2.3.01 Brucelosis Bovina

SECCIN 2.3.
ENFERMEDADES DE LOS BVIDOS DE LA LISTA B
CAPTULO 2.3.1.
BRUCELOSIS BOVINA
RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por B. melitensis y ms raramente por B. suis. La infeccin est globalmente muy extendida. Algunos pases del norte y del centro de Europa, Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres del agente. Clnicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto, retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los microorganismos en las descargas uterinas y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento de Brucella del material de los abortos, de las secreciones de la ubre y de tejidos analizados postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar determinando la respuesta especfica mediada por clulas o la serolgica frente a los antgenos de Brucella. Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para los humanos y tanto todos los tejidos infectados, como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin. Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observacin de la morfologa de Brucella, por tincin modificada de cido-alcohol resistentes, en los materiales de abortos o descargas vaginales, especialmente si est apoyada por pruebas serolgicas. La reaccin en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada proporciona medios adicionales de deteccin. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos cultivando las descargas uterinas, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o tejidos seleccionados, como los ganglios linfticos, los testis o el epididimo. Las especies y biotipos deberan identificarse por lisis fgica y por criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. Ms recientemente, se han introducido tcnicas moleculares como mtodos adicionales de biotipado. Pruebas serolgicas y alrgicas cutneas: Las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinacin tamponada en placa, as como la fijacin de complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarizacin de fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar rebaos y animales individuales. Sin embargo, ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La prueba ELISA indirecta o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son eficaces para analizar y controlar la brucelosis en vacas lecheras, pero la prueba del anillo de leche es menos fiable en grandes rebaos. Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse en anlisis o como una prueba confirmativa en rebaos cuando existe reaccin serolgica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en rebaos no vacunados. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La cepa 19 de Brucella abortus contina siendo la vacuna de referencia con la que se comparan otras vacunas. Debe prepararse a
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina
partir de inculos de siembra derivados de EE.UU. y cada lote debe cumplir un mnimo de condiciones respecto a viabilidad, ligereza, virulencia residual y capacidad para inmunizar ratones frente a un desafo con una cepa virulenta de B. abortus. La vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus se obtuvo de una cepa mutante, rugosa, de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de B. abortus. Sin embargo, su eficacia en el ganado bovino y su falta de inocuidad son objeto de debate. Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben estar libres de lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecficas ni interferir con las pruebas serolgicas. Los antgenos para el diagnstico deben prepararse de cepas lisas de B. abortus, las cepas 1119-3 99, y deben cumplir un estndar mnimo de pureza, sensibilidad y especificidad.
A. INTRODUCCIN
En el ganado bovino la brucelosis suele estar causada por biotipos de Brucella abortus. En algunos pases, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se asocia con ovejas o cabras, la infeccin puede ser tambin debida a B. melitensis. En ocasiones, B. suis puede causar una infeccin de las mamas en el ganado bovino pero no se ha descrito que origine abortos (16). Normalmente la enfermedad es asintomtica en hembras no gestantes. Despus de la infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestacin desarrollan una placentitis que por lo general conduce al aborto entre el quinto y el noveno mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se produce gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos fetales y las descargas vaginales. Las mamas y los ganglios linfticos asociados tambin pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan por lo general a trmino, pero la infeccin uterina y la mamaria se repite, con un nmero reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo est presente en la mayora de los ganglios linfticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar esterilidad en ambos sexos. Una manifestacin corriente de la brucelosis en algunos pases tropicales son los higromas, por lo general en las articulaciones de las patas, que pueden representar el nico indicador de la infeccin; con frecuencia, el lquido de los higromas est infectado por Brucella. La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas (C. bactrianus) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis. Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), as como en el bfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antlopes africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado bovino. El manual de bioseguridad para laboratorios elaborado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) clasifica a los microorganismos del gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fcilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda la fiebre ondulante- que puede convertirse en crnica y producir complicaciones graves que afectan a los msculos esquelticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. A menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se adquiere por va oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es la ingestin de productos lcteos contaminados. Los veterinarios y granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, estn expuestos a riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de ms fcil adquisicin en el laboratorio, y se deben observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como los productos del aborto. Existen recomendaciones especficas que han de seguirse con materiales infectados por Brucella (para ms detalles ver las referencias 1, 28, 67, 68 y el Captulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de microbiologa). La manipulacin en el laboratorio de cultivos vivos o de material animal contaminado es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contencin 3 o superior, como se indica en el Captulo I. 1. 6, para reducir la exposicin ocupacional. Para manejar grandes cantidades de Brucella se recomienda tambin un nivel de contencin 3, como mnimo. La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero Brucella estn estrechamente relacionados, y se ha propuesto (aunque an no est aceptado por el Subcomit de Taxonoma) que el gnero contenga una sola especie de la que las especies clsicas (abortus, melitensis, etc.), que seran entonces meros biotipos (para una revisin, ver la referencia 36). Sin embargo existen diferencias reales entre las principales variantes en cuanto a preferencia de hospedadores y a la epidemiologa, as como evidencias moleculares de variaciones genmicas. Desde el punto de vista prctico resulta conveniente mantener la clasificacin de las seis especies clsicas: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se subdividen en biotipos por propiedades de cultivo y serolgicas (ver Cuadros 1 y 2 al final de este captulo). En la ltima dcada se han aislado cepas de Brucella de mamferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las anteriores especies reconocidas. Hay investigaciones en curso para establecer su posicin correcta en la taxonoma del gnero y se ha propuesto que podran clasificarse en dos nuevas especies, B. cetaceae y
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B. pinnipediae (10, 18). Por ltimo, Brucella muestra una estrecha relacin gentica con patgenos y simbiontes de plantas de los gneros Agrobacterium y Rhizobium, as como con patgenos animales (Bartonella) y con bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Todos los abortos en el ganado bovino deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberan investigarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque la historia del rebao puede servir de ayuda. El diagnstico inequvoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificacin de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el anlisis bacteriolgico, el diagnstico puede basarse en mtodos serolgicos. No existe una prueba nica que permita la identificacin de Brucella. Normalmente se necesita una combinacin de las caractersticas de crecimiento y mtodos serolgicos y bacteriolgicos.
1.
a)
Identificacin del agente (1, 28)

Mtodos de tincin
El gnero Brucella est formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0,6-1,5 m de largo por 0,50,7 m de ancho. Normalmente aparecen aislados, y con menos frecuencia en pares o en grupos pequeos. La morfologa de los microorganismos del gnero Brucella es bastante constante aunque en cultivos viejos se observan formas pleomrficas. No es una bacteria mvil. No forma esporas ni flagelos, ni fimbrias o cpsulas verdaderas. Los microorganismos del gnero Brucella son Gram negativos y no suelen mostrar tincin bipolar. No son verdaderamente bacterias cido-alcohol resistentes, pero resisten a la decoloracin por cidos dbiles y se tien de rojo por la modificacin de Stamp del mtodo de ZiehlNeelsen. ste mtodo constituye el procedimiento normal para el examen de frotis de rganos o lquidos biolgicos, que se fijan previamente con calor o etanol, y por este mtodo los microorganismos se tien de rojo frente a un fondo azul. Tambin puede utilizarse una tcnica basada en un anticuerpo conjugado a un fluorocromo o marcado con peroxidasa (53). La presencia de microoorganismos intracelulares con morfologa de Brucella, dbilmente resistentes a cidos, o inmunoespecficamente teidos, es una evidencia preliminar de brucelosis. Sin embargo, estos mtodos presentan una baja sensibilidad en la leche y en productos lcteos donde los microorganismos del gnero Brucella se presentan a menudo en nmero bajo, y donde la presencia de glbulos de grasa impide frecuentemente una interpretacin correcta. En la interpretacin de los resultados positivos por el mtodo de Stamp tambin debe tenerse en cuenta que otros microorganismos que causan aborto son difciles de diferenciar de Brucella, como Chlamydophila abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. Los resultados, tanto positivos como negativos, deben confirmarse por cultivo. Para demostrar el agente en diversas muestras biolgicas se pueden utilizar mtodos en desarrollo basados en sondas de ADN o en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (8).
b)
Cultivo
i) Medio basal El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en medio slido. En general, ste representa el mtodo ms satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas fcilmente reconocibles. Los medios slidos tambin limitan el establecimiento de mutantes no lisos y el desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de medios lquidos puede recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se dispone de un amplio rango de medios basales comercializados en forma deshidratada, por ejemplo el medio base para Brucella, agar tripcasa (o triptona)-soja (TSA). Es necesario aadir 2-5% de suero bovino o equino para el crecimiento de algunas cepas como el biotipo 2 de B. abortus, y muchos laboratorios lo aaden sistemticamente al medio basal con resultados excelentes, como en el caso del agar sangre (Oxoid) o agar Columbia (BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar suerodextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (1). El medio SDA es normalmente el preferido para la observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la leche, y de otros lquidos del cuerpo, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un medio bifsico no selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque las brucelas tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la biotipificacin por tcnicas bacteriolgicas convencionales. ii) Medios selectivos Todos los medios basales indicados antes se pueden emplear para la preparacin de medios selectivos. Se aaden antibiticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a Brucella. El medio selectivo ms difundido es el de Farrell (17), que se prepara aadiendo seis
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antibiticos a un medio basal. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades); vancomicina (20 mg). Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin embargo, a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido nalidxico y la bacitracina pueden tener efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. melitensis (34). Por ello, la sensibilidad del aislamiento de B. melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de Thayer-Martin. En esencia, el medio modificado de Thayer-Martin se puede preparar con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos los productos de Sigma Chemical, St Louis, EE. UU) (34). A diferencia de otros biotipos de B. abortus, el crecimiento de B. melitensis no es dependiente de la presencia de una atmsfera con 5-10% de CO2 (Cuadro 2). Como el nmero de microorganismos de Brucella en la leche, en el calostro y en algunas muestras tisulares, es probablemente menor que en material de abortos, se recomienda un enriquecimiento. En el caso de la leche, los resultados tambin mejoran por centrifugacin y cultivo de la capa cremosa y del precipitado. El enriquecimiento se puede realizar en medio lquido con suero-dextrosa, con caldo de tripticasa (o triptona)-soja o con caldo para Brucella suplementado con una mezcla de antibiticos que lleve al menos anfotericina B (1 g/ml) y vancomicina (20 g/ml) (concentraciones finales). El medio de enriquecimiento debe incubarse a 37C en atmsfera aerobia con 5-10% (v/v) de CO2 hasta 6 semanas, con subcultivos semanales a un medio slido selectivo. Si se prefiere, se puede utilizar un sistema bifsico con medio selectivo lquido y slido en la misma botella (tcnica de Castaeda) para reducir el subcultivo. Para el aislamiento de Brucella de la leche se recomienda a veces un medio selectivo bifsico que se compone del medio basal de Castaeda al que se aaden los siguientes antibiticos en la fase lquida (las cantidades que se indican son por litro de medio): sulfato de polimixina B (6000 unidades = 6 mh); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); anfotericina B (1 mg); vancomicina (20 mg); D-cicloserina (100 mg). Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y permitir el crecimiento de cepas difciles de cultivar, como el biotipo 2 de B. abortus, a partir de inculos pequeos. En medios slidos adecuados, las colonias de Brucella son visibles despus de 2 das de incubacin. A los 4 das las colonias son redondas, de 1-2 mm de dimetro, con bordes lisos. Son translcidas y de color miel plido a la luz del da en medio transparente. Vistas desde arriba son convexas y de color blanco perla. Posteriormente las colonias se hacen ms grandes y ligeramente ms oscuras. Los cultivos lisos de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R). Las colonias son entonces mucho menos transparentes, presentan una superficie mate ms granular y el color vara de blanco mate a marrn con luz reflejada o trasmitida. La comprobacin de esta transicin se realiza fcilmente por tincin con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo plido. Si las colonias son lisas deben probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con antisueros monoespecficos contra los antgenos de superficie A y M. En el caso de colonias rugosas, las colonias deben probarse con antisuero contra el antgeno R de Brucella. Por lo general, los cambios de morfologa colonial se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades serolgicas y/o en la sensibilidad a los fagos. La aglutinacin positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificacin preliminar de que el aislado corresponde a Brucella. La identificacin posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia. iii) Toma y cultivo de muestras Para el diagnstico de la brucelosis animal mediante cultivo, la eleccin de las muestras depende en general de los sntomas clnicos observados. Las muestras ms adecuadas incluyen fetos abortados (contenido estomacal, bazo y pulmones), membranas fetales, descargas vaginales (frotis), leche, semen y lquidos artrticos o de los higromas. Los tejidos preferidos para cultivo de las canales animales son los del sistema retculo-endotelial (ganglios linfticos de la cabeza, mamarios y genitales, y el bazo), el tero inmediatamente antes o despus del parto, y las ubres. El crecimiento aparece generalmente despus de 2-3 das, pero no se deben desechar los cultivos como negativos hasta despus de 810 das. Tejidos: Las muestras se toman aspticamente con instrumentos estriles y se maceran con un Stomacher o en un homogenizador de tejidos con una pequea cantidad de solucin salina estril tamponada con fostato (PBS), antes de inocularlas en medios slidos. Descargas vaginales: Una fuente excelente para recoger Brucella es un frotis vaginal tomado despus del aborto o del parto, y es menos arriesgado para el personal que el material del aborto. El frotis se extiende sobre los medios slidos. Leche: Las muestras de leche deben recogerse con limpieza despus de lavar y secar toda la ubre y desinfectar los pezones. Es esencial que las muestras contengan leche de todas las partes, y se deben tomar 10-20 ml de cada cuartern. Los primeros chorros se desechan y la muestra se recoge directamente en un recipiente estril. Debe tenerse cuidado en evitar el contacto entre la leche y las
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manos del ordeador. La leche se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos en tubos cerrados (para evitar el riesgo de formacin de aerosoles que contaminen al personal), y se extienden la capa cremosa y el precipitado sobre los medios slidos, por separado o conjuntamente. Si las brucelas estn presentes en la leche completa, su nmero suele ser muy bajo y es improbable el aislamiento a partir de tales muestras. Derivados lcteos: Los productos lcteos, como los quesos, deben cultivarse en los medios descritos arriba. Como es probable que estos materiales contengan un nmero pequeo de microorganismos, se recomiendan cultivos de enriquecimiento. Se necesita que las muestras estn homogenizadas cuidadosamente antes del cultivo, despus de haberlas sometido a un triturador de tejidos, a un Stomacher o a una batidora elctrica con un volumen adecuado de PBS estril. Deben cultivarse las capas superficiales (corteza y regin adyacente) y el interior del producto. Como las brucelas viven, crecen y desaparecen rpidamente, su distribucin por las diferentes partes del producto vara en funcin de las condiciones fsico-qumicas locales relacionadas con la tecnologa especfica del proceso. Despus de la toma, todas las muestras deben enfriarse rpidamente y transportarse al laboratorio por el mtodo ms rpido. A su llegada, la leche y las muestras de tejido deben congelarse si no se cultivan de inmediato. El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sean absolutamente necesarios, aunque a veces constituyen el nico medio para detectar la presencia de Brucella, sobre todo cuando las muestras estn muy contaminadas o contienen un nmero bajo de microorganismos del gnero Brucella. La inoculacin animal puede ser subcutnea o a travs de la piel afeitada de cobayas o, con preferencia, intravenosa en ratones. Este trabajo debe realizarse en condiciones de bioseguridad como se indica en el Captulo I.1.6. Los bazos de los ratones se cultivan 7 das despus de la inoculacin y, en el caso de los cobayas, se somete una muestra de suero a pruebas especficas a las 3 y 6 semanas de la inoculacin, y a continuacin se cultivan los bazos.
c)
Identificacin y tipificacin
Cualquier colonia con la morfologa similar a las de Brucella debe analizarse por la tincin de Gram (o por la coloracin de Stamp). Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de sensibilidad a los fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin que se describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la morfologa de las colonias son el mtodo de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o el mtodo de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta (1). La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una combinacin de las siguientes pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa, oxidasa y catalasa, y la prueba de aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La identificacin de especies y de biotipos requiere pruebas ms elaboradas (como la lisis por fagos y la aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A, anti-N anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en laboratorios de referencia con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un sistema de tipificacin fgica que, con suficiente experiencia, permite identificar especies lisas y rugosas de Brucella. No obstante, algunas propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S (detectada por papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina bsica y tionina a concentraciones finales de 20 g/ml, se detectan por pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados moderadamente equipados (ver Cuadros 1 y 2 al final de este captulo). Cuando se envan cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para tipificacin, es esencial seleccionar cepas lisas. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn de rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de rosca. Tambin deben enviarse cepas suspendidas en medio lquido (por ejemplo en el medio de transporte de Ames) pero esto puede suponer una oportunidad para el establecimiento de mutantes rugosos. i) Brucella est situada entre las bacterias ms peligrosas con las que se trabaja, por el riesgo que presenta de producir infecciones adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella, las tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. Deben envolverse con papel adsorbente o con lana de algodn, sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un contenedor rgido de acuerdo con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA) para el envo de muestras peligrosas (25). Estas regulaciones se resumen en el Captulo I.1.1. Tcnicas de muestreo. Como los cultivos de Brucella son infecciosos, se designan UN2814 y se debe realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Los requisitos para enviar muestras sospechosas son similares y se deben repasar las regulaciones de la IATA antes del envo. Tambin deben seguirse otras directrices nacionales e internacionales (1, 28, 67, 68). Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo, debe de contactarse con el laboratorio receptor para determinar si se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la capacidad de
ii)
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realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras atraviesan las fronteras nacionales, probablemente se necesitar un permiso de importacin que debe obtenerse antes de despachar la muestra (ver Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6. Transferencia internacional y contencin de patgenos de origen animale en el laboratorio).
d)
Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos

