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MANUAL DE TECNICAS PARA LABORATORIO DE NUTRICION ANIMAL

INTRODUCCION
El desarrollo de la acuacultura en sistemas semi intensivos e intensivos ha forzado el desarrollo de patrones de alimentacin cada vez ms eficientes, basados en los requerimientos nutricionales de cada una de las especies a cultivar. Para que el animal presente un crecimiento adecuado en el menor tiempo y ms bajo costo posibles, el alimento suministrado debe poseer caractersticas nutricionales ptimas, por lo cual en la industria de alimentacin de peces, como en las dems especies animales, la elaboracin, los ingredientes y el almacenamiento de los alimentos procesados, deben de estar sometidos a estrictos controles de calidad. En la acuacultura semi-intensiva e intensiva, la calidad del alimento est considerada como uno de los factores de mayor influencia en el xito de un cultivo, ya que los costos del alimento y la alimentacin, representan por lo general entre el 50 y 70% de los costos de operacin en un sistema de este tipo. La calidad de los alimentos va a depender en primer trmino de la calidad de los ingredientes utilizados en la preparacin del alimento balanceado, as como tambin del tipo de procesamiento a que se sometan antes y durante la elaboracin del alimento. Adicionalmente, el cuidado que se tenga para almacenar tanto ingredientes como alimento terminado, influir notablemente en sus propiedades nutritivas. Los alimentos balanceados son preparados con base en los requerimientos nutricionales de cada especie y an cuando la dieta se formula para satisfacerlos, no siempre contiene los niveles de nutrientes calculados una vez preparado, debido a que el proceso usado en su elaboracin puede alterar significativamente su valor nutricional; por ejemplo, el calor puede daar algunos nutrientes y/o puede hacerlos ms disponibles eliminando los txicos termolbiles, mientras que por otro lado la molienda puede afectar la digestibilidad de protenas y carbohidratos (Harris, 1980). La calidad del alimento tambin se modifica despus de pasar cierto tiempo en el almacn, donde adems de sufrir cambios en el valor nutricional, se pueden presentar alterciones en otras caractersticas como son el color, la textura, el sabor y el olor. Por otra parte existe el grave riesgo de contaminarse con los desechos de roedores, insectos y micoorganismos que aceleran an ms su deterioro (Limborg, 1979; Chow et al., 1980; Smith and Moss, 1985). Teniendo en consideracin todos estos factores, resalta la importancia de tener un control de calidad de los ingredientes alimenticios y del producto terminado, con el fin de asegurar que la dieta posea los niveles nutricionales mnimos requeridos, ya que nos proporciona la composicin exacta del material y el nivel de sustancias txicas normalmente presentes. Este control se inicia con el anlisis de los ingredientes con que se elaborar el alimento y finaliza con la certificacin de los niveles de nutrientes en el alimento preparado, as como su adecuado almacenaje (Frazer, 1967; Harris, 1980). Adicionalmente, es claro que solo es posible formular una dieta completa, si se conoce con precisin al menos la composicin proximal de los ingredientes con que se elaborar, sin embargo, Tacon (1979) recomienda que el valor nutricional de un material usado en la formulacin de alimentos, debe evaluarse con base en: a. b. Su contenido de Nitrgeno proteico y no proteico. La composicin de aceites y cidos grasos.

c. d. e. f. g.

El contenido de fibra cruda y carbohidratos solubles Su contenido de minerales y vitaminas. La presencia de microbios. La presencia de compuestos orgnicos txicos. La variabilidad de la composicin qumica.

De manera ideal cualquier ingrediente debera pasar por los puntos de control sealados, sin embargo, si por limitaciones econmicas o de equipo no es posible, se debe entonces procurar cubrir al menos aquellos anlisis que garanticen una calidad mnima deseable y una seguridad de que los animales no presentarn reacciones adversas al alimento. An cuando el control de calidad es un tema que merece tratarse exhaustivamente, este manual est enfocado particularmente a los mtodos bsicos de anlisis qumicos necesarios para una adecuada evaluacin de ingredientes y dietas elaboradas, con el objeto de ponerlos a la disposicin de la mayora de acuacultores y personas interesadas en este tipo de evaluaciones que posean conocimientos bsicos de qumica. Los mtodos propuestos han sido recopilados de diferentes fuentes y la mayora son considerados como estndares de norma. Con fines prcticos los anlisis se han agrupado en tres secciones; en la primera se incluyen los mtodos considerados dentro del anlisis proximal, para determinar el contenido de humedad, protena cruda, lpidos crudos, fibra cruda, ceniza y extracto libre de nitrgeno; este anlisis permite conocer los niveles porcentuales de cada nutriente en el material pero no indica nada acerca de la calidad de los nutrientes, para lo cual se requieren otros anlisis complementarios, algunos de los cuales se incluyen en este manual en la segunda seccin donde se consideran como anlisis especiales. En un tercer apartado se incluyen las tcnicas ms sencillas para la deteccin de algunos de los txicos y antinutrientes ms comunes, ya que su presencia puede afectar negativamente la eficiencia de utilizacin de los alimentos, e inclusive, ser causa de mortalidad. Consideramos que este captulo es particularmente importante cuando se incluye en los alimentos subproductos agroindustriales como harina de soya, algodn, o nuevas fuentes proteicas, particularmente de origen vegetal. Antes de realizar alguna tcnica analtica, es importante considerar las siguientes recomendaciones: a. Asegurarse de que cuenta con los reactivos y equipo necesarios para efectuar la determinacin deseada, ya que una vez iniciado un anlisis, por lo general no es posible suspenderlo temporalmente en tanto se consiguen los faltantes. b. Efecte cada anlisis por TRIPLICADO. Es ms exacto trabajar con valores promedio que con un slo dato; si los resultados entre las rplicas varan notablemente, es preferible repetir todo el anlisis. c. Pese la muestra con la mayor aproximacin posible. Tres o cuatro decimales nos dan una mayor exactitud en el clculo. Siempre utilice una balanza analtica. d. Despus de pasar la muestra al recipiente donde se realizar el anlisis, pese nuevamente el contenedor a fin de ajustar el peso final. La exactitud en el peso es fundamental para obtener un buen resultado, ya que la mayor parte de las tcnicas son gravimtricas. e. Nunca modifique el tamao de muestra, los tiempos en las diferentes etapas o el tipo de reactivos, a menos de que se hagan pruebas comparativas

que garanticen la precisin de los resultados. Recuerde que los anlisis normalmente se basan en mtodos estndar aceptados o exigidos por las autoridades reguladoras. f. Utilice siempre los equipos y accesorios de seguridad requeridos, como son campanas de extraccin, mscaras y batas. g. Recuerde que estar manejando substancias txicas o peligrosas para el organismo, por ello extreme las precauciones requeridas segn el caso y no omita ninguna

2. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ANALISIS


La muestra utilizada en el anlisis debe ser representativa del total del lote de material, por lo cual se debe de aplicar la metodologa apropiada para la toma de muestras. Se recomienda la siguiente rutina para tener una buena representatividad: a. En lotes a granel menores de 10 ton tomar dos muestras por cada tonelada. b. En lotes a granel mayores de 10 ton tomar una muestra por tonelada. c. Para materiales encostalados, para 1 a 10 costales tomar muestras de cada uno; con ms de 10 costales muestrear un 10% del total al azar. Las muestras se debern tomar de diferentes puntos para que el material sea representativo del total del lote; posteriormente se mezclan perfectamente y se dividen en sublotes de 12 kg, se colocan en recipientes hermticos y se almacenan de manera apropiada hasta su anlisis. Para cada material se debe llevar un registro para conocer el tipo de proceso al que ha estado sujeto previamente (subproductos industriales), su origen (vegetal, animal, mineral, frmaco) y la parte usada como alimento (principalmente si ha estado sometido a un proceso que impida su reconocimiento). Estos datos son importantes particularmente cuando se estn usando productos agrcolas, ya que stos pueden variar su composicin dependiendo de la variedad cultivada, las condiciones de cultivo o la poca de cosecha; pueden tambin contener residuos de pesticidas o estar contaminados por mohos y en el caso de subproductos animales, presentar contaminacin por antibiticos y hormonas (Frazer, 1967; Harris, 1980).

2.1. Preparacin de la muestra.


Para que un material pueda ser utilizado en el laboratorio de anlisis deber ser preparado de manera apropiada, esto con el fin de que los resultados obtenidos sean representativos del total y puedan ser utilizados de manera confiable para la formulacin del alimento o para la valoracin del mismo, para lo cual se hacen las siguientes recomendaciones: a. La cantidad de material debe ser adecuada para realizar todos los anlisis necesarios; debe ser una muestra homognea y representativa. b. El manejo de la muestra debe ser cuidadoso para evitar cualquier cambio o contaminacin. c. La muestra deber molerse finamente, tamizarse y mezclarse homogneamente. Esta operacin debe hacerse rpidamente y con la mnima exposicin al medio ambiente. Evite su sobrecalentamiento durante el molido, por lo cual materiales sensibles al calor debern ser molidos a mano. Antes de usar el molino asegrese de que est perfectamente limpio.

d. Si la muestra contiene mucha humedad y la preparacin del material no puede hacerse sin cambios significativos en sta, determine la humedad antes y despus de la preparacin. e. Se recomienda un examen fsico macro y microscpico para detectar la presencia de materiales contaminantes. f. Mezcle la muestra perfectamente y divdala en dos partes iguales. De ser necesario haga un molido preliminar para facilitar esta operacin. Almacene una de las partes en un frasco hermtico, limpio y seco; la otra parte ser usada en los anlisis y su tamao deber ser adecuado para la totalidad de las pruebas requeridas. g. Al menos que el mtodo de anlisis indique lo contrario, los materiales sern molidos de inmediato y pasados por una malla de 1 mm2; mezcle perfectamente la muestra tamizada y almacnela en un recipiente hermtico. Antes de tomar material para cada anlisis mzclese nuevamente. h. Al menos que se seale lo contrario, las muestras hmedas debern secarse para su molido y tamizado, siguiendo las indicaciones del punto anterior. i. Las muestras lquidas y semilquidas debern conservarse en frascos tapados y mezclarse perfectamente antes de su anlisis. j. Los materiales debern conservarse en refrigeracin o a temperaturas que eviten cambios en su composicin. Muestras para anlisis de vitaminas u otras substancias sensibles a la luz se colocarn en recipientes de vidrio color mbar.

3. ANALISIS PROXIMALES.
Los anlisis comprendidos dentro de este grupo, tambin conocido como anlisis proximales Weende, se aplican en primer lugar a los materiales que se usarn para formular una dieta como fuente de protena o de energa y a los alimentos terminados, como un control para verificar que cumplan con las especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulacin. Estos anlisis nos indicarn el contenido de humedad, protena cruda (nitrgeno total), fibra cruda, lpidos crudos, ceniza y extracto libre de nitrgeno en la muestra. Una descripcin ms amplia de estos anlisis se puede encontrar en Osborne y Voogt (1978), MAFF (1982) y AOAC (1984).

3.1. Humedad.
Durante el balanceo de la racin, es fundamental conocer el contenido de agua en cada uno de los elementos que la compondrn; as mismo, es necesario vigilar la humedad en el alimento preparado, ya que niveles superiores al 8% favorecen la presencia de insectos y arriba del 14%, existe el riesgo de contaminacin por hongos y bacterias (Cockerell et al., 1971). El mtodo se basa en el secado de una muestra en un horno y su determinacin por diferencia de peso entre el material seco y humedo. Aparatos

Horno de secado. Desecadores.

Procedimiento 1. Pese alrededor de 510 g de la muestra previamente molida. 2. Coloque la muestra en un horno a 105C por un mnimo de 12 h. 3. Deje enfriar la muestra en un desecador.

4. Pese nuevamente cuidando de que el material no este expuesto al medio ambiente. Clculos Contenido de humedad (%) = 100(((B-A) - (C-A))/(B-A)) Donde: A = Peso de la charolilla seca y limpia (g) B = Peso de la charolilla + muestra hmeda (g) C = Peso de la charolilla + muestra seca (g)

FIGURA 1 Determinacin del contenido de humedad en ingredientes alimenticios.

