INFORME FINAL PROYECTOS DE INVESTIGACIN

ENFERMEDADES EMERGENTES EN ANFIBIOS: LA GRAN AMENAZA DE LA BIODIVERSIDAD

Tubos de descarga del hongo patgeno de anbios Batrachochytrium dendrobatidis atravesando la piel de un sapo corredor moribundo

I CONVOCATORIA DE AYUDAS A LA INVESTIGACIN EN BIOLOGA DE LA CONSERVACIN (2003)

MEMORIA CIENTFICA
Grado de cumplimiento de los objetivos iniciales del proyecto y resultados alcanzados
En esta memoria cientca se indica el grado de cumplimiento de los objetivos iniciales del proyecto, y se resumen los resultados mas signicativos alcanzados para cada uno de estos objetivos. No hemos pretendido recoger todos y cada uno de los resultados obtenidos dado que estos estn siendo publicados en revistas cientcas especializadas, sino por el contrario exponer, lo mas brevemente y didacticamente posible, los logros alcanzados por el proyecto. El objetivo general de este proyecto era contribuir al conocimiento de las enfermedades emergentes en anbios (fundamentalmente quitridiomicosis) aunando los esfuerzos de investigadores de distintos pases con el propsito de encontrar, en un futuro prximo, algn mtodo paliativo que salve de la extincin a multitud de especies de anbios en todo el mundo. La importancia del trabajo en equipo en este problema medioambiental es capital dado que, por un lado, se trata de un problema extraordinariamente complejo que necesita la dedicacin de un equipo multidiscliplinar que integre conocimientos de muchas materias de la biologa y, por otro, se trata de un amenaza muy seria para la supervivencia de miles de especies de anbios en todo el mundo que podran desaparecer si nuestros conocimientos sobre este problema no crecen de forma exponencial en los aos prximos. Sapo partero comn (Alytes obstetricans) Los sapos parteros son los anfibios de Espaa mas susceptibles a la accin del hongo patgeno

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ZONAS CALIENTES

Conocimiento de la incidencia de la quitridiomicosis

En primer lugar, el proyecto ha proporcionado un mayor conocimiento sobre la situacin real de la incidencia de quitridiomicosis en las reas geogrcas estudiadas. Entre otros resultados, el proyecto ha determinado que Espaa podra ser el pas europeo con mayor incidencia de enfermedades emergentes de anbios. Actualmente, Espaa es el pas europeo en el que mejor conocemos la distribucin del hongo patgeno Batrachochytrium dendrobatidis, como consecuencia de los intensos muestreos que hemos realizado en todo el pas en los ltimos 3 aos, y que han hecho que el volumen de muestras analizadas de Espaa sea muy superior al estudiado en toda Europa. Adems, estos muestreos por todo el pas han hecho que hayamos identicado sitios donde resulta especialmente signicativo y preocupante la presencia del hongo, como es el caso de la isla de Mallorca, donde se encuentra una de las especies de anbios mas amenazadas del mundo.

Por otro lado, gracias al proyecto de investigacin hemos determinado la situacin en reas geogrcas remotas de las que no poseamos informacin alguna. Este es el caso de las zonas limtrofes de Chile, Per y Bolivia, que albergan una interesante comunidad de anbios en continuo crecimiento a medida que se suceden los estudios taxonmicos y se describen nuevas especies y que, sin embargo, podra estar desapareciendo a un ritmo an mayor por accin de las enfermedades emergentes. Por otro lado, el proyecto tambin ha servido para poner de maniesto que el fenmeno de las enfermedades emergentes de anbios es un fenmeno complejo en el que hay varios agentes implicados. As, el estudio de varios episodios de mortalidad masiva de anbios en el suroeste de India nos ha permitido constatar que el hongo patgeno podra no ser el nico responsable de los declives generalizados de anbios, siendo, probablemente los virus especcos de anbios los responsables de los fenmenos registrados.