La PCR desarrollada recientemente supone un mtodo adicional de deteccin e identificacin de especies de Brucella (8). Pese al alto grado de homologa del ADN dentro del gnero Brucella, se han desarrollado varios mtodos que permiten, hasta cierto punto, la diferenciacin entre especies y algunos de sus biotipos, como la PCR, el anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin (RFLP) y la hibridacin tipo Southern (para una revisin, ver las referencias 8 y 36). Se ha desarrollado tambin una electroforesis en campo pulsante que permite la diferenciacin entre varias especies de Brucella (26, 35). Sin embargo, ninguno de estos mtodos se ha evaluado y estandarizado por completo y no son de distribucin amplia.
e)
Identificacin de cepas vacunales

La identificacin de las cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y B. melitensis cepa Rev.1, depende de pruebas adicionales. Brucella abortus S19 presenta las propiedades normales de un biotipo 1 pero no requiere CO2 para crecer, ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul tionina (2 g/ml) o i-eritritol (1mg/ml) (concentraciones finales), y presenta una elevada utilizacin de L-glutamato (1). Brucella melitensis cepa Rev.1 tiene las propiedades normales de un biotipo 1 de dicha especie pero crece mucho ms lentamente en medios ordinarios, no crece en presencia de fucsina bsica, ni con tionina (2 g/ml) o bencilpenicilina (3 g/ml) (concentraciones finales), pero crece en presencia de de estreptomicina a 2,5 o 5 g/ml (5 UI/ml) (1, 11, 12). Brucella abortus cepa RB51 se identifica por varias propiedades: morfologa rugosa, crecimiento en presencia de rifampicina (250 g por ml de medio), e incapacidad para producir el polisacrido O (OPS) (56). La incapacidad para producir OPS se puede demostrar haciendo reaccionar colonias RB51 con anticuerpos monoclonales (MAbs) especficos contra OPS, en ensayos puntuales o por inmunotransferencia (53, 56). Un modo indirecto de demostrar la ausencia de OPS es inyectar 4 x 108 microorganismos RB51 viables en ratones BALB/c y determinar la induccin de anticuerpos anti-OPS; la serologa ser negativa (56). Las cepas vacunales S19, Rev.1 y RB51 se pueden identificar utilizando PCRs especficas (8, 9, 55, 63).
2.
Pruebas serolgicas
Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas, presentando limitaciones en el anlisis de animales individuales (22, 42). Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se describen en esta captulo son mtodos estandarizados y validados, con caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilizacin de reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de comparacin respecto a la realizacin esperada del diagnstico. Debe resaltarse que la prueba de sueroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijacin de complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el diagnstico y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas diagnsticas de algunos inmunoenzimoensayos (ELISAs) y la prueba de polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y, como son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su utilizacin (44, 69). Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el anlisis las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a probar utilizando una estrategia confirmativa adecuada. En otras especies, como por ejemplo en bfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), y camellos (Camelus dromedarius, C. bactrianus) la infeccin por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden
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utilizarse los mismos procedimientos serolgicos (40), pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado (19, 20).
Sueros de Referencia
Los estndares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos los dems estndares. Estos estndares de referencia estn a disposicin de los laboratorios nacionales de referencia y deben emplearse para establecer estndares secundarios o nacionales frente a los que pueden prepararse otros de trabajo para utilizacin en el diagnstico diario rutinario de laboratorio. Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Estndar Internacionales 1 . Su empleo favorece la armonizacin internacional de las pruebas de diagnstico y la estandarizacin de antgenos (69): Para RBT y FC se emplea el suero estndar internacional de la OIE (OIEISS, antes designado Segundo suero anti-Brucella abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales para la prueba de fijacin del complemento). Adems, se dispone de tres sueros estndar de la OIE para ELISA. Son tambin de origen bovino y comprenden un estndar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), otro dbilmente positivo (OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS).
Produccin de clulas
En la produccin de antgenos para diagnstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de Brucella abortus (Weybridge) (S99) (ver direccin en la nota 1 a pie de pgina) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3) 2 . Debe destacarse que el antgeno preparado de una de estas cepas tambin se utiliza en las pruebas para infeccin por B. melitensis o B. suis. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solucin salina con 0,1% (p/v) de acriflavina. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de B. abortus biotipo 1 que son independientes de CO2. Los cultivos originales de siembra se cultivan para producir un lote de inculo que debe tener las propiedades de estas cepas, y se conservan por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Para la produccin de antgeno, el inculo de siembra se utiliza para inocular varios tubos de agar inclinado con medio de infusin de patata que se incuban a 37C durante 48 horas. Los medios slidos SDA y TSA, con adicin de 5% de suero equino o suero de ternero neonato y 0,1% de extracto de levadura, son satisfactorios con tal de que se utilice un inculo adecuado como se recomienda arriba. El crecimiento se comprueba respecto a pureza, se resuspende en PBS estril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar frascos Roux con medio slido de infusin de patata o con glicerol-dextrosa. stos se incuban luego a 37C durante 72 horas con la superficie inoculada hacia abajo. Se prueban muestras del crecimiento de cada frasco para pureza por la tincin de Gram, y los microorganismos se recogen aadiendo a cada frasco 50-60 ml de solucin salina con fenol (0,5% de fenol en una solucin de cloruro sdico al 0,85%). Los frascos se agitan, se decanta la suspensin, y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos. Despus de una prueba de viabilidad, el antgeno se conserva a 4C. Alternativamente, las clulas se pueden producir en medio lquido o por cultivo continuo en un fermentador (24), en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona de grado elevado (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato sdico (9 g) y fosfato bisdico (3,3 g). El pH inicial es 6,6 pero tiende a subir a 7,2-7,4 durante el crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formacin de clulas anormales o disociadas. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireacin y agitacin vigorosas y el ajuste del pH a 7,2-7,4 por adicin de HCl 0,1 M. El inculo de siembra se prepara como se describi anteriormente. El cultivo se incuba a 37C durante 48 horas. El cultivo continuo se puede mantener ms tiempo, pero se necesita ms experiencia para mantenerlo. Deben realizarse controles del proceso del crecimiento tanto en medio slido como lquido para confirmar la pureza, un nivel de viables que sea adecuado y la ausencia de formas rugosas disociadas. En la fase de recogida las clulas para utilizacin como antgeno deben probarse de nuevo para pureza y formas lisas. El cultivo se recoge por centrifugacin para precipitar los microorganismos, que se resuspenden en solucin salina con fenol. Los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos y se guardan a 4C. Deben formar suspensiones estables en solucin salina fisiolgica sin evidencias de
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Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA) Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Inglaterra. Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA), National Veterinary Services Laboratories (NVSL), 1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, EE. UU.
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autoaglutinacin. Con las suspensiones se debe de realizar una prueba de viabilidad sin evidenciar crecimiento despus de una incubacin de 10 das a 37C. El volumen de clulas empaquetadas (PCV) presentes en las suspensiones inactivadas puede determinarse centrifugando volmenes de 1 ml en tubos Wintrobe a 3.000 g durante 75 minutos.
a)
Pruebas de antgeno tamponado de Brucella (Prueba prescrita para el comercio internacional) Prueba del rosa de bengala
Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza antgeno coloreado con rosa de bengala y tamponado a bajo pH, normalmente 3,65 + 0,05 (37). Produccin de antgeno
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de B. abortus S99 o S1119-3, recogidas por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y resuspendindolas uniformemente en solucin salina fenicada a razn de 1 g por cada 22,5 ml.(Nota: si se utiliza carboximetil celulosa sdica como agente sedimentante durante la preparacin del concentrado celular, los residuos insolubles deben eliminarse antes de la tincin filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de rosa de bengala (CI No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada, y la mezcla se agita 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra por lana de algodn y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas teidas, que a continuacin se resuspenden uniformemente a razn de 1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidrxido sdico disueltos en 353 ml de solucin salina con fenol ms 95 ml de cido lctico, que se ajusta a 1.056 ml con solucin salina fenicada). El color de esta suspensin debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05. Despus de la filtracin por lana de algodn, la suspensin se filtra dos veces a travs de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV de aproximadamente 8%, dependiendo de la estandarizacin final frente a un suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El antgeno nunca debe congelarse. Cuando se utiliza en la prueba estndar, el antgeno RBT debe dar una reaccin positiva clara con dilucin 1/45 del OIEISS diluido en 0,5% de solucin salina con fenol, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin es conveniente comparar la reaccin de antgeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un conjunto de sueros definidos. i) Procedimiento de la prueba Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 + 4C); solo debe sacarse del refrigerador el antgeno suficiente para las pruebas del da. Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o en una placa para hemaglutinacin de la OMS. Agitar bien la botella de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo volumen de antgeno prximo a la gota de suero. Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno (usando un porta limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reaccin es oval o circular, respectivamente) Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4 minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva. Antes de las pruebas de cada da se debe probar un suero control que origine una reaccin positiva mnima para comprobar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces origina una reaccin positiva debido a vacunacin con S19 o a reacciones positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras pruebas como la investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas se producen muy raramente, sobre todo debido a fenmenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o volviendo a probarla despus de un cierto tiempo. Sin embargo, la RBT parece adecuada como una prueba de anlisis para detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en rebaos libres de brucelosis.
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Prueba de aglutinacin tamponada en placa

