reaco de ... ciso condensao transferncia de grupo isomerizao oxidao-reduo O pptido alanilglutamilglicilalanilleucina possui: uma ponte dissulfureto 5 ligaes peptdicas 4 ligaes peptdicas 2 grupos amino livres Um octapptido constitudo por 4 unidades repetidas de glicilalanil possui: um grupo amino livre num resduo de Ala um grupo amino livre num resduo de Ala e um grupo carboxlico livre num resduo de Gli um grupo amino livre num resduo de Gli e um grupo carboxlico livre num resduo de Ala dois grupos amino livres e dois grupos carboxlicos livres dois grupos carboxlicos livres em dois resduos de Gli No ponto isoelctrico de um tetrapptido ... apenas os grupos amino e carboxlico terminais contribuem para a carga global os grupos amino e carboxlico terminais no esto carregados a carga global nula os 4 aminocidos constituintes contribuem para a carga global com um grupo inico Considere o tripptido FenAspLis Represente, de uma forma abreviada indicando apenas os grupos ionizavis, todas as formas ionizadas do tripptido, indicando o valor de pKa associado a cada equilbrio cido-base; Calcule a carga formal do tripptido a pH = 3,05 e a pH = 9,5; Calcule o pH ao qual a carga do tripptido nula. Calcule o pH ao qual o tripptido tem carga global igual a +1,3 Responda s seguintes questes com verdadeiro ou falso. Se falso, explique porqu: S a pH muito baixo ou muito alto que a forma no ionizada de um dado aminocido predomina; A leucina mais polar do que a alanina; A um valor de pH superior ao valor de pKa de um grupo ionizvel mais de metade desses grupos esto ionizados; O ponto isoelctrico do tripptido Lis-Lis-Lis maior do que qualquer dos valores de pKa dos resduos individuais (Lisina). Esboce a curva de titulao com NaOH para este tripptido; H rotao livre em torno de uma ligao peptdica. Suponha que tem uma mistura de Ala, Val, Glu e Lis a pH = 6,0. Calcule a carga formal de cada aminocido. Desenhe a forma da tira de papel revelada pela ninidrina aps ter realizado a electroforese. Indique o nodo (+), ctodo (-) e a origem e a posio de cada um dos aminocidos.

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8.

Considere uma mistura de aminocidos constituda por quantidades equimolares de Tir, Arg, Gli e His. Esboce os resultados que esperaria obter se sujeitasse a mistura a uma electroforese em papel a pH = 6,0. A hormona -melanotropina tem a seguinte sequncia de aminocidos: SerTirSerMetGluHisFenArgTrpGliLisProval Escreva, representando apenas os grupos ionizveis, a estrutura da espcie que predomina a pH = 9,0; Determine o pI da hormona; Diga a que pH a hormona tem carga igual a 1,2; Esboce a curva de titulao da -melanotropina, partindo da sua forma totalmente protonada.

9. a) b) c) d)

10. Considere o seguinte pptido: Glu-Leu-Arg-Met-Glu-Trp-Arg-Ala-Trp-Glu a) b) c) Suponha que vai titular na forma Ln- indique todos os equilbrios desde a forma totalmente desprotonada at forma totalmente protonada referindo quais os grupos envolvidos em cada passo e os respectivos valores de pKa; Desenhe a curva de titulao. Justifique. Calcule o pH do ponto isoelctrico.

11. Na titulao de 0,01 moles de um pptido na sua forma completamente protonada foram gastos 0,07 moles de NaOH. Na figura apresenta-se a curva de titulao obtida. A composio de aminocidos revelou somente a presena de trs tipos de aminocidos (Glu, His, Arg). a) b) c) d) Analisando a curva de titulao obtida, determine a composio em aminocidos deste pptido. Justifique. Escreva os equilbrios postos em jogo ao longo da titulao e respectivos valores de pKa. Calcule a carga total do pptido a pH 4,0 e a pH 6,0. Determine o pH do ponto isoelctrico deste pptido.

