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PRCTICA No.

1 DETERMINACIN CUALITATIVA DE SFILIS EN PLASMA INTRODUCCIN Antecedentes histricos Se proponen hasta tres teoras para el origen de la sfilis: la teora del nuevo mundo, que propone que la sfilis era endmica en la zona actualmente conocida como Hait y que fue llevada al viejo mundo por Cristbal Coln; la teora del viejo mundo o precolombina que afirma que la sfilis provena del fricacentral, y lleg a Europa mucho antes que Coln llegara a Amrica y la teora unitaria, que sostiene que todas las infecciones por treponema eran una sola entidad clnica, y sus manifestaciones variaban de acuerdo a condiciones del medio ambiente, como el clima. Lo que si est muy claro es que para 1495 sfilis era epidmica en Europa, y que lleg a otros pases como la India en 1498, a la China en 1505 y a Japn en 1569. Durante el Renacimiento esta enfermedad tuvo varios nombres, como la gran maldicin (en ingls: the great pox), enfermedad venrea, enfermedad francesa o Morbus Gallicus, enfermedad italiana, espaola, alemana o polaca. Lo cierto es que ningn pas aceptaba ser el origen de la nueva plaga y cada cual la adjudicaba a sus enemigos, para los turcos por ejemplo, era la enfermedad de los cristianos. El trmino enfermedad francesa o Morbus Gallicus fue el ms aceptado en esa poca, hasta que en 1530 el poeta italiano, Girolamo Fracastoro (14831553), que adems era astrnomo, botnico, matemtico y filsofo, escribi un poema denominado Syphilis sive morbus gallicus, que se traduce como Sfilis y la enfermedad francesa; trataba de un pastor llamado Sfilis, que fue afectado por la enfermedad Morbus Gallicus. Como era de esperarse, rpidamente se acept el nuevo trmino para esta enfermedad, por que as no se afectaba el buen nombre de las naciones. Pero adems Fracastoro, en 1546, escribi De contagione et contagiosis morbis et curatione, donde formul tres formas de transmisin para esta enfermedad, una forma directa entre humanos al igual que la sarna y la lepra, una forma indirecta a travs de objetos como ropa o a travs de animales y la tercera en que estos grmenes eran atrados por los humores o por la pestilencia. Segn John Hunter (1728-1793), la sfilis y la gonorrea eran una sola enfermedad y no fue hasta 1838, que Philippe Ricord demostr que eran entidades diferentes; adems propuso clasificar la sfilis en primaria, secundaria y terciaria. Los primeros modelos animales corresponden a 1903, y fue Ilya Ilich Metchnikoff y Pierre Roux quienes transmitieron el agente causal de la sfilis a chimpancs, segn ellos ste era un virus, y lograron la trasmisin de la enfermedad entre primates, poco despus dos investigadores italianos inocularon el germen en testculos y escroto de conejos.1 Fueron Fritz Schaudinn y Paul Hoffman, microbilogos alemanes, quienes en 1905 realizaron las primeras observaciones al microscopio del Treponema pallidum, con coloracin de Giemsa modificada y demostraron que la espiroqueta era el agente causal de la sfilis. Un ao despus August von Wassermann, patlogo alemn, modific la tcnica de fijacin del complemento, utilizando hgados de recin nacidos fallecidos por sfilis, que luego se conoci como la reaccin de Wassermann. En 1906, se le atribuye a Karl Landsteiner y a Viktor Mucha el desarrollo de la microscopa de campo oscuro. Landsteiner tambin demostr que en la reaccin de Wassermann se podan usar otros tejidos, especialmente corazn bovino, luego se le aadi a la tcnica original de Wassermann, colesterol y lecitina para incrementar la sensibilidad de los antgenos. En 1912 Nichols y Hough aislaron el Treponema pallidum, subespecie pallidum del lquido cefalorraqudeo (LCR) de un paciente con neurosfilis y lo inocularon en testculos de conejos adultos, logrando mantener esta cepa viable, la que se denomin cepa Nichols. En 1922 Kahn desarroll un test de floculacin que no requera complemento y poda observarse microscpicamente en pocas horas. 