3.2. Protena cruda.


Por su costo es este el nutriente ms importante en la dieta en una operacin comercial; su adecuada evaluacin permite controlar la calidad de los insumos proteicos que estn siendo adquiridos o del alimento que se est suministrando. Su anlisis se efecta mediante el mtodo de Kjeldahl, mismo que evala el contenido de nitrgeno total en la muestra, despus de ser digerida con cido sulfrico en presencia de un catalizador de mercurio o selenio. a) Mtodo simple propuesto por Chow et al. (1980) Reactivos

Oxido de mercurio, grado reactivo. Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro, grado reactivo. Acido sulfrico (98%), libre de Nitrgeno. Parafina. Solucin de hidrxido de sodio al 40%; disolver 400 g de hidrxido de sodio en agua y diluir a 1,000 ml. Solucin de sulfato de sodio al 4%. Solucin indicadora de cido brico; agregue 5 ml de una solucin con 0.1% de rojo de metilo y 0.2% de verde de bromocresol a un litro de solucin saturada de cido brico. Solucin estndar de cido clorhdrico 0.1N.

Materiales y Equipo

Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl. Matraces Kjeldahl de 500 ml. Matraces Erlenmayer de 250 ml. Perlas de ebullicin.

Procedimiento 1. Pese con precisin de miligramos 1g de muestra y colquelo en el matraz Kjeldahl; agrguele 10g de sulfato de potasio, 0.7g de xido de mercurio y 20 ml de cido sulfrico concentrado. 2. Coloque el matraz en el digestor en un ngulo inclinado y caliente a ebullicin hasta que la solucin se vea clara, contine calentando por media hora ms. Si se produce mucha espuma, adicinele un poco de parafina. 3. Deje enfriar; durante el enfriamiento adicione poco a poco alrededor de 90 ml de agua destilada y desionizada. Ya fro agregue 25 ml de solucin de sulfato de sodio y mezcle. 4. Agregue una perla de ebullicin y 80 ml de la solucin de hidrxido de sodio al 40% manteniendo inclinado el matraz. Se formarn dos capas. 5. Conecte rpidamente el matraz a la unidad de destilacin, caliente y colecte 50 ml del destilado conteniendo el amonio en 50 ml de solucin indicadora. 6. Al terminar de destilar, remueva el matraz receptor, enjuague la punta del condensador y titule con la solucin estndar de cido clorhdrico. Clculos:

A = Acido clorhdrico usado en la titulacin (ml) B = Normalidad del cido estndar C = Peso de la muestra (g) Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B)/C) 0.014] Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 6.25

FIGURA 2 Determinacin de protena cruda por el mtodo Kjeldahl.

b) Mtodo estndar MAFF (1982) para la determinacin de protenas en alimentos y sus ingredientes. Reactivos:

Oxido de mercurio. Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro. Sacarosa. Zinc granulado. Granulado de piedra pomex lavada con cido sulfrico y quemada. Acido sulfrico concentrado (d = 1.84 g/ml). Solucin de hidrxido de sodio al 40 %. Solucin saturada de sulfato de sodio. Solucin de tiosulfato de sodio; 8g de Na2S2O35H2O en 100ml. Solucin de hidrxido de sodio 0.1N. Solucin de hidrxido de sodio 0.25N. Solucin de cido sulfrico 0.1N. Solucin indicadora de rojo de metilo; disuelva 0.3 g de rojo de metilo en 100 ml de etanol (9596 % V/V). Solucin indicadora rojo de metilo-azul de metileno; (a) disuelva 0.2g de rojo de metilo en 100ml de etanol (9596 % V/V) y (b) disuelva 0.1g de azul de metileno en 100ml de etanol (9596 % V/V), mezcle un volumen de (a) con uno de (b).

Materiales y Equipo

Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl. Matraces Kjeldahl.

Procedimiento 1. Pese 1g de muestra con aproximacin de miligramos y psela a un matraz Kjeldahl; adicione 10g de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.6 0.7g de xido de mercurio, 25 ml de cido sulfrico y unos pocos granos de piedra pomex. 2. Caliente el matraz moderadamente al principio, agitando ocasionalmente hasta que la materia este carbonizada y las burbujas hayan desaparecido, luego aumente la temperatura y permita que se establezca una ebullicin suave. Evite que las paredes del matraz se sobrecalienten para que no se le peguen partculas orgnicas. 3. Cuando la solucin se vea clara y sin color, contine la ebullicin por 2 horas ms y luego permita que se enfre. Si despus de la digestin y del enfriamiento se cristaliza la solucin repita el anlisis; si sigue ocurriendo la cristalizacin repita el anlisis usando una mayor cantidad de cido sulfrico. 4. Adicione con cuidado al matraz 250350ml de agua destilada, mezclando el contenido al mismo tiempo; deje enfriar y agrguele unas lentejas de Zinc. 5. Transfiera 25 ml de solucin de cido sulfrico 0.1 0.5N al matraz de colecta del aparato de destilacin, de acuerdo con el valor esperado de Nitrgeno en la muestra, as como unas cuantas gotas de indicador de rojo de metilo. 6. Tomando precauciones para evitar prdida de amonio, adicione cuidadosamente a la muestra 100 ml de solucin de hidrxido de sodio y luego 10 ml de solucin de sulfato de sodio o 25 ml de solucin de tiosulfato de sodio. Mezcle bien y conecte inmediatamente al aparato de destilacin.

7. Caliente el matraz de tal manera que se destilen alrededor de 150 ml del lquido en 30 min. Al finalizar, mida con papel indicador el pH del destilado resultante y si es alcalino contine con la destilacin, la cual se suspender cuando el pH aparezca neutro. Durante este proceso agite ocasionalmente el contenido del matraz. Si el destilado se torna alcalino, la determinacin deber ser abandonada y el anlisis repetido con los ajustes apropiados. 8. En el matraz de colecta titule el exceso de cido sulfrico con hidrxido de sodio 0.1 0.25N, de acuerdo con la normalidad del cido empleado, al punto final del indicador de rojo de metilo o rojo de metilo-azul de metileno. 9. Corra un blanco de reactivos usando 1g de sacarosa en lugar de la muestra, para usarlo en el clculo de los resultados. Clculos a. Determine el H2SO4 consumido. 1 ml de cido 1.4mg de Nitrgeno. b. Calcule el porcentaje de Nitrgeno en la muestra y convirtalo a porcentaje de protena multiplicando el resultado por 6.25. c. Si se sospecha de la presencia de Nitrgeno amoniacal o nitratos en la muestra, debern ser evaluados para restarse del Nitrgeno total. Exceptuando los alimentos para rumiantes, se deber evaluar el contenido de Nitrgeno no proteico y tambin substraerse del Nitrgeno total.

FIGURA 3 Mtodo estndar MAFF para la determinacin de protena cruda

3.3. Lpidos crudos


En este mtodo, las grasas de la muestra son extradas con ter de petrleo y evaluadas como porcentaje del peso despus de evaporar el solvente. Reactivos, Materiales y Equipo - Eter de petrleo, punto de ebullicin 4060C.

Aparato de extraccin Soxhlet. Horno de laboratorio ajustado a 105C. Desecador. Dedales de extraccin.

Procedimiento 1. Saque del horno los matraces de extraccin sin tocarlos con los dedos, enfrelos en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos. 2. Pese en un dedal de extraccin manejado con pinzas, de 3 a 5g de la muestra seca con aproximacin de miligramos y colquelo en la unidad de extraccin. Conecte al extractor el matraz con ter de petrleo a 2/3 del volumen total. 4. Lleve a ebullicin y ajuste el calentamiento de tal manera que se obtengan alrededor de 10 reflujos por hora. La duracin de la extraccin depender de la cantidad de lpidos en la muestra; para materiales muy grasosos ser de 6 horas. 5. Al trmino, evapore el ter por destilacin o con rotovapor. Coloque el matraz en el horno durante hora y media para eliminar el ter. Enfre los matraces en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos. La muestra desengrasada puede usarse para la determinacin de fibra cruda. Clculos A = Peso del matraz limpio y seco (g) B = Peso del matraz con grasa (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de lpidos crudos (%) = 100((B - A)/C)

FIGURA 4 Determinacin de lpidos por el mtodo de Soxhlet

3.4. Fibra cruda


Este mtodo permite determinar el contenido de fibra en la muestra, despus de ser digerida con soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos despus de la calcinacin nos indica la cantidad de fibra presente. Reactivos

Solucin de cido sulfrico 0.255N.

Solucin de hidrxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio. Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona). Alcohol etlico al 95% (V/V). Eter de petrleo. Solucin de cido clorhdrico al 1% (V/V).

Materiales y equipo.

Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado. Unidad de condensacin para el matraz. Matraz Kitazato de un litro. Embudo Buchner. Crisol de filtracin. Conos de hule. Papel filtro Whatman No. 541. Pizeta de 500 ml. Desecador. Horno de laboratorio. Mufla.

Mtodo 1. Pese con aproximacin de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra desengrasada y seca. Colquela en el matraz y adicione 200ml de la solucin de cido sulfrico en ebullicin. 3. Coloque el condensador y lleve a ebullicin en un minuto; de ser necesario adicinele antiespumante. Djelo hervir exactamente por 30 min, manteniendo constante el volumen con agua destilada y moviendo peridicamente el matraz para remover las partculas adheridas a las paredes. 4. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precalintelo con agua hirviendo. Simultneamente y al trmino del tiempo de ebullicin, retire el matraz, djelo reposar por un minuto y filtre cuidadosamente usando succin; la filtracin se debe realizar en menos de 10 min. Lave el papel filtro con agua hirviendo. 5. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pizeta conteniendo 200ml de solucin de NaOH en ebullicin y deje hervir por 30 min como en paso 2. 6. Precaliente el crisol de filtracin con agua hirviendo y filtre cuidadosamente despus de dejar reposar el hidrolizado por 1 min. 7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solucin de HCI y nuevamente con agua hirviendo, para terminar con tres lavados con ter de petrleo. Coloque el crisol en el horno a 105C por 12 horas y enfre en desecador. 8. Pese rpidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y colquelos en la mufla a 550C por 3 horas, djelos enfriar en un desecador y pselos nuevamente. Clculos A = Peso del crisol con el residuo seco (g) B = Peso del crisol con la ceniza (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C)

Recomendaciones Uno de los problemas ms frecuentes durante la evaluacin de la fibra cruda es la oclusin de los filtros, por lo que en algunos casos se recomienda sustituir el papel (paso 4 del mtodo) por una pieza de tela de algodn. Para evitar la saturacin del crisol de filtracin (paso 6) colquelo ligeramente inclinado y agregue muy lentamente el material a filtrar, de manera que gradualmente se vaya cubriendo la superficie filtrante. Con el uso los crisoles de filtracin tienden a taparse. Para su limpieza calcnelos a 500C y hgales pasar agua en sentido inverso. Cuando se han tapado con partculas minerales, prepare una solucin que contenga 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA sal sdica, calintela y hgala pasar por el crisol en sentido inverso. Este tratamiento erosiona al filtro de vidrio.

FIGURA 5 Determinacin proximal de fibra cruda

3.5. Ceniza
El mtodo aqu presentado se emplea para determinar el contenido de ceniza en los alimentos o sus ingredientes mediante la calcinacin. Se considera como el contenido de minerales totales o material inorgnico en la muestra. Materiales y equipo.

Crisoles de porcelana. Mufla. Desecador.

Procedimiento 1. En un crisol de porcelana que previamente se calcin y se llevo a peso constante, coloque de 2.5 a 5g de muestra seca. 2. Coloque el crisol en una mufla y calcnelo a 550C por 12 horas, deje enfriar y pselo a un desecador. 3. Cuidadosamente pese nuevamente el crisol conteniendo la ceniza. Clculos A = Peso del crisol con muestra (g) B = Peso del crisol con ceniza (g) C = Peso de la muestra (g) Contenido de ceniza (%)= 100((A - B)/C)

FIGURA 6 Determinacin del contenido de ceniza en ingredientes alimenticios.

3.6. Extracto Libre de Nitrgeno (ELN)


Dentro de este concepto se agrupan todos los nutrientes no evaluados con los mtodos sealados anteriormente dentro del anlisis proximal, constituido principalmente por carbohidratos digeribles, as como tambin vitaminas y dems compuestos orgnicos solubles no nitrogenados; debido a que se obtiene como la resultante de restar a 100 los porcientos calculados para cada nutriente, los errores cometidos en su respectiva evaluacin repercutirn en el cmputo final. Clculo Extracto Libre de Nitrgeno (%) = 100-(A+B+C+D+E) Donde:

A = Contenido de humedad (%) B = Contenido de protena cruda (%) C = Contenido de lpidos crudos (%) D = Contenido de fibra cruda (%) E = Contenido de ceniza (%)

3.7. Correcciones
Debido a que los anlisis normalmente se hacen con muestras preparadas para tal fin, es necesario realizar ciertas correcciones en los resultados para que reflejen el contenido real de nutrientes en el material en las condiciones en que se usar. a) Humedad Si los anlisis se efectuaron en base seca (BS), esto es material deshidratado, es necesario corregir el resultado para expresarlo en base hmeda (BH), tal como se encuentra en el alimento o material para su elaboracin, mediante la siguiente expresin: A = Contenido de nutriente (%/BS) B = Contenido de humedad de el material (%) Contenido de nutriente (%/BH) = (A ((100 - B)/100)) b) Lpidos Cuando se usa material desengrasado, por ejemplo en el anlisis de fibra cruda, se aplica una expresin similar a fin de obtener un valor representativo de la muestra: A = Contenido de fibra (desengrasada, %) B = Contenido de lpidos en el material (%) Contenido de fibra ajustado (%) = (A ((100 - B)/100))

4. ANALISIS ESPECIALES
Entre estas tcnicas se incluye algunos mtodos aplicables a la determinacin de la calidad de los ingredientes y los productos terminados, con base en su contenido de micronutrientes, tales como fibra digerible, minerales, vitaminas, actividad enzimtica, etc.; as mismo, se presenta el mtodo ms ampliamente utilizado para la cuantificacin de xido de cromo durante la evaluacin de la digestibilidad de las dietas.

