Leishmanioses Diagnstico (adaptado de: Parasitologia Clnica. Geraldo Atilio de Carli. 2ed.) Mtodos Parasitolgicos.

. Obteno do Material (leishmaniose cutnea) Realizar assepsia local da leso com lcool etlico 70%, seguido de anestesia local, usualmente realizada com lidocana a 2% com vasoconstritor. Visar as bordas da leso, realizando o procedimento com um bisturi ou punch de 4-6mm de dimetro. O fragmento do tecido obtido pode ser subdividido para procedimentos diversos, como histopatologia, preparao de esfregaos por aposio, semeadura em meio de cultura e inoculao em hamster. Amostras que visem o diagnstico molecular devem ser fixadas em etanol a 70% para evitar inibio do PCR. Esfregao corado Para realizao de esfregaos por aposio (imprint), fragmento removido dever sem limpo com salina estril (NaCl 0,85%) para remoo de excesso de sangue; em seguida, comprime-se repetida e delicadamente o fragmento de tecido sobre uma lmina previamente desengordurada, deixando-se o material secar a temperatura ambiente. Aps secagem, os esfregaos so fixados por trs minutos com metanol e corados pelo mtodo de Giemsa por 15 a 20 minutos. Na falta deste corante, poder ser utilizado o corante de Leishman. A pesquisa do parasito feita em objetiva de 100X e, em geral, requer experincia e pacincia do microscopista em virtude da usual baixa parasitemia. Formas amastigotas de leishmanias podem ser encontradas livres ou no interior de macrfagos ou histicitos. De maneira geral, a demonstrao do parasito inversamente proporcional ao tempo de evoluo da lcera. Histopatologia - O fragmento de tecido pode ser processado por meio de tcnicas histopatolgicas convencionais, podendo o material ser corado pela hematoxilina-eosina Giemsa ou Grocott. O exame do material pode revelar, alm das leishmanias, outros patgenos como fungos e bactrias, permitindo, desta forma, o diagnstico diferencial de outras patologias inflamatrias e/ ou neoplasias. Em geral, o aspecto histoplatolgico da LTA consiste de um infiltrado inflamatrio mononuclear misto, apresentando granulomas tuberculides. Cultura A cultura poder ser realizada a partir do fragmento de tecido retirado na bipsia da borda da leso, que semeado em meio LIT (Liver Infusion Tryptose), (NNN- agar sangue) + LIT ou meio Schneider. A coleta do material pode ser feita atravs da aspirao do material da leso utilizando-se uma seringa de 5 ml com agulha de 25x8, onde, aps assepsia e anestesia local, a agulha introduzida na borda da leso injetando-se cerca de 1 a 3 ml de salina estril e, mediante movimentos rotacionais, possvel aspirar material, o qual pode ser semeado em meio de cultura. Os tubos semeados so mantidos a 26C e examinados semanalmente. Alguns isolados de leishmania apresentam crescimento muito lento e podem ter dificuldade para o seu estabelecimento em cultura. Inoculao em animais O hamster (Mesocricetus auratus) o animal mais utilizado por sua grande susceptibilidade ao parasito. O tecido na bipsia triturado em soluo salina ou tampo fosfato e inoculado por via subcutnea na superfcie dorsal das patas traseiras e/ou no focinho do animal. O tempo de aparecimento de leses nodulares pode variar de dois meses a um ano, dependendo do inculo e principalmente da espcie do parasito.

Diagnstico na leishmaniose visceral O parasito pode ser demonstrado por puno de vsceras (bao, fgado ou medula ssea). A bipsia do bao e fgado procedimento de elevado risco e s deve ser realizado em condies especiais. Em face da maior simplicidade e do menor risco ao paciente, o material da medula ssea coletado atravs de puno do esterno, tbia ou da crista ilaca, sendo esta, preferencial em adultos. Com o material coletado devem ser feitos esfregaos corados com Giemsa, semeadura em meio de cultura NNN+LIT, inoculao em Hamster e, se possvel, esfregaos sobre papel Whatman n.1 esterilizado ou papel de ntrocelulose, visando-se o diagnstico por PCR. A cultura deve apresentar positiva aps um perodo de at quatro a cinco semanas. A inoculao de animais, embora no tenha aplicao prtica para fins de diagnstico imediato, pode ser til para isolamento do parasito visando sua caracterizao e estudos epidemiolgicos.