Localidades con presencia del hongo patgeno en Espaa y Europa

Espaa es, actualmente, el pas de Europa donde mejor se conoce la distribucin del hongo patgeno. La isla de Mallorca, y concretamente la Sierra de Tramontana, es una de la zonas calientes dado que alberga una de las especies de anfibio mas amenazadas del mundo

Macho de sapo partero balear

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Conocimiento de la biologa del hongo patgeno

En segundo lugar, el proyecto ha proporcionado un mayor conocimiento de la biologa de hongo patgeno causante de la quitridiomicosis. Este avance contribuir, sin duda, a la obtencin de mtodos para paliar la enfermedad en un futuro prximo. As por ejemplo, y gracias al proyecto, hemos podido determinar que la temperatura juega un papel muy relevante en la virulencia del hongo, de modo que en muchas localizaciones la llegada del hongo podra no estar exactamente correlacionada con la aparicin de mortalidades masivas de anbios. Los resultados obtenidos en nuestras investigaciones indican que en muchas zonas de latitudes templadas la accin devastadora del hongo podra estar producindose de forma poco conspicua tras su introduccin, reduciendo el tamao de las poblaciones de anbios al ir eliminado ejemplares

lentamente. Por el contrario, y solo cuando las condiciones ambientales alcanzan las condiciones ptimas de crecimiento del hongo, y en el medio se encuentran determinadas especies de anbios altamente susceptibles, se podran desencadenar mortalidades masivas espectaculares, existiendo as un asincronismo entre la llegada del hongo a una determina localidad y los fenmenos espectaculares de mortandades masivas que estamos observando recientemente. Por otro lado, y una vez mas, comprobamos cmo las amenazas que se ciernen sobre los anbios actan de forma sinrgica. Ahora sabemos que el calentamiento global, cuyos efectos en nuestras latitudes son especialmente graves en las zonas altas de montaa, podra estar contribuyendo a aumentar la virulencia del hongo en las zonas de montaa, haciendo que ahora se alcancen las temperaturas ptimas que el hongo patgeno precisa para su crecimiento.

CAMBIO GLOBAL

Las montaas ya no son seguras para los anbios

Subida de las temperaturas

La subida de las temperaturas en las zonas altas de montaa podra estar proporcionando en los ltimos aos las condiciones idneas para el desarrollo del hongo patgeno y, por tanto, aumentando su virulencia y desencadenando mortandades masivas de anfibios.

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Metodologas de trabajo
En tercer lugar, el proyecto ha proporcionado varias metodologas de trabajo tiles para el estudio de la quitridiomicosis. As por ejemplo, y gracias al proyecto, hemos puesto a punto el primer mtodo en el mundo,que sirve no solo para determinar la presencia del hongo patgeno en el medio sin la necesidad de analizar los anbios presentes, sino tambin para cuanticar la cantidad de zoosporas por volumen de agua. Adems, tambin hemos desarrollado una metodologa de anlisis de la prevalencia de la infeccin que ha proporcionado datos comparables entre distintas localidades muy interesantes, utilizando para ello una especie de anbio ampliamente distribuido en Europa y altamente sensible a la accin del hongo. Estas dos metodologas estn siendo

usadas ya por investigadores de otros pases, y se han convertido en herramientas estndares en el estudio de la incidencia de la enfermedad en las zonas altas de Europa.

Cuanticacin de zoosporas presentes en el medio

Objetivos concretos y grado de cumplimiento

A continuacin se detallan el grado de cumplimiento, y los resultados mas significativos alcanzados, para cada uno de los objetivos concretos iniciales del proyecto.

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OBJETIVO 1.

Enfermedades emergentes
Una enfermedad emergente es aquella de reciente aparicin, o cuyo rango geogrfico se ha incrementado mucho en los ltimos aos. La quitridiomicosis est ya presente en casi todo el mundo, aunque an no conocemos en detalle las zonas de incidencia.

Determinacin de las zonas de incidencia de la quitridiomicosis en los pases objeto de estudio.

Gracias al proyecto de investigacin hemos podido determinar la incidencia de la quitridiomicosis en amplias zonas geogrcas del mundo. En Espaa hemos demostrado que el hongo patgeno se encuentra ampliamente distribuido, mucho mas de lo esperado cuando iniciamos el proyecto. En ese momento, partamos del supuesto de que en Espaa el patgeno haba sido introducido recientemente y, por lo tanto, suponamos que sera posible determinar los patrones de dispersin rpida del patgeno en forma de frentes epidmicos. Adems, hemos podido constatar que el hongo patgeno se encuentra ampliamente distribuido por Europa, aumentando de forma signicativa la lista de pases europeos donde el patgeno est presente. Los resultados obtenidos sobre la incidencia de la enfermedad en Europa han sido difundidos en trabajos como el publicado en la prestigiosa revista Emerging Infectious Disease, as como en multitud de charlas y seminarios en distintos foros cientcos. La incidencia en el resto de pases objeto de estudio ha sido ya analizada, y la difusin de los resultados obtenidos se ha realizado ya en diferentes foros cientcos y se encuentra en fase de publicacin.

