Inativao do X e Imprinting Genmico: 1.

Inativao do X
Fernando Borges

1.1 - Introduo: A inativao do cromossomo X um processo que ocorre em todos os mamferos, resultando na inativao seletiva de alelos em um dos dois cromossomos X, nas fmeas. Sabe-se que as mulheres possuem dois cromossomos X, enquanto os homens possuem apenas um, sendo eles considerados hemizigticos para os genes deste cromossomo, mas as fmeas tornam-se funcionalmente hemizigticas pela inativao de um dos alelos cromossmicos X parentais. O cromossomo Y contm pouqussimos genes que, em sua maioria, governam a funo sexual do macho, de modo que as fmeas podem passar perfeitamente bem sem este cromossomo. O cromossomo X, entretanto, contm muitos genes que desempenham papis vitais em ambos os sexos, e, assim, algum mtodo de compensao de dose necessrio para assegurar que as clulas funcionem normalmente tanto com um como com dois cromossomos X. Essa compensao de dose se d pelo mecanismo de inativao do X, freqentemente chamado de lyonizao, por ter sido a Dra. Mary Lyon quem primeiro sugeriu esse mecanismo (Figura 1.1).

Fig. 1.1

Cedo no desenvolvimento embrionrio no estgio tardio da blstula (por volta do 13 ao 16 dias de vida embrionria blastocisto com menos de 100 clulas), a clula, de alguma maneira, conta seus cromossomos X e inativa todos eles, menos um (por exemplo uma clula 47,XXX inativaria dois X). No entanto, quando os cromossomos de uma clula feminina so observados na metfase da mitose, o X ativo e o X inativo tm o mesmo aspecto mas isso porque na metfase mittica todos os cromossomos esto condensados e inativos. Terminada a diviso celular, o X inativo continua condensado, enquanto os demais cromossomos se descondensam e reassumem as suas atividades de transcrio. Em algumas clulas, o X inativo pode ser visto como um corpsculo de Baar ou corpsculo de cromatina sexual, prximo membrana do ncleo interfsico. A escolha do X inativado na clula feminina 46,XX aleatria (com poucas excees), de modo que algumas clulas inativaro o X paterno e outras, o X materno. Feita a escolha, ela memorizada, ou seja, as clulas filhas inativam o mesmo X que a clula me. Uma fmea adulta um mosaico de clones derivados de diferentes clulas embrionrias, ou seja, compreendem misturas de linhagens celulares nas quais o X paterno inativado e linhagens em que o X materno inativado (Figura 1.2). Em um clone todas as clulas inativam o mesmo X, porm entre clones, a escolha aleatria. Nem todos os genes do cromossomo X esto sujeitos inativao; os genes que escapam inativao incluem aqueles em que existe um homlogo funcional no cromossomo Y e alguns em que a compensao de dose no parece ser importante.