Produccin de antgeno
El antgeno para la BPAT se prepara a partir de B. abortus S1119-3 siguiendo el procedimiento descrito por Angus & Barton (2). Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las dos soluciones se almacenan por separado durante 24 horas, y luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y se guardan en un refrigerador durante ms de 6 meses antes de uso. La mezcla de colorantes slo puede usarse entre 6 y 12 meses despus de la preparacin inicial. El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidrxido sdico (150 g) en 3-4 litros de solucin salina estril con fenol. A esta solucin se aade cido lctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros aadiendo solucin salina estril con fenol. El pH de la solucin debe estar entre 3,63 y 3,67. Las clulas empaquetadas de Brucella abortus S1119-3 se diluyen a una concentracin de 250 g/litro en solucin salina con fenol; se aaden 6 ml de colorante por litro de suspensin celular, y la mezcla se agita antes de filtrar por algodn absorbente estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y las clulas precipitadas se resuspenden a continuacin a una concentracin de 50 g/100 ml en diluyente tamponado (como se describe antes). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y despus se diluye aadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de clulas resuspendidas (es decir, a una concentracin final de 50 g de clulas empaquetadas/400 ml de diluyente tamponado). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 20-24 horas antes de que la concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche antes de uso. Pendientes de pruebas sobre el control final de calidad, el antgeno se guarda a 4C hasta su empleo. El antgeno tiene una caducidad de 1 ao y no se debe congelar. El pH del antgeno tamponado en placa debe ser 3,70 + 0,03 y el pH de una mezcla suero-antgeno a una proporcin 8:3 debe ser 4,02 + 0,04. La suspensin al 11% de clulas teidas debe ser azul-verdosa. Cada lote de antgeno tamponado en placa debe probarse con al menos 10 sueros de reactividad dbil y comparar los resultados con uno o ms lotes previos de antgeno. Si es posible, los lotes de antgeno deben compararse con el antgeno estndar preparado por el NVSL, USDA (ver nota 2 a pie de pgina para direccin). No hay sin embargo establecido un procedimiento de estandarizacin internacional para uso con el OIEISS. Procedimiento de la prueba
Se mezcla suero (80 l) con 30 l de antgeno en una placa de vidrio marcada con cuadros de 4 x 4 cm. Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres veces para asegurar la dispersin homognea de los reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda. Se extrae la placa y se mueve como antes, incubando otros 4 minutos. Despus, se extrae la placa, se mueve y se observa la aglutinacin (1). Cualquier reaccin visible se considera positiva. Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpo inducido por la vacuna, y las muestras positivas deben volverse a probar con pruebas confirmativas. Pueden producirse reacciones negativas falsas, debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse diluyendo el suero o volviendo a probar despus de cierto tiempo.
b)
Prueba de fijacin de complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)

La FC es una prueba confirmativa ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realizacin y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. Existen muchas variaciones de FC, pero la prueba ms adecuada se realiza en formato de microtitulacin. Para la incubacin de suero, antgeno y complemento, se puede utilizar fijacin en caliente o en fro: 37C durante 30 minutos o 4C durante 14-18 horas. Varios factores influyen en la eleccin del mtodo: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja calidad es ms evidente con la fijacin en fro, mientras que a 37C aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar varias diluciones para cada muestra. Se han propuesto varios mtodos para FC que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (SRBCs) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensin al 2,5% o al 3%). Los SRBCs estn sensibilizados con un volumen igual de suero anti-SRBC de conejo diluido hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentracin mnima necesaria para producir un 100% de lisis de SRBCs en presencia de una solucin titulada de complemento de cobaya. El ltimo se titula independientemente (en presencia o ausencia de antgeno, segn el mtodo) para determinar la cantidad de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de SRBCs sensibilizados por unidad de
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volumen de una suspensin estndar; stas se definen como la unidad hemoltica de complemento al 50% o al 100%/ dosis hemoltica mnima (CH MHD50 CH MHD100), respectivamente. Se suele recomendar titular el complemento antes de cada serie de pruebas, siendo preferible un micromtodo para la determinacin ptima de CH50. Normalmente se utilizan en la prueba 1,25-2 CH100 o 5-6 CH50. El diluyente estndar para la FC es solucin salina tamponada con barbital (veronal). Se prepara con tabletas comerciales; alternativamente puede prepararse a partir de una solucin stock de cloruro sdico (42,5 g), cido barbitrico (2,875 g), dietil barbiturato sdico (1,875 g), sulfato magnsico (1,018 g) y cloruro clcico (0,147 g) en 1 litro de agua destilada y se diluye antes de uso aadiendo cuatro volmenes de una solucin de gelatina al 0.04%. Produccin de antgeno
Existen numerosas variaciones de la prueba pero, cualquiera que sea el procedimiento, debe emplearse un antgeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o la S1119-3, y que est estandarizado frente al OIEISS. El antgeno para FC puede preparase por mtodos especiales (1, 24) o utilizar clulas enteras diluyendo la suspensin stock de modo que la PCV de la suspensin de antgeno concentrado para FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al OIEISS. El antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50% a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar tambin una fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una concentracin demasiado baja (o demasiado alta) de antgeno puede no producir un 100% de fijacin a diluciones ms bajas de suero. Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno, debe escogerse la suspensin de antgeno ms concentrada para evitar el fenmeno de prozona. La apariencia del antgeno a dilucin 1/100 debe ser la de una suspensin blanca, uniforme y densa, sin agregacin visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C durante 18 horas. No debe producir efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. El antgeno se guarda a 4C y no debe congelarse. Procedimiento de la prueba (ejemplo)
Los sueros problema sin diluir y los estndar adecuados de trabajo se inactivan durante 30 minutos en una bao de agua a 60C + 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con solucin salina tamponada con veronal, se pueden inactivar a 58C + 2C durante 50 minutos. En general slo se prueba rutinariamente una dilucin del suero (1/4 o 1/5, dependiendo del procedimiento escogido de FC), pero se recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona. Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica se realiza normalmente del modo siguiente: i) En el pocillo de la primera, segunda y tercera filas, se colocan 25 l de suero problema inactivado diluido. La segunda fila es un control anticomplemento para cada suero. Se aade a los pocillos de la primera fila 25 l de tampn FC (controles anticomplemento) para compensar la falta de antgeno. A todos los otros pocillos se aade 25 l de tampn FC excepto a los de la segunda fila. A continuacin se hacen diluciones dobles seriadas transfiriendo volmenes de 25 l de suero de la tercera fila en adelante. A cada pocillo, excepto en la primera fila, se aade 25 l de antgeno, diluido a la concentracin de trabajo, y 25 l de complemento, diluido al nmero de unidades requerido. Se establecen controles con diluyente slo, suero + complemento + diluyente, antgeno + complemento + diluyente, y complemento + diluyente, que contengan en cada caso 75 l de volumen total. En cada serie de pruebas debe probarse un suero control que d una reaccin positiva mnima para comprobar la sensibilidad en las condiciones de la prueba. Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos o durante toda la noche a 4C y se aade a cada pocillo un volumen de SRBCs sensibilizados (25 o 50 l dependiendo de la tcnica). Las placas se reincuban a 37C durante 30 minutos. Los resultados se leen despus de centrifugar las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4C y despus dejarlas en reposo a 4C durante 2-3 horas para permitir que sedimenten las clulas no lisadas. El grado de hemolisis se compara con estndares que correspondan a una lisis del 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis. La ausencia de actividad anticomplementaria se comprueba en la primera fila para cada suero.
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Estandarizacin de los resultados de la FC: Existe un sistema de unidades basado en el OIEISS. Este suero contiene 1000 UIFC (unidades internacionales de la prueba de fijacin de complemento) por ml. Si este suero se prueba por un mtodo determinado y origina un ttulo de, por ejemplo, 200 (50% de hemolisis), entonces el factor de un suero problema probado por el mismo mtodo se deduce de la frmula: 1000 x 1/200 x ttulo del suero problema = nmero de UIFC de anticuerpo en el suero problema por ml. El OIEISS contiene IgG especfica; los sueros estndar nacionales tambin deben depender de este isotipo para su actividad especfica de fijacin de complemento. Surgen dificultades en la estandarizacin porque diferentes tcnicas favorecen selectivamente la FC por diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Se recomienda que cualquier pas que use FC a escala nacional acuerde entre los diversos laboratorios que realizan la prueba el mismo mtodo para obtener el mismo nivel de sensibilidad. Para facilitar la comparacin entre pases, los resultados deben expresarse siempre en UIFC, calculadas en relacin con las obtenidas en una titulacin paralela con un suero estndar, que a su vez se calibra frente al OIEISS.
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Interpretacin de los resultados: Los sueros con un ttulo equivalente a 20 UIFC/ml o ms, se consideran positivos.
Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros volmenes y cantidades de reactivos con tal de que la prueba se calibre frente al OIEISS como se describe antes y que los resultados se expresen en UIFC/ml. La prueba FC es muy especfica. Sin embargo, como todas las pruebas serolgicas, a veces da un resultado positivo debido a vacunacin con S19 o a consecuencia de FPSR. En consecuencia, las reacciones positivas deben investigarse por estrategias confirmativas. Las hembras que se han vacunado con Brucella abortus S19 entre los 3 y 6 meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan una fijacin positiva con un ttulo de 30 o ms UIFC/ml cuando los animales se prueban a una edad de 18 meses o superior.
c)
Enzimoinmunoensayos (pruebas prescritas para el comercio internacional)

