Introduccin

Beatriz Alvarez Laboratorio de Enzimologa

Curso de Enzimologa 2010

Coordinacin: Beatriz Alvarez, beatriz.alvarez@fcien.edu.uy. Fecha: Segundo semestre, del 7 de setiembre al 11 de noviembre. Tericos: 2 tericos semanales de 2 horas cada uno, los das martes y jueves de 10 a 12 horas, saln 107. Total de horas de terico: 40 horas. Prcticos: 1 prctico por semana de 4 horas, los das martes o los das jueves, de 13 a 17 horas, en el saln 304 o en los Laboratorios de Enzimologa y Fisicoqumica Biolgica. Total de horas de prctico: 40 horas. Crditos: (40*2 + 40*1.5)/15 = 9.3 Ganancia del curso: El curso se ganar por asistencia a los prcticos y aprobacin de los correspondientes informes. Evaluacin: Examen. Cupo: 40 estudiantes.

Apoya PEDECIBA Biologa. Auspicia PEDECIBA Qumica.

Material para el curso, protocolos de prctico, repartidos de ejercicios: Subespacio http://enzimologia.fcien.edu.uy/

Temas Introduccin. Cintica enzimtica. Efectos del pH. Efectos de la temperatura. Inhibicin. Reacciones de dos sustratos. Cintica preestacionaria. Mecanismos. Regulacin y cooperatividad. Sistemas multienzimticos.

Objetivos
Estudio sistemtico de diferentes temas de enzimologa que permitan una aproximacin a la pregunta: cmo funcionan las enzimas? Curso dirigido a estudiantes avanzados y de posgrado que provee de conceptos de cintica enzimtica y mecanismos, as como de herramientas prcticas para el trabajo con enzimas.

Bibliografa
Textos de Bioqumica
Lehninger, Stryer, Voet (Bioqumica), Mathews, Devlin, Zubay Segel, Biochemical calculations, John Wiley (1976)

Textos de Enzimologa
Dixon and Webb, Enzymes, Longman (1979) SUBESPACIO Fersht, Structure and mechanism in protein science, Freeman (1999) Cornish-Bowden, Fundamentals of enzyme kinetics, Portland (1995) Segel, Enzyme kinetics, Wiley (1993) Methods in Enzymology, volmenes 63, 64, 87, 249, Academic Press. Price and Stevens, Fundamentals of enzymology, Oxford (1989) Frey and Hegeman, Enzymatic reaction mechanisms, Oxford (2007) Eisenthal and Danson, Enzyme Assays, A Practical Approach, Oxford (2002) Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover (1987). Incluye el captulo de 1975 The Circe Effect.

RECURSOS DE RED Brenda http://www.brenda.uni-koeln.de Manual Worthington http://www.worthington-biochem.com/manual/manIndex.html ExPASy Proteomics Server (DE TODO!) http://ca.expasy.org ExPASy Enzyme Nomenclature Database http://ca.expasy.org/enzyme/ ExPASy Metabolic Pathways http://us.expasy.org/cgi-bin/search-biochemindex Enzyme Structures Database http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/ Enzyme Nomenclature http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/

Las enzimas son catalizadores biolgicos. Un catalizador es una sustancia que acelera la velocidad de una reaccin y se recupera incambiado. La catlisis biolgica tiene gran importancia: El azcar puede guardarse por aos. Sin embargo, nos sirve como fuente de energa en segundos, gracias a la catlisis.

Resea histrica
La especie humana no demor mucho en aprender a aprovechar el poder cataltico de las enzimas, por ejemplo, para procesar alimentos (queso, pan, cerveza, vino). La referencia ms antigua acerca de la utilizacin de enzimas es la elaboracin de vino en el Cdigo de Hammurabi (2100 AC, Babilonia).

I enzymes

La comprensin de los mecanismos como actan las enzimas evolucion de estudios acerca de la fermentacin alcohlica realizados en el siglo XIX.

La historia de la enzimologa es la historia de la bioqumica.

Jns Jakon Berzelius

1837, Suecia El concepto de catlisis "Tenemos una nueva fuerza que pertenece a la Naturaleza orgnica e inorgnica, que provoca reactividad qumica ... reordenando los componentes de una sustancia hacia otras relaciones sin necesariamente cambiar sus propios componentes..."

Pasteur y Liebig Estn vivas las enzimas?

Justus von Liebig

famoso por inventar los laboratorios para estudiantes

Alemania, 1839 Teora qumica de la fermentacin

"Los tomos de un cuerpo en putrefaccin, el fermento, estn en continuo movimiento; cambian sus posiciones y forman nuevas combinaciones. Estos tomos mviles estn en contacto con los tomos del azcar, que est unida solo por fuerzas dbiles. El movimiento de los tomos del fermento no puede pasar sin efecto sobre los tomos del azcar. O se anula el movimiento o el azcar se mover tambin. As el azcar sufre un desplazamiento de sus tomos que se rearreglan para formar alcohol y dixido de carbono."
Liebig crea que la fermentacin era causada por la trasmisin de vibracin de los fermentos al material a fermentar.