Nuestro Entre otros, conviene destacar los resultados conocimiento ha obtenidos en Cuba, donde hemos encontrado crecido mucho en el hongo patgeno en las regiones occidental, los ltimos central y oriental, desde el nivel del mar hasta aos los 1385 m de altitud, pero siempre en la
vertiente caribea del pas. Curiosamente, el foco principal de infeccin que hemos detectado se encuentra en una zona muy antropizada en la Sierra de Banao, un macizo montaoso prximo a Topes de Collantes, el nico sitio donde otros investigadores hallaron en octubre de 2006 un ejemplar moribundo que result ser el primer caso conocido de quitridiomicosis en la isla. En Chile, la presencia del patgeno aparece asociada a los focos de introduccin de una especie

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extica introducida, un sapo de uas duda por alguna enfermedad del gnero Xenopus, en centro-norte especca de anbios, no hemos del pas. En Per y Bolivia, hemos podido constatar la presencia del patgeno en las zonas altas de los Andes, donde su incidencia podra ser elevado nmero de localidades donde, presumiblemente, hemos constatado extinciones locales de poblaciones de anbios durante los trabajos de campo. Adems, resultan muy elocuentes los testimonios de la poblacin local de diferentes valles andinos que recogimos durante los trabajos de campo, y que indefectiblemente encontrado una relacin causal con el hongo patgeno. A nivel global, hemos considerado primordial difundir los resultados obtenidos en el proyecto pudiera ser til para toda la comunidad cientca internacional. La pgina web www.spatialepidemiology.net/bd, cuyo desarrollo corre a cargo del Dr. Fisher, responsable del proyecto en Inglaterra, se ha convertido en la principal base de datos a nivel mundial sobre quitridiomicosis, tras su exitosa presentacin en el

MORTALIDADES MASIVAS DE ANFIBIOS

mucho mas dramtica a juzgar por el a travs de una herramienta que

coincidieron en la gran mortalidad de congreso mundial sobre la incidencia anbios observada entre dos y de la enfermedad desarrollado cuatro aos atrs, y que afect probablemente a las formas ciertos bufnidos. En India, resulta sorprendente como, pese a haber registrado durante nuestros trabajos de campo los primeros casos de mortalidades masivas de anbios motivados, sin www.spatialepid emiology.net/bd recientemente en Tampa (Florida, EEUU). Tan slo un mes despus de hemos incorporado en esta base de datos los resultados obtenidos en Espaa, mientras que los resultados del resto de los pases se incorporarn en breve.

forestales del gnero Telmatobius y a su lanzamiento (noviembre de 2007)

Durante el desarrollo del proyecto hemos constatado la incidencia de las enfermedades emergentes de anfibios en amplias zonas geogrficas, desde Sudfrica a India, pasando por Per o Cuba.

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OBJETIVO 2.

Origen de la quitridiomicosis
La hiptesis mas aceptada sobre el origen de la enfermedad es que sta es originaria del sur de frica, desde donde habra sido diseminada a todo el mundo a travs del comercio internacional de ranas para investigacin desde hace dcadas.

Determinacin de las pocas de introduccin del patgeno en las reas objeto de estudio.
La determinacin de la introduccin del patgeno en las reas de estudio es otro factor que considerbamos clave al inicio del proyecto. La posibilidad de determinar la presencia del hongo patgeno en ejemplares de colecciones cientcas colectados en pocas anteriores es una herramienta extremadamente til. Sin embargo, dado que todo el material antiguo disponible se encuentra jado en formol, su anlisis no puede realizarse mediante tcnicas moleculares y son necesarias tcnicas de histologa bsica muy laboriosas y muy poco potentes. Los resultados mas signicativos obtenidos en este apartado han sido, quizs, los obtenidos con el anlisis de mas de 1000 ejemplares de colecciones cientcas de Espaa. As, se han preparado miles de preparaciones histolgicas con material de distintas localidades en las que la presencia actual del hongo patgeno ha sido constatada por mtodos moleculares. Para cada localidad, y en funcin del material disponible, se han seleccionado las especies mas susceptibles a la quitridiomicosis y los ejemplares colectados en distintas pocas cuando era posible. Desgraciadamente, todo el ingente trabajo realizado con este material no ha servido para constatar la presencia del patgeno en pocas pasadas en las localidades estudiadas. Una posible explicacin de los resultados negativos obtenidos sera la ausencia del patgeno en pocas antiguas en las localidades estudiadas y, por tanto, la constatacin de que el hongo patgeno habra sido