12. Os aminocidos podem ser usados como tampes. Uma soluo tampo uma soluo que no varia apreciavelmente de pH quando se lhe adiciona cido ou base. A zona na qual uma dada soluo um tampo efectivo designada por zona tampo e geralmente definida por pKa 1. a) b) c) Indique a zona tampo da glicina, histidina, asprtico e lisina; (zona tampo = pka 1) Escolha um aminocido para tamponizar a pH = 4,6 ; 9,0 e 12,0; Uma protena contendo 110 aminocidos ser melhor ou pior tampo que a soluo de concentrao equivalente dos aminocidos constituintes? Explique. (Ajuda para a resposta: nas protenas os grupos amino e carboxilo esto envolvidos nas ligaes peptdicas)

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13. Diga se o tetrapptido AlaGluGliLis um bom tampo a pH=7,0. 14. A vasopressina uma hormona antidiurtica secretada em resposta tenso arterial baixa ou a elevadas concentraes de Na+ no sangue. Actua de modo a estimular o rim a reter gua. A sequncia de aminocidos da vasopressina :

CisTirFenGlnAsnCisProArgGli
SS a) b) Qual o resultado do tratamento da hormona com -mercaptoetanol? Esboce a curva de titulao com NaOH do(s) produto(s) desse tratamento Escreva, de uma forma abreviada destacando apenas os grupos ionizveis, a estrutura da espcie que em condies no-redutoras tem a carga global nula.

15. A partir do colagnio isolado da cauda do canguru obtevese uma prolina substituda (aminoprolina) ainda no caracterizada. A partir das curvas de titulao determinaram-se os pKa dos grupos ionizveis: pKa(-carboxilo) = 1,9 pKa(-amino) = 9,8 pKa(-amino) = 10,0. a) b) c)

H H3N C H2C N H2 CH2 HC CO2

-

Indique todas as formas ionizadas deste aminocido Calcule o ponto isoelctrico deste aminocido Calcule a carga deste aminocido a pH 2,5 e diga qual a direco de migrao deste aminocido quando sujeito a electroforese a este pH.

Isolamento e purificao de pptidos e protenas

16. A maior parte das protenas puras so pouco solveis em gua destilada, mas a sua solubilidade aumenta em solues diludas de sal. Contudo, a adio de elevadas concentraes de sal a uma soluo aquosa de protenas f-las precipitar. a) b) Explique a variao da solubilidade das protenas em funo da concentrao de sais. A solubilidade de duas protenas em funo de (NH4)2SO4 apresentada na figura. Conhecendo estes dados, como que procederia para separar as protenas A e B?

17. Em cada alnea indique o pptido mais solvel: a) b) c) (Gli)20 ou (Glu)20, a pH=7,0 (Ala-Ser-Gli)5 ou (Asn-Ser-His)5, a pH=6,0 (Ala-Asp-Gli)5 ou (Asn-Ser-His)5, a pH=3,0

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18. Pretende-se purificar uma soluo contendo uma mistura de albumina do soro (pI = 4,9), urease (pI=5,0), ribonuclease (pI=5,9) e tripsina (pI=1,0), por aplicao de cromatografia de permuta inica. Diga se conseguiria uma separao eficiente usando esta tcnica. 19. Em que ordem sero eludas as seguintes protenas de colunas de permuta inica por um aumento de fora inica?

a) b)

Citocromo c, lisozima, albumina do ovo, de uma resina catinica; Citocromo c, pepsina, urease, hemoglobina, de uma resina aninica. Justifique.

Protena Citocromo c Lisozima Albumina do ovo Pepsina Urease Hemoglobina

pI 10,7 1,0 11,0 <1,0 5,0 6,8

20. Qual o significado da presena de uma nica banda num gel SDS-PAGE? 21. Pretende-se purificar uma soluo contendo uma mistura de duas protenas: citocromo c (pI=10,6) e ferredoxina (pI=3,2). Sabe-se que o peso molecular do citocromo c 13.000 Da e o da ferredoxina 6.000 Da. Que tcnicas poderia escolher para poder separar estas duas protenas? Justifique. Para cada tipo de tcnica escolhida indique como se processa a separao. 22. O uso de SDS numa electroforese possibilita:

a) b) c) d) e)

a a a a a

determinao do pI das protenas determinao da actividade especfica das protenas determinao da composio em aminocidos manuteno da estrutura nativa e da actividade biolgicas das protena separao das protenas com base no seu peso molecular