Louis Pasteur
Francia, 1858 Teora de la "fuerza vital"
"Veo en el hecho de la fermentacin un fenmeno relativo a la vida -un hecho fisiolgico- que origina mltiples productos, todos los cuales son necesarios para la clula. Creo que no existe fermentacin sin que haya, simultneamente, la organizacin, el desarrollo y la multiplicacin (es decir el crecimiento) de la levadura u otros glbulos, o al menos la continuacin de la vida de los glbulos que ya estaban presentes. La totalidad de los resultados me parece en oposicin a las opiniones de M. Liebig."
Pasteur crea que la fermentacin era inseparable de las clulas vivas.

De dnde sale el nombre ENZIMA?

El nombre "enzima" fue acuado en 1878 por Fredrich Wilhelm Khne. Proviene del griego: en (dentro de) + zima (levadura). Enfatiza que hay algo en la levadura, por oposicin a la levadura misma, que cataliza los procesos, y distingue las enzimas de los organismos que las producen.

Hans y Eduard Bchner

Alemania, 1897 Las enzimas son molculas
(Nobel 1907)

"Respecto a la teora de la fermentacin ahora podemos hacer la siguiente afirmacin: NO es necesario tener un aparato tan complicado como la clula viviente de una levadura para que se lleve a cabo la fermentacin. Ms bien un fermento soluble, o enzima, se considera el portador de la actividad fermentativa del jugo de la prensa. Llamaremos a este agente subcelular de la fermentacin zimasa."
Los hermanos Buchner observaron que extractos libres de clulas son capaces de realizar la fermentacin del azcar a etanol y dixido de carbono.

Emil Fischer
(Nobel 1902)

Alemania, 1894 Las enzimas son selectivas

Hiptesis llave-cerradura

El efecto especfico en los glucsidos puede ser explicado asumiendo que el contacto ntimo entre las molculas, necesario para la liberacin de la reaccin qumica, es posible solo con configuraciones geomtricas similares. Para ilustrarlo dir que la enzima y el glucsido encajan uno en el otro como una llave y una cerradura... Las enzimas puedenas distinguir entre diferentes estereoismeros de azcar. Las enzimas consisten en "molculas construidas asimtricamente". As, "la enzima y el sustrato encajan uno en el otro como una llave en una cerradura".

Las enzimas son protenas

James Sumner (Estados Unidos) 1926. Cristaliza la ureasa y obtiene slo aminocidos cuando la hidroliza (Nobel 1946). John Northrop (Nobel 1946) y Moses Kunitz 1926. Northrop cristaliza la pepsina. Cristalizan enzimas digestivas y comprueban que la actividad biolgica no se puede separar de la protena.

COENZIMAS Y COFACTORES Las enzimas son protenas. La actividad cataltica depende de la integridad de la estructura y de que la protena no est desnaturalizada. Los grupos funcionales de los aminocidos participan en la catlisis. Muchas enzimas no requieren nada ms, pero algunas enzimas requieren un cofactor. Los cofactores pueden ser iones metlicos o coenzimas orgnicas. Si el cofactor est unido muy fuertemente o covalentemente se denomina grupo prosttico. apoenzima + cofactor = holoenzima

NOMENCLATURA En general, las enzimas se nombran agregando el sufijo asa. Ej: ureasa, lactato deshidrogenasa. Este sufijo proviene del nombre del extracto de malta que hidrolizaba almidn en el siglo XIX, diastasa. La Comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular propone clasificar y nombrar las enzimas de acuerdo a las reacciones qumicas que catalizan.

Clasificacin

Tipo de reaccin catalizada

1. Oxidorreductasas Reacciones redox 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Liasas 5. Isomerasas 6. Ligasas Transferencia de grupos funcionales Reacciones de hidrlisis Eliminacin de grupos para formar dobles enlaces Isomerizacin Formacin de enlaces acoplada a la hidrlisis de ATP

Cada enzima pasa a tener: Un nombre recomendado, generalmente el nombre trivial histrico. Un nombre sistemtico: nombre del sustrato seguido por el tipo de reaccin. Un nmero formado a su vez por 4 nmeros: EC _._._._ carboxipeptidasa A peptidil-L-aminocido hidrolasa EC 3.4.17.1
EC indica Enzyme Commission El primer nmero indica la clase: hidrolasa El segundo indica subclase: acta en enlaces peptdicos El tercero, la subsubclase: metalocarboxipeptidasa (Zn2+) El cuarto es un nmero arbitrario en la subsubclase

alcohol deshidrogenasa alcohol:NAD+ oxidorreductasa EC 1.1.1.1

A diferencia de otros catalizadores qumicos, las enzimas se caracterizan por:

1. Altsimo poder cataltico. 2. Condiciones de reaccin suaves. 3. Alta especificidad por el sustrato (reactivo) y por los productos de la reaccin. 4. Su actividad puede ser regulada. 5. Pueden acoplar transformaciones de energa.

Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Aceleran las reacciones por factores de 105 a 1017. Consideremos 109 como promedio. Cunto es 109? Por ejemplo, un estudiante tiene 21 aos. 21 x 109 = 21 mil millones de aos = 21,000,000,000 aos.

Enzyme OMP decarboxylase Staphylococcal nuclease AMP nucleosidase Carboxypeptidase A Ketosteroid isomerase TPI isomerase Chorismate mutase Carbonic anhydrase

Nonenzymatic half-life 78,000,000 years 130,000 years 69,000 years 7.3 years 7 weeks 1.9 days 7.4 hours 5 seconds

Uncatalyzed rate (kun, s-1) 2.8 10-16 1.7 10-13 1.0 10-11 3.0 10-9 1.7 10-7 4.3 10-6 2.6 10-5 1.3 10-1

Catalyzed rate (kcat, s-1) 39 95 60 578 66,000 4,300 50 1 106

Rate enhancement (kcat/kun) 1.4 1017 5.6 1014 6.0 1012 1.9 1011 3.9 1011 1.0 109 1.9 106 7.7 106

Especificidad de la glucosa oxidasa por el sustrato

glucosa + O2 cido glucnico + H2O2

Azcar Velocidad relativa -D-glucosa 100 2-desoxi-D-glucosa 25 6-desoxi-6-fluoro-D-glucosa 3 6-metil-D-glucosa 1.85 D-manosa 0.98 -D-glucosa 0.64 D-fructosa 0 sacarosa 0 glucosa-6-fosfato 0

Sitio activo
Los sustratos se unen a una regin especfica de la enzima denominada sitio activo para formar el complejo enzima-sustrato.
La idea de complejo enzima-sustrato surge de experimentos con invertasa a fines del siglo XIX. OSullivan y Thompson, en 1890, ven que la resistencia trmica de la invertasa aumenta cuando hay sacarosa. Brown, en 1892, relaciona la cintica de saturacin con la formacin de un complejo enzima-sustrato, deduce que cuando se alcanza la velocidad mxima, toda la enzima est como ES. Chance, en 1943, ve por primera vez un complejo enzimasustrato. En este trabajo utiliza por primera vez espectrofotometra de flujo detenido y simulaciones numricas.

Qu caractersticas tienen los sitios activos?

1. El sitio activo ocupa una porcin pequea de la protena.

Unin de la quimotripsina a su sustrato

2. El sitio activo es una entidad tridimensional formada por grupos funcionales que provienen de diferentes partes de la secuencia proteica.

Lisozima y diferentes residuos de su sitio activo

3. Los sustratos se unen a las enzimas por mltiples uniones dbiles. - Interacciones de van der Waals. - Interacciones electrostticas - Puentes de hidrgeno - Interacciones hidrofbicas Las constantes de equilibrio de los complejos ES van de 10-2 a 10-8 M, lo cual corresponde a energas libres entre -3 y -12 kcal/mol, considerando que G' = -RT ln K'eq.

Interacciones entre la quimotripsina y el sustrato

3. Los sitios activos son ranuras o hendiduras. En general, tienen carcter no polar, excluyen el agua, y tienen ciertos residuos polares, de tal forma que constituyen un microambiente.

5. La unin del sustrato depende de una disposicin definida de tomos en el sitio activo.
El sitio de unin al sustrato puede existir en ausencia de sustrato (hiptesis de llavecerradura de Emil Fischer). O puede formarse el sitio de unin al unirse el sustrato (hiptesis de encaje inducido de Daniel Koshland).

Encaje inducido
Estructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa

glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP

Cmo lo hacen?
La cuestin fundamental de la enzimologa es comprender cmo hacen las enzimas para ser catalizadores tan potentes y especficos

Las enzimas son catalizadores, aceleran la velocidad de la reaccin pero no alteran la posicin del equilibrio.

G' = -RT ln K'eq

Teora del estado de transicin (Henry Eyring, 1935)

La teora del estado de transicin relaciona la velocidad de una reaccin a la diferencia en energa libre entre el estado basal y el estado de transicin. La transformacin de S en P ocurre a travs de la formacin de un estado de transicin S*.
K* k S* P S

La energa de activacin de Gibbs G* es la diferencia de energa entre el estado de transicin y el sustrato. La velocidad k es proporcional a [S*], la cual a su vez depende de K*. [S*] = [S] e-G*/RT (pues G' = -RT ln K'eq) k = kBT/h e-G*/RT
donde kB es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.

Teora del estado de transicin (Henry Eyring, 1935)

k = (kBT/h) e-G*/RT La velocidad de una reaccin aumenta cuando la energa de activacin, G*, disminuye. A su vez, G* tiene un componente de entropa y un componente de entalpa: G* = H* -TS* k = (kBT/h) e-S*/R e-H*/RT La energa de activacin puede ser grande y la reaccin lenta cuando el estado de transicin es demasiado energtico u ordenado. H* es siempre positivo porque se requiere energa para reorganizar los enlaces. S* puede ser negativo o positivo dependiendo si el estado de transicin tiene ms o menos grados de libertad.