El anlisis de ejemplares de coleccin puede ser de gran utilidad

introducido recientemente en las zonas donde ahora est presente. Sin embargo, estos resultados negativos no permiten descartar la explicacin alternativa de que no hemos detectado el hongo patgeno por la combinacin de distintos factores como son: a) la baja potencia de las tcnica utilizada, b) la bajsima prevalencia de la infeccin esperada en pocas antiguas, y c) lo reducido

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EL HONGO EN MALLORCA

del material analizado dado el material disponible. As por ejemplo, hay que sealar que con una

inexplicablemente durante el programa de cra en cautividad que tuvo lugar en el Zoo de Jersey por la

prevalencia de la infeccin menor del prestigiosa organizacin 4% (que hemos determinado en conservacionista Durrell Wildlife muchas poblaciones usando mtodos moleculares altamente sensibles) sera necesario el anlisis de hasta 60 ejemplares por localidad y fecha de colecta para poder Trust, indican que el patgeno se encontraba presente en sus instalaciones. No obstante, conviene sealar aqu, que en esos aos la comunidad cientca an desconoca

determinar con rotundidad la la existencia del hongo patgeno y ausencia del hongo patgeno, lo que de la enfermedad que produce. Mas desgraciadamente resulta imposible con el material antiguo de colecciones del que disponemos. Sin embargo, nuestro trabajo con material antiguo de ejemplares encontrados muertos hace tiempo, sin causas evidentes, ha arrojado resultados mucho mas interesantes. Este es el caso de los trabajos que hemos realizado con el sapo partero balear (Alytes muletensis) en Mallorca, y para el que hemos analizado todos los ejemplares antiguos que se conservan en distintas colecciones. Los resultados obtenidos en este caso fueron muy sorprendentes, y han constatado que, muy probablemente, la introduccin del patgeno en Mallorca se produjo irnicamente reintroduccin de la especie en la isla a principios de los aos 90. En efecto, los anlisis que hemos realizado de varios ejemplares que murieron
La introduccin del hongo causante de la quitridiomicosis en Mallorca pudo tener lugar a principios de los 90 mediante el programa de reintroduccin del sapo partero balear, cuando aun la comunidad cientfica desconoca la existencia de este organismo patgeno.

an, los anlisis que hemos realizado con este material indican que la posible va de infeccin de los animales usados en el programa de cra del sapo partero balear fue una partida de ejemplares del gnero Xenopus. Estos ejemplares, procedentes de Africa y con toda probabilidad portadores del hongo patgeno, fueron desafortunadamente mantenidos en las mismas instalaciones del Zoo junto con los ejemplares de sapo partero que luego fueron liberados en Mallorca. Estos resultados, que indican no slo la poca, sino tambin la posible va de introduccin del hongo patgeno en una zona geogrca, constitua el caso mejor dispersin de la quitridiomicosis, y esperamos que sea publicado en los prximos meses en una revista cientca de alto impacto.

como consecuencia del programa de conocido a nivel mundial sobre la

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OBJETIVO 3.

Dispersin del patgeno

Como en cualquier enfermedad infecciosa, la mejor forma de luchar contra la quitridiomicosis es evitar su propagacin. Slo conociendo en profundidad los patrones de dispersin del hongo patgeno podremos llegar a evitar la pandema.

Anlisis de patrones de dispersin de la enfermedad.