Fig. 1.2

1.2 - Genes que Escapam Inativao: Cerca de 25% dos genes do cromossomo X inativo escapam inativao e expressam-se tanto pelo cromossomo X ativo, como pelo inativo. A maioria desses genes encontra-se no brao curto do cromossomo X (Xp). Uma conseqncia desse processo a clnica de pacientes com Sndrome de Turner (45,X). Se todos os genes do cromossomo X inativo estivessem metilados, essas pacientes no teriam nenhuma caracterstica clnica diferente da populao normal. Porm, a falta dos genes que escapam metilao do X inativo gera os sinas e sintomas caractersticos dessa sndrome. Os genes que escapam metilao so os das seguintes regies: 1)Regio pseudoautossmica: homologia e crossing over com cromossomo Y. 2)Regio com cpia correlata no Y, mas sem crossing over. 3)Regio sem cpia correlata e sem crossing over com o Y. Ex: gene para esteride sulfatase. Cerca de 16 genes do cromossomo X inativo escapam inativao, 12 deles tm homlogos no cromossomo Y. Alm disso, alguns genes apresentam inativao varivel entre diferentes indivduos e, desta forma, podemos inferir que existam outros mecanismos envolvidos na compensao de dosagem entre homens e mulheres em relao a genes ligados ao X. Na revista Nature, de 17/03/2005, contm uma reportagem sobre um estudo realizado que mostrou que o segundo cromossomo X nas mulheres, que at ento era considerado inativo, no to silencioso quanto se imaginava. "Os efeitos dos genes do cromossomo X inativo podem explicar algumas diferenas entre homens e mulheres que no podem ser atribudas aos hormnios sexuais", disse Laura Carrel, Ph.D., professora assistente de bioqumica e biologia molecular na Pennsylvania State College of Medicine. Dependendo do gene, possuir duas cpias ativas pode fazer pouca ou muita diferena. Quando genes no X inativo escapam da inativao e se expressam, isso pode criar uma concentrao maior de genes particulares. Carrel e o co-autor do estudo, Huntington F. Willard, diretor do Institute for Genome Sciences & Policy, da Duke University, determinaram quais genes estavam escapando da inativao e sua localizao no cromossomo X inativo. Eles descobriram que a maior parte desses genes "desobedientes" estava grupada. Trabalho anterior de Willard e outros pesquisadores, apresentou a primeira evidncia que parte dos genes no segundo cromossomo X da mulher permanecia ativo. O trabalho atual estende as descobertas anteriores para um conjunto completo de genes ligados ao X e tambm revela que as mulheres exibem diferenas individuais em relao inativao do X, disse Willard. Ns examinamos os cromossomos X de 40 mulheres e cada um deles possua um padro nico de expresso do gene", disse Willard. Todas essas variaes so completamente nicas para as mulheres. Os cromossomos X nos homens so todos iguais nesse aspecto. No estudo, os pesquisadores isolaram clulas da epiderme de 40 mulheres. Eles mediram o grau de atividade de 471 genes para determinar se a segunda cpia estava desligada ou no. Cerca de 15% dos genes no segundo cromossomo X escaparam da inativao em algum grau. Isso siginifica que pelo menos 15% dos genes ligados ao X, e suas protenas produzidas, esto presentes em nveis mais elevados e variados nas mulheres do que nos homens. A proporo de genes que permanece ativa difere dramaticamente entre as regies do cromossomo X. Alm disso, em algumas mulheres, um adicional de 10% de genes

ligados ao X demonstraram padres de inativao variveis e diferentes graus de atividade nos cromossomos X "silenciados", reportou a equipe. Os dados tambm sugerem que o genoma feminino difere do masculino em pelo menos quatro formas. Primeiro, estudos prvios mostraram que o cromossomo Y fornece aos homens diversos genes que as mulheres no possuem. Segundo, este estudo mostra que o fato de alguns genes no X inativo serem expressos significa que cerca de 15% dos genes so expressos num grau maior em mulheres do que nos homens. Terceiro, este estudo tambm mostra que um adicional de 10% de genes no X inativo apresentam graus de expresso varivel nas mulheres, enquanto que os homens possuem uma nica cpia desses genes. Agora sabemos que 25% do cromossomo X - de 200 a 300 genes - podem ser expressos de forma nica em comparao a outro sexo, disse Willard. Em essncia, no existe um genoma humano, mas dois - o masculino e o feminino. Trabalhos adicionais so necessrios para explorar as conseqncias potenciais dessas variaes, acrescentou. As descobertas ressaltam as diferenas entre o genoma masculino e feminino. 1.3 - Mecanismos de Inativao: A inativao do cromossomo X em mamferos parece ser iniciada por um nico gene, XIST, o qual unicamente expresso no cromossomo X inativado. um processo complexo e mecanismos moleculares distintos esto envolvidos na iniciao e na manuteno da inativao. O centro de inativao do X (Xic), que em humanos est localizado em Xq13, controla a iniciao e a propagao da inativao do X. Nesse centro, o gene XIST codifica um produto de RNA maduro de 15 kb que unicamente codificado pelo cromossomo X inativo. XIST essencial para o funcionamento de Xic na iniciao da inativao do cromossomo X, mas no necessrio para a manuteno da inativao do cromossomo X. De alguma forma, uma propagao cis-limitada desse produto de RNA atua de forma a cobrir o cromossomo X inativado por distncias muito longas. No entanto, o mecanismo que assegura a inativao dos genes no cromossomo X inativo, mas no no X ativo, desconhecido (existem apenas modelos possveis). Embora XIST seja essencial para a funo de Xic, XIST no suficiente sozinho. O elemento controlador de X (Xce) afeta a escolha de qual cromossomo X permanece ativo e diferente de XIST, estando localizado a 3 desse. Alm disso, a deleo de uma regio de 65kb a 3 de XIST produz um efeito que sugere que elementos envolvidos no mecanismo de contagem situam-se distantes a 3 de XIST. Recentemente outro gene foi identificado como sendo transcrito a partir da fita dupla oposta quela que utilizada para transcrever o gene XIST. Uma vez que a unidade de transcrio do novo gene sobrepe-se completamente ao gene XIST e est em orientao reversa, ela foi denominada Tsix. Isso d origem idia de que XIST possa ser regulado pelo gene Tsix. Assim, temos que o processo de inativao do X inicia na vida embrionria, por ao do gene XIST, mas deve ser mantido atravs de mecanismos especficos para que permanea nos descendentes clonais celulares. No cromossomo X que permanece ativo, o gene XIST inativo, e seus genes expressam-se normalmente. O gene XIST ativo apenas no cromossomo X inativo.