Las enzimas aceleran las reacciones porque estabilizan el estado de transicin y bajan la barrera de activacin.
La unin de la enzima al sustrato genera una nueva va de reaccin en la que la energa del estado de transicin es menor que en ausencia de enzima

El poder de las enzimas deriva de la energa de unin entre la enzima y el sustrato. Esta energa surge de las mltiples interacciones dbiles entre la enzima y el sustrato, y contribuye a la catlisis y a la especificidad. Las interacciones dbiles entre la enzima y el sustrato se optimizan en el estado de transicin. Los sitios activos de las enzimas no son complementarios a los sustratos sino que son complementarios a los estados de transicin. Se establecen interacciones dbiles entre la enzima y el sustrato, pero stas son optimizadas en el estado de transicin. La energa liberada en el establecimiento de estas interacciones dbiles hace disminuir la barrera de activacin.

sin enzima

con enzima complementaria al sustrato con enzima complementaria al estado de transicin

Los anlogos del estado de transicin son inhibidores competitivos de alta afinidad.
Ejemplo: prolina racemasa bacteriana El estado de transicin es planar. Por lo tanto, anlogos planos de la prolina actan como inhibidores competitivos muy potentes.

Anlogos de estado de transicin

Proteasas de serina Se unen preferentemente al intermediario tetradrico.

Si una enzima acelera la velocidad de una reaccin por un factor de 109, cunto debe bajar la barrera de activacin? Haciendo cuentas con la ecuacin k = (kBT/h) e-G*/RT podemos concluir que para acelerar la reaccin por un factor de 109, la barrera de activacin debe disminuir 12 kcal/mol.

Cunta energa se libera con una estas uniones? - Interacciones de van der Waals. - Interacciones electrostticas - Puentes de hidrgeno - Interacciones hidrofbicas La energa que se libera al establecerse una de estas uniones dbiles es de 1-7 kcal/mol. Por lo tanto, la formacin de mltiples uniones dbiles a nivel del estado de transicin puede dar cuenta de las aceleraciones observadas.

La energa de unin entre la enzima y el sustrato puede utilizarse para bajar el componente entrpico de la barrera de activacin (G* = H* -TS*)
Uno de los aspectos ms importantes de la catlisis enzimtica es la entropa. Las reacciones en solucin son lentas porque la aproximacin de los reactivos implica una prdida importante de entropa. Las reacciones enzimticas estn confinadas al sitio activo. Los grupos que reaccionan forman parte de la misma "molcula", el sitio activo, por lo cual no hay prdidas de entropa traslacional o rotacional al formarse el estado de transicin. La enzima, al unirse al sustrato, logra que los reactivos estn prximos, inmovilizados y alineados ptimamente para reaccionar. Esta ventaja entrpica "se paga" con la energa de unin entre la enzima y el sustrato.

Adems de los ya mencionados: 1. catlisis por efecto de proximidad y orientacin 2. catlisis por unin preferencial de estado de transicin Determinados grupos funcionales alineados apropiadamente en el sitio activo contribuyen a la catlisis mediante los siguientes mecanismos: 3. catlisis general cido-base 4. catlisis covalente 5. catlisis por iones metlicos 6. catlisis electrosttica

Catlisis general cido base

Un grupo de la enzima participa como aceptor o dador de protn, estabilizando intermediarios cargados inestables. a) no catalizada b) Catlisis general cida b) Catlisis general bsica

Catlisis covalente
Un grupo del sitio activo de la enzima, generalmente un buen nuclefilo, reacciona covalentemente con el sustrato modificndose transitoriamente.

Catlisis por iones metlicos

70 % de las enzimas necesitan metales! Algunas formas por las cuales los metales participan en la catlisis: 1. Unindose a los sustratos para orientarlos correctamente. 2. Mediando reacciones redox a travs de cambios en el estado de oxidacin del metal. 3. Estabilizando cargas negativas.

Catlisis electrosttica
En el sitio activo de las enzimas, las interacciones electrostticas son muy fuertes porque el agua est excluida y las constantes dielctricas son bajas. La distribucin de cargas en el sitio activo es tal que estabiliza los estados de transicin.

Qu se preguntan hoy en da los enzimlogos?

La revolucin de la ingeniera gentica y los datos de estructura cristalogrfica han vuelto disponibles muchsimos datos. Se ha avanzado mucho en la elucidacin de mecanismos enzimticos y en la base estructural de la catlisis. Los ejemplos ms estudiados ponen de manifiesto que es necesaria informacin estructural, cintica y mecanstica para comprender un determinado sistema enzimtico.

Pero, qu queda por responder?

An no se cuenta con explicaciones cuantitativas para los altos niveles de catlisis. Los efectos de estabilizacin del estado de transicin, efectos de proximidad, catlisis cidobase, etc., quedan cortos.

Repaso de cintica

REPASO DE CINTICA QUMICA

Una reaccin ocurre en una serie de pasos individuales. Cada uno de estos pasos se denomina reaccin elemental. Una reaccin de estequiometra A P puede ocurrir a travs de una secuencia de reacciones elementales A Ia Ib P que describen el mecanismo. En una reaccin elemental, el nmero de especies que se combinan para formar el estado de transicin se denomina molecularidad. En general las reacciones son unimoleculares o bimoleculares. Excepcionalmente, termoleculares.