23. As mobilidades electroforticas relativas em SDS-PAGE de duas protenas, uma com 30 kDa e a outra com 92 kDa, so iguais a 0,8 e 0,4, respectivamente. Calcule a massa molecular aparente de uma protena que no mesmo gel apresenta uma mobilidade de 0,62. 24. Complete a seguinte tabela de purificao:
Etapa da purificao Protena total (mg) 20 000 5 000 1 500 500 45 Actividade total (U) 4 000 000 3 000 000 1 000 000 750 000 675 000 Actividade especfica (U/mg) Grau de purificao 1 Y (%)

Extracto celular Precipitao com (NH4)2SO4 Cromatografia em DEAE-celulose Cromatografia de filtrao em gel Cromatografia de afinidade

100

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25. Considere os pptidos com as sequncias de aminocidos seguintes:

(A) Lis-Pro-Gln-Gli-Arg-Ser-Pro-Lis (B) Cis-Asn-Val-Cis-Ile-Gli (C) Asn-(Tir-Fen-Met)50 a) Uma mistura constituda pelos pptidos A, B e C foi sujeita a um campo elctrico, a pH =9,5, produzindo a tira de papel de electroforese apresentada abaixo. Identifique cada banda (no necessita de recorrer equao de Hendersson-Hasselbalch para responder a esta questo).

b) c) d) e)

Escreva abreviadamente, destacando apenas os grupos ionizveis de cada aminocido a estrutura do pptido C predominante a pH=10,46 (no use a notao LH ). Esboce a curva de titulao do pptido B a partir da sua forma totalmente protonada. Justifique a sua resposta escrevendo todos os equilbrios cido-base possveis em soluo e todos os clculos necessrios. Classifique os trs pptidos quanto sua solubilidade numa soluo tampo a pH=12,0. Recorrendo exclusivamente a tcnicas cromatogrficas, diga de que forma procederia para separar uma mistura constituda pelos trs pptidos. Especifique os resultados esperados sob a forma de cromatograma e as condies experimentais que achar relevantes.
n a

26. Considere as propriedades das protenas indicadas na tabela. Para responder s diferentes questes e sempre que adequado, esboce esquematicamente (recorrendo a cromatogramas e tabelas) os resultados esperados. Especifique as condies experimentais que achar relevantes.

protena
- antitripsina citocromo c hemoglobina mioglobina polimerase do RNA interfero transferrina

pI
5,4 10,6 7,1 7,0 5,9

n subunidades idnticas
1 4 1 1 2 -

massa molecular total (kDa)

45,0 13,0 64,0 16,0 98,0 33,0 90,0

a) b) c)

Esboce o gel de poliacrilamida na presena de SDS e -mercaptoetanol que esperaria obter da aplicao de uma mistura de todas as protenas apresentadas na tabela. Indique as massas moleculares de cada banda. Seria possvel separar as protenas de uma mistura constituda por todas as protenas da tabela, por cromatografia de filtrao em gel, usando um gel com uma gama de excluso entre 15 e 100 kDa? Diga qual o procedimento experimental que utilizaria para separar a mistura de protenas contendo hemoglobina, mioglobina e citocrom c. Especifique as condies experimentais que usaria.

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Estrutura de pptidos e protenas

27. O arranjo do esqueleto de carbonos de duas ligaes peptdicas descrito por:

a) b) c) d) e)

CNCCCNCC CNCCN C CNCCCN CCNCCN CCCN CCC

28. Numa hlice os grupos R dos resduos de aminocidos:

a) b) c) d) e)

alternam entre o lado externo e interno da hlice esto dispostos para o exterior da hlice esto dispostos para o interior da hlice causam uma torso da hlice para a direita esto envolvidos em pontes de H que estabilizam a hlice

29. Numa protena conjugada, o grupo prosttico :

a) b) c) d)

uma uma uma uma

regio fibrosa nas protenas globulares subunidade distinta nas protenas multimricas subunidade de uma protena oligomrica parte da protena que no faz parte da cadeia polipeptdica

30. De uma forma geral, as protenas no so desnaturadas por:

a) b) c) d) e)

adio de um detergente tal como o SDS aquecimento a 90 C cido iodoactico pH=10,0 ureia