ELISA indirecto
Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando diferentes preparaciones antignicas, diversos conjugados de antiglobulina con enzimas, y varios substratos/cromgenos. Algunos IELISAs validados en ensayos amplios de campo se han comercializado y son muy utilizados. Para una homologacin internacional se deben usar los tres Sueros Estndar para ELISA de la OIE en los laboratorios nacionales de referencia para comprobar o calibrar el mtodo de la prueba en particular. La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica (OD) del Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto de la porcin lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo por debajo de la meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar siempre una reaccin positiva que est situado en la porcin lineal de la misma curva dosis-respuesta, justo por encima del umbral positivo/negativo. El suero negativo y el control de tampn deben originar reacciones que estn por debajo del umbral positivo/negativo (70). El umbral debe establecerse en la prueba con tcnicas adecuadas de validacin (ver Captulo I.1.3. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas). La prueba I-ELISA es muy sensible, pero a veces no es capaz de distinguir entre anticuerpos debidos a vacunacin por S19 u otros problemas de FPSR y los inducidos por cepas patgenas de Brucella. Por consiguiente, la prueba I-ELISA debe considerarse como una prueba de anlisis ms que como una prueba confirmativa con ganado vacunado o en rebaos afectados con problemas de FPSR. Respecto al antgeno, se deben utilizar preparaciones ricas en lipopolisacrido liso (sLPS). Existen varios mtodos para preparar un antgeno adecuado. En funcin de la disponibilidad y de las necesidades concretas se pueden emplear antiglobulinas mono o policlonales conjugadas con enzimas. Un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 bovina puede mejorar la especificidad an a costa de perder sensibilidad. El mtodo de la prueba que se describe a continuacin es un ejemplo que ha sido validado internacionalmente y utilizado por todo el mundo en proyectos financiados a nivel internacional de cooperacin tcnica e investigacin cientfica. El tampn para antigenizar es carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, que contiene carbonato monosdico (2,93 g) y carbonato bisdico (1,59 g) en 1 litro de agua (la azida sdica [0,2 g/litro] es opcional). El tampn de dilucin del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M, pH 7,2, que contiene ortofosfato
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bisdico (1,4 g), fosfato monopotsico (0,20 g), cloruro sdico (8,50 g) y Tween 20 al 0,05% disuelto en 1 litro de agua destilada (PBST). Este tampn tambin se usa como tampn de lavado. El conjugado utilizado en este ejemplo es un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 conjugado con peroxidasa de rbano (HRPO). La solucin base de substrato es perxido de hidrgeno al 3%. La solucin base de cromgeno es 0,16 M de 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) en agua destilada. El tampn del substrato es tampn citrato, pH 4,5, compuesto por citrato trisdico hidratado (7.6 g) y cido ctrico (4,6 g) disueltos en 1 litro de agua destilada. La solucin para detener la reaccin enzimtica es 4% de dodecil sulfato sdico (SDS). Produccin de antgeno (ejemplo)
El sLPS de B. abortus S1119-3 S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de clulas suspendidas a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66C. La mezcla se agita continuamente a 66C durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante 15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cnula larga y si es necesario los restos celulares se eliminan por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman No.1). El LPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato sdico. Despus de 2 horas de incubacin a 4C, el precipitado se recoge por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se resuspende en 80 ml de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4C. El sobrenadante se recoge por centrifugacin como antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente. A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160 ml del LPS crudo. Despus de agitar durante 10 minutos, el precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida que constituye el sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mnimo, dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se liofiliza. El LPS liofilizado se pesa, se reconstituye a una concentracin de 1 mg/ml en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6, y se sonica en un bao de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. A continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente. i) Procedimiento de la prueba (ejemplo) El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6 (o a una dilucin predeterminada por titulacin frente al suero estndar de la OIE para ELISA). Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de LPS, se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 30-45 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A los pocillos especificados se aaden 100 l de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene 7,5 mM de cido etiln diamino tetra-actico (EDTA) y 7,5 mM de cido etiln glicol tetra-actico (EGTA) (PBST/EDTA) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles, calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control del tampn. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST (no debe usarse PBS que contenga EDTA/EGTA con HRPO ya que inactiva el enzima). A cada pocillo se aade 100 l de conjugado (MAb M23) especfico para un eptopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina unido a HRPO y diluido en PBST y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de conjugado se elimina por cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de sustrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 [100 l/20 ml de tampn citrato] y 4,0 mM de ABTS [500 l/ 20 ml de tampn citrato]), las placas se agitan durante 10 minutos y el color desarrollado se determina en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como un 100% de positividad y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1,000 y 1,800) empleando la ecuacin: Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra problema)/absorbancia (control fuertemente positivo) x 100.
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Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles 3 el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba I-ELISA. Mediante este protocolo descrito para I-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser igual o mayor que los BBATs en pruebas con ganado infectado, y la especificidad diagnstica debe ser equivalente a la prueba FC en pruebas con ganado sin vacunar (22). Puede esperarse que la sensibilidad diagnstica en pruebas de ganado vacunado con S19 o en el caso de FPSR sea notablemente inferior a la prueba FC dependiendo de dnde se establezca el umbral de positividad/negatividad en el I-ELISA. ELISA competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los eptopos de la Brucella OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (33, 45, 58). Se realiza seleccionando un MAb con mayor afinidad que el anticuerpo con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el C-ELISA elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin cruzada (41, 66). El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones debidas a anticuerpo residual que se producen en respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular especificidad y afinidad influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier prueba basada en MAb, se debe considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptacin internacional y su utilizacin generalizada. Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. Para una homogenizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para ELISA para comprobar o calibrar el mtodo concreto. La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la zona lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente positivo debe dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin mnima). El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y utilizado con amplitud a nivel mundial en proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica con financiacin internacional. Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA. Produccin de antgeno (ejemplo)
El sLPS de B. abortus S1119-3 se prepara y se utiliza como para el I-ELISA. i) Procedimiento de la prueba El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin de LPS, se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 30-45 minutos a 37C. El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aaden 50 l de de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e inmediatamente otros 50 l de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin, por lo menos durante los 3 minutos iniciales. Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles, calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control del tampn. El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aade 100 l de conjugado comercial de IgG anti-ratn de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
ii)
iii)
iv)
Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, Animal Diseases Research Institute, 3851 Fallowfield Road, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
457
v)
El exceso de conjugado se elimina por cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de substrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 y 4,0 mM de ABTS), se agitan las placas durante 10 minutos y el color desarrollado se determina en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin. Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibicin del 0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la ecuacin: Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de tampn] x 100).
vi)
Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles el antgeno sLPS, pequeas cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA (ver direccin en nota 3 a pie de pgina). Mediante este protocolo descrito para C-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser equivalente a los BBATs y el I-ELISA en pruebas con ganado infectado (22, 43-45). La especificidad diagnstica del C-ELISA debe ser equivalente o superior a la de FC e I-ELISA en pruebas con ganado sin vacunar o en el caso de FPSR. La especificidad diagnstica de C-ELISA es mayor que la de FC e I-ELISA en pruebas con ganado vacunado con S19.
d)
Prueba de polarizacin de fluorescencia (prueba prescrita para el comercio internacional)

La FPA es una tcnica sencilla para determinar la interaccin antgeno/anticuerpo y puede realizarse en instalaciones de laboratorio o en el campo. Es una prueba homognea que no requiere la separacin de los compuestos analizados y que por tanto es muy rpida. En la fecha de publicacin, la FPA se ha propuesto como una prueba obligada para el comercio internacional. El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las molculas en solucin. El tamao molecular es el principal factor que influencia la velocidad de rotacin, con una relacin de proporcionalidad inversa. As, una molcula pequea gira ms deprisa que una grande. Si una molcula se marca con un fluorocromo, se puede determinar el tiempo de rotacin a travs de un ngulo de 68,5C midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y horizontales. Una molcula grande emite ms luz en un nico plano (ms polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz ms despolarizada. En la mayora de las FPAs, se marca con un fluorocromo un antgeno de pequeo peso molecular, inferior a 50 kD, y se aade suero u otro lquido problema para detectar la presencia de anticuerpo. Si estn presentes anticuerpos, la unin con el antgeno marcado provoca un descenso en su velocidad rotacional que puede medirse. Para el diagnstico de la brucelosis, se emplea como antgeno un fragmento de bajo peso molecular (media de 22 kD) del OPS del sLPS de B. abortus y se marca con isotiocianato de fluorescena. Este antgeno se aade a suero diluido o a sangre completa y en 2 minutos (para suero) o 15 segundos (para sangre) se obtiene una medida del contenido de anticuerpos mediante un analizador de polarizacin de fluorescencia (43). La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de 96 pocillos. El suero bovino se diluye 1/100 o, si se emplea sangre tratada con EDTA, a 1/50 (la sangre tratada con heparina aumenta la variabilidad de la prueba). El diluyente utilizado es Tris 0,01 M (1,21 g) que contiene cloruro sdico 0,15 M (8,5 g), 0,05% de Igepal CA630 (500 l) (antes denominado NP40) y 10 mM de EDTA (3,73 g) por litro de agua destilada, pH 7,2 (tampn Tris). Despus de mezclar, se obtiene una lectura inicial para determinar la dispersin de la luz con un analizador de polarizacin de fluorescencia (FPM). Se aade un antgeno titulado marcado adecuadamente (que por lo general origine una intensidad de 250.000-300.000), se mezcla y se obtiene con el FPM una segunda lectura a los 2 minutos para suero y a los 15 segundos para sangre. Una lectura superior al nivel umbral establecido (en miliunidades de polarizacin, mP) indica una reaccin positiva. Un nivel umbral tpico es 90-100 mP, aunque la prueba debe calibrarse localmente con un Suero Estndar de Referencia Internacional. Deben incluirse controles de suero fuertemente positivo, dbilmente positivo, y negativo, as como suero de animal vacunado con S19. Produccin de antgeno (ejemplo)
El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo 400 ml de cido actico al 2% (v/v), autoclavando la suspensim durante 15 minutos a 121C y eliminando los restos celulares por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. A continuacin, el sobrenadante se trata con 20 g de cido tricloroactico para precipitar protenas y cidos nucleicos. El
458
precipitado se elimina de nuevo por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El sobrenadante se dializa frente, al menos, 100 volmenes de agua destilada y se liofiliza. Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido sdico 0,1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37C durante 1 hora. Despus se aade 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una concentracin de 100 mg/ml en dimetil sulfxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1 x 10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera fraccin (despus de 10-15 ml de elucin con tampn) es verde fuerte, y despus se cambia el tampn a fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se eluyen 10-15 ml de buffer seguidos luego de 20-40 ml donde se obtiene el material verde fluorescente. Este ltimo material es el antgeno utilizado en FPA. La preparacin de antgeno se puede aumentar proporcionalmente. La cantidad de antgeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr una intensidad de fluorescencia de 250.000-300.000 en el FPM. El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a 4C en una botella opaca o se puede liofilizar en botellas opacas. Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno marcado para la investigacin y estandarizacin de procedimientos operativos relacionados con la obtencin de antgeno y la realizacin de FPA (para direccin, ver nota 3 a pie de pgina). i) Procedimiento de la prueba Se aade 1 ml de tampn Tris a tubos de vidrio de borosilicato de 10 x 75 mm y despus 10 l de suero o 20 l de sangre tratada con EDTA. Es importante mezclar bien. Se obtiene una lectura en el FPM para determinar la dispersin de la luz. Se aade al tubo un volumen de antgeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de 250-300 x 103 y se mezcla bien. Este volumen puede variar de lote a lote, pero en general es de unos 10 l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus de una incubacin a temperatura ambiente de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA. Una lectura superior al umbral predeterminado indica una reaccin positiva. En cada serie de pruebas se incluye un suero estndar de trabajo fuertemente positivo, otro dbilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estndar de la OIE).
ii)
iii) iv)
La sensibilidad y especificidad diagnstica de la FPA en la brucelosis bovina es casi idntica a las de CELISA. La especificidad diagnstica en ganado recientemente vacunado con S19 supera el 99% (19, 20, 43). Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. La FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y dbiles de la OIE suministren resultados positivos repetitivos.
3.
a)
Otras pruebas
Prueba cutnea de la brucelina
Una prueba inmunolgica alternativa es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse para analizar rebaos no vacunados siempre que se emplee una preparacin antignica purificada (libre de LPS) y estandarizada (por ejemplo, brucelina INRA). La prueba cutnea de la brucelina tiene una especificidad muy elevada, de modo que los animales sin vacunar que son serolgicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba de la brucelina deben considerarse animales infectados (15, 51). Adems, los resultados de esta prueba pueden ayudar a interpretar reacciones serolgicas que se consideran como FPSR debidas a infeccin por bacterias con reaccin cruzada, especialmente en reas libres de brucelosis (51, 54). Sin embargo, no todos los animales infectados reaccionan, por lo que esta prueba sola no es recomendable como prueba nica a efectos del comercio internacional. Es esencial utilizar una preparacin estandarizada y definida de brucelina que no contenga antgeno sLPS, ya que ste puede producir reacciones inflamatorias inespecficas o interferir con pruebas serolgicas
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posteriores. Una preparacin de ese tipo es la brucelina INRA preparada de una cepa rugosa de B. melitensis que est comercializada 4 . i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se inyecta intradrmicamente 0,1 ml de brucelina en el repliegue caudal, en la piel del costado lateral, o de un lado del cuello. La prueba se lee despus de 48-72 horas. El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con un calibrador vernier antes y despus de la inyeccin. Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente como un hinchamiento local e induracin. No obstante, las reacciones dudosas requieren una interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel de 1,5-2 mm debe considerarse como una reaccin positiva.
Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms especficas de la brucelosis (en animales no vacunados) el diagnstico no puede hacerse basndose solamente en reacciones intradrmicas positivas en unos cuantos animales de la manada, y debe apoyarse en una prueba serolgica fiable. La inoculacin intradrmica de brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune celular. Por tanto, en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre el mismo animal.
b)
Prueba de aglutinacin del suero