A una temperatura determinada, la velocidad de una reaccin elemental es proporcional a la concentracin de especies que participan, pues depende de la frecuencia con que se encuentran las molculas. Convencin de la IUPAC:
aA + bB + .... pP + qQ + ....
v=1 d [A] 1 d [B] 1 d [P] 1 d [Q] == = = k [A]a [B]b a dt b dt p dt q dt

El orden de una reaccin es la suma de los exponentes de los factores de concentracin en la ley de velocidad. Debe ser determinado experimentalmente. Para una reaccin elemental, el orden es igual a la molecularidad.

REACCIONES DE ORDEN UNO AP

[Producto]

d [A] d [P] v== = k [A] dt dt

Integrando entre t = 0 y t:
[A] = [A]o exp (-kt ) ln [A] = ln [A]o - kt [P] = [A]o [1 - exp (-kt )]

Tiempo

En una reaccin de orden uno, la vida media es constante e independiente de la concentracin inicial, t1/2 = ln2/k

REACCIONES DE ORDEN DOS, v = k [A]2 2AP

1 d [A] 2 v== k [A] 2 dt

[A]0 [A] = 1 + [A]0 2 kt 1 1 = + 2 kt [A] [A]0

REACCIONES DE ORDEN DOS A+BP

v=d [A] = k [A][B] dt [B]0 [B] ln = ln + k ([B]0 -[A]0 )t [A] [A]0

Ahora, si [B]0 >> [A]0 la reaccin es de pseudo primer orden y la constante de velocidad aparente es k = k[B]0.

[Producto]

kobs = k[B]0
Tiempo

kobs

[P] = [A]o [1 - exp (-kobst )]

[B]0

REACCIONES DE ORDEN CERO

d [A] v==k dt [A] = [A]0 - kt

Cmo puede determinarse el orden de reaccin?

Mtodo integral: Se observa cmo vara la concentracin de producto (o reactivo) a lo largo del tiempo, hasta completitud. Se ve cmo ajusta a la ecuacin de velocidad integrada, por ejemplo, a una funcin exponencial. Mtodo de las velocidades iniciales: Se observa la formacin de concentraciones muy pequeas de producto, durante un perodo en el cual las concentraciones de reactivos se mantienen constantes.

DIMENSIONES Concentraciones en M Velocidades en M s-1 Constantes de velocidad de primer orden en s-1 Constantes de velocidad de orden dos en M-1 s-1 PASO DETERMINANTE DE LA VELOCIDAD En una reaccin compleja, si un paso es mucho ms lento que los otros, la velocidad del proceso ser la del paso lento.

REACCIONES CATALIZADAS ENZIMTICAMENTE Las reacciones catalizadas enzimticamente no tienen un orden de reaccin simple. Sin embargo, los pasos individuales s tienen rdenes simples. Unin de enzima a sustrato
E + S ES

proceso bimolecular de orden dos

Transformacin del complejo ES en producto

ES E + P

proceso unimolecular de orden uno

Cintica enzimtica

Historia
Las velocidades de las reacciones catalizadas enzimticamente fueron estudiadas por primera vez a fines del Siglo XIX. Estudios con invertasa: sacarosa + H2O glucosa + fructosa OSullivan y Thompson (1890) ven que la velocidad depende de la acidez y que es proporcional a la cantidad de enzima. La resistencia trmica aumenta en presencia del sustrato sacarosa. Brown (1892) ve que la velocidad primero aumenta con la concentracin de sacarosa y luego se vuelve independiente. Pone el concepto de complejo ES en trminos cinticos. Problemas experimentales: control de pH y mutarrotacin de la glucosa. No se pudo progresar hasta que se control el pH. Concepto de amortiguadores y escala de pH: Sorensen, 1909.

Michaelis y Menten deciden hacer experimentos ms prolijos 1. Fijan el pH con amortiguador actico. 2. Consideran la mutarrotacin de la glucosa. 3. Miden velocidades iniciales

Hoy en da, cmo se determina la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente?

pH y temperatura constantes, amortiguador se adiciona sustrato y enzima a una solucin amortiguadora y se mide la desaparicin de sustrato o la aparicin de producto se puede seguir una propiedad fsica que vare en forma proporcional a la concentracin mtodos continuos o discontinuos (de muestreo) se determina la velocidad inicial, v0 v0 = d[P]/dt = -d[S]/dt a tiempo cero

VELOCIDAD INICIAL
Los enzimlogos casi siempre determinan velocidad inicial, v0. Esto es muy importante, pues se evita que la enzima se inactive, que se consuma sustrato, que cambie el grado de saturacin de la enzima, que ocurra la reaccin reversa, que haya inhibicin por producto. Cuando se est en velocidad inicial, las grficas de concentracin de producto en funcin del tiempo son lineales. En general, cuando se est en velocidad inicial, reaccion menos de 10% del sustrato.