2 3 Fue recin en 1941, que Mary Pangborn purific la cardiolipina del corazn bovino, mediante repetidas precipitaciones con cloruro de bario, sta se mezcla con colesterol y lecitina para forma un antgeno estable usado en la deteccin de anticuerpos contra la sfilis, lo que permiti el desarrollo de la prueba de VDRL.4 Nelson y Mayer desarrollaron en 1949, la primera prueba con anticuerpo treponmico, denominada prueba de inmovilizacin del treponema (TPI), que usaba como antgeno la cepa Nichols y complemento srico para inmovilizar los treponemas vivos, luego se observa al microscopio de campo oscuro, su inconveniente es que es laboriosa, costosa, poco sensible y con una especificidad del 50%. En 1953, DAllesandro y Dardanoni prepararon un antgeno de Treponema phagedenis, conocido como treponema de Reiter o cepa Reiter, un organismo no patgeno que a diferencia del T. pallidum subespecie pallidum, es fcilmente cultivable in vitro. Poco despus en 1957, apareci la prueba de anticuerpos treponmicos fluorescentes (FTA), esta prueba tena el inconveniente de alto porcentaje de reacciones inespecficas

con la flora normal humana y fue modificada por Deacon y Hunter en 1962, usando un sonicado de cultivos de espiroquetas de la cepa Reiter a los que se le removieron los antgenos comunes por absorcin, lo que llevo al desarrollo del FTA-ABS, ms sensible y especfico. Rathlev en 1965 aplic la prueba de hemaglutinacin al estudio de la sfilis, utilizando eritrocitos de carnero sensibilizados con un ultrasonicado de la cepa Nichols, luego la tcnica fue modificada con el uso de un sorbente como el usado para el FTAABS. Inicialmente esta prueba se realizaba en tubo, luego evolucion al uso de microvolmenes denominndose microhemaglutinacin para T. pallidum (MHA-TP)3. Tanto FTA-ABS, como MHA-TP tienen gran utilidad en la actualidad, y el FTA-ABS se consider por muchos aos la prueba confirmatoria para el diagnstico de la sfilis. Fue en 1998 que se identifico el genoma completo del T. pallidum, esto ha permitido el desarrollo de nuevas pruebas diagnsticas altamente sensibles y especficas para la deteccin de anticuerpos o de componentes de la estructura de este microorganismo, mediante la produccin de pptidos producidos por tcnicas de ARN o ADN recombinante.5

Clasificacin y estructura
T. pallidum es una bacteria miembro de la familia Spirochaetaceae, genero Treponema, conformada por cuatro especies patgenas y seis no patgenas; las especies patgenas son: T. pallidum subespecie pallidum que causa la sfilis venrea; T. pallidum subespecie endemicum, que causa la sfilis endmica o bejel; T. pallidum subespecie pertenue que produce el pian. Antes perteneca a este grupo el T. carateum, que produce la pinta, pero fue separado por carecer de informacin gentica. Las especies no patgenas se encuentran en la flora normal del tracto digestivo, tracto genital y cavidad oral. El T. pallidum tiene una estructura helicoidal sumamente fina, de 6 a 15 m de largo y 0,1 a 0,2 m de ancho. Su composicin es 70% protenas, 20% lpidos, y 5% carbohidratos. La porcin lipdica est formada por varios fosfolpidos, dentro de los que destaca la cardiolipina. El T. pallidum se caracteriza por tener una pared celular flexible, rodeando la pared se encuentran unas pequeas microfibrillas, que presenta flagelos denominados endoflagelos o flagelos periplsmicos. Tapizando a la pared celular y a los endoflagelos, se encuentra una bicapa externa, similar a la estructura de las bacterias gramnegativas. La membrana externa que rodea al flagelo periplsmico es un complejo de peptidoglicano citoplasmtico y un cilindro protoplsmico. Esta membrana contiene la mayora de las protenas integrales y abundantes lipoprotenas, siendo la ms antignica la que tiene 47 kilodaltons (kDa); se encuentra anclada por lpidos en la membrana citoplasmtica. Se ha demostrado que la membrana externa del T. pallidum reacciona pobremente con los anticuerpos especficos del suero de pacientes sifilticos, su baja antigenicidad explica la persistencia de este microorganismo por largos perodos de tiempo. 