4.1. Determinacin de Fibra por Detergente Acido.


Este mtodo permite tener una aproximacin del grado de digestibilidad de las fibras en el alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en cido sulfrico y el residuo es considerado como la fibra no digerible. Reactivos

Solucin de detergente cido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco a poco 56 ml de cido sulfrico concentrado, lleve la solucin a un volumen final de 2 1 con agua y agregue 20g de Cetil-trimetil-amonio. Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno). Acetona.

Materiales y Equipo

Horno Matraces erlenmayer de 500 ml. Mantilla de calentamiento. Condensador de dedo fro. Crisoles de filtracin, porosidad 1.

Procedimiento 1. 2. 3. 4. Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm. Tome una submuestra y squela durante la noche en un horno a 105C. Enfre la muestra en un desecador. Pese con aproximacin de miligramos un gramo de la muestra seca y colquela en un matraz erlenmayer de 500 ml. 5. Adicione 100 ml de la solucin de detergente cido y 2 ml del antiespumante. 6. Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado. 7. Lleve rpidamente a ebullicin (3 a 5 minutos) y contine el calentamiento por 2 horas. 8. Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado. 9. Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre. 10. Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succin dbil (por vaco). 11. Enjuague el residuo con acetona y seque. 12. Coloque el crisol en el horno a 105C durante 12 horas. 13. Enfre dentro de un desecador la muestra e inmediatamente despus determine el peso. Clculos Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1) Donde W1 = Peso de muestra (g). W2 = Peso del residuo (g).

FIGURA 7 Determinacin del contenido de fibra por el mtodo de detergente cido.

4.2. Determinacin de Fibra por Detergente Neutro.


Este mtodo es til para la determinacin de fibras vegetales en alimentos. Aparentemente tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales solubles de aquellos que no son totalmente aprovechables o que dependen de la fermentacin

biolgica para su aprovechamiento. El mtodo tiene limitaciones en su precisin cuando los valores de protena son muy altos y los valores de fibra son bajos. Reactivos

Solucin detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg de sulfato lauril sdico USP, 18.61 g de etilendiamino tetra acetato disdico dihidrogenado dehidratado, 6.81 g de borato de sodio decahidrato y 4.56 g del reactivo fosfato cido disdico anhidro. Agtese hasta disolver y mantenga el pH entre 6.9 y 7.1. Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H2O mas 10 ml de etilenglicol. Acetona grado reactivo. Sulfito de sodio anhdro. Se usa nicamente en anlisis de subproductos animales.

Materiales y Equipo

Equipo de reflujo. Cualquier equipo estndar adecuado para el anlisis de fibra. Crisoles de filtracin en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa de filtracin de 40mm de dimetro con capacidad para 40 50 ml de lquido. Cuando los crisoles se obstruyen despus de un uso continuo se prepara una solucin limpiadora de 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasar caliente en en sentidi opuesto a travs del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la solucin pues tiende a erosionar el vidrio.

Procedimiento 1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y depostela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo. 2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra. 3. Caliente para que la solucin hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullicin reduzca la temperatura para evitar la formacin de espuma. Ajuste la temperatura para que la solucin hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir. 4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para succin al vaco. Use poco vaco al principio incrementndolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase toda la muestra al crisol utilizando un mnimo de agua caliente (80C) para el lavado del matraz. Elimine el vaco, afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra del filtro y seque con vaco. 5. Seque los crisoles a 105C durante 12 h y pselos en caliente (esta operacin no debe durar ms de 30 seg). Si no se puede pesar de inmediato, enfre los crisoles en un desecador que contenga como desecante pentxido de fsforo (P2O5). 6. El residuo de fibra recuperado se registra en trminos de paredes celulares. 7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100. NOTA:

En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un material gelatinoso derivado de los almidones y la protena, el cual obstruye el filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtracin haga pasar aire en sentido inverso en el crisol. As mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullicin, calentando rpidamente con agitacin constante. Clculos a. Paredes celulares (%) en base seca o como se ofrece. 100(((peso del crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra. b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares. % contenido celular = 100 - % paredes celulares. Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.

FIGURA 8 Determinacin del contendido de fibra por el mtodo de detergente neutro

4.3. Ceniza insoluble en Acido Clorhdrico


Este mtodo determina el contenido de substancias minerales insolubles en cido clorhdrico contenidos en los alimentos; de acuerdo con el contenido mineral de la muestra se aplica ya sea el mtodo A, para alimentos con alto contenido de materia orgnica, o el mtodo B, recomendable para alimentos con un alto contenido de minerales, incluyndose aquellos cuyo contenido de ceniza insoluble es mayor a 1 % al evaluarse previamente con el mtodo A. Reactivos

Solucin HCI 3N. Solucin A de cido tricloroactico al 20%, 20 g en 100 ml. Solucin B de cido tricloroactico al 1 %, 1 g en 100 ml.

Materiales y Equipo

Placa de calentamiento. Mufla elctrica con termostato. Crisoles de calcinacin: Platino o aleacin de platino y oro (10% Pt, 90% Au); Rectangulares (60 40 25 mm) o circulares (6075 mm de dimetro con 20 25 mm de alto).

Mtodo A Calcine la muestra siguiendo el mtodo de determinacin de ceniza. Transfiera el residuo a un vaso de precipitado de 250 400 ml usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y evapore a sequedad, contine calentando durante una hora ms para deshidratar cualquier slice presente. Enfre y agregue 75 ml de solucin de HCI 3N y caliente a ebullicin suavemente por 15 minutos. Filtre la solucin en caliente a travs de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo con agua caliente hasta que el filtrado deje de ser cido. Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550700C en un crisol de platino prepesado, enfre en un desecador y posteriormente pese.

FIGURA 9 Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo A. Mtodo B Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y transfirala a un vaso de precipitado de 250 400 ml. Adicione 25 ml de agua destilada y 25 ml de

solucin de cido clorhdrico 3N. Mezcle con cuidado y espere hasta que ya no se liberen gases. Agregue otros 50 ml de cido clorhdrico y espere hasta que cese la liberacin de gases y coloque el vaso en un bao mara a ebullicin durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre la solucin cuando todava este caliente con papel filtro libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50 ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser cido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 700C. Transfiera las cenizas a un vaso de precipitado usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y contine el anlisis como en el mtodo anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra suavemente por 15 minutos. NOTA: Si se hace difcil filtrar, repita el anlisis reemplazando los 50 ml de cido clorhdrico 3N con 50 ml de la solucin A de cido tricloroactico y enjuague el filtro con una solucin tibia de la solucin B de cido tricloroactico. Clculos Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la muestra.

FIGURA 10 Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo B.

4.4. Carbohidratos Totales Disponibles (Clegg-Anthrone).


Este mtodo determina la cantidad de carbohidratos totales, basndose en su contenido de almidones hidrolizables y azcares solubles. Reactivos

Solucin de cido perclrico al 52 %. 279ml de cido perclorico (grado especfico 1.70) en 100 ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Solucin de cido sulfrico. 760ml de H2SO4 (grado especfico 1.84) en 330ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Reactivo Anthrone. Prepare suficiente reactivo Anthrone preparando una solucin de cido sulfrico al 0.1 % con el fin de usarla el mismo da. Solucin estndar de glucosa. Disuelva 100mg de glucosa en 100ml de agua. Solucin estndar de glucosa diluida. Diluya 10ml del estndar de glucosa a 100 ml de agua destilada (1ml = 0.1mg de glucosa).

Materiales y Equipo

Espectrofotmetro. Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150.

Procedimiento Extraccin: 1. Pese con aproximacin de 0.001g 1.0g de muestra seca 2.5g de muestra hmeda conteniendo aproximadamente de 60 a 300 mg de carbohidratos totales disponibles. 2. Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con tapn. 3. Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la muestra. 4. Adicione 13 ml de la solucin de cido perclrico. Agite constantemente con la varilla de vidrio durante 20 minutos. 5. Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml. Mezcle y filtre a un matraz volumtrico de 250 ml. 6. Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz volumtrico. Afore el matraz con agua destilada y agite. Determinacin: 1. Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido. 2. Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirn como blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye. 3. Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solucin de glucosa diluida. 4. Agregue rpidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recin preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colquelos en un bao mara y caliente durante 12 minutos. 5. Enfre rpidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solucin a celdas para espectrofotmetro de 1 cm. El color verde es estable slo por 2 horas. 8. Lea la absorvancia a 630 nm contra el blanco. Clculos Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 b)/(a W) Donde

W = Peso en g de la muestra. a = Absorvancia del estndar diluido1. b = Absorvancia de la muestra diluida.


1

El grfico es una lnea recta n el rango de 0 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 1.5 mg de glucosa (automtico).

Clegg, K.M. (1956). J.Sci. Food Agric. 7, 40.

FIGURA 11 Determinacin de carbohidratos totales disponibles en alimentos.

4.5. Nitrgeno Proteico y No Proteico


Esta tcnica permite reconocer la porcin de nitrgeno de origen proteico y no proteico de los materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales. Reactivos

Acetato de cobre monohidratado en solucin al 3 % p/v. Sulfato de aluminio y potasio (2 H2O) en solucin al 10% p/v. Antiespumante de silicona.

Materiales y Equipo

Matraces kjeldhal de 800 ml. Embudos buchner de 12 cm de dimetro. Matraces kitazato. Papel filtro Whatman no. 541 Schleicher y Schill no. 1505, de 18 cm.

Procedimiento Pese 2 g de muestra con ms de 25% de protena cruda, lg para rangos de 25 50% de protena y 0.5g para materiales con ms de 50% de protena cruda. Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos grnulos de antiebullente y una o dos gotas del antiespumante. Caliente a ebullicin durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque). Cuando la muestra est todava caliente agregue 2 ml de la solucin de sulfato de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y caliente a ebullicin, adicione 50 ml de la solucin de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y deje enfriar. Filtre usando vaco. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fra. Para evaluar el nitrgeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrgeno total de kjeldahl. El nitrgeno no proteico se analiza por medio de la misma tcnica a partir del lquido filtrado. Los resultados respectivos de los slidos y lquidos por medio de kjeldahl ofrecern directamente los datos de nitrgeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.

FIGURA 12 Determinacin del contenido de nitrgeno proteico y no proteico en alimentos.

4.6. Determinacin de Protenas por el Mtodo de Lowry.


El mtodo ms preciso para la determinacin de concentraciones proteicas es probablemente el mtodo de hidrlisis cida. La mayor parte de los otros mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de las protenas y no pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no es la excepcin, pero es sensiblemente constante de protena a protena, lo cual ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una alternativa completamente

aceptable con un rigor absoluto en todas las determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren mezclas de protenas o extractos crudos. Reactivos

Reactivo de formacin compleja. Preprese inmediatamente antes de usarse, mezclando las soluciones A, B y C en proporcin 100:1:1 respectivamente. Solucin A: 2% (P/V) Na2CO3 en agua destilada. Solucin B: 1% (P/V) CuSO4.5H2O en agua destilada. Solucin C: 2% (P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada. Solucin de Hidrxido de sodio 2N. Reactivo de Foln (disponible comercialmente): sese en concentracin 21N. Estndares: Use una solucin madre de protena estndar (por ejem. fraccin V de albmina de suero bovino) conteniendo 4 mg/ml de protena en agua destilada, almacenada a -20C. Prepare los estndares diluyendo la solucin madre con agua destilada tal como se indica en la siguiente tabla: PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA

Solucin madre (l) Agua (l) Concentracin de protena (g/ml)

0 0

1.25 2.50 6.25 12.50 25.00 62.50 125.0 250.0 475 200 438 500 475 250 10 20 50 100 1000 2000

500 499 498 494 488

Procedimiento

1. A 0.1 ml de muestra o sol. estndar, adicinele 0.1 ml de sol. NaOH 2N.


2. 3. Caliente a 100C durante 10 min a bao mara hirviendo para hidrolizar la muestra. Deje enfriar a temperatura ambiente y agrguele 1 ml del reactivo de formacin de complejo recin preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min. Adicione 0.1 ml de reactivo de Foln, agite con un mezclador de vrtice y deje reposar a temperatura ambiente durante 3060 min (no exceda este tiempo). Lea la absorvancia a 750 nm si la concentracin de la protena fuera menor a 500 g/ml, 550 nm si fuese entre 100 y 2000 g/ml. Trace una curva estndar de absorvancia como funcin de concentracin inicial de protena y sela para determinar el contenido de protena en la muestra.