Dado el carcter introducido del hongo patgeno de anbios, uno de los aspectos claves para entender la incidencia de la enfermedad y poder encontrar mtodos de control, es el conocimiento de los patrones de dispersin del patgeno. Gracias al proyecto de investigacin hemos encontrado algunos patrones de dispersin en distintas reas y escalas geogrcas. Quizs, los casos mas interesantes encontrados sean, adems del comentado previamente sobre la introduccin del hongo en Mallorca va el programa de reintroduccin del sapo partero balear, los observados en Chile y en el Parque Natural de Pealara en Madrid. La comparacin de ambos casos resulta muy interesante, ya que estos dieren tanto en la escala geogrca de actuacin (desde pocos kilmetros en Pealara hasta centenares de kilmetros en el centro de Chile), como en el vector dispersor actual del patgeno. conocido de la enfermedad a nivel mundial. Tras la casi total extincin del sapo partero comn (Alytes obstetricans) en el parque entre los aos 1997 y 1999, en los ltimos aos hemos podido determinar la expansin del sapo comn (Bufo bufo). Curiosamente, el sapo comn se ha beneciado de la desaparicin del sapo partero, ya que ha tenido acceso a las masas de

agua que aos antes ocupaba aquel. Este El hombre hecho se explica por que las larvas de sapo ha propagado el hongo patgeno por comn no pueden competir con las larvas de sapo partero, dadas las peculiaridades de la todo el mundo biologa de ambas especies y los escasos recursos trcos de las charcas del parque. Desgraciadamente, el sapo comn, aunque muestra una mayor resistencia a la enfermedad, es un hospedador ideal para el hongo patgeno, por lo que su reciente expansin ha motivado no solo la dispersin del hongo a zonas nuevas, sino su permanencia en aquellas donde la desaparicin del sapo partero comn podra haber comprometido la supervivencia del hongo. Este

A una escala espacial reducida, en Pealara hemos interesante patrn de dispersin de la enfermedad, va podido documentar el que sera el primer efecto indirecto movimientos naturales de anbios, est siendo publicado

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en la revista Diversity &

acuticos, indican, al contrario que Distributions, y constituye uno de lo en el caso del sapo comn de escasos ejemplos documentados en Pealara, que la dispersin del el mundo. Por otro lado, los estudios que hongo en este caso est directamente mediada por la mano

PEALARA

hemos realizado en Chile determinan del hombre. Por lo tanto, el patrn que la presencia del hongo patgeno observado en Chile es especialmente se halla limitada, por ahora, a las poblaciones introducidas de la rana de uas (Xenopus laevis) localizadas en el centro-norte del pas. La constatacin de que el hongo se encuentra presente en todas y cada una de las poblaciones de Xenopus conocidas en Chile, y que sin embargo los anbios autctonos de las zonas cercanas no presentan an sntomas de infeccin, es especialmente interesante. Las elevadas distancias geogrcas entre las distintas poblaciones de la rana de uas, y sus hbitos muy relevante para conocer, en los prximos aos, la dispersin de la enfermedad a los anbios autctonos, por lo que uno de nuestros objetivos planteados para el futuro es el estudio, mas detallado, de las zonas cercanas a los puntos de introduccin que hemos detectado con el proyecto.

En Chile el hongo est presente en todas las poblaciones introducidas de anbios

Vectores involuntarios de transmisin del hongo

El sapo comn se ha convertido en el mejor aliado del hongo en el Parque Natural de Pealara, dispersando el patgeno por toda la zona y permitiendo su supervivencia incluso despus de que muchas charcas quedasen vacas por la accin devastadora del hongo.

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OBJETIVO 4.

Temperatura y virulencia
La temperatura se ha revelado como un factor clave para el desarrollo de la quitridiomicosis. El hongo patgeno soporta un amplio rango de temperaturas, pero slo cuando se encuentra dentro de un rango ptimo de temperaturas resulta letal para los anfibios.

Anlisis de las caractersticas ecolgicas mas favorables para el establecimiento y dispersin de la quitridiomicosis.
Uno de los resultados mas interesantes que ha producido el proyecto es, sin duda, la constatacin de que las condiciones medioambientales pueden resultar determinantes a la hora de desencadenar los brotes de quitridiomicosis. En el trabajo que publicamos en la prestigiosa revista Proceedings of the Royal Society, demostramos como las mortalidades masivas de anbios que se iniciaron en 1997 en Pealara estaban ligadas a cambios medioambientales drsticos en la zona. Varias variables medioambientales recogidas en la zona mostraron una variacin signicativa antes y despus de las mortalidades mediante el anlisis de las variables meteorolgicas recogidas a nivel del suelo se correspondan con patrones generales de circulacin de las capas altas de la atmsfera, como es la Oscilacin del Atlntico Norte. Por otro lado, tambin demostramos que las desviaciones en la temperatura media supercial en la zona haban alcanzado su valor mximo en 1996, esto es, justo antes de que se produjesen las primeras mortalidades masivas en la zona. El anlisis detallado a menor escala de la evolucin de las temperaturas en la zona mostr una relacin aun mayor con las