6 Su motilidad es caracterstica, consiste en una rpida rotacin sobre su eje longitudinal; necesita un ambiente microaeroflico, rico en carbohidratos, un pH de 7,2 a 7,4, y una temperatura de 30 a 37C, y an no se ha logrado su cultivo exitoso in vitro. Con la finalidad de estandarizar la nomenclatura de los polipptidos identificados en T. pallidum se han desarrollado varias nomenclaturas. Una de las ms usadas, utiliza el prefijo TnP (de T. pallidum Nichols) seguido de la masa molecular que posee cada una; el gen que codifica cada polipptido ser: tnp (en letras minsculas e itlicas), por ejemplo el polipptido TnP47 es expresado por el gen tnp47. Existe otra denominacin para los 12 genes de T. pallidum identificados, a los que se le asigna una letra mayscula correlativa despus del prefijo tpr (T. pallidum repeat) tprA, tprB, tprC, y as sucesivamente hasta tprL. La familia tpr se divide en subfamilias I, II, y III, correspondiendo a la subfamilia I tprC, D, F, I; a la subfamilia II tprE, G, J; y a la subfamilia III tprA, B, H, K, L. Esta clasificacin est en relacin a la homologa del ADN. Tambin se ha designado a los polipptidos flagelares, as tenemos los siguientes polipptidos flagelares: TpN37a, TpN34.5, TpN33, TpN30, TpN29, y TpN27.5, que estn subdivididos en clase A y clase B en funcin a la secuencia N-terminal o C-terminal de sus aminocidos. As TpN37a es una flagelina tipo A, mientras que TpN34.5, TpN33 y TpN30 son las flagelinas FlaBl, FlaB2 y FlaB3, respectivamente y corresponden al core. A las protenas integrales de la membrana externa se les denomin TROMP (Treponemal rare outer membrane proteins), y son un grupo de unas 20 protenas denominadas principalmente en funcin a su masa molecular, son las que le dan la virulencia al T. pallidum y funcionan como porinas, adhesinas y varias de ellas tambin como hemolisinas. Las principales protenas de la membrana externa son las que tienen 17, 28, 31, 45 y 65 kDa de peso molecular. Tambin son conocidas como Tromp1 (31 kDa.), Tromp2 (28 kDa), Tromp3 (65 kDa) y TmpA (45 kDa). De estas protenas, son exclusivas de la membrana externa, las de 28 kDa., 31 kDa, y 65kDa, ya que las de 17 kDa y 45kDa tambin se encuentran en la membrana interna del cilindro protoplsmico. Las lipoprotenas identificadas son: TpN47, TpN44.5, TpN39, TpN35, TpN29-35, TpN24-28, TpN17 y TpN15. Existen otras protenas importantes como TpN60

(GroEL o antgeno comn) que representa el 6% del total de protenas del T. pallidum, TpN60 presenta reaccin cruzada inmunolgica con protenas similares de una gran variedad de bacterias.7 8 Respuesta Inmune a las protenas del T. Pallidium El suero humano normal contiene pequeas cantidades de anticuerpos reactivos contra los antgenos TpN47, TpN33 y TpN30 del T. pallidum. En la sfilis primaria y secundaria activa se encuentran anticuerpos de tipo IgM e IgG contra T. pallidum, pero IgM disminuye en los estadios tardos y despus del tratamiento. Mediante WB de antgenos reconocidos por el suero sifiltico, se ha demostrado que el grado de reactividad es proporcional a la duracin de los sntomas. En un modelo en conejos de la infeccin por T. pallidum, se ha observado presencia de linfocitos reactivos en el bazo, 3 a 6 das despus de la infeccin. Esta alta respuesta especfica al antgeno se mantiene desde el dcimo da hasta los 2 aos despus de la infeccin, y correlaciona con la infiltracin mononuclear progresiva en el sitio primario de la infeccin. En el sexto da hay respuesta celular a las protenas de 37 y 30 kDa, en el dcimo da hay respuesta a las de 35, 33 y 14 kDa, esta respuesta se mantiene hasta el sptimo mes. En humanos la aparicin de clulas perifricas reactivas a T. pallidum ocurre durante la sfilis tarda. Mediante electroforesis de alta resolucin SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), se ha demostrado que el T. pallidum posee unos 30 antgenos y mediante electroforesis bidimensional se ha demostrado la presencia de cerca de 60 antgenos, de estos de mayor importancia por su utilidad diagnstica son las de 47, 37, 35, 33, 30, 17 y 15 kDa. En modelos humanos in vivo, mediante inoculacin intradrmica de lipoprotenas de T. pallidum, se analiz las clulas de las ampollas producidas mediante