4.
5. NOTA

a. Si la muestra se encuentra como precipitado, disulvalo en NaOH 2N e


hidrolice como en el paso 1. Use alcuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2. b. Todas las clulas u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA. c. Mezcle rpidamente en cuanto el reactivo de Foln sea adicionado; esto es importante para obtener una adecuada reproductibilidad. d. Se requiere un grupo de estndares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.

FIGURA 13 Determinacin de protena en alimentos por el mtodo de Lowry

4.7. Determinacin de Urea


Este mtodo permite cuantificar el contenido de urea en ingredientes alimenticios. Reactivos

Carbn activado

Solucin Carrez I: disuelva 21.9 g de acetato de zinc dehidratado en agua, agregue 3 ml de cido actico glacial y diluya a 100 ml con agua destilada. Solucin Carrez II: disuelva 10.6 g de ferrocanuro de potasio en 100 ml de agua destilada. Acido clorhdrico 0.02N. Solucin de acetato de sodio: disuelva 136 g de acetato de sodio trihidratado en 1000 ml de agua. Solucin de 4-dimetilaminobenzaldehdo: disuelva 1.6 g de 4dimetilaminozenzaldehdo (4-DMAB) en 100 ml de etanol al 96% y adicione 10 ml de cido clorhdrico (d=1.18 g/ml). Solucin estndar de urea: disuelva 0.1 g de urea en 100 ml de agua.

Materiales y Equipo

Agitador rotatorio Espectrofotmetro con celdas de 10 mm.

Procedimiento Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisin de 0.001 g, o una cantidad que se espera contenga de 50 a 200 mg de urea y colquela en un matraz volumtrico de 500 ml. Agregue 150 ml de cido clorhdrico 0.02N, agite por 30 min y adicione 10 ml de la solucin de acetato de sodio y mezcle. Agregue 1 g de carbn activado, agite perfectamente bien y deje reposar la mezcla por 15 min. Adicione 5 ml de la solucin Carrez I, seguido por 5 ml de la solucin Carrez II, mezclando perfectamente bien entre las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco. Determinacin Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapn esmerilado, adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la absorvancia de la solucin a 435 nm en una celda de 10 mm, contra una solucin de referencia preparada con los reactivos. Curva de Calibracin Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solucin de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10 ml de cada solucin a tubos de ensaye con tapn esmerilado y adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje reposar por 15 minutos, mida la absorvancia como se seal anteriormente contra una solucin de referencia preparada con 10 ml de solucin 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una grfica relacionando las absorvancias con la cantidad de urea presente. Expresin de Resultados Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibracin elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra. % Urea 0.4665 = % N urea. NOTA:

Si la muestra est muy coloreada, la cantidad de carbn activado deber ser incrementada arriba de 5 g. La solucin final despus del filtrado deber ser incolora.

FIGURA 14 Determinacin del contenido de urea en ingredientes alimenticios.

4.8. Acido Urico.


A travs de este mtodo es posible determinar el contenido de cido rico y sus sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.

Reactivos

Solucin de hidrxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de agua, mezcle bien y almacene la solucin en un envase de plstico. Solucin neutra de formaldehido.

a. Verifique la concentracin de la solucin disponible, para lo cual mezcle 30 ml de sta con 50ml de solucin de NaOH IN y 25ml de solucin de Perxido de hidrgeno (20 volmenes). Caliente en bao de vapor hasta que no haya ms efervescencia. Enfre y titule con NaCl IN usando indicador de fenoftalena. Realice una titulacin de blanco usando 3 ml de agua en lugar del formaldehdo y calcule la concentracin como sigue: 1ml de la solucin de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehdo. Conc. de formaldehdo (g/100 ml) = ((B-T) ((0.0300 100)/3) Donde B = Titulacin del blanco. T = Titulacin de la muestra. b. Prepare una solucin neutra que contenga 17.5g de formaldehdo con 250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solucin de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.

Solucin buffer de succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de cido succnico en 750ml de agua y 20ml de la solucin de NaOH. Deje enfriar y adicione una cantidad adecuada de solucin de formol que contenga 17.5g de formaldehdo, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0 con la solucin de NaOH. Diluya a 1000ml con agua destilada, mezcle y ajuste el pH si es necesario. Solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na2S2O3.5H2O en 1000ml de agua destilada. Solucin de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de lactato de plata en 50ml de agua destilada y 1ml de cido lctico. Diluya a 100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No lo exponga a la luz directa. Solucin de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO4.7H2O y 17.5g de NH4CL en 50ml de agua. Agregue 30ml de NH4OH (d = 0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua. Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solucin de lactato de plata con 15ml de solucin de magnesio amoniacal. Adicione 50ml de hidrxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mzclese bien. Preprese inmediatamente antes de usarse. Solucin estndar de cido rico. Pese 250mg de cido rico con una precisin de 0.1mg y transfiralo a un matraz de fondo redondo acoplado a un condensador de reflujo. Adicione 100ml de la solucin de formaldehdo etlico y caliente a reflujo en un bao de vapor por 30min agitando frecuentemente. Enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, lavando el matraz redondo con sol. de formaldehdo etlico, afore con esta solucin y mezcle. 1 ml contiene 1 mg de cido rico. Eter de petrleo, punto de ebullicin 40 60C.

Materiales y Equipo

Epectrofotmetro con celdas de cuarzo de 10 mm. Tubos de cristal para percolacin, con aproximadamente 240 mm de longitud, 18 mm de dimetro interno, y en la parte inferior aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de dimetro interno.

Extraccin del cido rico: 1. De la gallinaza: Pese con una aproximacin de 0.001 g cerca de 0.4g de gallinaza seca y colquela en un matraz de fondo redondo de 150ml. Adicione 60ml de solucin neutra de formaldehdo, conecte a un condensador de reflujo y caliente en bao de vapor por una hora. Enfre y filtre a travs de un crisol (Porosidad 4) a un matraz volumtrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones de 10ml de solucin de formaldehdo etlico, pasando cada porcin por el crisol de filtracin al matraz volumtrico. Afore con la misma solucin y agite. 2. De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y desengrasela por extraccin con ter de petrleo. Transfiera cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire. Contine el anlisis como previamente se seal, iniciando con la adicin de 60 ml de solucin de formaldehdo etlico. Determinacin Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra prepesado, segn los mtodos descritos, a un tubo de centrfuga de 50 ml. Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelos reposar en la oscuridad por una hora. Centrifuge a 2000 rpm por 15 min. Retire el sobrenadante y deje escurrir por 10 min. Cuidadosamente limpie cualquier lquido remanente sin perturbar el precipitado y adicione 20 ml de solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva el precipitado, agitando con una varilla de vidrio delgada. Con una pipeta transfiera 5 ml de esta solucin a un matraz volumtrico de 200 ml conteniendo 40 ml de solucin buffer de succinato, afore con agua destilada y mezcle bien. Mida la absorvancia de la solucin a 294 nm en celdas de slice de 10 mm comparada contra una solucin preparada mezclando 5 ml de solucin de tiosulfato de sodio con 40 ml de solucin buffer de succinato aforada a 200 ml con agua destilada. Determine la cantidad de cido rico mediante una curva de calibracin. Curva de Calibracin: En una serie de tubos de centrfuga de 50 ml de capacidad transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solucin estndar de cido rico (equivalentes a una cantidad similar de cido rico en mg) y llvelos a 20 ml con la solucin de formaldehdo etlico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelo reposar en la oscuridad por una hora. Contine el mtodo como en la determinacin a partir del centrifugado. Mida la absorvancia de la solucin y trace la curva de calibracin graficando absorvancia (y) contra la cantidad correspondiente de cido rico en mg (x). Expresin de Resultados El contenido de N del cido rico como % de la muestra est dado por la frmula: % N = A/(6 W)

Donde A = mg de cido rico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado por la medicin fotomtrica. W = peso de la muestra en g.

FIGURA 15 Determinacin de cido rico en gallinaza e ingredientes alimenticios

4.9. Ceniza Soluble e Insoluble en Acido.


Este mtodo proporciona una estimacin de la disponibilidad de minerales en base a su digestibilidad en cido. Reactivos, Materiales y Equipo

Acido clorhdrico (12.5 % v/v) Papel filtro libre de ceniza Crisoles de porcelana

Procedimiento Use el residuo obtenido de la determinacin de ceniza. Caliente 25 ml de cido clorhdrico con cuidado para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con agua caliente hasta que quede libre del cido. Coloque el papel filtro y el residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colquelo en la mufla a 600 C durante 2 horas o hasta que quede libre de carbn. Clculos Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con cido/Peso de la muestra)

FIGURA 16 Determinacin de ceniza soluble e insoluble en cido clorhdrico

4.10. Determinacin de Calcio en el Alimento.


La evaluacin de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con el fsforo u otros minerales generar un bajo crecimiento. Reactivos

Acido clorhdrico (1 3 %)

Acido ntrico 70% Hidrxido de amonio (1:1 v/v) Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol) Solucin de oxalato de amonio 4.2 % Acido sulfrico 98 % Solucin estndar de permanganato de potasio 0.05N

Materiales y Equipo

crisoles de porcelana matraces volumtricos de 250 ml vasos de precipitado de 250 ml Papel filtro para anlisis cuantitativos libre de cenizas

Procedimiento Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y unas gotas de HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullicin, enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales 25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione NH4OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml de agua, hierva y adicione con agitacin 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste el pH con cido para regresar al color rosa si es necesario. Dje reposar, filtre y lave el precipitado con la solucin de NH4OH (1.5%). Coloque el papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de H2SO4, caliente a 70C y titule con la solucin de permanganato y calcule: Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato/Peso de la Muestra) (Alicuota usada en ml/250)

FIGURA 17 Determinacin de calcio en alimento e ingredientes alimenticios.

4.11. Determinacin de Fsforo


Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de los organismos cultivados, debiendo estar presente en las dietas en cantidades suficientes para satisfacer las necesidades metablicas de los organismos. Este elemento en protenas de origen vegetal puede estar formando parte de fitatos, por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una determinacin de cido ftico previa al uso de tales materiales. Reactivos

Reactivo de Molibdato. Disuelva 40 g de molibdato de amonio 4.H2O en 400 ml de agua caliente y enfre. Disuelva 2 g de metavanadato de amonio en 250 ml de agua caliente, enfre y adicione 450 ml de cido perclrico al 70%. Gradualmente adicione la sol. de molibdato a la sol. de vanadato con agitacin y diluya a 2 1. Estndar de Fsforo. Prepare una solucin stock disolviendo 8.788 g de Ortofosfato dihidrgeno potasio en agua y llvelo a 1 1. Prepare la solucin de trabajo diluyendo la sol. stock 1 en 20 (Conc. de trabajo 0.1 mg P//ml).

Materiales y Equipo

Espectrofotmetro para leer a 400 nm Matraces graduados de 100 ml

Procedimiento 1. Pase una alicuota como en la determinacin de Ca a un matraz de 100 ml y adicione 20 ml del reactivo de molibdovanato. Aforelo, mezcle y deje reposar por 10 min. 2. Transfiera alicuotas del estndar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 mg de P en matraces de 100 ml y trtelos como al anterior. 3. Lea la muestra a 400 nm ajustando el estndar de 0.5 mg a 100% de transmisin. 4. Determine mg de fsforo en la muestra usando una curva estndar.

FIGURA 18 Determinacin de fsoforo en dietas e ingredientes alimenticios.