Experimentalmente, los primeros enzimlogos encuentran que:

V0

V0

[enzima]

[sustrato]

- la velocidad inicial vara en forma lineal con la concentracin de enzima - la velocidad inicial depende hiperblicamente de la concentracin de sustrato

Para empezar a derivar la ecuacin de Michaelis y Menten

k1 k2 E + S ES E + P k -1

v=-

d [S] d [P] = = k 2 [ES] dt dt

Asumimos: velocidades iniciales [S]T = [S] + [ES] como [S]T >> [E]T entonces [S]T = [S] [E]T = [E] + [ES]

Hiptesis de equilibrio (Michaelis y Menten, 1913)

ES est equilibrio con E y con S Equilibrio de disociacin: k1[E][S] = k-1[ES]

ES E + S

[E][S] k -1 = = KS [ES] k1
como [E] = [E]T [ES]

KS =

[E][S] ([E]T - [ES]) [S] = [ES] [ES]

despejando [ES]

[ES] =

[E]T [S] K S + [S]

entonces

v = k 2 [ES] = k 2

Vmax [S] [E]T [S] = K S + [S] K S + [S] k -1 k1

donde Vmax = k2 [E]T y

Ks =

Hiptesis de estado estacionario (Briggs y Haldane, 1925)

ES est en estado estacionario

d [ES] = 0 = k1[E][S] - k -1[ES] - k 2 [ES] dt k1[E][S] = (k -1 + k 2 ) [ES] [E][S] k + k2 = -1 = KM [ES] k1

KM = [E][S] ([E]T - [ES]) [S] = [ES] [ES]

despejando [ES]:

[ES] =

[E]T [S] K M + [S]

entonces

v = k 2 [ES] = k 2

Vmax [S] [E]T [S] = K M + [S] K M + [S] k -1 + k 2 k1

donde Vmax = k2 [E]T y

KM =

En suma:
k2 ES E + P E + S k -1 k1

Vmax [S] v= K M + [S]

Vmax = k 2 [E]T
k -1 + k 2 KM = k1

Del repartido de ejercicios 12. Para una enzima michaeliana, cunto debe aumentar la concentracin de sustrato para que la velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? Y si la enzima presenta cooperatividad positiva?

13. La hexoquinasa cataliza la fosforilacin de la glucosa con un KM de 0.13 mM. glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP. a. Qu fraccin de Vmax se observara cuando la concentracin de glucosa corresponde al valor fisiolgico de 5 mM? b. Cuando la glucosa se une a la enzima, sta sufre un cambio conformacional. Recin entonces puede unirse el ATP a la enzima. Qu sentido tiene este fenmeno?

Cmo se determinan los parmetros cinticos (KM, Vmax y Vmax/KM) de una reaccin catalizada enzimticamente?

Midiendo la velocidad inicial para concentraciones crecientes de sustrato.

Cmo determinamos KM, VMAX y VMAX/KM? Tratemos de no usar la linealizacin del doble recproco de Lineweaver-Burk!

VMAX
error bars 5% VMAX

v0

Slope = VMAX/KM KM [Substrate]

[Substrate]/v0

1/v0

X
Slope = KM/VMAX 1/[Substrate]

Slope = 1/VMAX

1/VMAX

KM/VMAX [Substrate]

Lineweaver-Burk plot

Hanes or Woolf plot

From Cornish-Bowden, 1995, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press.

Qu significan KM, Vmax, kcat y kcat/KM?

KM
K M = [S] cuando v = V max tiene unidades de concentracin (M) k -1 + k 2 KM = k1 Si k 2 << k -1, K M = K S Ks representa la afinidad entre la enzima y el sustrato, pues es la constante de equilibrio de disociacin K M representa una constante aparente de disociacin, [E][S] pues K M = [ES] cuanto ms pequeo sea K M, hay menos enzima libre y ms complejo enzima-sustrato

En suma:
KM es una constante aparente de disociacin que puede ser considerada como la constante de disociacin global de todas las especies enzima-sustrato.

kcat
Vmax = kcat [E]T entonces kcat = Vmax / [E]T en un mecanismo simple, kcat = k2 y representa el proceso de primer orden de transformacin de ES en P en un mecanismo complejo, representa el lmite inferior de las constantes de velocidad de la transformacin de ES en P -1 -1 unidades de tiempo (s ) es el nmero de recambio (turnover number), mximo nmero de molculas de S que se transforman en P por unidad de tiempo y por sitio activo.