1.4 - Manuteno da Inativao: O gene XIST determina o padro de inativao e inicia o silenciamento dos genes do cromossomo X. Para que esse processo seja mantido, preciso que os genes inativados pelo XIST sejam metilados. A metilao um processo primariamente normal de inativao de diversos tipos de genes. o processo mais importante na manuteno da inativao iniciada pelo gene XIST. feita nas citosinas do DNA pela enzima DNA metiltransferase, sendo restrita ao dinucleotdeo CpG. A metilao tambm est relacionada expresso do XIST. No cromossomo X ativo o gene XIST encontra-se hipermetilado, o que determina a ausncia de sua expresso neste cromossomo. Algumas protenas histonas tambm participam no processo de manuteno da inativao associadas metilao. 1.5 - Inativao No Aleatria: H algumas situaes em que a inativao do X no aleatria, sendo as principais: 1)Lyonizao seletiva: em situaes onde h uma mutao presente em um dos cromossomos X, a inativao ocorre preferencialmente no X onde h defeito, permitindo a seleo de X ativos sem mutao e tendo, portanto, um efeito benfico. Assim, as anomalias do X so melhores toleradas que as anomalias similares dos autossomos. 2)Lyonizao negativa: neste caso tambm h uma mutao presente em um dos cromossomos X, mas h uma inativao preferencial do cromossomo X normal, permanecendo o X mutado na maioria dos cromossomos X ativos. Esta forma de inativao no aleatria tem conseqncias negativas, podendo heterozigotas desenvolverem doenas ligadas ao X como Hemofilia, Distrofia Muscular de Duchenne, Daltonismo, Sndrome de Wiskott-Aldrich e distrbios oculares ligados ao X. 3)Mutao em XIST: que proporciona alterao no processo aleatrio. 4)Clulas de tecido extra-embrionrio: nas quais somente o X de origem paterna inativado. A inativao no-aleatria gera expressividade varivel de doenas ligadas ao cromossomo X em mulheres heterozigotas. As mesmas podem ter fentipo desde normal at plenamente afetado, dependendo da porcentagem de X ativo alterado e de X ativo no alterado por mutao, translocao ou doena recessiva ligada ao X. 1.6 - Gametognese: No processo de formao dos gametas femininos (oocitognese) necessrio que ocorra a reativao do cromossomo X previamente inativo para que seus gametas disponham cada qual de um cromossomo X ativo. Este processo de reativao do cromossomo X ocorre pela ao da enzima 5-azacytidine que inibe a metilao da citosina. Simultaneamente a isso, a expresso do gene XIST diminui. A reativao do X fundamental para manuteno da vida, pois do contrrio 50% dos embries masculinos (aqueles que o espermatozide levava um Y) no sobreviveriam, uma vez que 50 % dos gametas femininos possuiriam um X inativo e pelo menos um X deve ser ativo para que o embrio se desenvolva.