4.12. Determinacin de Cloruro de Sodio


Este mtodo permite determinar la cantidad de sal presente en harina de pescado y otros ingredientes. Reactivos

Solucin estndar 0.1N de Nitrato de Plata Solucin estndar 0.1N de Tiocianato de Amonio Indicador Frrico - Solucin acuosa saturada Solucin de Permanganato de Potasio 6 % p/v Solucin de Urea 5 % p/v Acetona grado analtico Acido Ntrico concentrado

Procedimiento 1. Pese 2 g de muestra en un matraz erlenmayer de 250 ml, humedezca la muestra con 20 ml de agua, adicione con pipeta 15 ml de la solucin de nitrato de plata y mezcle bien. 2. Adicione 20 ml de Acido Ntrico concentrado y 10 ml de la solucin de Permanganato de Potasio y mezcle. Caliente continuamente la mezcla hasta que el lquido se aclare y desaparezca los vapores nitrosos, enfre. 3. Adicione 10 ml de Solucin de Urea y deje reposar por 10 min. 4. Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador frrico y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de Tiocianato hasta el punto final rojo-caf. Clculos Calcule resultados como NaCl %NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH4CNS 0.585)/g de muestra

FIGURA 19 Determinacin de cloruro de sodio en harina de pescado y otros ingredientes

4.13. Determinacin de Potasio


Reactivos

Acido Clorhdrico concentrado. Solucin estndar de Potasio: Para preparar solucin stock (500 ppm), disuelva 0.477 g de Cloruro de Potasio y llvelo a 500 ml con agua destilada. Para preparar el estndar de trabajo (10 ppm), diluya 1:50.

Aceite de oliva (puro)

Materiales y Equipo

Crisoles de Slice. Fotmetro de flama Mufla

Procedimiento 1. Seque 2 g de muestra en un crisol de slice a 100C para eliminar la humedad. Adicione unas cuantas gotas de aceite de oliva y caliente sobre la flama hasta que deje de producir flama. 2. Calcine a 500C en la mufla por 24 h, enfre y adicione 2 ml de HCI concentrado para disolver el residuo. 3. Llvelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solucin y haga una nueva dilucin a 100 ml con agua destilada. 4. Ajuste el fotmetro de flama para que de una lectura de 100 con el estndar de 10 ppm y lea la solucin muestra. 5. Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilucin al momento para dar una lectura apropiada.

FIGURA 20 Determinacin del contenido de potasio en ingredientes alimenticios.

4.14. Cuantificacin de xido de cromo en heces y alimentos (Furukawa y Tsukahara, 1966)


El xido de cromo es el marcador ms ampliamente utilizado durante la evaluacin de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El mtodo aqu presentado es una modificacin del propuesto por Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinacin del contenido de xido de cromo en dietas y heces. Reactivos

Acido ntrico concentrado, gr. Acido perclrico, g.r.

Materiales y equipo

Espectrofotmetro Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml Matraces kjeldahl de 100 ml Matraces volumtricos de 25 ml

Procedimiento Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habr eliminado previamente escamas y cualquier otra materia extraa; mantngalos a sequedad. Pese con precisin de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullicin suave por un mnimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de lquido y contine habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de cido ntrico y siga digiriendo. Al trmino la solucin debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar. Ya fra la solucin, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de cido perclrico. Realizar la adicin dentro de una campana de extraccin y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestin incompleta se puede presentar una reaccin explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y contine la ebullicin hasta que la solucin vire de verde a amarillo limn; apague el digestor y deje enfriar. Ya fro se debe formar un anillo rojizo en el borde del lquido; en caso de no formarse o si el lquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente. Pase el lquido fro a un matraz volumtrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotmetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultneo a la muestras usando solamente los cidos y agua destilada. Clculos a) Calcule la cantidad de xido de cromo (mg) presente en la muestra: X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4

Donde Y = absorvancia 0.0032 y 0.2089 son constantes b) Calcule el % de xido de cromo en la muestra: O.C.% = 100(X/A) Donde X = peso del xido de cromo A = peso de la muestra

FIGURA 21 Determinacin de xido de cromo en alimentos y heces.

4.15. Mtodo de Carpenter para la determinacin de Lisina Disponible (Tejada, 1985)


El mtodo permite determinar la cantidad de lisina libre que reacciona con el lfluorodinitro benceno. Reactivos

Solucin madre de Mono E N dinitrofenil - lisina HCI (p. m. 366.77, 39.85 % lisina) Disolver 314 mg en 250 ml de HCl concentrado. Se disuelve lentamente, de manera que hay que iniciar su preparacin un da antes. Solucin estndar diluida de DPN-lisina. Diluya 10 ml de la solucin madre en 100 ml de agua destilada para formar el estndar. Hecho lo anterior, 2 ml de la solucin contienen alrededor de 0.1 mg de lisina y disuelto a 100 ml da una absorcin neta de alrededor de 04 a 435 nm en celdilla de 1 cm. Solucin de 1 - fluoro 2,4 dinitrobenceno (FDNB). Manjese con guantes de plstico desechables. S el FDNB est slido colquese en balo de agua caliente para que se funda, tome con una pipeta automtica aproximadamente 0.4 ml y disuelva en 15 ml de alcohol etlico por muestra. Debe prepararse diariamente. Cloruro de metoxicarbonil (cloroformato de metilo). El MCC es inestable por lo que se debe almacenar en refrigeracin. Manjese con cuidado. Solucin de bicarbonato de sodio al 8% en agua destilada. Eter etlico libre de perxidos. Solucin de fenoftalena, 500 mg/l de alcohol etlico al 60%. Solucin de hidrxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a 8.5 durante la reaccin del MCC. Debe almacenarse en frasco de plstico. Tener a la mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier exceso. Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de NaHCO3 y 1g de Na2CO3 en 250 ml de agua destilada; ajuste el pH si es necesario. Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para evitar prdida de CO2 Acido clorhdrico concentrado

Materiales y Equipo

Tamiz de 0.5 mm Matraces de fondo redondo Matraz volumtrico de 250 ml Bao mara Rotoevaporador Aparato de reflujo Papel filtro Whatman 541 Tubos de ensaye con tapn Perlas de vidrio Espectrofotmetro

Procedimiento Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar deber contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 2g de la muestra. Pasela a un matraz de fondo redondo. Agregue 23 perlas de vidrio y 10ml de NaHCO 3, agitar suavemente para que la muestra no se adhiera a las paredes.

Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la muestra se quede en las paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un bao de agua hirviendo el matraz debe perder aproximadamente 12.5g. Enfre y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua presente, se tendr un volumen de 40ml y una concentracin de cido de 6M. Reflujar suavemente durante 16 horas. Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en caliente a un matraz volumtrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias veces con agua destilada y colecte en el matraz volumtrico; afore en fro con agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de dinitrofenol que se puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el ter. Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapn, etiquetndolos A y B. Agregar al tubo B 5 ml de ter y agita. Extraiga el ter (capa superior) con una pipeta automtica. Coloque el tubo en un bao a 90C hasta que se elimine todo el ter y enfre. Agregue una gota de fenoftalena al tubo, adicione gota a gota la solucin de NaOH hasta que aparezca un ligero color rosado; aada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presin con cuidado. Despus de 5 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar la formacin de espuma. Se extrae cuatro veces la solucin con ter como se describi anteriormente. Elimine el ter residual en bao mara, enfre y lleve el volumen 10 ml con agua destilada. Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con ter el tubo A; elimine el ter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el espectrofotmetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B (blanco) es la absorvancia atribuible al DNP - lisina. Absorvancia del estndar DPN - Lisina Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento ya indicado-Practicar hasta que se tenga confianza en las manipulaciones. La absorvancia neta se usar para calcular las muestras problema. El blanco B tiene generalmente una absorvancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar el procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de carbonato, la longitud de onda a que se est leyendo y el ter libre de perxidos. Precauciones con alimentos de origen vegetal. En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrlisis total a las 16 horas y como un tiempo ms largo se descompone el DNP-L, debe hacerse una segunda digestin con materiales desconocidos. Para lograr esto, despus de la digestin se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se seal. El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas perlas de vidrio (se pueden juntar los residuos de las rplicas); el volumen del cido clorhdrico debe ser menor a 30 ml. Se deja en reflujo por 16 horas, se filtra en caliente y se lleva a 100 ml segn el procedimiento ya descrito. Si el resultado es muy pequeo se elimina, o de lo contrario, se hacen las correcciones necesarias para el material.

Para determinar la prdida de DNP-L se debe calcular un factor de correccin, el cual vara con el material. Para su clculo, consultar a: Makade, M.L. y Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271. Clculos C = (Ws Au V 100 100)/Wu As a (cp) Donde C= g de lisina/16g de N Ws= Peso del estndar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 s se prepara como se indica. Wu= Peso de la muestra en mg As= Absorcin neta del estndar Au= Absorcin neta del desconocido V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda digestin). a= Alcuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml. CP= Protena cruda, 6.25 g N/100g material. Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la frmula. NOTA: El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los hidrolizados y soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz especialmente a pH alcalino.

FIGURA 22 Determinacin de lisina disponible en ingredientes alimenticios.

4.16. Anlisis de Melazas


Los peces, segn su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar carbohidratos en su dieta, por lo cual se considera importante contar con un mtodo rpido para la determinacin de azcares totales disponibles. Reactivos:

Solucin de Fehling (modificada por Soxhlet): a. Disuelva 34.639g de Sulfato de Cobre 5H2O en agua destilada, afore a 500ml, filtre. b. Disuelva 173 g de tartrato de sodio y potasio 4.H2O y 50 g de Hidrxido de Sodio en agua destilada, diluya a 500 ml, deje reposar por 2 das y filtre a travs de asbesto preparado. Estndar de Azcar invertida. Prepare una solucin stock adicionando 5ml de HCL (Sp. g 1.18) a 9.5g de sacarosa en solucin y diluya a 100ml con agua destilada. Despus de almacenar por 2 das a temperatura ambiente, afore a 1000 ml con agua destilada. Prepare soluciones de trabajo que contengan

5mg/ml, para lo cual mida con una pipeta volumtrica una alcuota de 100 ml de la solucin stock. Vace a un matraz volumtrico de 200 ml y neutralice con una solucin de NaOH al 20%, usando fenoftalena como indicador, lleve a volumen y mezcle. Acido Clorhdrico concentrado (Sp.g 1.18). Acido Clorhdrico (0.5N). Hidrxido de Sodio, Solucin 20%. Indicador de Fenoftalena (1% en etanol). Indicador de azul de metileno (1% en agua).

Materiales y Equipo

Calentador elctrico Matraces erlenmayer de 500 ml

Procedimiento Disuelva 8g de melaza y llvela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftalena como indicador y diluya a 200 ml. Estandarizacin de la Solucin Soxhlet: Mida 10ml de la solucin Soxhlet (a) y (b) con una pipeta volumtrica y vace a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un volumen de estndar de trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solucin Soxhlet. Llvelo a ebullicin y djelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y rpidamente complete la titulacin mientras est hirviendo, hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el volumen de solucin requerido para reducir completamente 20 ml de solucin Soxhlet. Titulacin de Muestra: Primero realice una titulacin aproximada; pase a un matraz 10ml de las soluciones (a) y (b), adicione alcuotas de 10ml de la solucin muestra. Aada 40 ml de agua y llvelo a ebullicin. Si persiste el color azul, titule con una solucin estndar de trabajo y calcule el contenido aproximado de azcar en la muestra. Para determinar con precisin el contenido de azcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b); adicione una alcuota de la solucin muestra. El volumen de muestra usado depender del contenido de azcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullicin, agregue estndar de trabajo con una bureta hasta que la titulacin sea casi completa. Aada azul de metileno y complete la titulacin. VOLUMEN DE MUESTRA USADO EN LA TITULACION SOXHLET (AOAC, 1970)
ml de H2O 40 35 30 25 20 ml de muestra 10 15 20 25 30 g de muestra en alcuota 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 Total como azcar invertida (%) 73 82-58 61-41 49-35 49-29

Calcule el % de azcar (como invertida) = (F - M) I 100/w Donde:

F= Volumen de estndar necesario para reducir 20 ml de Solucin Soxhlet. M= Volumen de solucin estndar de azcar requerido para completar la titulacin I= Peso de la azcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo. W= Peso de la muestra en la alcuota usada.

FIGURA 23 Determinacin de azcares totales disponibles en melaza

5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOS


El valor nutricional de un alimento depende en gran medida de la calidad de los ingredientes utilizados, la cual se mide en funcin de su capacidad de promover el crecimiento y mantener en buen estado a los organismos. En este sentido, el origen y/o el tratamiento previo a que se someten los materiales influir sobre su calidad, en funcin de la disponibilidad de nutrientes para usarse en las funciones metablicas del animal, o tambin, el contenido de factores txicos endgenos caractersticos de cada material, particularmente aquellos de origen vegetal, que funcionan como antinutrientes afectando negativamente al organismo. En este sentido, existen varias tcnicas que permiten conocer la disponibilidad de un nutriente determinado, principalmente aminocidos, as como tambin, determinar el contenido de sustancias txicas a fin de eliminarlas o desechar el material. En este documento se incluyen los mtodos para anlisis de los antinutrientes ms comunes encontrados en las protenas vegetales.