En suma:
kcat es una constante de primer orden que se relaciona con las propiedades del complejos enzimasustrato (incluyendo enzima-intermediario y enzimaproducto).

kcat/KM

como K M =

[E][S] , la ecuacin de Michaelis y Menten [ES] k puede escribirse v = k cat [ES] = cat [E][S] KM

kcat/KM representa la constante aparente de orden dos para la reaccin de la enzima y el sustrato tiene unidades de M-1 s-1 debe ser menor o igual que las constantes de orden dos en el mecanismo da idea de la eficiencia cataltica, puede llegar a ser igual a k1 y estar limitada por difusin k cat k2 k k = = 1 2 k -1+k 2 KM k -1+k 2 k1 da idea de la especificidad de la enzima por el sustrato
E A PA E B PB

v A = k cat [EA] = (k cat /K M )A [E] [A] vB = k cat [EB] = (k cat /K M )B [E] [B]

(k /K ) [A] vA = cat M A vB (k cat /K M )B [B]

En suma:
kcat/KM es una constante aparente de orden dos que se relaciona con las propiedades de la enzima libre y el sustrato libre.

Algunos valores
Enzima Acetilcolinesterasa Anhidrasa carbnica Catalasa Fumarasa Ureasa Sustrato Acetilcolina CO2 H2O2 Fumarato Urea KM (M) 9.5 x 10-5 0.012 0.025 5.0 x 10-6 0.025 kcat (s-1) 1.4 x 104 1.0 x 106 1.0 x 107 800 1.0 x 104 kcat/KM (M-1 s-1) 1.5x106 8.3x107 4.0 x 108 1.6 x 108 4.0 x 105

Enzimas glicolticas
Enzima Glucosa 6-P isomerasa Aldolasa Triosafosfato isomerasa Gliceraldehdo 3P deshidrogenasa Fosfoglicerato quinasa Fosfoglicerato mutasa Enolasa Piruvato quinasa Glicerol fosfato deshidrogenasa Lactato deshidrogenasa Sustrato G6P FBP G3P G3P 3PG 3PG 2PG PEP GP Pyr

[S] (M)
130 32 3 3 60 60 7 23 220 51

KM (M) 210 1000 460 70 1200 5000 70 200 190 59

Las enzimas que quieren maximizar la velocidad evolucionan de tal forma de maximizar kcat/KM y de que KM sea mayor que [S], la concentracin fisiolgica de sustrato, pues v = kcat/KM [E] [S].
(Ideas desarrolladas por Alan Fersht)

Del repartido de ejercicios:

14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. a) Una enzima participa en la reaccin alterando la constante de equilibrio de la reaccin, sin alterar la barrera de activacin (Ea). b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por la enzima. c) Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas. d) El nmero de recambio (kcat) es el nmero de moles de sustrato transformado por minuto por mol de centro activo. e) La catlisis puede ser explicada por una unin tipo llave y cerradura entre el sustrato y la enzima. f) La velocidad inicial de una reaccin catalizada enzimticamente es independiente de la concentracin de sustrato. g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentracin de enzima. h) El KM equivale a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la mxima. i) El KM vara con la concentracin de enzima.

Experimentalmente, se encuentra que:

V0

V0

[enzima]

[sustrato]

- la velocidad inicial vara en forma lineal con la concentracin de enzima - la velocidad inicial depende hiperblicamente de la concentracin de sustrato

k2 ES E + P E + S k -1 k1

Vmax [S] v= K M + [S]

Vmax = k 2 [E]T
k -1 + k 2 KM = k1

k2 ES E + P E + S k -1 k1

Velocidad inicial o de estado estacionario

0 20 40 60 80 100 120

[Producto]

Tiempo (s)

[Producto]

[Producto]
0

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

1000

2000

3000

4000

5000

Tiempo (s)

Tiempo (s)

Preestacionario

Curso total de reaccin

Ecuacin de Michaelis-Menten integrada

[Producto]

Velocidad inicial
Tiempo

Cuando el enlentecimiento en la formacin de producto se debe solo a la deplecin de sustrato, se puede encontrar KM y VMAX con un solo tubo de ensayo: - Determinando v para diferentes [S] con las tangentes. - Integrando la ecuacin de Michaelis-Menten.

Integrando la ecuacin de MichaelisMenten

VMAX [S] d[P] d[S] v= == dt dt K M + [S] Balance de masa [S]0 = [S] + [P] d[P] VMAX ([S]0 - [P]) = dt K M + [S]0 - [P] d[P] (K M + [S]0 - [P]) = VMAX dt [S]0 - [P] Condicion de frontera [P] = 0 a t = 0 (K M + [S]0 ) d[P] [P] d[P] [S]0 - [P] - [S]0 - [P] = VMAX dt VMAX t = [P] + K M ln Analogamente: VMAX [S]0 t = [S]0 - [S] + K M ln [S] [S]0 [S]0 - [P]

[S]0 VMAX t = [S]0 - [S] + K M ln [S] Rearreglando:

VMAX

[S]0 - [S] t

KM VMAX/KM

[S]0 1 ln t [S]

VMAX [S] d[P] d[S] v= == dt dt K M + [S] caso limite: K M << [S]0 d[P] = VMAX dt [P] = VMAX t

VMAX [S] d[P] d[S] v= == dt dt K M + [S] Caso limite: K M >> [S]0 d[S] VMAX = [S] dt KM VMAX [S] = [S]0 exp t KM VMAX ln [S] = ln [S]0 t KM
Ln [S] VMAX KM