Aunque no se considera una prueba obligada o alternativa, la SAT se ha utilizado con eficacia durante muchos aos en programas de vigilancia y control de la brucelosis bovina. Su especificidad mejora notablemente si se aade EDTA al antgeno (21, 32, 46). El antgeno es una suspensin bacteriana en solucin salina con fenol (NaCl al 0,85% [p/v] y fenol al 0,5% [v/v]). No debe usarse formaldehdo. Los antgenos pueden presentarse en forma concentrada siempre que el factor de dilucin para uso se indique en la etiqueta de la botella. Para reducir el nivel de resultados positivos falsos se puede aadir EDTA a la suspensin antignica a una concentracin final en la prueba de 5 mM. En consecuencia, el pH de 7,2 debe reajustarse en la suspensin de antgeno. El OIEISS contiene 1000 UIs de aglutinacin. El antgeno se prepara sin referencia a la concentracin celular, pero su sensibilidad debe estandarizarse con relacin al OIEISS de modo que el antgeno produzca el 50% de aglutinacin con una dilucin srica final de 1/600 a 1/1.000, o el 75% con una dilucin srica final de 1/500 a 1/750. Tambin se aconseja comparar la reactividad de lotes de antgenos nuevos con los estandarizados previamente utilizando un juego de sueros definidos. La prueba se realiza en tubo o en microplaca. La mezcla de antgeno con las diluciones de suero debe incubarse 16-24 horas a 37C. Si la prueba se realiza en microplaca, el tiempo de incubacin puede acortarse a 6 horas. Para cada suero debe prepararse un mnimo de tres diluciones para evitar respuestas negativas debidas a fenmenos de prozona. La dilucin de sueros sospechosos debe llevarse a cabo de modo que la lectura de la reaccin al lmite de positividad se haga en un tubo medio (o pocillo en el mtodo de microplaca). Interpretacin de los resultados: El grado de aglutinacin de Brucella por un suero debe expresarse en UI por ml. Un suero con 30 UI o ms, se considera positivo.
c)
Pruebas de hapteno nativo y poliB

Las pruebas de hapteno nativo y poliB son pruebas confirmativas 5 usadas con xito en un programa de erradicacin en combinacin con RBT como prueba de anlisis (3). La sensibilidad ptima se obtiene por un sistema de inmunodifusin radial inversa donde el suero difunde en un gel hipertnico que contiene el polisacrido (14). No obstante, el procedimiento de doble difusin en gel tambin resulta til (30, 31). Los terneros vacunados subcutneamente con la dosis estndar de S19 a los 35 meses de edad son negativos a los 2 meses de la vacunacin, y el ganado adulto vacunado subcutneamente 45 meses antes con dosis reducida de S19 no da reacciones positivas a menos que resulten infectados y excreten la vacuna en la leche (29). La vacunacin conjuntival (tanto en jvenes como en adultos) reduce el tiempo de obtencin de una respuesta negativa en las pruebas con hapteno nativo y poliB. Una caracterstica notable
4 5
Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia. El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigacin Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Espaa.
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de la prueba RID es que un resultado positivo se correlaciona con la excrecin de Brucella, como se ha demostrado en ganado infectado experimentalmente (29) y en ganado con infeccin natural sometido a tratamiento antibitico (27).
d)
Pruebas en la leche
Un medio eficaz de analizar vacas lecheras es probar la leche de los tanques de recogida. De estas fuentes se puede obtener leche de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y habitualmente estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas las vacas que aportan leche deben probarse individualmente a partir de muestras de sangre. La prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta particularmente til para probar grandes poblaciones de animales. La prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de ELISA. I-ELISA en leche
Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. Se han comercializado varios I-ELISAs que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos de una armonizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el mtodo particular de la prueba en cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar fuertemente positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se prueban generalmente a diluciones mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es similar a lo descrito para suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede usarse con muestras de suero. Prueba del anillo de leche
En animales lactantes, la prueba MRT puede emplearse para analizar brucelosis en rebaos. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mastitis. Por tanto, no se recomienda la utilizacin de esta prueba en granjas muy pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba. Produccin de antgeno
El antgeno para MRT se prepara de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o S1119-3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a 4C y se resuspenden en solucin de colorante hematoxilina. Se emplean varios mtodos satisfactorios; un ejemplo es el siguiente: se aaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de etanol, a una solucin de sulfato amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol. A la solucin se aaden 2 ml de iodato sdico al 10% (p/v) recin preparado. Despus de 30 minutos a temperatura ambiente, la solucin de color prpura oscuro se aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico al 10% (p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin se deja envejecer mantenindola a temperatura ambiente durante 45-90 das en la oscuridad. Antes de uso, la solucin de colorante se agita y se filtra por lana de algodn. Las clulas empaquetadas se suspenden en la solucin de colorante a razn de 1 g por 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48 horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80C durante 10 minutos). Las clulas teidas se depositan por centrifugacin y se lavan tres veces con una solucin de cloruro sdico (6,4 g), cido lctico al 85% (1,5 ml) e hidrxido sdico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua destilada, a pH final de 3,0. Las clulas lavadas se resuspenden a razn de 1 g en 27 ml de un diluyente que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0 por adicin de cido ctrico 0,1 M (aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisdico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4C durante 24 horas. La mezcla se filtra por lana de algodn, se comprueba el pH, y se determina el PCV ajustndolo aproximadamente al 4%. La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reaccin preparado diluyendo un suero positivo en leche. El antgeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilucin 1/500 sea positiva y una dilucin 1/1.000 sea negativa. El antgeno se guarda a 4C sin congelar. El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro. Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un animal sin brucelosis, el antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de leche sin formar depsitos ni coloracin en la capa cremosa.
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Procedimiento de la prueba
La prueba se lleva a cabo sobre muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 2-3 das a 4C antes de uso. La prueba se lleva a cabo aadiendo 30-50 l de antgeno a 1-2 ml de leche completa (el volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes). La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitacin violenta o guardadas por ms de 72 horas. Normalmente, las mezclas de leche/antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con estndares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubacin durante la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin ms fcil. Una reaccin fuertemente positiva se indica por la formacin de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones. La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

C1. Brucelina
La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de B. melitensis B115 rugosa. Esta preparacin no provoca la formacin de anticuerpos reactivos en BBAT, FC o ELISA.
1.
a)
Control de inculos
Caractersticas del inculo
La produccin de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como se describe para los antgenos y las vacunas. El inculo original de la cepa B115 de B. melitensis para produccin de brucelina 6 debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse por liofilizacin o congelacin en nitrgeno lquido. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B. melitensis y no producir LPS liso de Brucella. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antgenos proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella.
b)
Mtodo de cultivo (1)

La cepa B115 de Brucella melitensis crece mejor en el medio de cultivo descrito antes para cultivo en fermentador. Puede crecer en fermentador por el mtodo continuo o discontinuo o en matraces colocados en un agitador. Deben realizarse comprobaciones de pureza en cada recogida aislada y el organismo debe encontrase en la fase rugosa.
c)
Validacin como un reactivo de diagnstico in vivo

Estudios de laboratorio y de campo realizados en Francia, han confirmado que la brucelina INRA es segura, no txica y de accin especfica. La preparacin contiene un 50-75% de protenas, principalmente de bajo peso molecular, y un 15-30% de carbohidratos. No contiene antgenos LPS. La brucelina INRA no provoca repuestas inflamatorias en animales no sensibilizados, y no es por s misma un agente sensibilizante. No provoca anticuerpos reactivos en las pruebas serolgicas estndar para brucelosis. Ms del 90% de los pequeos rumiantes infectados por B. melitensis manifiestan hipersensibilidad retardada a la brucelina INRA en alguna fase. La preparacin no es recomendable como un agente de diagnstico para animales individuales, pero puede ser til para el anlisis de poblaciones. Se suministra a los pequeos rumiantes en dosis de 100 g por va intradrmica e induce una reaccin local de hipersensibilidad retardada que es visible a las 48-72 horas en animales sensibilizados. Tanto los animales vacunados como los infectados dan reaccin positiva.
2.
Mtodo de produccin (1)
Las clulas de Brucella melitensis B115 se inactivan despus del cultivo elevando la temperatura a 70C durante 90 minutos, se enfran a 4C, y se recogen por centrifugacin a 9.000 g durante 15 minutos a 4C. Las clulas se lavan con agua destilada estril y fra y se deshidratan precipitndolas con tres volmenes de acetona a 20C, y luego se deja reposar a 20C durante 24-48 horas. Despus de lavados repetidos con acetona fra y de un lavado final con dietil ter, las clulas se secan sobre cloruro clcico y se mantienen a 4C. Las clulas secas se someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sdico estril al 2,5% hasta una concentracin
Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.
462
final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 das a 4C. Las clulas bacterianas se eliminan por centrifugacin como antes y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen por ultrafiltracin con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita aadiendo tres volmenes de etanol fro. La mezcla se mantiene a 4C durante 24 horas y el precipitado se recoge por centrifugacin, se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. Despus de centrifugar a 105.000 g durante 6 horas a 4C, el sobrenadante, que es la brucelina sin estandarizar, se analiza en cuanto a protenas y carbohidratos. Puede liofilizarse como material global o despus de distribuirla en sus recipientes finales.
3.
Control del proceso
El extracto crudo de brucelina debe probarse para esterilidad despus de la extraccin con acetona para comprobar la inactivacin de las clulas de Brucella, y de nuevo al final del proceso para comprobar alguna posible contaminacin. Deben determinarse el pH y la concentracin de protena y realizarse pruebas de identidad sobre el material global antes del llenado de los recipientes finales.
4.
a)
Control de lotes
Esterilidad
Las preparaciones de alrgenos deben probarse para esterilidad como se describe en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estndar de esterilidad y tambin deben probarse las preparaciones para toxicidad anormal. Se inyectan intraperitonealmente dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. Tambin se inyectan subcutneamente cinco ratones normales con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 das y no debe haber reaccin local o generalizada a la inyeccin. La capacidad dermonecrtica se examina por inoculacin intradrmica de 0,1 ml del producto examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. No debe observarse reaccin cutnea. La ausencia de sensibilizacin alrgica o serolgica se comprueba por inoculacin intradrmica de tres cobayas albinos normales, tres veces cada 5 das, con 0,1 ml de una dilucin 1/10 de la preparacin examinada. Se suministra una inyeccin similar 15 das despus a los mismos tres animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se han inyectado previamente. Los animales no deben convertirse en seropositivos cuando se analizan 24 horas despus de la ltima inyeccin por las pruebas estndar de brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada.
c)
Potencia
La potencia de las preparaciones de brucelina se determina por inyeccin intradrmica de dosis graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado por inoculacin subcutnea con 0,5 ml de brucelina de referencia 7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la reaccin eritematosa a las 24 horas y se calcula el ttulo por comparacin con una brucelina de referencia 8 . Este mtodo solo es vlido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que el alrgeno sensibilizante. Se ha descrito la estandarizacin inicial de un lote de alrgeno y la sensibilizacin y titulacin en rumiantes (1).
d)
Duracin de la sensibilidad
La duracin de la sensibilidad es dudosa. Los animales varan considerablemente a nivel individual en cuanto al grado de hipersensibilidad manifestado a la brucelina. Los animales en fases muy tempranas de la infeccin, o con infecciones de larga duracin, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyeccin intradrmica.
Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Gnral-de-Gaulle, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France. El procedimiento estadstico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67, 94706 Maisons-Alfort Cedex, France.
463
e)
Estabilidad
La preparacin liofilizada retiene una actividad completa durante varios aos. La preparacin comercial lquida debe retener la potencia durante la caducidad recomendada.
f)
Conservantes
No se recomienda el uso de conservantes en preparaciones liofilizadas. En la forma lquida, se puede utilizar mertiolato sdico como conservante (mximo 0,1 mg/ml). Si la preparacin est liofilizada no debe reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.
g)
Precauciones (riesgos)
La brucelina no es txica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la inyeccin accidental o la contaminacin por las mucosas. El equipo de inyeccin utilizado y los recipientes deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineracin en contenedores adecuados de desecho.
5.
a)
Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Se debe realizar una prueba de esterilidad por el mtodo recomendado. Las pruebas de seguridad in vivo son las descritas para el control de lotes (ver seccin C1.4.b.). Estas pruebas pueden omitirse en el lote si se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado.
b)
Potencia
Se realiza por inyeccin de una nica dosis en cobayas segn el procedimiento descrito en la seccin C1.4.c.
C2. Vacunas Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus

La vacuna ms ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado bovino es la vacuna con Brucella abortus S19, que contina siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de vacunas. Se utiliza como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis nica subcutnea de 5-8 x 1010 microorganismos viables. Se puede administrar al ganado adulto una dosis reducida de 3 x 108 a 3 x109 microorganismos, pero algunos animales desarrollan ttulos duraderos de anticuerpos y pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche. Alternativamente, se puede administrar a ganado de cualquier edad en dos dosis de 5-10 x 109 microorganismos viables por va conjuntival; esto produce proteccin sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de excrecin en la leche. La vacuna con Brucella abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafos moderados por microorganismos virulentos. La vacuna debe prepararse de inculos derivados del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie de pgina) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraos), viabilidad (bacterias vivas por dosis) y homogeneidad (determinacin de la fase de disociacin). Los lotes de inculo para la produccin de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en ratones para virulencia residual e inmunogenicidad. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.
Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus

Desde 1996 la cepa RB51 de Brucella abortus es la vacuna oficial en muchos pases para la prevencin de la brucelosis en el ganado vacuno. Sin embargo, su eficacia e inocuidad en comparacin con la S19 son motivo de controversia (38, 39, 57). Cada pas utiliza mtodos ligeramente diferentes de administrar la vacuna. En EE.UU. los terneros se vacunan subcutneamente entre los 4 y 12 meses con 1-3,4 x 1010 microorganismos viables de la cepa RB51. La vacunacin de ganado de mayor edad solo se hace bajo autorizacin de organizaciones estatales o federales de salud animal y la dosis recomendada es de 1 x 109 microorganismos viables. En otros pases se recomienda la vacunacin de terneros (4-12 meses) con dosis de 1-3,4 x 1010, y la revacunacin de 12 meses en adelante con una dosis similar para inducir un efecto de recuerdo y aumentar la inmunidad.
464
Se ha descrito que cuando se administran intravenosamente al ganado dosis completas de RB51 se induce placentitis grave e infecciones placentarias en la mayora del ganado vacunado (49) y que un nmero notable de stos excreta microorganismos en la leche. Las experiencias de campo tambin indican que en algunos casos puede provocar aborto si se aplica a vacas grvidas. Debido a estas observaciones se debe evitar la vacunacin de vacas grvidas. Un modo de reducir los efectos colaterales de RB51 es reducir la dosis. Con la dosis reducida de esta vacuna (1 x 109 unidades formadoras de colonias [CFU]) no se producen abortos ni lesiones placentarias en el ganado vacunado subcutneamente (50), aunque un porcentaje significativo de estos animales excreta la cepa vacunal (61). Sin embargo, esta dosis reducida no protege contra B. abortus cuando se usa en la vacunacin de terneros (47), aunque lo hace cuando se aplica a adultos (48). Debe destacarse que, como la S19, la cepa RB51 puede infectar a humanos (65). La cepa RB51 es muy resistente a rifampicina, uno de los antibiticos de eleccin en el tratamiento de la brucelosis humana. Adems, el diagnstico de la infeccin por RB51 requiere pruebas especiales que no estn disponibles en la mayora de los hospitales. Los Centros para el Control de Enfermedades, del Departamento de Salud y Servicios Humanos, en Atlanta, Georgia, EE.UU. (CDC), establecieron una vigilancia pasiva sobre la inoculacin accidental con la vacuna RB51 en EE.UU. para determinar si la vacuna produce enfermedad en humanos. Este estudio incluy 26 participantes expuestos a la vacuna durante la vacunacin de animales. La exposicin accidental origin efectos indeseables tanto locales como sistmicos; sin embargo, no ha quedado claro si la cepa vacunal RB51 puede causar brucelosis sistmica en el hombre. El nmero de casos descritos de pacientes en este estudio (veinte y seis) es pequeo comparado con el nmero de vacunaciones (varios millones de terneros vacunados) y con las predicciones estimadas de inoculaciones fortuitas con RB51 (8 por 11.000). El estudio indicaba que un uso apropiado de antibiticos protega contra la infeccin pero no ha quedado determinado hasta qu punto otros componentes de la vacuna contribuyan a los efectos adversos (60). Esto contrasta con la cepa 19, donde est bien documentado que se desarrolla la fiebre ondulante por exposicin accidental sin tratamiento preventivo. Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.
Vacuna con la cepa Rev.1 de Brucella melitensis

Es frecuente aislar B. melitensis en ganado vacuno en pases con una elevada prevalencia de esta infeccin en pequeos rumiantes (64). Ha habido cierto debate sobre la eficacia protectora de S19 en infecciones por B. melitensis en el ganado vacuno y se ha supuesto que la Rev.1 debera ser una vacuna ms eficaz en estas condiciones. Sin embargo solo hay un trabajo sobre esta materia que demuestra que S19 es capaz de controlar B. melitensis en condiciones de campo (27). En contraste, no se han realizado experimentos sobre la eficacia de Rev.1 en la infeccin del ganado por B. melitensis. Adems, la seguridad de esta vacuna es prcticamente desconocida en el ganado (62). Hasta que se realicen estudios sobre la seguridad y eficacia de Rev.1 contra B. melitensis en el ganado a diferentes condiciones fisiolgicas y bajo situaciones estrictamente controladas, esta vacuna no debera recomendarse para el ganado vacuno.
1.
a)
Control de inculos
Caractersticas del inculo
El inculo original de Brucella abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie de pgina) y utilizarse para producir un lote de inculos conservado por liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido. Las propiedades de este lote de inculos deben ser las de un cultivo puro de B. abortus biotipo 1 no dependiente de CO2, que sea sensible a la bencilpenicilina, azul de tionina e ieritritol a las concentraciones recomendadas, y que tenga una patogenicidad mnima en cobayas. El inculo original de Brucella abortus RB51 est comercializado 9 . Estas compaas tienen los derechos legales de la vacuna.
b)
Mtodo de cultivo
Para producir la vacuna, Brucella abortus S19 se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para B. abortus S99 S1119-3 (1). La cepa RB51 de Brucella abortus sigue mtodos similares de cultivo.
Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.
465
c)
Validacin como vacuna

Muchos estudios independientes han confirmado el valor de S19 como vacuna que protege al ganado de la brucelosis. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada cuando se suministra a ganado sexualmente inmaduro. En casos raros puede producir una infeccin localizada en el tracto genital. Con adultos, es probable que se produzca una respuesta persistente de anticuerpos durante 6 meses o ms en una proporcin notable del ganado vacunado subcutneamente con la dosis estndar. Parte del ganado vacunado como terneros puede desarrollar ms tarde artropata, particularmente en las articulaciones de la tibia y el fmur (7, 13). La vacuna es segura para la mayora de los animales si se administra a terneros entre 3 y 8 meses de edad. Puede emplearse tambin en animales adultos a dosis reducida. Produce una inmunidad duradera para un desafo moderado con cepas virulentas de B. abortus, pero su duracin exacta es desconocida. La duracin de la proteccin frente a B. melitensis es tambin desconocida. La cepa vacunal es estable y su reversin a la forma virulenta es extremadamente rara. Cuando se administra involuntariamente a animales grvidos se ha asociado con la aparicin de cepas que utilizan i-eritritol. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada para ratones, e incluso grandes inculos desaparecen rpidamente de los tejidos. Estudios sobre desafos experimentales y desafos realizados en condiciones de campo destacan el valor de la cepa RB51 de B. abortus en la proteccin del ganado frente a la brucelosis. El microorganismo es atenuado en terneros y en adultos. Como esta cepa expresa niveles mnimos de sLPS no se produce seroconversin frente a sLPS en animales vacunados. Adems, RB51 no induce anticuerpos detectables contra el antgeno OPS utilizando los procedimientos actuales de prueba (59). Produce inmunidad a desafos moderados de cepas virulentas, pero se desconoce su duracin exacta. La vacuna es estable y no revierte de fase in vivo ni in vitro. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada en varios tipos de animales, como en ratones, y desaparece rpidamente de los tejidos. Las vacunas S19 y RB51 tienen cierta virulencia para el hombre, y pueden producirse infecciones accidentales. Se debe tener cuidado en su preparacin y manejo, as como incluir un aviso de riesgo en la etiqueta de los recipientes finales. En cualquier caso, las inoculaciones accidentales deben tratarse con antibiticos apropiados (ver Seccin C2.4.g.).
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que las clulas se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugacin o aadiendo carboximetil celulosa sdica a una concentracin final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las clulas agrupadas de un lote de cultivos en botellas Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inculo constituye una cosecha individual. Se puede juntar ms de una cosecha para formar la masa final que se utiliza para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, cada cosecha individual se prueba para pureza, concentracin celular, disociacin e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas sobre la masa final, que debe tener un nmero de viables entre 8 y 24 x 109 CFU/ml. Los ajustes de concentracin se hacen aadiendo PBS a la vacuna presentada en forma lquida o estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea estabilizador debe tenerse en cuenta la prdida de viabilidad en la liofilizacin, y no debe superar el 50%. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser 1-2%. Los envases deben cerrarse al vaco o en nitrgeno seco inmediatamente despus del secado, y han de mantenerse a 4C. El proceso de produccin para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.
3.
Control del proceso
La vacuna con Brucella abortus S19 debe probarse para pureza y estado de fase lisa durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular, que puede realizarse por medidas de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de viables. Tambin debe probarse la identidad mediante pruebas de aglutinacin con antisuero contra el antgeno A de Brucella. La concentracin de viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 x 109 por cada dosis estndar despus de la liofilizacin y al menos el 95% de las clulas deben estar en la fase lisa. La vacuna con Brucella abortus RB51 debe probarse para pureza y estado de fase rugosa durante la preparacin de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular. En los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de viables. La concentracin de viables en los recipientes finales debe ser de 1-3,4 x 1010 CFU por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutneamente) y el 100% de las clulas deben estar en fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAbs especficos para el antgeno OPS.
466
4.
a)
Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se encuentran en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mnima virulencia para que sea eficaz (ver seccin C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricacin o cuando se espera alguna modificacin de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza 12 terneras de 4-6 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 das. No deben producirse lesiones locales o sistmicas significativas. Si para una dosis y una ruta de administracin dadas la prueba da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inculo o de vacuna preparados con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin. Tambin debe realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mnimo se inyectan por va intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 x 109 microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad. Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 8-10 semanas con 1 x 108 CFUs y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculacin. Los bazos deben estar libres de RB51 y los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.
c)
Potencia Vacuna S19