5.1. Mtodo Rpido Potenciomtrico para Medir Actividad Uresica en Harina de Soya
Este mtodo determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de acuerdo al mtodo Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Qum. Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mrida, Yucatn, Mxico). El resultado esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad uresica. Los valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento. Reactivos

Solucin bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio monobsico g.r. (KH2PO4) en 100ml de agua destilada recin hervida. Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibsico g.r. (K2HPO4) en 100ml de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada. Ajuste el pH a 7.0 con un cido o base fuerte antes de usarse. En refrigeracin tiene una vida til de 90 das. Solucin bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior. Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml.

Materiales y Equipo

Bao mara con agitacin, precisin 0.5C. Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir muestras de 5ml, precisin de 0.02 unidades de pH y compensacin de temperatura. Tubos de ensaye, 20 150mm con tapn de hule Vasos de precipitado de 10ml

Procedimiento 1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml de la

2. 3. 4. 5.

solucin bufer de urea. Tape, agite e incube en bao mara por 30 min a 30 0.5C. Despus de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos, tape, agite y coloque en el bao mara. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30 min). Retire el tubo A del bao mara, decante el sobrenadante en un vaso de pp de 10ml y mida el pH dentro de un perodo menor a 3 min. Repita el procedimiento con el tubo B 5 minutos despus del A. Calcule el ndice de actividad uresica como unidades de pH resultantes de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la calidad de la muestra segn la tabla de ejemplo incluida: IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer fosfatos)

Grado de cocimiento Cruda Subcocida Cocido adecuado Cocido adecuado Sobrecocida

Unidades de pH 1.9 0.80 0.30 0.08 0.03

pH tubo A 8.80 7.60 7.10 6.98 6.93

pH tubo B 6.90 6.80 6.80 6.90 6.90

Color Rojo Rosa Rosa Rosa tenue Ambar

FIGURA 24 Determinacin de actividad uresica en harina de soya y sus derivados.

5.2. Gosipol Libre en Harina de Semilla de Algodn


Este antinutriente es caracterstico de la harina de algodn, siendo necesario determinar su contenido debido a sus efectos adversos sobre los organismos alimentados con la semilla, aun cuando los peces aparentemente resisten mayores concentraciones del alcaloide debido al elevado contenido proteico de su dieta. En este documento se describen dos mtodos, el primero para harinas normales y el segundo para harinas que han sido tratadas qumicamente y contienen dianilinogosipol. Reactivos:

Acetona acuosa, 7 partes de acetona en 3 partes de agua destilada (v/v). Solucin de Acetona acuosa - Anilina. En 700 ml de acetona y 300 ml de agua, adicione 0.5ml de anilina purificada. Prepare diariamente. Solucin acuosa de alcohol isoproplico, 8 partes de alcohol isoproplico + 2 partes de agua destilada (v/v). Anilina purificada. Destile anilina grado reactivo sobre una pequea cantidad de polvo de zinc, descartando el primero y ltimo 10% del destilado. Almacene refrigerada en un frasco mbar de vidrio. Estable por varios meses. Solucin estndar de Gosipol: a. Disuelva 25 mg de gosipol puro en acetona libre de anilina y transfiera a un matraz aforado de 250 ml, usando 100 ml de acetona. Adicione 75 ml de agua destilada, afore con acetona y mezcle. b. Tome 50 ml de la solucin (a), adicione 100 ml de acetona pura, 60 ml de agua destilada, mezcle y diluya a 250 ml con acetona pura. La solucin (b) contiene 0.02 mg de gosipol/ml y es estable por 24 h en oscuridad.

Materiales y Equipo

Agitador mecnico. Espectrofotmetro Matraces erlenmayer de 250 ml Matraces Volumtricos de 25 y 250 ml Bao mara

Procedimiento Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agrguele 25 ml de acetona pura. Agite por unos minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una porcin, adicinele una lenteja de Hidrxido de Sodio y caliente en bao mara por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con el Hidrxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con el mtodo 1. Si se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de dianilinogosispol y requiere del mtodo 2. Mtodo 1 Pese 0.51 g de muestra, dependiendo de la cantidad de gosipol esperada, en un matraz erlenmayer y adicione 2 3 perlas de vidrio. Agregue 50 ml de solucin de acetona acuosa, tape el matraz y agite por una hora. Filtre, deseche los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alcuotas iguales (210 ml, dependiendo del contenido de gosipol esperado) y pselas a matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una de las alcuotas, afore a volumen con alcohol isoproplico acuoso (solucin a), mientras la otra alcuota (solucin b). Adicinele 2 ml de anilina purificada, caliente en bao mara (90100C) por 30 min. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilina y un volumen de solucin acuosa de acetona igual a la alcuota. Retire la solucin b y el blanco, adicione suficiente alcohol isoproplico acuoso para efectuar solucin homognea, y enfra a temperatura ambiente en un bao con agua. Afore con alcohol isoproplico acuoso. Lea las muestras a una absorvancia de 400 nm en el espectrofotmetro. Ajuste el instrumento a 0 absorvancia con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia de la solucin (a) y el blanco de reactivo. Si el blanco est abajo de 0.022

de absorvancia contine con el anlisis, de lo contrario repita el anlisis usando anilina recin destilada. Determine la absorvancia de la solucin (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0 absorvancia. Calcule la absorvancia corregida de la alcuota: absorvancia de la solucin (b) menos absorvancia de la solucin (a). Determine los mg de gosipol libre presentes en la solucin de la muestra usando la curva de calibracin. Mtodo 2. Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer, agregue 50 ml de acetona acuosa, agite y filtre como el anterior. Agregue alcuotas duplicadas del filtrado (de 2 a 5 ml, dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces volumtricos de 25 ml. Afore una de las alcuotas (solucin a) con el alcohol isoproplico acuoso y djelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el espectrofotmetro. Afore la otra alcuota (solucin b) como en el procedimiento (1), determine las absorvancias de las soluciones a y b como el procedimiento anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando la curva de calibracin. Preparacin de la Curva de Calibracin. Tome alcuotas duplicadas de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10 ml de estndar de gosipol 0.02 mg/ml y colquelas en matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una serie (solucin A) aforando con alcohol isoproplico acuoso y determine la absorvancia como en el anterior. A la otra serie (solucin b) adicinele 2 ml de anilina purificada y proceda como anteriormente. Prepare un blanco de reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa, calentada junto con el estndar. Determine absorvancias como en el procedimiento (1) y calcule la densidad ptica corregida para cada solucin estndar: Absorvancia Corregida = (Abs. solucin b - Abs. solucin a) Trace la curva estndar, graficando absorvancia corregida contra concentracin de gosipol en 25 ml. Calule % de gosipol libre en harinas normales. Gosipol libre % = 5G/WV Donde: G= Lectura en la Grfica W= Peso de la muestra V= Volumen de la alcuota usada. Para harinas qumicamente tratadas. Gosipol libre % = 5(B - A)/WV Donde: A = mg Gosipol libre aparente en alcuota (a) B= mg Gosipol libre aparente en alcuota (b)

FIGURA 25 Determinacin de gosipol libre en harinas de semilla de algodn.

5.3. Determinacin de Tioglucsidos


El mtodo descrito proporciona el contenido aproximado de tioglucsidos pero no determina tioglucsidos e isocianatos individuales. Reactivos y Aparatos

Solucin Cloruro de Bario 5% Matraces volumtricos de 600 ml

Bao de vapor

Procedimiento 1. A 10 g de harina (desengrasada por extraccin Soxhlet) adicinele 250 ml de agua destilada, hidrolice a 54C por 1 h y caliente a ebullicin por 2 h., manteniendo el volumen constante. 2. Filtre, reteniendo el filtrado y lave el residuo tres veces con 50 ml de agua caliente, agregando el lquido al filtrado inicial y afore a 600 ml. 3. Precipite el sulfato de bario por calentamiento y adicionando un exceso de solucin de Cloruro de bario. Djelo en un bao de vapor por algunas horas y filtre. 4. Calcine en una mufla y pese el precipitado. Calcule el contenido aproximado de tioglucsido como: % Tiogl= (M. wt. tioglucsido Peso de BaSO4) 100/M.wt. BaSO4 Peso Muestra

FIGURA 26 Determinacin de tioglucsidos en ingredientes alimenticios.

5.4. Anlisis de Aflatoxinas


El mtodo que se incluye es adecuado para materiales como harina de cacahuate, harina de copra y harina de palma kernel; para detalles del mtodo, as como para procedimientos alternativos, refirase a Methods of Aflatoxin Analysis por B.D. Jones (1972), Report No. G70, Tropical Products Institute, London. Reactivos:

Cloroformo (G.R.) Eter etlico (G.R.) Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v) Celita, tierra de diatomeas Gel de slica G (Merck) Estndares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede usar con este propsito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B obtenible en el Inst. de Productos Tropicales de Londres.

Materiales y Equipo

Placas para cromatografa de capa fina 20 20 cm. Lmparas UV pico de emisin a 365 Botellas de boca ancha de 250 ml Micropipetas Agitador Rotoevaporador

Procedimiento 1. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mzclelo con 10 ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa, ser necesaria una extraccin previa con soxhlet). Adicione 100 ml de cloroformo y agite por 30 min. 2. Filtre el extracto a travs de la celita, tome 20 ml del filtrado y llvelo a 25 ml (solucin a). Tome otros 20 ml del filtrado y concntrelos a 5 ml (solucin b). 3. Prepare placas de cromatografa agitando 100 g de gel de slica G con 220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el aparato apropiado, con un grosor de 509. Djela reposar por 1 hora y seque a 100C. 4. Coloque gotas de 10 y 20 l de solucin b y 15 y 10l de solucin a en la placa, junto con una gota de estndar cualitativo, en una lnea a 2 cm del fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicacin bajo luz tenue. 5. Revele la placa en ter etlico a una altura de 12 cm, djela secar en luz tenue y luego vulvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta una altura de 10 cm desde la lnea basal. 6. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. La presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0.50.55 indica aflatoxina B (asegrese de que la mancha del estndar se encuentre tambin en ese rango). la presencia de una segunda mancha a Rf 0.45 0.5 indica aflatoxina G. La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en trminos de aflatoxinas B y G de acuerdo con la tabla siguiente:

TABLA COMPARATIVA PARA DETERMINAR TOXICIDAD DE AFLATOXINAS B Y G


Conc. de Aflatoxina (mg/kg) Volumen aplicado (ml) No fluoresencia c/fluoresencia 5 (sol. A) 10 (sol. A) 10 (sol. B) 20 (sol. B) <1000 <500 <100 <50 >1000 5001000 100500 50100 Toxicidad de fluorescencia observada Muy alta Alta Media Baja

Tomado de Harris, 1980

FIGURA 27 Determinacin cromatogrfica de aflatoxinas en ingredientes alimenticios.

5.5. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de Mimosina (Matsumoto y Sherman, 1951).


La mimosina es un aminocido libre muy comn en algunas leguminosas, incluyendo a Leucaena leucocephala y L. glauca, consideradas excelentes fuentes de protena para la alimentacin animal. Su presencia limita el uso de las hojas y semillas en la

alimentacin de monogstricos, ya que afecta la funcin de la tiroides, provocando reduccin del crecimiento. Reactivos

Solucin de Mimosina, 0.1% en HCl 0.1N (mimosina de L. glauca recristalizada) Solucin de Cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N Carbn Activado. Acido Clorhdrico 0.1N.

Materiales y Equipo

Colormetro (usar espectrofotmetro 535 nm) Klett-Summerson con Filtro No. 54. Matraz Kitazato. Tubos de ensaye. Crisol de Filtracin. Vasos de precipitado de 250 ml. Vasos de precipitado de 150 ml. Matraz Volumtrico de 250 ml. Matraz Volumtrico de 100 ml.