citometra de flujo, para determinar el infiltrado celular dentro de la dermis. Se observ que las clulas T reclutadas presentaban marcadores fenotpicos Th1. Mediante marcadores de diferenciacin celular (CD83, CD1a), molculas coestimultorias (CD80/ CD86), y receptores de quimoquinas (CXCR4 y CCR5), se determin que el contenido de las ampollas eran clulas dendrticas, particularmente una poblacin monocitoide altamente activada. En resumen, estos estudios demuestran que los lipopptidos treponmicos tienen una gran capacidad de inducir inflamacin como la que se encuentra en las lesiones de la sfilis temprana, estos agonistas reclutan un infiltrado celular que son puente entre la inmunidad innata y la adquirida. Otros investigadores estudiaron biopsias de lesiones sifilticas primarias y secundarias, mediante tcnicas de RTPCR (reverse transcriptase-PCR) e inmunohistoqumica, demostrand que el infiltrado celular es predominantemente de macrfagos y en segundo lugar de linfocitos, estos linfocitos son principalmente CD4+ en chancros y CD8+ en lesiones de sfilis secundaria. Las clulas que infiltran ambos tipos de lesiones contienen ARNm para citoquinas Th1, interleuquina- 2 (IL-2), interfern gama (IFN-), e interleuquina- 12 (IL-12). Mediante WB, se ha observado que las muestras de suero de pacientes con sfilis secundaria y latente tienen anticuerpos reactivos para la mayora de polipptidos: TpN47, TpN44.5a, TpN37, TpN34.5, TpN33, TpN30, TpN17 y TpN15. Esta reactividad va disminuyendo en el suero de los pacientes no tratados con sfilis latente tarda (ms de 2 aos); sin embargo, en sfilis tarda se mantiene alguna reactividad para anticuerpos de tipo IgG. Cuando el tratamiento de la sfilis es exitoso, se observa una disminucin gradual de los anticuerpos anti-T. pallidum, particularmente la respuesta para anticuerpos de tipo IgM. En conejos se ha observado que la presencia de anticuerpos contra el antgeno de 45 kDa. (TmpA), correlaciona con resistencia a reinfeccin por T. pallidum.9 En cuanto a la familia de genes tpr, su heterogeneidad y el hecho que no todas las cepas de T. pallidum expresen el mismo repertorio de genes se cree que contribuye a la evasin inmunolgica y a la persistencia del T. pallidum; adems se ha demostrado que las diferentes cepas de T. pallidum, expresan repertorios diferentes para protenas tpr. En cuanto a tprK se ha observado que es blanco para anticuerpos opsonizantes, por lo que se sugerira que la inmunizacin con tprK recombinante podra tener cierto efecto protectivo.10 Nuevas pruebas para el diagnstico de la sfilis El estudio del genoma completo del T. pallidum y la tecnologa de ADN recombinante, que involucra la clonacin, expresin y purificacin de antgenos treponmicos como TpN15, TpN17, TpN47 y TmpA han llevado al desarrollo de pruebas de anticuerpos treponmicos de nueva generacin, como son las tiras inmunocromatogrficas, enzimoinmunoensayos (EIA), Western blot (WB) y reaccin en cadena a la polimerasa (PCR). Pruebas rpidas: Inmunocromatografa

Muchas de las pruebas rpidas se basan en la tcnica de inmunocromatografa. Son membranas de nitrocelulosa donde se colocan pptidos recombinantes de T. pallidum (como los de 47, 17 y 15 kDa.) en lneas separadas y antiglobulina IgG marcada con partculas de oro coloidal, mediante fuerzas capilares las partculas unidas a los analitos migran lateralmente a las denominadas zonas de captura (que es donde estas partculas se unen a los ligandos inmovilizados en la tira). El procedimiento es sencillo, se utiliza suero del paciente segn instrucciones del fabricante y el resultado se obtiene en pocos minutos. Esta prueba es del tipo de pruebas point of care o pruebas rpidas, aquellas que se realizan a la cabecera del paciente, y que no requieren personal con entrenamiento en laboratorio, ni equipos sofisticados, pero si deben ser realizadas por personal mdico o enfermeras, siguiendo estrictamente las instrucciones para su proceso y las normas de bioseguridad. Adems se debe corroborar todos los resultados positivos con pruebas confirmatorias. En ensayos realizados