Una vacuna S19 es eficaz si posee las caractersticas de la cepa original S19, es decir, si es satisfactoria respecto a identidad, fase lisa, inmunogenicidad y virulencia residual (6). Los lotes deben probarse tambin respecto al nmero de microorganismos viables. Identidad La vacuna S19 reconstituida no debe contener microorganismos exgenos. La Brucella abortus presente en la vacuna se identifica por pruebas morfolgicas, serolgicas y bioqumicas adecuadas y por cultivo: Brucella abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. abortus biotipo 1 pero no requiere CO2 para crecer ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul de tionina (2g/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales). Fase lisa (determinacin de la fase de disociacin) La vacuna S19 reconstituida en agua destilada se siembra en estra en seis placas con medio slido (agar suero-dextrosa o agar tripticasa-soja (TSA) con 5% [v/v] de suero o 0,1% [p/v] de extracto de levadura) de modo que las colonias estn juntas en algunas reas mientras que en otras estn semiseparadas y en otras separadas. Las pequeas diferencias son ms obvias en las colonias adyacentes que en las separadas. Las placas se incuban a 37C durante 5 das y se examinan con luz reflejada oblicua (mtodo de Henry) antes y despus de teir (tres placas) con cristal violeta (mtodo de tincin de White & Wilson). Apariencia de las colonias antes de teir: Las colonias de tipo S aparecen redondas, brillantes y de color azul a verde-azulado. Las colonias R tienen un aspecto seco, granular y son de color blanco amarillento. Las colonias mucoides (M) son transparentes y grisceas y pueden distinguirse por su consistencia pegajosa cuando se las toca con un asa de siembra. Las colonias intermedias (I) son las ms difciles de clasificar y tienen una apariencia intermedia entre las formas S y R: son ligeramente opacas y ms granulares que las colonias S. Apariencia de las colonias despus de teir con cristal violeta: Las colonias S no toman el colorante. Las colonias disociadas (I, M o R) se tien en varios tonos de rojizo a prpura y su superficie puede mostrar grietas radiales. A veces se observa un film superficial teido que se despega de una colonia disociada y aparece adyacente a ella. La fase colonial puede confirmarse por la prueba de aglutinacin con acriflavina (1): Las colonias S quedan en suspensin mientras que las R aglutinan rpidamente y, si son mucoides, forman tiras. Las colonias intermedias pueden quedar en suspensin o formar una aglutinacin muy fina.
467
Determinacin de bacterias vivas Se inoculan al menos cinco placas de agar triptosa, de agar suero-dextrosa o de cualquier otro medio slido adecuado con 0,1 ml de diluciones apropiadas de la vacuna que se extienden con un asa de vidrio, metal o plstico. Se cuentan las CFU por unidad de volumen de la vacuna.
i)
Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperacin al 50%) (6, 23) Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de B. abortus S19 que se vaya a probar (vacuna problema) y del cultivo original de inculo de S19 (como cepa de referencia). Para esto, se recoge un cultivo de 24-48 horas de cada cepa en solucin salina estril tamponada (BSS: NaCl 8,5 g; KH2PO4 1,0 g; K2HPO4 2,0 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8) y se ajusta la suspensin con BSS a 109 CFU/ml con un espectrofotmetro (OD = 0,170 cuando se lee a 600 nm). El nmero exacto de CFU/ml se determina despus por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).
ii)
Inyectar subcutneamente 0,1 ml (108 CFU/ratn) de la suspensin de la vacuna problema en cada una de 32 hembras de ratn CD1 de 5-6 semanas. En paralelo se realiza una inoculacin similar en otros 32 ratones con la suspensin que contiene la cepa de referencia S19. La cepa S19 original de siembra, que es satisfactoria respecto a inmunogenicidad y virulencia residual, se puede obtener del USDA (para direccin ver nota 2 a pie de pgina). A las 3, 6, 9 y 12 semanas, sacrificar los ratones por dislocacin cervical, en grupos de ocho elegidos al azar. Extraer los bazos y homogenizarlos asptica e individualmente en 1 ml de BSS estril con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en bolsas estriles adecuadas). Extender en cada caso toda la suspensin completa de bazo sobre varias placas con un medio apropiado de cultivo e incubar en condiciones estndar para Brucella durante 5-7 das (lmite inferior de deteccin: 1 bacteria por bazo). Un animal se considera infectado cuando se asla al menos 1 CFU del bazo. Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperacin al 50% (RT50) por el mtodo estadstico SAS, desarrollado especficamente para calcular RT50 (para obtener el SAS especfico, ver la direccin en la nota 5 a pie de pgina) (23). Para esto se determina el nmero de ratones curados (sin colonias aisladas del bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y se calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el mtodo de Reed y Muench (descrito en la ref. 4). La funcin de distribucin de este porcentaje describe una curva sigmoidal que debe linearizarse para calcular los valores RT50, mediante el procedimiento computarizado PROBIT en el sistema estadstico SAS.
iii) iv) v)
vi)
vii)
Comparar estadsticamente el paralelismo (corte y pendiente) entre las lneas de distribucin obtenidas para la cepa problema y para la S19 de referencia, utilizando el SAS diseado para este propsito. Se pueden comparar estadsticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de lneas de distribucin paralelas. Si no existe paralelismo, la virulencia residual de la cepa problema se considera inadecuada y se elimina para produccin de vacunas. problema y de referencia utilizando el SAS diseado para este propsito. Para ser aceptable para la produccin de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del obtenido con la cepa de referencia S19 (RT50 y los lmites de confidencia son normalmente 7,0 + 1,3 semanas).
viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadsticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa
Las bases del procedimiento estadstico para el clculo anterior de la virulencia residual se han descrito recientemente con detalle (52). Alternativamente, los clculos estadsticos descritos en los pasos vi) a viii) se pueden evitar con un programa especfico de fcil empleo HTML-JAVA (Rev2) recientemente desarrollado y disponible sin coste alguno en la direccin: http://www.afssa.fr/interne/Rev2.html. Si la prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de inculo o de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el mismo proceso de produccin. Inmunogenicidad en ratn (5, 6)
Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 5-7 semanas, que se eligen al azar. i) Preparar y ajustar espectrofotomtricamente las suspensiones de vacuna como se indic anteriormente.
468
ii) iii)
Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga 105 CFU (en un volumen de 0,1 ml/ratn) a cada uno de los seis ratones del primer grupo. Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 CFU de bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo control sin vacunar y se inocula subcutneamente con 0,1 ml de BSS. El nmero exacto de CFU inoculado se comprueba despus por siembra en placa de diluciones decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA). 30 das despus de la vacunacin (e inmediatamente despus de 16 horas de ayuno) todos los ratones se someten a una inoculacin intraperitoneal de desafo con una suspensin (0,1 ml/ratn) que contenga 2 x 105 CFU de la cepa 544 de B. abortus (dependiente de CO2), preparada, ajustada y comprobada como antes. Sacrificar los ratones 15 das ms tarde por dislocacin cervical. Cada bazo se corta aspticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los bazos pueden congelarse y mantenerse a 20C de 24 horas a 7 semanas.
iv) v)
vi) vii)
viii) Cada bazo se homogeniza aspticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en sacos estriles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio slido y se incuban dos placas a 37C durante 5 das en atmsfera con 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y de la desafo) y otras dos placas en aire (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafo B. abortus 544 que es dependiente de CO2). ix) Las colonias de Brucella se cuentan en las diluciones que corresponden a placas con menos de 300 CFU. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilucin 1/10, se considera que el bazo est infectado con cinco bacterias. Este nmero de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y, despus de hacer la siguiente transformacin: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones como media y desviacin estndar. Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados (media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de referencia es menor de 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0,8. Realizar comparaciones estadsticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas [LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se prueba respecto a los obtenidos en ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control no vacunado. La vacuna problema es satisfactoria si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si, adems, no difiere significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. (Para una informacin detallada de este procedimiento, ver la nota 5 a pie de pgina con la direccin de contacto).
x)
xi)
Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el mismo proceso de produccin.
Vacuna RB51
No existe prueba de potencia estandarizada para la vacuna con la cepa RB51 de B. abortus y no se realiza rutinariamente. Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 x 104 microorganismos de la cepa 2308 de B. abortus como cepa de desafo, pero la utilidad de la prueba para predecir la proteccin en el ganado vacuno es dudosa. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la determinacin en placa de microorganismos viables.
d)
Duracin de la inmunidad
Se considera que la vacunacin de terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en reas endmicas puede ser aconsejable la revacunacin. La vacunacin de terneros con la cepa RB51 de B. abortus parece estimular una inmunidad que dura un perodo similar al inducido con la S19, aunque no existen estudios especficos que lo demuestren
469
e)
Estabilidad
La vacuna S19 de B. abortus preparada de inculos de orgenes apropiados muestra caractersticas estables siempre que se cumplan los requisitos descritos arriba sobre el control del proceso y de los lotes, y no tiene tendencia a revertir a virulenta. La vacuna liofilizada muestra una prdida gradual de viables pero debe retener su potencia hasta el perodo de caducidad recomendado. En funcin de este fenmeno se establece un cierto margen de seguridad, asegurando que el nmero de viables antes de la liofilizacin est en exceso sobre el mnimo requerido. El mantenimiento de la cadena de fro durante la distribucin de la vacuna asegura su viabilidad. La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a microorganismos lisos virulentos despus de muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localizacin de las mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupcin en el gen wboA debida a un elemento IS711 que impide la sntesis de OPS. Datos no publicados indican que tambin contiene una segunda mutacin que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de OPS con el ncleo del LPS, o a ambos procesos.
f)
Conservantes
En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga 2,5% de hidrolizado de casena, por ejemplo Triptona (Oxoid), 5% de sacarosa y 1% de glutamato sdico, disuelto en agua y esterilizado por filtracin.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque son cepas atenuadas, Brucella abortus S19 y RB51 son an capaces de causar enfermedad en humanos. Los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de contencin para bioseguridad. La reconstitucin y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con cuidado para evitar una inyeccin accidental o la contaminacin de los ojos o la piel. Los residuos de vacuna y el equipo de inoculacin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenlico, iodforo o aldehdo) a la concentracin adecuada. En caso de exposicin accidental debe requerirse atencin mdica. En humanos, no se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibitico de las infecciones causadas por S19 y RB51; sin embargo, el CDC suministra recomendaciones para el tratamiento. Si se produce contaminacin por S19, se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. En caso de contaminacin con RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina.
5.
a)
Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Ver Seccin C2.4.b.
b)
Potencia
Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el descrito en la Seccin C2.4.c.
REFERENCIAS
1. ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France. ANGUS R.D. & BARTON C.E. (1984). The production and e valuation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand., 56, 349356. ASARTA A. (1989). Erradicacin de la brucelosis en el ganado vacuno de Navarra. En: Actas del XII Congreso Nacional de Microbiologa.Sociedad Espaola de Microbiologa (Ed.), SEM, Pamplona, 371371. BONET-MAURY P., JUDE A. & SERVANT P. (1954). La mesure statistique de la virulence et limmunit. Application letude de la virulence du bacille typhique et la mesure du pouvoir immunisant des vaccins antityphoidiques. Rev. d'Immun. Th. Antimic., 18, 2149.
2.
3.
4.
470
5.
BOSSERAY N. (1992). Le vaccin Rev.1: drive des caractres dimmunognicit et de virulence indpendante des marqueurs classiques. En: Prevention of Brucellosis in the Mediterranean Countries, PLOMMET M., ed. Pudoc Scientific, Wageningen, The Netherlands, 182186. BOSSERAY N. (1993). Control methods and thresholds of acceptability for anti-Brucella vaccines. Dev. Biol. Stand., 79, 121128. BRACEWELL C.D. & CORBEL M.J. (1980). An association between arthritis and persistent serological reactions to B. abortus in cattle from apparently brucellosis-free herds. Vet. Rec., 106, 99. BRICKER B.J. (2002). PCR as a diagnostic tool for brucellosis, Vet. Microbiol., 90, 435446. CLOECKAERT A., GRAYON M. & GREPINET O. (2002). Identificiation of Brucella melitensis vaccine strain Rev.1 by PCR-RFLP based on a mutation in the rpsL gene, Vaccine, 7, 1920.
6.
7.
8. 9.
10. CLOECKAERT A., VERGER J.M., GRAYON M., PAQUET J.Y., GARIN-BASTUJI B., FOSTER G. & GODFROID J. (2001). Classification of Brucella spp. isolated from marine mammals by DNA polymorphism at the omp2 locus. Microbes Infect., 3, 2938. 11. CORBEL M.J., BRACEWELL C.D., THOMAS E.L. & GILL K.P.W. (1979). Techniques in the identification of Brucella species. En: Identification Methods for Microbiologists, Second Edition. Skinner F.A. & Lovelock D.W., eds. Academic Press, London, UK and New York, USA, 8689. 12. CORBEL M.J. & HENDRY D.M.F.D. (1983). Methods for the identification of Brucella. Booklet 2085. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Lion House, Alnwick, Northumberland, UK. 13. CORBEL M.J., STUART F.A., BREWER R.A., JEFFREY M. & BRADLEY R. (1989). Arthropathy associated with Brucella abortus Strain 19 vaccination in cattle. 1. Examination of field cases. Br. Vet. J., 145, 337. 14. DIAZ R., GARATEA P., JONES L.M. & MORIYON I. (1979). Radial immunodiffusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. J. Clin. Microbiol., 10, 3741. 15. EUROPEAN COMMISSION (1999). The modification of Technical Annexes of Council Directive 64/432/EEC to take account of Scientific Developments regarding Tuberculosis, Brucellosis and Enzootic Bovine Leucosis. Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare adopted 11 October 1999. Sanco/B3/R10/1999. 16. EWALT D.R., PAYEUR J.B., RHYAN J.C. & GEER P.L. (1997). Brucella suis biovar 1 in naturally infected cattle: a bacteriological, serological, and histological study. J. Vet. Diagn. Invest., 10, 417420. 17. FARRELL I.D. (1974). The development of new selective medium for the Isolation of Brucella abortus from Contaminated Sources. Res. Vet. Sci., 16, 280286. 18. FOSTER G., MACMILLAN A.P., GODFROID J., HOWIE F., ROSS H.M., CLOECKAERT A., REID R.J., BREW S. & PATTERSON I.A.P. (2002). A review of Brucella sp. infection of sea mammals with particular emphasis on isolates from Scotland. Vet. Microbiol., 90, 563580. 19. GALL D., NIELSEN K., FORBES L., COOK W., LECLAIR D., BALSEVICIUS S., KELLY L., SMITH P. & MALLORY M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37, 110118. 20. GALL D., NIELSEN K., FORBES L., DAVIS D., ELZER P., OLSEN S., BALSEVICIUS S., KELLY L., SMITH P., TAN S. & JOLY D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469476. 21. GARIN B., TRAP D. & GAUMONT R. (1985). Assessment of the EDTA seroagglutination test for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Rec., 117, 444445. 22. GODFROID J., SAEGERMAN C., WELLEMANS V., WALRAVENS K., LETESSON J.J., TIBOR A., MCMILLAN A., SPENCER S., SANAA M., BAKKER D., POUILLOT R. & GARIN-BASTUJI B. (2002). How to substantiate eradication of bovine brucellosis when aspecific serological reactions occur in the course of brucellosis testing. Vet. Microbiol., 90, 461477.
471
23. GRILLO M.J., BOSSERAY N. & BLASCO J.M. (2000). In vitro markers and biological activity in mice of seed lot strains and commercial Brucella melitensis Rev.1 and Brucella abortus B19 vaccines. Biologicals, 28, 119 127. 24. HENDRY D.M.F.D., CORBEL M.J., BELL R.A. & STACK J.A. (1985). Brucella antigen production and standardisation. Booklet 2499. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Lion House, Alnwick, Northumberland, UK. 25. INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition. International Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113; Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 815 pp. 26. JENSEN A.E., CHEVILLE N.F., THOEN C.O., MACMILLAN A.P. & MILLER W.G (1999). Genomic fingerprinting and development of a dendrogram for Brucella spp. isolated from seals, porpoises, and dolphins. J. Vet. Diagn. Invest., 11, 152157. 27. JIMENEZ de BAGUES M.P., MARIN C. & BLASCO J.M. (1991). Effect of antibiotic therapy and strain 19 vaccination on the spread of Brucella melitensis within an infected dairy herd. Prev. Vet. Med., 11, 1724. 28. JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BRUCELLOSIS (1986). Technical Report Series 740, Sixth Report. WHO, Geneva, Switzerland. 29. JONES L.M., BERMAN D.T., MORENO E., DEYOE B.L., GILSDORF M.J., HUBER J.D. & NICOLETTI P.L. (1980). Evaluation of a radial immunodiffusion test with polysaccharide B antigen for diagnosis of bovine brucellosis. J. Clin. Microbiol., 12, 753760. 30. LORD V.R. & CHERWONOGRODZKY J.W. (1992). Evaluation of polysaccharide, lipopolysaccharide, and betaglucan antigens in gel immunodiffusion tests for brucellosis in cattle. Am. J. Vet. Res., 53, 389391. 31. LORD V.R., ROLO M.R. & CHERWONOGRODZKY J.W. (1989). Evaluation of humoral immunity to Brucella sp in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen. Am. J. Vet. Res., 50, 18131816. 32. MACMILLAN A.P. & COCKREM D.S. (1985). Reduction of non-specific reactions to the Brucella abortus serum agglutination test by the addition of EDTA. Res. Vet. Sci., 38, 288291. 33. MACMILLAN A.P., GREISER-WILKE I., MOENNIG V. & MATHIAS L.A. (1990). A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. Dtsch Tierarztl. Wochenschr., 97, 8385. 34. MARIN C.M., ALABART J.L. & BLASCO J.M. (1996). Effect of antibiotics contained in two Brucella selective media on growth of B. abortus, B. melitensis and B. ovis. J. Clin. Microbiol., 34, 426428. 35. MICHAUX-CHARACHON S., BOURG G., JUMAS-BILAK E., GUIGUE-TALET P., ALLARDET-SERVENT A., OCALLAHAN D. & RAMUZ M. (1997). Genome structure and phylogeny in genus Brucella. J. Bacteriol., 179, 32443249. 36. MORENO E., CLOECKAERT A. & MORIYON I. (2002). Brucella evolution and taxonomy. Vet. Microbiol., 90, 209 227. 37. MORGAN W.J.B., MACKINNON D.J., LAWSON J.R. & CULLEN G.A. (1969). The rose bengal plate agglutination test in the diagnosis of brucellosis. Vet. Rec., 85, 636641. 38. MORIYON I. (2002). Rough vaccines in animal brucellosis. En: Proceedings of the CIHEAM Advanced Seminar Human and Animal Brucellosis, Pamplona, Spain, 1620 September 2002. 39. MORIYON I., GRILLO M.J, MONREAL D., GONZALEZ D., MARIN C.M., LOPEZ-GONI I., MAINAR-JAIME R.C., MORENO E. & BLASCO J.M. (2004). Rough vaccines in animal brucellosis: structural and genetic basis and present status. Vet. Res., 35, 138. 40. NICOLETTI P. (1992). An evaluation of serologic tests used to diagnose brucellosis in buffaloes (Bubalus bubalis). Trop. Anim. Health Prod., 24, 4044. 41. NIELSEN K. (1990). The serological response of cattle immunized with Yersinia enterocolitica O:9 or O:16 to Yersinia and Brucella abortus antigens in enzyme immunoassays. Vet. Immunol. Immunopathol., 24, 373 382.
472
42. NIELSEN K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol., 90, 447459. 43. NIELSEN K., GALL D., JOLLEY M., LEISHMAN G., BALSEVICIUS S., SMITH P., NICOLETTI P. & THOMAS F. (1996). A homogenous fluorescence polarisation assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods, 195, 161168. 44. NIELSEN K., KELLY L., GALL D., BALSEVICIUS S., BOSSE J., NICOLETTI P. & KELLY W. (1996). Comparison of enzyme immunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med., 26, 1732. 45. NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 46, 285291. 46. NIELSEN K., SAMAGH B.S., SPECKMANN G. & STEMSHORN B. (1979). The bovine immune response to Brucella abortus. II. Elimination of some sporadic serological reactions by chelation of divalent cations. Can. J. Comp. Med., 43, 420425. 47. OLSEN S.C. (2000). Immune responses and efficacy after administration of commercial Brucella abortus strain RB51 vaccine to cattle. Vet. Therapeutics, 3, 183191. 48. OLSEN S.C. (2002). Responses of adult cattle to vaccination with a reduced dose of Brucella abortus Strain RB51. Res. Vet. Sci., 59, 135140. 49. PALMER M, CHEVILLE N & JENSEN A (1996). Experimental infection of pregnant cattle with vaccine candidate Brucella abortus strain RB51: Pathologic, bacteriologic and serologic findings. Vet. Pathol., 33, 682691. 50. PALMER M.V., OLSEN S.C. & CHEVILLE N.F. (1997). Safety and immunogenicity of Brucella abortus strain RB51 vaccine in pregnant cattle. Am. J. Vet. Res., 58, 472477. 51. POUILLOT R., GARIN-BASTUJI B., GERBIER G., COCHE Y., CAU C., DUFOUR B. & MOUTOU F. (1997). The brucellin skin test as a tool to differentiate false positive serological reactions in bovine brucellosis. Vet. Res., 28, 365374. 52. POUILLOT R., GRILLO M.J., ALABART J.L., GARIN-BASTUJI B. & BLASCO J.M. (2004). Statistical procedures for calculating the residual virulence of Brucella abortus strain 19 (S19) and Brucella melitensis strain Rev.1 vaccines in mice: theoretical basis and practical applications. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 22 (3), 1051 1063. 53. ROOP II, R.M., PRESTON-MOORE D., BAGCHI T. & SCHURIG G.G. (1987). Rapid Identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody. J. Clin. Microbiol., 25, 20902093. 54. SAERGERMAN C., VO T.-K.O., DE WAELE L., GILSON D., BASTIN A., DUBRAY G., FLANAGAN P., LIMET J.N., LETESSON J.J. & GODFROID J. (1999). Diagnosis of bovine brucellosis by skin test: conditions for the test and evaluation of its performance. Vet. Rec., 145, 214218. 55. SANGARI F.J., GARCIA-LOBO J.M. & AGUERO J. (1994). The Brucella abortus vaccine strain B19 carries a deletion in the erythritol catabolic genes. FEMS Microbiol. Lett., 121, 337342. 56. SCHURIG G.G., ROOP R.M., BUHRMAN D., BOYLE S., BAGCHI T. & SRIRANGANATHAN N. (1991). Biological Properties of RB5l, a stable, O-chain deficient mutant of Brucella abortus. Vet. Microbiol., 28, 171188. 57. SCHURIG G.G., SRIRANGANATHAN N. & CORBEL M.J. (2002). Brucellosis vaccines: past, present and future, Veterinary microbiology, 90, 479496. 58. STACK J.A., PERRETT L.L., BREW S.D., MACMILLAN A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record, 145, 735736. 59. STEVENS M.G., HENNAGER S.G., OLSEN S.C. & CHEVILLE N.F. (1994). Serologic responses in diagnostic tests for brucellosis in cattle vaccinated with Brucella abortus 19 or RB51. J. Clin. Microbiol., 32, 10651066. 60. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA), ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICES (APHIS) (2003). Availability of an Environmental Assessment for Licensing of Brucella abortus Vaccine, Strain RB-51, Live Culture. Federal Register, 18 Feb 2003, 68 (32), 7761.
473
61. UZAL F., SAMARTINO L., SCHURIG G., CARRASCO A., NIELSEN K., CABRERA R. & TADDEO H. (2000). Effect of vaccination with Brucella abortus strain RB51 on heifers and pregnant cattle. Vet. Res. Comm., 24, 143 151. 62. VAN DRIMMELEN G. & HORWELL F. (1964). Preliminary findings with the use of Brucella melitensis strain Rev 1 as a vaccine against brucellosis in cattle. OIE Bull., 62, 987. 63. VEMULAPALLI R., MCQUISTON J.R., SCHURIG G.G., SRIRANGANATHAN N., HALLING S.M. & BOYLE S.M. (1999). Identification of an IS711 element interrupting the wboA gene of Brucella abortus vaccine strain RB51 and a PCR assay to distinguish strain RB51 from other Brucella species and strains. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 6, 760764. 64. VERGER J.M. (1985). B. melitensis infection in cattle. In: Brucella melitensis, Plommet & Verger, eds. Martinus Nijhoff Publ., Dordrecht-Boston-Lancaster. 197203. 65. VILLARROEL M., GRELL M. & SAENZ. R. (2000). Reporte de primer caso humano de ailsamiento y tipificacin de Brucella abortus RB51. Arch. Med. Vet., 32, 8991. 66. WEYNANTS V., GILSON D., CLOECKAERT A., TIBOR A., DENOEL P.A., GODFROID F., LIMET J.N. & LETESSON J.J. (1997). Characterization of smooth-lipopolysaccharide and O polysaccharides of Brucella species by competition binding assays with monoclonal antibodies. Infect. Immun., 65, 19391943. 67. WORLD HEALTH ORGANIZATION (1993). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition. WHO, Geneva, Switzerland. 68. WORLD HEALTH ORGANIZATION (1997). WHO Guidelines for the Safe Transport of Infectious Substances and Diagnostic Specimens, WHO, Geneva, Switzerland, WHO/EMC/97.3. who.int/emc/biosafety.html 69. WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 435450. 70. WRIGHT P.F., TOUNKARA K., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech., 3, 824832.
* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Brucelosis bovina (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).
474
Cuadro 1. Caracteres diferenciales de especies del gnero Brucella