El cambio global est modulando la enfermedad

masivas. Por ejemplo, el nmero de das al mes soleados caractersticas de la biologa del hongo causante de la y calientes, entre otras variables relacionadas con la quitridiomicosis. As, analizamos el comportamiento de temperatura, experiment un crecimiento consistente con el patrn global de incremento de la temperatura observado en gran parte del planeta. Adems, demostramos como los patrones observados en la zona las temperaturas mximas registradas durante el perodo del ao en el que las especies afectadas experimentan mayores mortalidades, esto es, durante los meses de verano cuando completan la metamorfosis. Los anlisis concluyeron que el nmero de das durante parte del

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verano en los que se alcanzan Desgraciadamente, parece que las temperaturas comprendidas entre 21 zonas altas de montaa, demasiado y 27C, precisamente el rango de temperaturas ptimo para el crecimiento del hongo, se haba incrementando drsticamente en la zona desde que se vienen sucediendo las mortalidades masivas. Al contrario, el nmero de das con temperaturas poco fras antao para el desarrollo del hongo, resultan ahora un ambiente ideal para el crecimiento del patgeno. Estos estudios, realizados en el marco del proyecto, podran explicar por qu las zonas de montaa son las zonas las afectadas por la

favorables para el desarrollo del quitridiomicosis en Espaa y en gran hongo (inferiores a 21C o superiores parte de Europa, y conrman la a 27C) no ha variado signicativamente en los ltimos aos. Parece por tanto, que en los ltimos aos el calentamiento global en las zonas de montaa podra estar favoreciendo las temperaturas ptimas de crecimiento del hongo, mientras que por otro lado no ha hecho que se alcancen las temperaturas sucientemente altas que inhiben su crecimiento. necesidad de seguir profundizando en el anlisis de las caractersticas medioambientales de las zonas afectadas y en la implicacin del cambio climtico en las enfermedades emergentes en anbios.

Los cambios en las capas altas de la atmsfera tambin repercuten a nivel del suelo

Temperaturas ptimas de crecimiento del hongo

El nmero de das en los que se alcanzan las temperaturas suaves preferidas por el hongo ha aumentado en los ltimos aos en Pealara. Sin embargo, el aumento de las temperaturas no ha sido tan elevado como para alcanzarse las altas temperaturas que el hongo no puede soportar.

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OBJETIVO 5.

Anlisis comparativos
La quitridiomicosis afecta de forma muy diferente a las distintas especies de anfibios, por lo que resulta muy complicado establecer comparaciones sobre la incidencia de la enfermedad entre zonas con especies de anfibios distintas.

Determinacin de metodologas estandarizadas en la toma de muestras para el estudio de la quitridiomicosis.

Otro de los logros alcanzados en el proyecto ha sido la propuesta de mtodos estandarizados para el estudio de la quitridiomicosis. Quizs, nuestra propuesta mas interesante en este campo sea el uso de las larvas del sapo partero comn (A. obstetricans) como organismo modelo para el estudio de la incidencia del hongo patgeno en comprende desde Alemania hasta el sur de Espaa, consiste en el anlisis de 20 ejemplares de esta especie en fase larvaria. La muestra de cada ejemplar se toma mediante un frotis del disco oral con una torunda estril que puede almacenarse a temperatura ambiente hasta su anlisis. Despus, la cantidad de ADN del hongo patgeno recogida en cada muestra