Procedimiento Extraccin: Coloque 1.25 g de hoja seca de leucaena en un Vaso de precipitado de 250 ml y digiera con 100 ml de HCl 0.1N por hora con agitacin constante, deje enfriar y transfiera todo a un matraz volumtrico de 250 ml, agite bien y deje reposar hasta que los slidos se asienten en el fondo. Clarificacin: Transfiera 10 ml de sobrenadante a un V.P. de 150 ml con 30 mg de Carbn. Agregue agua para llevar el volumen a 25 ml, cbralo con un vidrio de reloj y caliente a ebullicin por 15 min., deje enfriar y filtre con vaco en el crisol de filtracin; el filtrado es colectado en un tubo colocado en el matraz kitazato. Enjuague el vaso de precipitado y el material en el crisol con 10 ml de HCl 0.1N dividido en tres porciones. Enjuague finalmente el crisol con 5 pequeas porciones de agua. Determinacin Colorimtrica: Transfiera el lquido obtenido a un matraz volumtrico de 100 ml, agregue 4 ml de solucin de cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N y afore con agua. El pH deber ser entre 1.5 y 2.5. Lea en el Colormetro y calcule la cantidad de mimosina en una curva de calibracin. Curva de Calibracin: Disuelva 0.1046 g de mimosina pura en HCl 0.1N y afore a 100 ml con el cido. La solucin contiene 0.1% de mimosina. Coloque 1 ml de solucin de mimosina en un matraz volumtrico de 100 ml y adicione 10 ml de HCl 0.1N y 4 ml de la solucin de cloruro frrico al 0.5% y afore con agua. Lea la intensidad del color en el Colormetro (espectro 535 nm). Use agua destilada como referencia y repita el procedimiento usando 2,3,4 y 5 ml de solucin de mimosina. Se obtiene una lnea al graficar la lectura del Colormetro contra la concentracin.

FIGURA 28 Determinacin colorimtrica de mimosina.

5.6. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de Canavanina (Archibald, 1946)


Las semillas y hojas de leguminosas y en particular las de canavalia (Canavalia ensiformis) y sesbania (Sesbania spp.) contienen cantidades variables del aminocido libre canavanina, el cual es txico para animales monogstricos. El mtodo permite determinar la cantidad del antinutriente en ingredientes alimenticios. Reactivos

Buffer fosfato 1 M, pH 7.2. Mezcle 34.5 g de NaH2PO4.H2O con 130.6g de K2PO4 y ajuste el volumen a 1 litro Solucin de nitroprusiato de sodio al 2%. Se debe usar solucin recin preparada. Es estable por una semana cuando se almacena en obscuridad a 04C. Perxido de hidrgeno (30% H2O2) Solucin de carbonato de potasio al 20%

Solucin stock de canavanina. 2.5mg de canavanina/ml. Almacenar en hielo seco Solucin estndar de canavanina. Lleve 1 ml de la solucin stock a 10 ml con agua Reactivo de acuoprusiato. Mezcle 0.5ml de la solucin de carbonato al 20% y 0.4 ml de H2O2 con 10ml de la solucin de nitroprusiato. Deje reposar por 30 min a temperatura ambiente (2025C). Deber prepararse diariamente. El uso de cantidades mayores de perxido disminuye el color obtenido con la canavanina.

Materiales y Equipo

Tubos de ensaye Colormetro Espectrofotmetro

Procedimiento 1. Ponga en un tubo de ensaye una muestra de 1 ml de extracto de la muestra, conteniendo 00.25 mg de canavanina, se le adicionan 0.5 ml de buffer fosfato y 0.5 ml de reactivo de acuoprusiato. Maneje de la misma manera blancos conteniendo 0.2, 0.5, 0.8, y 1 ml de solucin madre diluida y llevados a 1 ml con agua, as como tambin un blanco de reactivos con 1 ml de agua, tratados con el fosfato y acuoprusiato. 2. Mezcle vigorosamente y guarde los tubos en un gabinete obscuro; se desarrollar una coloracin rojiza en presencia de canavanina. 3. Despus de 2 horas lea en un colormetro o espectrofotmetro. En este ltimo, ajuste a una longitud de onda de 520 nm y el blanco a una densidad ptica de cero. Puede usar cubetas del espectrofotmetro para desarrollar el color; si usa cubetas de ms de 2 ml, puede adicionarles hasta 10 ml de agua despus de las 2 horas de incubacin para desarrollo del color. Clculos Se grafica la densidad ptica de cada estndar contra su cantidad correspondiente de canavanina y el contenido de canavanina de las muestras se calcula a partir de la curva.

FIGURA 29 Determinacin colorimtrica de canavanina en ingredientes alimenticios.

5.7. Determinacin de Acido Cianhdrico


El cido cianhdrico se encuentra de manera natural en diferentes materiales como son la semilla de lino, harina de yuca y algunas semillas de leguminosas. Este mtodo permite determinar el cido libre o en forma de glucsido, para lo cual, la muestra se suspende en agua, se libera el cido mediante enzimas y se separa por destilacin para colectarse en una solucin de nitrato de plata acidificada. Reactivos

Antiespumante (Silicona) Acido ntrico (d= 1.42g/ml) Solucin de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidrxido de amonio (d=0.88 g/ml) en dos volmenes de agua. Sulfato frrico amoniacal, solucin saturada Suspensin de almendras dulces. Triture 20 almendras dulces blanqueadas en 100 ml de agua a 3740C. Asegrese de que no existe cido cianhdrico en 10 ml de la suspensin usando papel de picrato de sodio o corriendo un blanco testigo como se describe ms adelante Solucin de acetato de sodio, neutral a la fenoftalena: 10g de acetato de sodio anhidro en 100 ml de agua destilada. Solucin 0.02N de tiocianato de amonio Solucin 0.02N de nitrato de plata.

Materiales y Equipo

Estufa regulada a 3738C Aparato para destilacin de vapor Matraz de fondo plano de 1000 ml con tapn esmerilado Bao de aceite Bureta graduada a 0.05 ml

Procedimiento Pese con exactitud de 0.005g aproximadamente 20g de la muestra preparada, colquela en un matraz de fondo plano de 1000 ml, adicione 50 ml de agua y 10 ml de suspensin de almendras dulces. Tape el matraz y pngalo en la estufa durante 16 horas a 3738C. Enfre a temperatura ambiente, adicione 80 ml de agua, 10 ml de solucin de acetato de sodio y una gota de antiespumante. Conecte el matraz al aparato de destilacin y colquelo en el bao de aceite previamente ajustado a una temperatura ligeramente superior a 100C; destile 200 300 ml de lquido pasando una corriente de vapor a travs del matraz y calentando suavemente el bao de vapor. Colecte el destilado en un matraz erlenmayer protegido de la luz conteniendo exactamente 50ml de solucin de nitrato de plata 0.02N y 1ml de cido ntrico. Asegrese de que la extensin del condensador est sumergida en la solucin de nitrato de plata. Transfiera el contenido del matraz erlenmayer a un matraz aforado de 500 ml y llvelo al volumen con agua, mezcle y filtre. Remueva 250 ml del filtrado, adicione aproximadamente 1 ml de sulfato frrico amoniacal y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de tiocianato de amonio. Si se desea, se puede correr un blanco siguiendo el mismo procedimiento con 10ml de suspensin de almendras dulces omitiendo la muestra.

Expresin de resultados Si el blanco indica que la solucin de nitrato de plata ha sido consumida, reste su valor del volumen consumido por la destilacin de la muestra. 1 ml de 0.02N AgNO3 0.54mg de HCN. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra. NOTA: Si la muestra (ej. frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre, se formar un precipitado negro de sulfato de plata, el cual se filtra junto con el depsito de cianuro de plata. La formacin de este precipitado consume solucin de nitrato de plata y su efecto debe ser eliminado para el clculo de contenido de HCN, para lo cual, trate el depsito sobre el papel filtro con 50ml de amonaco a fin de disolver el cianuro de plata. Lave el residuo en amonaco diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de solucin 0.02N de solucin de nitrato de plata y rsteselo al volumen de solucin de nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra.

FIGURA 30 Determinacin de cido cianhdrico en ingredientes alimenticios.

5.8 Taninos en Plantas y Forrajes. (Krishna y Ranjhan, 1980)


Los taninos son glucsidos de polipptidos solubles en agua presentes en muchas plantas, con un sabor agrio astringente, confiere sabor y olor indeseable a los alimentos. Afectan la utilizacin de las protenas debido a que ligan a la lisina, hacindola indisponible para animales monogstricos.

Reactivos

Solucin 0.1N de cido oxlico. 1 ml = 0.006235 g de cido quercitnico 0.0008g 02 absorbido Solucin de permanganato de potasio. Disuelva 1.333g de KMnO4 en un litro de agua y estandarice contra el cido oxlico. Solucin ndigo. Disuelva 6g de indigotin disulfonato de sodio en 500ml de agua mediante calentamiento, enfra y adicione 50ml de cido sulfrico. Diluya a 1 litro y filtre.

Procedimiento 1. Extraiga 2g de muestra durante 20 horas con ter anhidro. Hierva el residuo por 2 horas con 300ml de agua, enfre, diluya a 500 ml y filtre. 2. Mida 25 ml de la infusin dentro de una cpsula de porcelana de 2 litros, adicione 20ml de la solucin de ndigo y 750ml de agua. Adicione la solucin estndar de permanganato, 1 ml a la vez, hasta que cambie el color azul a verde, luego agregue otras gotas hasta que se torne de color amarillo dorado. 3. De manera similar, titule una mezcla de 20ml de solucin de ndigo y 750ml de agua. Multiplique la diferencia entre las titulaciones por el factor deseado para obtener cido quercitnico u oxgeno absorbido.

FIGURA 31 Mtodo simple para la determinacin de taninos en ingredientes alimenticios

5.9. Mtodo Simple para la Determinacin de Acido Ftico (Wheeler y Ferrel, 1971).
El cido ftico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjol, trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, etc. Su presencia puede provocar deficiencias de fsforo en monogstricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible ese elemento; afecta tambin la disponibilidad de calcio, magnesio o el fierro con los que forma el complejo fitina. Reactivos

Solucin de cido tricloroactico (ATA) al 3% Solucin concentrada de FeCl3 Solucin de sulfato de sodio al 3% en ATA Solucin 1.5N de hidrxido de sodio Solucin 3.2N de HNO3 Solucin 1.5M de KSCN Solucin FeCl3 - ATA que contenga 2 mg de Fe2 en sol 3% ATA

Materiales y equipo

Matraz erlenmayer de 125 ml Tubos cnicos para centrfuga Matraz volumtrico de 100 ml Bao mara Agitador mecnico Espectrofotmetro Centrfuga de laboratorio Embudos Papel filtro Whatman 2

Procedimiento 1. Coloque en un matraz erlemayer de 125 ml una muestra finamente molida (40 mallas), estimada para contener de 5 a 50 mg de fitato-P. Extraiga durante 30 min con 50 ml de solucin al 3% de ATA bajo agitacin constante. 2. Centrifuge la suspensin y transfiera una alcuota de 10 ml del sobrenadante a un tubo de centrfuga cnico. Agrguele 4 ml de la solucin de FeCl3 preparada para contener 2 mg de Fe2 soplando rpidamente la pipeta. 3. Caliente durante 45 min el tubo con la muestra en un bao mara a 90100C. Si el sobrenadante no est claro despus de 30 min adicione 1 2 gotas de la sol. al 3% de sulfato de sodio en ATA y contine con el calentamiento. Centrifuge por 1015 min y decante con cuidado el sobrenadante. Lave dos veces el precipitado con 2025 ml de solucin de ATA al 3% dispersndolo bien y calentndolo en agua a ebullicin por 510 min y centrifuge. Finalmente repita una vez el lavado con agua. 4. Disperse el precipitado en un poco de agua destilada, adicione 3 ml de la solucin 1.5N de NaOH y mezcle. Lleve el volumen a aproximadamente 30 ml con agua destilada y caliente en agua a ebullicin durante 30 minutos. Filtre en caliente (cuantitativamente) con un papel de retencin moderada (Whatman 2 SyS 597). 5. Lave el precipitado con 6070 ml de agua destilada caliente y deseche el filtrado. Si se desea hacer determinacin de fsforo se puede usar el filtrado.

Disuelva el precipitado en el papel con 40 ml de la solucin 3.2N de HNO3 pasndolo a un matraz volumtrico de 100 ml. Lave varias veces el papel con agua destilada colectndola en el matraz. Enfre la muestra a temperatura ambiente y afore con agua destilada. 6. Transfiera una alcuota de 5 ml a un matraz volumtrico de 100 ml y diluya a aproximadamente 70 ml. Agregue 20 ml de la solucin 1.5M de KSCN y afore con agua destilada. Lea de inmediato (dentro de un lapso de 1 min) en el espectrofotmetro a 480 nm. 7. Corra un blanco de reactivos con cada muestra. Calcule el contenido de fierro a partir de un estndar de Fe(NO3)3 corrido al mismo tiempo o mediante una curva estndar preparada con anterioridad. Clculos Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro, asumiendo una tasa molecular de 4:6 fierro:fsforo

FIGURA 32 Mtodo simple para la determinacin de cido ftico en ingredientes alimenticios.