31. Liste 4 factores (ligaes ou foras) que contribuem para a estabilizao da estrutura nativa das protenas. Descreva uma condio, ou reagente, que interefe com cada uma das foras estabilizadoras que anteriormente mencionou. 32. Sabendo que diferentes aminocidos podem ser encontrados em zonas distintas das protenas, que aminocidos se encontram no interior das protenas globulares. 33. Qual o significado biolgico da presena de resduos de aminocidos variveis em protena homlogas? O que se pode concluir sobre a conservao de motivos na estrutura primria destas protenas? 34. Explique de que forma o pH afecta a conformao de uma protena. 35. Purificou-se uma protena X cuja estrutura se pretende determinar. Realizaram-se diferentes experincias com as quais se obtiveram resultados abaixo listados. O que que pode concluir acerca da estrutura da protena X? (i) Por cromatografia de filtrao em gel, verificou-se que a protena nativa tem uma massa molecular de 240000 Da; (ii) Por cromatografia de filtrao em gel na presena de 6 M de hidrocloreto de guanidnio (agente desnaturante) obteve-se um nico pico com massa molecular igual a 60000;

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(iii)

Por cromatografia de filtrao em gel na presena de hidrocloreto de guanidnio e de mercaptoetanol (HSCH2CH2OH) detectaram-se picos com massas moleculares iguais a 34000 e 26000.

36. Pretende-se determinar a sequncia de aminocidos de um polipptido. Sabe-se que por reduo do mesmo se obtiveram duas cadeias polipeptdicas com as seguintes sequncias de aminocidos:

Cadeia 1: AlaCisFenProLisArgTrpCisArgArgValCis Cadeia 2: CisTirCisFenCis O polipptido nativo (com as pontes dissulfureto intactas) foi digerido com Termolisina, obtendo-se os seguintes pptidos: (1) (2) (Ala, 2Cis, Val) (Arg, Lis, Fen, Pro) (3) (2Arg, 2Cis, Trp, Tir) (4) (2Cis, Fen)

Indique a posio das pontes dissulfureto no polipptido.

37. Com base nos dados apresentados deduza a estrutura primria do polipptido.

A. B. C.

Composio em aminocidos: (2Ala, Arg, 2Lis, Met, Fen, 2Ser) Tratamento com Carboxipeptidase A: (Ala) Digesto com Tripsina: (1) (2) (Ala, Arg) (Lis, Fen, Ser) (Ala, Arg, 2Lis, Met, Fen, Ser) (Ala, Ser) (Ala, Arg, Ser) (Ala, 2Lis, Met, Fen, Ser) (3) (Lis) (4) (Ala, Met, Ser)

D.

Tratamento com brometo de cianognio: (5) (6)

E.

Digesto com Termolisina: (7) (8)

38. Um grupo de pptidos que influenciam a transmisso nervosa em algumas partes do crebro foi isolado. Usando a informao apresentada determine a sequncia de aminocidos deste tipo de pptidos.

A. B.

Hidrlise completa com 6 M de HCl a 110 C seguida de anlise de aminocidos indicou a presena de Gli, Leu, Fen, Tir, Pro numa estequiometria molar de 2:1:1:1:1 Tratamento do pptido com fenil-isotiocianato seguido de hidrlise completa e cromatografia (degradao de Edman) indicou a presena de um derivado feniltiohidantona da Tir. No foi detectada qualquer Tir na forma livre. Digesto completa com pepsina seguida de cromatografia produziu um tripptido de Fen, Pro e Leu, e um tripptido contendo Tir e Gli numa razo 1:2.

C.

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39. Um pptido com propriedades antibiticas foi isolado da bactria Bacillus brevis. Com base nas observaes descritas deduza a estrutura do pptido.

A.

Hidrlise completa do pptido seguida de anlise de aminocidos revelou quantidades equimolares de Leu, Orn, Fen, Pro, e Val. Orn respresenta a ornitina, um aminocido derivado com a seguinte estrutura:
H

H3 N+

(CH2)3

C
+

COO-

NH3

B. C. D. E.

A massa molecular do pptido 1200 Da Tratamento com carboxipeptidase do pptido no produziu qualquer resultado Sequenciao automtica do pptido nativo produziu um derivado da Orn Hidrlise parcial do pptido seguida de separao cromatogrfica e anlise da sequncia Nterminal originou dipptidos e tripptidos Leu-Fen, Fen-Pro, Orn-Leu, Val-Orn, Val-Orn-Leu, Fen-Pro-Val, e Pro-Val-Orn.

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DETERMINAO DA ESTRUTURA PRIMRIA DE PPTIDOS E PROTENAS

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