Resulta Europa. Tras el anlisis de mas de 3000 puede cuanticarse en el laboratorio esencial poder muestras de casi 25 especies de anbios en mediante el uso de PCR en tiempo real. comparar la Espaa, hemos podido determinar que A. Otra de las ventajas de trabajar con las incidencia del hongo obstetricans es, sin duda, la especie mas larvas de esta especie es la facilidad de en distintos susceptible al ataque del hongo. Adems, este obtener muestras, dado el elevado perodo lugares
resultado coincide con la observacin de que esta especie aparece implicada en todos y cada uno de los episodios de mortalidades masivas que hemos registrado en Europa durante el proyecto. La propuesta para estandarizar un valor de prevalencia de la infeccin, dentro del amplio rango de distribucin de A. obstetricans en Europa, que larvario de la especie y su preferencia por masas de agua de carcter permanente. As por ejemplo en Espaa hemos determinado que el hongo patgeno se encuentra presente en 27 de las 98 localidades donde hemos aplicado este protocolo. Curiosamente, no existe relacin alguna entre las distintas variables ambientales analizadas en cada

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localidad y la prevalencia observada de la infeccin. Mas an, la prevalencia observada es altamente variable entre localidades muy prximas, incluso entre los valores los episodios de mortalidades masivas si que aparecen estadsticamente asociados a zonas altas (superiores a 1500 m de altura). Estos resultados conrman, por un lado, que el hongo patgeno causante de la quitridiomicosis en anbios presenta, desgraciadamente, unos requerimientos ambientales que pueda sobrevivir en prcticamente cualquier ambiente. Por otro lado, estos resultados indican que, no solo la presencia del

de prevalencia no van siempre asociados con mortalidades masivas y declives poblacionales, sino que por el contrario, frecuentemente son las condiciones ambientales las que desencadenar la enfermedad, probablemente como consecuencia de la mayor virulencia que alcanza el hongo dentro su rango ptimo de crecimiento. Este protocolo propuesto esta siendo utilizado ya por investigadores franceses y suizos ajenos al proyecto, y servir en un futuro prximo para llegar a conocer quitridiomicosis en Europa, donde actualmente solo ha sido estudiada en profundidad en nuestro pas, y precisamente gracias al presente

ORGANISMO MODELO

extremos de 0 y 100%. Sin embargo, juegan un papel determinante para

extraordinariamente bajos que hacen la situacin real de la incidencia de la

hongo, sino incluso valores extremos proyecto de investigacin.

Zoosporas del hongo en la zona bucal de una larva de sapo partero

Larvas de sapo partero

Las larvas del sapo partero comn se han revelado como un organismo modelo ideal para el anlisis de la incidencia de la quitridiomicosis por varios motivos: alta susceptibilidad, facilidad de obtencin de muestras, presencia en un amplio rango ecolgico y geogrfico, etc.

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OBJETIVO 6.

Presencia en el medio
La determinacin de la presencia del hongo patgeno en una determinada localidad requera, al inicio del proyecto, del anlisis de ejemplares de anfibios. Sin embargo, para llegar a entender la dinmica de la enfermedad resulta imprescindible poder determinar la presencia del hongo en el medio.

Determinacin de tcnicas de diagnstico de la quitridiomicosis.

Antes del presente proyecto de investigacin resultaba imprescindible el anlisis de muestras de ejemplares de anbios para la determinacin de la presencia del hongo patgeno en el medio. Sin embargo, desde hace tiempo se sospechaba que el hongo patgeno podra ser capaz de sobrevivir como saprto en el medio, incluso sin la presencia de anbios hospedadores. Por lo tanto, una de las metas del proyecto de investigacin era la obtencin de una metodologa que nos permitiera, no solo la deteccin ambiental del patgeno, sino la posibilidad de cuanticar la presencia del hongo en el medio sin la necesidad de obtener muestras de anbios. La metodologa propuesta por nosotros para la determinacin de la densidad del hongo patgeno ha sido publicada en la prestigiosa revista Diseases of Aquatic Organisms, siendo la primera propuesta realizada a nivel mundial. El mtodo propuesto consiste en el ltrado de pequeos volmenes de agua utilizando una membrana de celulosa capaz de retener las zoosporas del hongo que se encuentran en el agua. Una

TCNICAS DE DIAGNSTICO

HISTOLOGA
El anlisis de cortes histolgicos de la piel de los anfibios puede revelar la presencia del hongo patgeno.

MICROSCOPA
Los tubos de descarga del hongo en la piel de los anfibios pueden observarse mediante el microscopio electrnico.

RT PCR
La presencia del hongo en los anfibios puede determinarse mediante el anlisis de tejidos con tcnicas moleculares.