Lisis por fagosa Tb Requiere suero Wb Iz1 R/C Actividad ureasa
104RTD
Morfologa colonialb
Oxidase
RTDc
RTD
RTD
RTD
Especies
Hospedador preferido
B. abortus
+e
+f
Vacas y otros bvidos Biotipo 1: cerdo Biotipo 2: cerdo, liebre
B. suis
+g
+g
+h
Biotipo 3: cerdo Biotipo 4: reno Biotipo 5: roedores salvajes
B. melitensis B. neotomae B. ovis B. canis
S S R R
i +
+ +
+ +
+ +
+j +h +h
Ovejas y cabras Rata lanuda del desiertol Carneros Perros
Tomado de las refs 1, 28. a b c d e f g h i j k l Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C Fase normal de presentacin : S: lisa, R: rugosa RTD: dilucin rutinaria de prueba Brucella abortus biotipo 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario Algunos aislamientos africanos de B. abortus biotipo 3 son negativos Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas Algunos aislamientos de B. suis biotipo 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1 Velocidad rpida Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rpidas Placas o calvas pequeas Neotoma lepida
475
Cuadro 2. Caracteres diferenciales de los biotipos de especies de Brucella

Crecimiento con colorantesa Fucsina Tionina Aglutinacin con sueros monospecficos
bsica
Especies
Produccin de H2S
Requiere CO2
Biotipo
1 B. melitensis 2 3 1 2 3 B. abortus 4 5 6 9 1 2 B. suis 3 4 5 B. neotomae
+b +b +b +b +o
+ + + + + + +
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + +c + + + d + e
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + + +
B. ovis B. canis
+ +
e e
+ +
Tomado de las refs 1, 28. a b c d e f Concentracin del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 g/ml Normalmente positivo en aislamiento primario Algunas cepas se inhiben con colorantes Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina bsica Negativo en la mayora de las cepas Crecimiento a una concentracin de 10 g/ml de tionina
476

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SECCIN 2.3.

ENFERMEDADES DE LOS BVIDOS DE LA LISTA B

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Identificacin del agente (1, 28)

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos

Identificacin de cepas vacunales

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Prueba de aglutinacin tamponada en placa

Prueba de fijacin de complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Enzimoinmunoensayos (pruebas prescritas para el comercio internacional)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

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Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Prueba de polarizacin de fluorescencia (prueba prescrita para el comercio internacional)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Prueba de aglutinacin del suero

Pruebas de hapteno nativo y poliB

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Mtodo de cultivo (1)

Validacin como un reactivo de diagnstico in vivo

Mtodo de produccin (1)

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Control del proceso

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Pruebas sobre el producto final

C2. Vacunas Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus

Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Vacuna con la cepa Rev.1 de Brucella melitensis

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina

Validacin como vacuna