con este tipo de pruebas con 353 y 291 pacientes respectivamente, se demostr que esta prueba es ms sensible que RPR y que tiene slo 1,4% de resultados falso-positivos. Ms recientemente se realiz otro ensayo con 567 pacientes, que demostr sensibilidad y especificidad mayor del 95%. El inconveniente de usar este tipo de pruebas, adems de elevados costos, es el incurrir en errores por no ser realizadas correctamente.11 12 13 Enzimoinmunoensayos (EIA) La primera vez que se utiliz este tipo de pruebas para el diagnstico de la sfilis fue en 1975. Los EIA pertenecen al grupo de las pruebas treponmicas. Actualmente existen muchas enzimoinmunoensayos comerciales para la deteccin de anticuerpos antitreponmicos IgG, IgM o ambos (IgG-IgM), stos han mejorado en sensibilidad y especificidad con el uso de protenas recombinantes, como TpN15, TpN17 y TpN47. El uso de anticuerpos treponmicos totales (IgG-IgM) es particularmente importante como tamizaje, sobretodo cuando los volmenes de trabajo son altos, por ser susceptibles de automatizacin. Se recomienda que el tamizaje para sfilis se realice con una combinacin de RPR y TPHA o slo con EIA, la decisin de qu pruebas se usarn se toma en funcin a costos y volmenes de trabajo, no se recomienda realizar tamizaje con una sola prueba no treponmica por la alta posibilidad de obtener resultados falso-positivos. Una vez obtenido un resultado reactivo en las pruebas de tamizaje, ste debe confirmarse con una prueba treponmica diferente a la usada inicialmente; adems de una prueba no treponmica cuantitativa o semicuantitava (Ej. si se us EIA como tamizaje, se usar TPHA ms una prueba no treponmica, como RPR o VDRL). Se debe considerar la realizacin adicional de una prueba de enzimoinmunoensayo especfica para anticuerpos treponmicos de tipo IgM en funcin al ttulo obtenido en la prueba no treponmica y al cuadro clnico. Los anticuerpos IgM para T. pallidum indican una infeccin reciente y/o activa, aunque un resultado negativo no excluye la necesidad de tratamiento stos son detectables despus de 2 semanas de adquirida la infeccin, mientras que los anticuerpos de tipo IgG son detectables despus de 4 a 5 semanas. La sensibilidad para anticuerpos IgM es de 93% para sfilis temprana, 85% para sfilis secundaria y 64% para sfilis latente. Los anticuerpos antitreponmicos de tipo IgM declinan despus del tratamiento, pero no rpidamente, por lo que el monitoreo para respuesta al tratamiento se realiza con RPR o VDRL, observndose una disminucin del ttulo de 4 veces en 3 a 4 meses y de 8 veces en 6 a 8 meses, volvindose no reactivos despus de un ao en la sfilis primaria, y despus de 2 aos en la sfilis secundaria. El seguimiento con RPR o VDRL debe hacerse hasta el ao, si el paciente se mantiene asintomtico y no reactivo, con controles a los 3, 6 y 12 meses. En el caso de la sfilis latente, el 95% es no reactivo despus de 2 a 4 aos. En unos pocos pacientes el titulo se vuelve estacionario, esto no indica necesariamente falla del tratamiento, pero debe hacerse seguimiento a fin de buscar compromiso neurolgico. Si durante el seguimiento el ttulo de RPR o VDRL se incrementara 4 veces o ms, indicara reinfeccin, en casos de reinfeccin la sensibilidad de los anticuerpos antitreponmicos de tipo IgM disminuye. En sfilis congnita, la determinacin de anticuerpos treponmicos de tipo IgM es de gran utilidad. Su presencia en el suero del neonato se considera diagnstico presuntivo de sfilis congnita, aunque la prueba negativa no descarta esta posibilidad, y debe repetirse todos los meses durante los tres primeros meses de vida, as como tambin debe realizarse RPR o VDRL. Las causas de resultados falso-negativos son: por infeccin tarda durante el embarazo, por supresin de IgG en el neonato por altos niveles de IgG materna y por un sistema inmune poco desarrollado del recin nacido. Las pruebas no treponmicas deben negativizar a los 3 a 6 meses de recibido tratamiento. En casos de transferencia pasiva de anticuerpos al neonato, la prueba de anticuerpos treponmicos de tipo IgG, debe estar negativa a los 6 meses del nacimiento.14 15 16 17 Inmunoblot: Western Blot