2. Imprinting Genmico
2.1 Introduo: Com exceo dos cromossomos sexuais, X e Y, para a totalidade dos genes restantes dos cromossomos autossmicos, existem dois alelos ativos, cujas manifestaes fenotpicas dependem da sua dominncia ou recessividade. No entanto, vrios estudos recentes, mostraram que, para alguns genes, o postulado da contribuio eqitativa dos progenitores no se aplica. Nesses casos excepcionais, observa-se que apenas um dos alelos, paterno ou materno, normalmente expresso. O alelo herdado de um dos progenitores comporta-se de forma distinta do alelo herdado do outro progenitor. Este fenmeno denomina-se imprinting genmico, j que se admite que um dos alelos parentais adquiriu, presumivelmente, uma marca (imprint) de natureza supostamente bioqumica. O imprint dever levar, direta ou indiretamente, expresso diferencial de um dos alelos parentais. O imprinting poder assim ser o responsvel pelo fato de algumas doenas genticas apenas ocorrerem quando o gene responsvel herdado por via materna, e outras quando o alelo em causa de origem paterna, como o caso das sndromes de Prader-Willi e Angelman. Geralmente, se refere ao somatrio das diferenas entre alelos como epigentico, e elas incluem modificaes covalentes do DNA (metilao), alterao da estrutura da cromatina e acetilao das histonas. O mecanismo de imprinting no exclusivo da classe dos mamferos, sendo observado tambm em fungos, nematdios, insetos e protozorios, que apresentam elegantes processos de marcao gentica, que resultam na expesso diferenciada de genes 2.2 - A Descoberta do Imprinting: O imprinting genmico foi identificado no incio da dcada de 80, atravs de resultados de experimentos com ratos. Uma das tcnicas utilizadas consistia em fazer embries que herdassem cromossomos especficos de apenas um dos progenitores (dissomia uniparental Figura 2.1).

Fig. 2.1

Atravs deste experimento concluiu-se que alguns genes funcionariam diferentemente dependendo se a herana for materna ou paterna. 2.2 Aspectos Moleculares e Propriedades do Imprinting: Os genes imprintados raramente so encontrados em regies isoladas. Em torno de 80% esto fisicamente ligados em um agrupamento (cluster) com outros genes imprintados. A organizao em agrupamentos deve refletir a regulao coordenada dos genes em um domnio cromossmico. H elementos controladores do imprinting (ICS) em alguns agrupamentos que so necessrios para seu controle ou para a expresso dos genes imprintados. No existe uma tendncia no padro de metilao dos genes. Isto significa que a metilao pode estar associada com a atividade e inatividade do gene. Existem inmeras propriedades que permitem a distino entre genes expressos e no expressos e razovel esperar que os dois alelos parentais mostrem tal diferena. Geralmente, se refere ao somatrio das diferenas entre alelos como epigentico, e elas incluem modificaes covalentes do DNA (metilao), alterao da estrutura da cromatina e acetilao das histonas. 2.3 Genes Imprintados: Na dcada de 90 foram descobertos os primeiros genes imprintados. Hoje existem mais de 20 genes humanos imprintados identificados, desde fatores de crescimento a RNA no traduzidos, e acredita-se que 100 a 500 genes imprintados possam existir. Alguns genes no cromossomo 11, por exemplo, so imprintados, incluindo o fator de crescimento similar a insulina (IGF-2). Este gene est imprintado no cromossomo de origem materna, e ativo apenas no cromossomo paterno. Em camundongos, se o gene IGF2 for herdado do pai, ele possui um tamanho normal, mas se for herdado da me resulta num fentipo ano. Os genes imprintados esto normalmente envolvidos no crescimento embrionrio e desenvolvimento comportamental, entretanto, devido a uma expresso imprpria, perda do imprinting ou dissomia uniparental em um locus imprintado, eles podem funcionar como oncogenes ou como genes supressores de tumores. Dos genes imprintados, os mais envolvidos em carcinognese humana inclui: IGF-2, WT-1,p57, p73, NOEY2 E MP6/IGF2R. A perda do imprinting associada com a perda da metilao alelo-especfica caracteriza um exemplo de variao epigentica encontrada em clulas cancerosas que atua como facilitadora da expresso de protooncogenes e inativadora de genes supressores de tumores 2.4 As Sndromes de Prader-Willi e Angelman: O imprinting , assim como outros mecanismos genticos, passvel de erros. Alteraes no imprinting tem sido relatadas como causa de diversas doenas humanas. As sndromes de Prader-Willi (PWS) e Angelman (AS) constituem patologias clinicamente distintas (Figuras 2.2 e 2.3), embora ambas ocorram por perda (de funo) de genes na regio 15q11-q13 do cromossoma 15. Dentro desta regio, vrios genes so transcricionalmente ativos apenas no cromossomo herdado do pai, enquanto outros so ativos apenas no cromossomo herdado da me. Assim, existem vrios genes nessa regio que so ativos em apenas um dos cromossomos e se a nica cpia ativa for perdida por uma deleo cromossmica nenhum produto gnico ser gerado, resultando em doena.