5.10. Determinacin de Saponinas en Vegetales y Alimentos (Fenwick y Oakenfull, 1983)


Las saponinas se pueden encontrar en una gran variedad de plantas incluyendo la alfalfa, soya y semillas de leguminosas, habindose demostrado un efecto negativo sobre el crecimiento de monogstricos. Es un antinutriente estable al calor. Reactivos

Acetona G.R. Metanol Solucin n-butanol-metanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5) Solucin estndar de saponina purificada en metanol Solucin de cido sulfrico en metanol (100 ml por litro)

Materiales y equipo

Extractor soxhlet Rotoevaporador Densitmetro con graficador Planmetro Desecador Placa de gel de slica para cromatografa (Kieselgel 60 F-254 Merck)

Procedimiento Muela finamente la muestra y squela a peso constante. Pese alrededor de 40 g y colquela a reflujo con acetona en el extractor soxhlet por al menos 24 horas para remover lpidos, pigmentos, etc. Cambie el solvente por metanol y contine la extraccin por al menos otras 24 horas. Deje enfriar el extracto metanlico y llvelo a 250 ml con metanol. En este punto hay una modificacin al mtodo propuesta por Miriam Monforte (CICY, Mrida, Yucatn, Mxico). En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el mtodo original, es ms recomendable concentrar la muestra, lo que permite cuantificar cantidades muy pequeas de saponina, para lo cual, pase el extracto metanlico a un rotoevaporador y concentre a sequedad. Resuspenda el residuo con un mnimo de metanol y pselo a un vial previamente pesado; si no se va a usar de inmediato, seque con nitrgeno y gurdelo en desecador. Pese el vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. Para utilizar la muestra, resuspenda con una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml). Cromatografa cualitativa en capa fina Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de slica y revlelos con una solucin n-butanol-etanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar tres diferentes mtodos para identificar las manchas de saponina: (1) asperson con cido actico-anisaldeido; (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidrxido de sodio y (3) tratamiento con una suspensin de eritrocitos en buffer isotnico. Para mayores detalles consulte a Fenwick y Oakenfull (1981). Cromatografa cuantitativa en capa fina

Coloque series de puntos con volmenes conocidos del extracto y de una solucin estndar de saponina sobre las placas de cromatografa. Los puntos deben ser colocados de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de los de estndar de saponina. Revele las placas de la misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la asperson de una solucin de cido sulfrico en metanol, seguida de calentamiento a 110C por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponina por medio de un densitmetro y calcule las reas de los picos en el graficador con un planmetro. los resultados son expresados como la relacin (R) de las reas de los picos de la muestra desconocida con respecto a la del estndar. Se ha determinado que la concentracin de saponina en la muestra (en g) es proporcional al cuadrado de las reas relativas (R2). Grafique R2 contra el volumen de la gota de extracto metanlico colocada en la placa. La pendiente de la lnea (calculada por el mtodo de cuadrados mnimos), divido entre la pendiente de una lnea obtenida de una curva patrn, dar la concentracin de la saponina en el extracto y de esa manera, el contenido de saponina en la muestra. El mtodo puede tener un error experimental acumulado de 20%.

FIGURA 33 Determinacin de saponinas en ingredientes alimenticios.

6. REFERENCIAS
AOAC, 1984. Official Methods for Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 14th edition. Arlington, VA, 1141 pp. Archibald, R.M., 1946. Colorimetric determination of canavanine. J.Biol.Chem., 165: 169178. Chow, K.W., Rumsey, G.L. and Woldroup, P.W., 1980. Linear programming in fish diet formulation. In: Fish feed technology, UNDP/FAO/ADCO/REP/80/11, 395 pp. Cockerell, I., Francis, B. and Halliday, D., 1971. Changes in nutritive value of concentrate feedingstuffs during storage. Tropical Products Institute, London, U.K. F.A.O., 1980. Fish feed technology. ADCP/REP/80/11. 395 pp. F.A.O., 1983. Fish feeds and feeding in developing countries - An interim report on the ADCP Feedo Development Programme. ADCP/REP/83/18. 97 pp. Fenwick, D.E. and Oakenfull, D., 1981. Saponin content of soya beans and some commercial soya bean products. J. Sci. Food Agric., 32:273278. Frazer, A.C., 1967. Health problems in quality control: Chemical aspects. In: S. M. Herschdoerfer (Editor), Quality Control in the Food Industry. Academic Press, London, U. K., 385 pp. Furukawa, H. and Tsukahara, H., 1966. On the acid digestion method for the determination of chromic oxide as an index substance in the study of digestibility of fish fed. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish., 32(6):502508. Caskey, D. D., Jr. and Knapp, F. C., 1944. Method for detecting inadequately heathed soybean oil meal. Ind. Eng. Chem. Anal., 16:640. Harris, L. E., 1980. Feedstuffs. pp. 111170. Kent-Jones, D. W. and Amos, A. J. 1957. Modern Cereal Chemistry, fifth edition. The Northern Publishing Co., LTD, Liverpool, England. pp. 5960. Krishna, G. and Ranjhan, S.K., 1980. Laboratory manual for nutrition research. Vikas Publishing House PVT LTD, New Delhi, India. 134 pp. Limborg, C. L., 1979. Industrial production of ready to use feeds for mass rearing of fish larvae. Proc. World Symp. on Finfish Nutrition and Fish Feed Technology, Hamburg 2023 june, 1978. Vol. II. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265275 MAFF, 1982. The feeding stuffs (sampling and Analysis) regulations 1982. Minister of Agriculture, Fisheries and Food. Her Majesty's Stationery Office, London U.K., 99 pp.

Matsumoto, H. and Sherman, G., 1951. A rapid colorimetric method for the determination of mimosine. Arch. Biochem. Biophys., 33: 195200. New, B. B., 1987. Feed and feeding of fish and shrimp. A manual on the preparation and presentation of compound feeds for shrimp and fish in aquaculture. FAO, ADCP/REP/87/26, 275 pp. Osborne, D. R. and Voogt, P. 1978. The analysis of nutrients in foods. Academic Press, London, U.K., 240-pp. Smith, J. E. and Moss, M. O. 1985. Micotoxins, formation, analysis and significance. John Wiley & Sons. 148 pp. Tacon, A. G. J., 1979. The nutritional evaluation of animal and food processing wastes. 3rd International Conference on Effluent Treatment in the Biochemical Industries. London, 7th november 1979. Tacon, A. G. J. and Jackson, A. J., 1985. Utilization of conventional and unconventional protein sources in practical fish feeds. In: C. B. Cowey, A. M. Mackie and J. G. Bell (Eds.), Nutrition and Feeding in Fish. Academic Press, London. pp. 119145. Tejada, de H. I., 1985. Manual de laboratorio para anlisis de ingredientes utilizados en la alimentacin animal. Patronato de Apoyo a la Investigacin by Experimentacin Pecuaria de Mxico, D. F., 387 pp. Wheeler, E. L. and Ferrel, R. E., 1971. A method for phytic acid determination in wheat and wheat fractions. Cereal Chem., 48:312320. Williams, D. R., 1987. Animal feeding stuffs legislation of the U. K. A concise guide Butterworths, London, U. K., 135 pp.

Anexo 1. Clases de alimento por composicin y uso


1. Forraje seco Paja, ramas, follajes, productos con ms de 18% de fibra en base seca. Son pobres en energa neta por unidad de peso debido a su alto contenido de fibra. Se incluyen subproductos como cascarillas de semillas, vainas, salvados, etc. 2. Pasturas; plantas y Incluye todos los forrajes aun cuando no se hayan cortado, o cortados y forrajes verdes proporcionados en fresco 3. Ensilados Incluye solo forrajes ensilados (maz, alfalfa, pastos), pero no ensilados animales, de granos, races y tubrculos 4. Alimentos energticos Incluye productos con menos de 20% de protena y 18% de fibra en base seca como pescado, granos, subproductos de molienda 5. Alimentos proteicos Incluye productos con ms de 20% de protena en base seca, de origen animal (incluyendo ensilados) as como oleaginosas y otros materiales. 6. Suplementos minerales 7. Suplementos Incluye levaduras ensiladas vitamnicos 8. Aditivos Incluye otros suplementos como antibiticos, colorantes, saborizantes, hormonas y medicamentos

Anexo 2. Limites recomendados para algunas substancias indeseables en los ingredientes alimenticios.
SUBSTANCIA Arsnico MATERIAL - Todos los ingredientes excepto: Alimentos elaborados con pasto, alfalfa o trbol secos Pulpa o melaza de remolacha Fosfatos y subproductos de pescado y otros animales marinos - Todos los ingredientes excepto: Materiales de origen animal Fosfatos - Todos los ingredientes excepto: Harina de pasto, alfalfa o trbol Fosfatos Levaduras - Todos los ingredientes excepto: Subproductos de pescado y otros animales marinos - Harina de pescado Contenido mximo (12% de humedad; mg/kg) 2 4 4 10 150 500 2000 10 40 30 5 0.1 0.5 60 (como nitrito de sodio) 0.05 10 (como vainas de la planta) 100 20 1200 50 250 350 100 100 4000 (como isotiocianato) 3000

Fluoruros

Plomo

Mercurio

Nitritos

Aflatoxina B1 Ricino (Ricinus communis)

- Todos los ingredientes - Todos los ingredientes

Crotalaria spp Gosipol libre Acido cianhdrico

Aceite voltil de mostaza

- Todos los materiales sin moler - Todos los ingredientes excepto: Harina o pasta de algodn - Todos los ingredientes excepto: Semilla de lino Harina o pasta de lino Productos de yuca y pasta de almendra - Todos los ingredientes excepto: Harina o pasta de colsa

Semillas y frutos conteniendo - Todos los ingredientes alcaloides, glucsidos u otras substancias txicas separadas o en combinacin, incluyendo: Lolium temulentum Lolium remotum Datura stramonium

1000 1000 1000

Tomado de Williams, 1987

Anexo 3. Algunos Factores Antinutricionales Identifcados en Diferentes ingredientes Alimenticios.


ANTINUTRIENTE Inhibidor de proteasas MATERIAL Oleaginosas incluyendo: Algodn (Gossypium spp.) Cacahuate (Arachis hypogaea) Colsa (Brassica campestris) Girasol (Hellianthus annuus) Soya (Glycine max) Leguminosas incluyendo: alfalfa (Medicago sativa) Leucaena (Leucaena leucocephala) Canavalia (Canavalia spp.) Frijoles (Phaseolus spp.) Lupino (Lupinus albus) Cereales y sus subproductos Oleaginosas incluyendo: Cacahuate, soya Leguminosas incluyendo: Frijoles Chcharos (Cicer spp., Vigna spp., Cajanus spp., Pisum spp.) Cereales y sus subproductos Oleaginosas incluyendo: Cacahuate, colsa, soya, algodn Ajonjol (Sesamum indicum) Leguminosas incluyendo: Frijoles, chcharos Cereales y sus subproductos Oleaginosas incluyendo: Lino (Linum usitatissimum) Leguminosas incluyendo: Frijoles, chcharos Harina de yuca y sorgo Antagonistas de vitaminas Anti Vitamina E Anti Vitamina B12, D, A Micotoxinas Aflatoxinas Soya, frijoles, alfalfa Soya Oleaginosas incluyendo: Cacahuate, colsa, soya, girasol, algodn Leguminosas incluyendo: Frijoles, chcharos EFECTO Afecta la actividad de la tripsina y agudiza la deficiencia de aminocidos sulfurados de las protenas vegetales. Provoca hipertrofia pancretica asociada a prdida de protenas secretadas por el pncreas, constituidas en gran medida por enzimas ricas en Cistina. Son termolbiles

Fitohemaglutininas

Provocan coagulacin de la sangre. Son termolbiles

Acido fitico (fitatos)

Forma complejos indigeribles entre protenas, fsforo, calcio, zinc, cobre, magnesio, etc., provocando deficiencia de minerales. No se inactivan con calor

Ciangenos

Toxicidad por cianuro El cocimiento destruye las enzimas liberadoras del txico y volatiliza el HCN Reducen la disponibilidad biolgica de las vitaminas. Se inactivan por calor Elevada toxicidad. Producidas por el moho (Azpergilus spp.) bajo condiciones inadecuadas de almacenamiento: alta humedad y temperatura. Se presenta tambin en alimentos terminados

Cereales y sus subproductos Aminocidos libres: Mimosina Canavanina Leguminosas incluyendo: Txicos a niveles elevados; inhibicin del crecimiento.

Leucaena Canavalia, Sesbania (Sesbania spp.) Estables al calor

Adaptado de: FAO, 1983; Tacon y Jackson, 1985; New, 1987

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