El inmunoblot o enzimoinmunoensayo de membrana es un mtodo que consiste en transferir protenas (mediante aplicacin directa o electrotransferencia por electroforesis), a una membrana sinttica. Por razones histricas cuando la transferencia es a un gel de electroforesis de alta resolucin (como el SDS PAGE o electroforesis bidimensional), se llama WB. Las membranas sintticas pueden ser de nitrocelulosa o nylon, stas luego se cortan en tiras y se incuban con la muestra del paciente, en el WB se usa un segundo anti cuerpo marcado con una enzima y sustrato o con material luminiscente. El WB combina capacidad de resolucin de las protenas en un gel (electroforesis), con la especificidad de esta protena con su anticuerpo (reaccin antgeno-anticuerpo). Mediante WB se logra la identificacin de un antgeno especfico mediante anticuerpos monoclonales o policlonales, por una reaccin cromognica o luminiscente; es importante destacar que este mtodo es altamente sensible, ya que detecta cantidades muy pequeas de antgeno. El resultado es la deteccin de una o ms bandas18. Mediante WB para T. pallidum mediante anticuerpos tipo IgM, IgG, o ambos se puede detectar los antgenos ms relevantes como TpN15, TpN17, TpN37, TnP45, TmpA, y TpN4714, 19 El WB de tipo IgM es de gran valor para la confirmacin de sfilis congnita. Al igual que sucede con el FTA-ABS y debido a que podran haber reacciones cruzadas con otras espiroquetas u otros microorganismos como Borrelia debe ser interpretado cuidadosamente en zonas donde la enfermedad de Lyme es endmica, tambin en casos de infeccin por VIH, o en casos de lupus eritematoso sistmico (LES), otras enfermedades autoinmunes, embarazo y ancianidad. Para evitar estos falso-positivos el criterio diagnstico es considerar negativo la existencia de menos de tres bandas y positivo cuando hay tres o ms bandas presentes. Con estos criterios la sensibilidad y especificidad para esta prueba es bastante mayor que FTA-ABS, llegando segn diferentes estudios a 99100%3, 19 20 21 Inmunoensayo lineal (LIA) Este mtodo es un inmunoblot, muy similar al WB, la diferencia es que no se produce electrotransferencia de los pptidos recombinantes, si no que se adosan directamente a manera de lneas paralelas a una membrana de nitrocelulosa o nylon que se protege con una cubierta plstica. Los antgenos presentes son tres protenas recombinantes (TpN47, TpN17, TpN15) expresadas mediante insercin de secuencias de ADN en Escherichia coli, obtenidas mediante reaccin en cadena a la polimerasa (PCR), adems de un pptido sinttico (TmpA), que se purific mediante HPLC reversa (cromatografa lquida reversa de alta perfomance). Para su interpretacin, la tira posee un control negativo y tres controles positivos de IgG, que se valoran desde una cruz o dbil (1+) a tres cruces o fuerte (3+), con lo cual la prueba es semicuantitativa. La prueba se considera reactiva cuando hay ms de dos bandas presentes e indeterminada cuando slo hay una banda. Como prueba confirmatoria tiene la ventaja, que no presenta reacciones falso-positivas, descritas para WB y FTA-ABS. Segn diferentes estudios se reporta una sensibilidad de 99,6 a 100% y especificidad de 99,3 a 99,5% para esta prueba.22 23 24 Inmunofluorescencia de superficie (SIFA) La inmunofluorescencia de superficie (SIFA) es una tcnica compleja en la que el suero inactivado del paciente se coloca en una suspensin de treponemas. La suspensin es obtenida de testculos de conejos infectados con T. pallidum, a una concentracin de 108 bacterias/mL, antes de iniciar la prueba se debe comprobar que la motilidad de los treponemas sea del 100%. Luego se incuba la suspensin a 37C en anaerobiosis y se observa la viabilidad de los treponemas en microscopa de campo oscuro. Esta prueba se considera vlida, si la motilidad se ha conservado en 99%. La suspensin luego se centrifuga y se diluye a una concentracin final de 107 bacterias/mL. Se coloca en lmina portaobjetos, se deja secar y se fija. Luego, se le aade un conjugado de antiinmunoglobulina total de conejo