Sustratos con alta afinidad

Cuando [E]0 ~ [S]0, ya no se puede asumir que [E]0 << [S]0 Ya no se cumple:

Vmax [S] v= K M + [S]

No va a haber un buen ajuste a una hiprbola y las linealizaciones van a presentar desviaciones. En cambio se puede demostrar:
Vmax v= 2 [E]T

([E]T + [S]T + K S )

([E]T + [S]T + K S )2 4 [E]T [S]T

Sustratos con alta afinidad

Reacciones reversibles
E + S ES E + P k -1 k -2
k1 k2
f r Vmax [S] Vmax [P] S KM KP M [S] [P] 1+ S+ P KM KM

donde

f Vmax = k 2 [E]T

r Vmax = k -1[E]T

v=

k -1 + k 2 K = k1
S M

KP = M

k -1 + k 2 k -2

En el equilibrio v = 0
f P (k CAT KM )S Vmax K M [P] Keq = = r = S [S] Vmax K M (k CAT KM )P

Relacin de Haldane

Los parmetros cinticos de una reaccin reversible estn relacionados por la constante de equilibrio

Del repartido de ejercicios

18. La enzima fumarasa cataliza la hidratacin del fumarato para dar malato. Esta reaccin tiene un G de 3.8 kJ/mol. Para la enzima de corazn de chancho, se han reportado valores, para la reaccin directa, de KM = 1.7 mM y VMAX = 0.25 mM-1 s-1; y, para la reaccin reversa, de KM = 3.8 mM y VMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de una bacteria, se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX = 0.024 mM-1 s-1 para la reaccin directa, y KM = 1.2 mM y VMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reaccin reversa. Comente en la plausibilidad de estos reportes.

(PARNTESIS)
UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA
Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de sustrato en producto en 1 min bajo condiciones definidas. (Comisin de Enzimas, Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular, 1961) U mL-1: concentracin U mg-1: actividad especfica Otra unidad es el katal. Un katal corresponde a la conversin de 1 mol de substrate por segundo.

En la mayora de los casos, las unidades se refieren a concentraciones altas de sustrato (>KM), por lo que las unidades no dependen de la concentracin de sustrato.
40 35

v0 (uM min )

v0 (M min )

-1

25 20 15 10 5 0 0 10 20 30
-1

-1

30

0
40 50

20

40

60

80

100

mU mL

[Xanthine] (uM)

Entonces, para formar ms producto, o descomponer ms sustrato, o en un perodo ms corto de tiempo, simplemente hay que aadir proporcionalmente ms enzima.

Del repartido de ejercicios:

1. Se quiere medir la actividad de la enzima malato deshidrogenasa en un extracto tiempo (s) absorbancia bacteriano. oxalacetato + NADH L-malato + NAD+ 0 0.635 Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH 20 0.584 7.6, oxalacetato 0.6 mM y NADH 0.1 mM en un 40 0.536 volumen total de 3 mL. Se dispara la reaccin 60 0.484 agregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este extracto contiene 32 mg de protena/mL. Se 80 0.433 observa la disminucin de absorbancia a 340 100 0.385 nm debido a la desaparicin de NADH ( = 6.22 120 0.356 mM-1 cm-1). 140 0.335 a- Cul es la velocidad de reaccin? b- Calcule la actividad de la enzima por mL de 160 0.324 extracto. c- Calcule la actividad especfica de la enzima.

Del repartido de ejercicios:

2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a la sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad siguiendo la desaparicin de NADH acoplndola a la malato dehidrogenasa:
TGO aspartato + -cetoglutarato glutamato + oxalaceto

oxalaceto + NADH malato + NAD+

En una mexcla de reaccin se coloca un exceso de aspartato (100 veces el Km), 0.1 mL de suero de un paciente, 0.3 moles de NADH y exceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 mL. La reaccin se inicia agregando un exceso de cetoglutarato contenido en 0.1 mL. Luego de un perodo de latencia, se observa un decrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de absorbancia por minuto siendo la cubeta de reaccin de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente.

MDH

Del repartido de ejercicios:

3. Se quiere medir actividad -galactosidasa en un extracto bacteriano que contiene 5 mg de protena por mL de extracto. Para ello, se incuban 0.25 mL de extracto en amortiguador con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil -galactsido en un volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos, se toman alcuotas de 0.1 mL y se agregan a 2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide la formacin de p-nitrofenol a 400 nm, siendo = 18300 M-1 cm-1 en NaOH 0.1 M. a- Cul es la actividad de la enzima por mL de extracto? b- Cul es la actividad especfica del extracto? c- Qu controles deben realizarse?

tiempo 90 s 180 s 270 s 360 s

A400 0.068 0.135 0.202 0.270

Del repartido de ejercicios: 8. Un gramo de msculo fresco contiene 40 unidades de una enzima. Estime la concentracin intracelular de la enzima asumiendo que un gramo de msculo fresco contiene 0.8 mL de agua intracelular: a) Sabiendo que el nmero de recambio de la enzima es de 6 x 104 min-1. b) Sabiendo que la actividad especfica de la enzima pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es 120.000.