Mtodos imunolgicos Intradermorreao de Montenegro (IDRM) - Avaliar reao de hipersensibilidade tardia do paciente diante de antgenos de Leishmania sp.. Alm de sua utilizao com fins diagnsticos, a IDRM pode ser utilizada em inquritos epidemiolgicos e na monitorao de programas de vacinao contra a leishmaniose tegumentar. A intradermorreao realizada com antgenos padronizados, composto de promastigotas de Leishmania sp. mortos numa concentrao de 240 mg de nitrognio total ou 40 mg de nitrognio protico por mililitro. Para a realizao do teste, 0,1 ml do antgeno injetado intradermicamente na face anterior do antebrao. A leitura realizada 48 a 72 horas aps a inoculao, medindo-se o dimetro do halo de endurao com auxlio de uma caneta esferogrfica. Embora no existam medidas limites do teste, a endurao com dimetro 5 mm considerada positiva. A intensidade da reao pode variar com a resposta celular do paciente, tempo de evoluo da leso, forma clnica da doena (tegumentar ou mucocutnea) e a qualidade do antgeno. Na tegumentar a intensidade da resposta maior quando o paciente j apresenta lceras crnicas: na forma mucocutnea, em virtude do estado hiper-reativo do paciente, a resposta pode ser intensa a ponto de causar flictemas e necrose no local de injeo do antgeno (contrariamente, na leishmaniose difusa, devido ao estado alrgico do paciente, a resposta negativa). Da mesma forma na LV o teste intradrmico geralmente negativo na fase da doena ativa em virtude da imunossupresso causada pelo parasito. Na LV o teste intradrmico volta a ser positivo aps a cura da doena.

Reao de imunofluorescncia indireta - Na LTA no so utilizados rotineiramente. Entretanto, esses testes sorolgicos podem ser utilizados para detectar anticorpos da classe IgM e IgG anti-leishmania, especialmente no calazar, onde podem auxiliar no diagnstico da enfermidade assim como em inquritos epidemiolgicos. Apesar de sua elevada sensibilidade, a reao grupo - especfica e, desta forma, reaes cruzadas com Trypanosoma cruzi e LTA

devem ser esperadas. Este fato especialmente importante, uma vez que em vrias regies geogrficas estas patologias coexistem. Desta forma a reunio de vrios elementos clnicos e epidemiolgicos de fundamental importncia no diagnstico da parasitose. Na LV, os ttulos sorolgicos se mantm elevados diante do antgeno homlogo tanto na RIFI como no ELISA, mesmo aps o tratamento especfico. Alm destes, vrios outros testes como Dot-ELISA, Fast ELISA, contraimunoeletroforese, aglutinao direta (DAT) e testes imunocromatogrficos (ICT) tm sido empregados no diagnstico da LV humana e canina. Elevada especificidade e sensibilidade tem sido demonstradas no sorodiagnstico da LV utilizando-se antgenos recombinantes. Alm disso, o desenvolvimento de outras metodologias para deteco de antgenos circulantes no sangue e na urina poder ser de grande ultilidade no diagnstico da leishmaniose visceral.

Mtodos Moleculares (PCR) : Diferentes genes ou sequncias gnicas tem sido utilizados com propsito diagnstico. Entre estas sequncias podemos destacar os minicrculos de DNA. Pares especficos de primers so capazes de diferenciar as diferentes espcies do parasito. Ainda, o imprinting de leses em papel de nitrocelulose ou papel Whatman tem facilitado o trabalho de campo e posterior processamento da amostra em laboratrio.