con fluorescena y se debe observar fluorescencia brillante. La SIFA fue comparada con WB y demostr una especificidad del 100%.25 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica muy rpida, que permite a partir de una sola copia de una molcula de ADN obtener miles de copias. Por lo tanto, resulta ser una tcnica muy til en las estrategias de clonacin y tambin de deteccin, sobre todo cuando la cantidad de la muestra es escasa. Esta tcnica aprovecha las caractersticas de la replicacin del ADN, es decir que a partir de un pequeo cebador, la polimerasa, puede proseguir la sntesis de una cadena. Se debe contar con dos cebadores adecuados, uno para cada cadena. Por la posicin de estos cebadores, al cabo de una serie

de secuencias de replicacin, se obtiene la amplificacin de una molcula de ADN correspondiente al tramo que va desde uno de los cebadores al otro. Por lo tanto, se obtienen muchas molculas idnticas. Los cebadores suelen ser cortos, de 15 a 20 bases y en la reaccin se mezclan con la muestra de ADN a ser amplificada. Al comenzar la reaccin, la muestra de ADN de doble cadena debe ser desnaturalizada calentndola a 95C y luego enfriada para permitir la hibridacin con los cebadores. La siguiente etapa consiste en la sntesis a partir de los cebadores de cada una de las cadenas de ADN por la polimerasa, utilizando nucletidos agregados a la mezcla de reaccin. Este ciclo de desnaturalizacin, hibridizacin y sntesis se repite muchas veces y por tanto se amplifica, puesto que en cada nuevo ciclo se dispone de ms cantidad de ADN molde. Como el ADN tiene que ser desnaturalizado por calor para iniciar cada nuevo ciclo,se emplea una polimerasa que resiste el calor (denominada Taq polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus). El PCR para T. pallidum utiliza cebadores diseados a partir de fragmentos de ADN del gen TpN47. Se puede realizar a partir de muestras, como lquido amnitico, suero neonatal y LCR neonatal, aunque tambin se puede usar en sangre y tejidos; permite detectar de 1 a 10 treponemas por muestra. Como mtodo que puede detectar T. pallidum en pequeas cantidades de LCR es extremadamente valioso, especialmente para determinar la efectividad del tratamiento en neurosfilis. Un inconveniente es determinar si el ADN encontrado pertenece a una pequea cantidad de microorganismos persistentes o es ADN de organismos muertos3. Sin embargo, en modelos animales se ha podido determinar que despus del tratamiento exitoso la eliminacin de ADN de microorganismos muertos de T. pallidum es a los 15 a 30 das26. Tambin se ha diseado una prueba de RT-PCR (reverse transcriptase-PCR). RT-PCR es la prueba ms sensible para deteccin y cuantificacin de ARNm (ARN mensajero). Debido a que los ribosomas son crticos para la funcin celular e interaccionan con un gran nmero de otras molculas, incluyendo el ARN mensajero y el ARN de transferencia (tARN), las secuencias de las molculas de ARNr estn notablemente conservadas a travs de la evolucin. Adems, las secuencias de los genes que codifican para el ARNr se encuentran dentro de las ms altamente conservadas. La comparacin de las secuencias del ARNr 16S ha facilitado la identificacin de bacterias, incluyendo microorganismos no cultivables, como es el caso del T. pallidum. En cuanto a la metodologa de este anlisis, el ARNr 16S es secuenciado utilizando una modificacin de la tcnica de dideoxinucletidos, en la que cebadores complementarios conocidos de las regiones conservadas del ARNr 16S son elongados utilizando una transcriptasa inversa. Las pequeas cadenas de ADN producidas pueden ser amplificadas mediante la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) o por clonacin, y despus secuenciadas mediante un proceso automatizado por electroforesis en geles de poliacrilamida. Esta prueba es ms sensible que el PCR para ADN, ya que detecta la presencia de hasta un solo microorganismo de T. pallidum27. Las pruebas de PCR, aunque costosas, son particularmente tiles en las infecciones del SNC y tienen una sensibilidad mayor al 95% y una especificidad mayor al 99%28.