Apesar da incidncia das sndromes de Prader-Willi e Angelman ser relativamente baixa, nos ltimos anos tornaram-se objeto de estudo intensivo, dado constiturem paradigmas do fenmeno de imprinting genmico. A maioria dos doentes com PWS ou AS possuem uma deleo do cromossoma 15, essa deleo ocorre no cromossoma 15 paterno na PWS e no cromossoma 15 materno na AS. Com efeito, uma proporo significativa de indivduos com PWS (25%) herdam apenas o cromossoma 15 materno, uma situao conhecida por dissomia uniparental materna (UPD materna). Estudos moleculares mostraram que, na maioria dos casos, os indivduos afetados herdam os dois cromossomas 15 maternos como resultado de no disjuno na meiose I. Assim, por exemplo, se um ovo dissmico para o cromossoma 15 materno, for fertilizado por um espermatozide normal, originar um zigoto com trissomia do cromossoma 15, situao que, a manter-se, originar um abortamento precoce. Se, no entanto, ocorrer nas primeiras divises ps-zigticas uma perda (por no-disjuno) de um dos cromossomas 15, poder haver uma reposio do estado euplide. Se esta nodisjuno resultar na perda do cromossoma 15 paterno (probabilidade de 1/3) ocorrer uma PWS. Finalmente, cerca de 1% dos casos de PWS resultam de uma pequena deleo da regio que contm um centro de imprinting no cromossomo 15. 2.5 Resumo: Em suma o imprinting genmico um tipo de herana epigentica na qual os alelos de determinado gene so expressos de forma diferente dependendo de qual progenitor foram herdados. Ultimamente um crescente nmero de genes imprintados tem sido identificados e acredita-se que possam existir mais de cem. A maioria desses genes apresentam elementos reguladores de sua expresso, que desempenham uma importante funo no desenvolvimento e sua desregulao conduz a alteraes no desenvolvimento embrionrio, doenas hereditrias e a carcinognese.

Sndromes de Prader-Willi & Angelman

Manifestaes Clnicas da PWS Hipotonia Dificuldades alimentares Hipogonadismo Atraso psico-motor e estaturoponderal Hiperfagia com subsequente desenvolvimento de obesidade Mos e ps pequenos Baixa estatura Atraso mental moderado

Fig. 2.2

Manifestaes Clnicas da AS Atraso do desenvolvimento psicomotor Ausncia de linguagem (menos de 6 vocbulos) Paroxismos de riso Movimentos bruscos e descoordenados Microbraquicefalia progressiva Alteraes eletroencefalogrficas Atraso mental profundo

Fig 2.3