FILTRADO AGUA
El nuevo mtodo desarrollado detecta las zoosporas del hongo presentes en el medio.

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vez que la membrana se ha

en este pas son sorprendentes, ya que indican que la presencia del hongo patgeno en el medio es muy inferior a la observada en Espaa, cuando por el contrario muchas especies de anbios de Costa Rica estn afectadas por la quitridiomicosis, y el hongo patgeno est presente en la gran mayora de los ejemplares de anbios analizados en las zonas estudiadas. Las diferencias encontradas en ambos pases podran explicarse por la mayor proporcin de biomasa de anbios presentes en las zonas tropicales, que hara que el hongo realizase todo su ciclo vital en los hospedadores. Por otro lado, este resultado podra estar relacionado con la escasa habilidad del hongo patgeno para sobrevivir en el medio compitiendo con otros microrganismos, lo que explicara la idoneidad de las masas de agua oligotrcas de las zonas altas de montaa de Espaa.

FILTRADO AGUA

saturado, esta se conserva congelada hasta su anlisis en laboratorio. La extraccin del ADN del hongo se realiza mediante un kit comercial usado para muestras de suelo, y la cuanticacin del material gentico del hongo se realiza mediante PCR cuantitativo. Con esta metodologa hemos logrado detectar la presencia del hongo patgeno en volmenes de agua inferiores a 1 litro, y en mas del 60% de las masas de agua analizadas en la Sierra de Guadarrama en Madrid. Adems, hemos determinado la presencia del hongo en masas de agua de otras zonas de montaa en Espaa, fundamentalmente en la Cordillera Cantbrica y los Pirineos. Esta metodologa ha sido usada tambin en nuestros muestreos realizados en Costa Rica, cubriendo un amplio rango geogrco y en multitud de medios acuticos distintos. Los resultados obtenidos

Proceso de anlisis
La metodologa propuesta se basa en el filtrado de pequeos volmenes de agua mediante una jeringuilla y una membrana que recoge las zoosporas del hongo. Posteriormente, y ya en el laboratorio, se extrae el ADN del hongo y se cuantifica mediante tcnicas moleculares de PCR en tiempo real.

Primer mtodo para la deteccin ambiental del hongo

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OBJETIVO 7.

Estudios multidisciplinares
El estudio de la quitridiomicosis requiere el uso de multitud de tcnicas de anlisis, tales como la microscopa electrnica, la histologa bsica, o el anlisis molecular mediante PCR en tiempo real, que necesitan un cierto grado de aprendizaje.

Aporte de conocimientos para la deteccin y el anlisis de la enfermedad a los investigadores participantes de otros pases.
Uno de los objetivos planteados en el proyecto de investigacin es que este sirviese para aportar conocimientos a los investigadores participantes de otros pases. Se persegua as que el proyecto no solo sirviera para impulsar el conocimiento de la enfermedad en otras zonas del mundo, sino tambin para promover el desarrollo de grupos de investigacin independientes en otros pases. Gracias al proyecto de investigacin, todos los investigadores de otros pases que han participado en el proyecto, y que no contaban al inicio de este con conocimientos en distintas tcnicas de diagnstico y de estudio de la enfermedad, han recibido instruccin. El proceso de instruccin se ha realizado, fundamentalmente, por parte del equipo britnico y espaol del proyecto. La instruccin de los investigadores se ha realizado tanto durante las visitas del responsable espaol del proyecto a los diferentes centros de investigacin de los otros pases, como durante las visitas de los investigadores extranjeros a Espaa e Inglaterra. Entre la instruccin realizada por el responsable espaol en visitas a miembros del equipo de otros pases, destacan las realizadas en varias ocasiones a la Universidad de Chile, as como las realizadas al Poornaprajna Institute of Scientic Research en India. Entre estas visitas de investigadores de otros pases, cabe destacar la visita del Dr. Merino del equipo ecuatoriano que realiz a Espaa y a Inglaterra, y en las que recibi instruccin sobre el uso de tcnicas histolgicas y moleculares para la deteccin del hongo patgeno. Tambin es de destacar el entrenamiento del responsable cubano del proyecto, Ariel Rodrguez, en tcnicas moleculares que recibi durante su estancia en el Museo Nacional de Ciencias Naturales en Madrid.

Todos los participantes en el proyecto han intercambiado conocimientos

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