MTODO: ANTICUERPOS TOTALES (AT) EN LA SFILIS EIA II


DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI T. PALLIDIUM EN SUERO O PLASMA HUMANOS ANTECEDENTES CLNICOS

La sfilis es una infeccin crnica que progresa a travs de distintas etapas infecciosas: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Estas etapas producen sntomas clnicos diferentes normalmente llagas abiertas iniciales, llamadas chancros, seguidos de una exantema sifiltica o erupcin cutnea y largos periodos de latencia. La infeccin no tratada pude resultar en problemas cardiovasculares y neurosfilis. La infeccin es provocada por la espiroqueta Treponema pallidium y se adquiere normalmente mediante contacto sexual, aunque tambin puede remitirse mediante trasfusin de sangre infectada. Tambin ocurre la infeccin intrauterina. Ha sido virtualmente imposible cultivar el organismo en medios artificiales y el diagnstico de la infeccin depende comnmente de la aparicin de los anticuerpos en la sangre, que aparecen despus de la infeccin inicial. Las pruebas para la sfilis vienen en 4 categoras: examen microscpico directo, pruebas de anticuerpos treponmicos, pruebas de anticuerpos no treponmicos y pruebas directas de antgeno. Debido a los prolongados de latencia y a la naturaleza no especfica de las pruebas treponmicas, los mtodos que detectan anticuerpos antitreponmicos especficos en muestras sanguneas han adquirido una creciente popularidad en la seleccin de las pruebas. Una de estas es la prueba de anticuerpos totales (AT) EIA II. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Los kits de la prueba de sfilis EIA II 96 y 480 usan 3 antgenos recombinantes en una prueba sndwich para producir un ensayo que es de alta especificidad y sensibilidad. Los antgenos detectan IgG, IgM y IgA especficos del T. Pallidium, lo que permite detectar anticuerpos durante todas las etapas de la infeccin Todos los reactivos, excepto la solucin de lavado, se suministra listos para usar y codificar por colores, y el procedimiento utiliza muestras no diluidas y volmenes estndares para facilitar los usos automticos y manual .La prueba se puede utilizar tanto con sueros como con plasma. Los pocillos plsticos estn recubiertos con una mezcla de antgenos recombinantes 15Kd, 17Kd, 47kd del T. pallidium. Los anticuerpos especficos en muestra de suero o plasma se combinan con estos antgenos y con los mismos antgenos conjugados de la peroxidasa de rbano picante, cuando el conjugado se aade a un pocillo en el cual se ha incubado una muestra. Una vez que el material no reaccionado ha sido retirado por medio de un lavado, la presencia de enzimas unida que indica la presencia en la muestra de anticuerpos especficos se revela al cambiar el color de la mezcla sustrato/cromgeno .La intensidad del color se compara con la de los pocillos de control para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos especficos. CONTENIDO DEL KIT (REACTIVOS) NATURALEZA DE LOS REACTIVOS R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Micro placa : 12 tiras de 8 pocillos recubiertos con T. pallidum rAg Solucin concentrada de lavado (20x) Control negativo (humano) Amarillo Control positivo (humano) Rojo Conjugado listo para usarse Azul rAg conjugado a la peroxidasa de rbano picante Substrato Rosa Solucin Stop H2 SO 4.0.5M Bolsa para guardar los pocillos sin usar PRESENTACION 72518 72519 1 placa 5 placas 1x125ml 2x125ml 1x2ml 1x2ml 1x1.5ml 1x1.5ml 1x8ml 1x30 ml 1x7ml 1x7ml 1 1x30 ml 1x30ml 1

ESPECIFICACIONES DE LOS REACTIVOS

R1.Syphilis EIA Plate 12x8 Wells Lot: 805603 IVD 2010/02 (+2C +8C). New market Laboratories Ltd. R2.Syphilis EIA Wash 20x Conc. 125 ml Lot: 803202 IVD 2010/02 (+2C +8C.) R3.Syphilis EIA Negative Control 2 ml Lot: 802404 Cad: 2010/01 (+2C +8C) R4.Syphilis EIA Positive Control 1.5 ml Lot: 802405 IVD 2010/01 (+2C +8C) R5.Syphilis EIA II Conjugate 30 ml Lot: 807903 IVD 2010/03 (+2C +8C) R6.Syphilis EIA Substrate 30 ml Lot: 772011 IVD 2010/02 (+2C +8C) R7.Syphilis EIA Stop Reagent 30 ml. Lot: 803505 IVD 2010/02 (+2C +8C.)
INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDAD Todos los reactivos incluidos en el kit debern usarse para el empleo diagnostico in vitro

Use guantes desechables al manejar los reactivos y las muestras y lvese bien las manos despus de manejarlos. No pipetee con la boca

Todos los componentes sanguneos humanos usados en el kit han dado resultados negativos a HBs Ag, HCV Ab y VIH 1 y 2 Ab usando mtodos aprobados por la FDA. Sin embargo ya que ningn mtodo conocido de prueba ofrece una garanta absoluta, los materiales debern tratarse como si pudiesen transmitir enfermedades. Cualquier equipo que entre en contacto directo con las muestras y reactivos, as como con las soluciones de lavado deber considerarse como producto contaminado y tratarse como tal. Evite derramar las muestras o soluciones que lo contiene Enjuague los derrames con leja diluida al 10 % si el liquido contaminante es un acido, neutralice inicialmente el derrame con bicarbonato de sodio y seque con papel absorbente. El material usado para la limpieza deber desecharse en un contenedor de residuos contaminados. Las muestras y reactivos de origen humano, as como los materiales y productos contaminados debern desecharse despus de la descontaminacin. ya sea por inmersin en lejana con una concentracin final del 5% de hipoclorito de sodio (1 volumen de lejana por 10 volmenes de liquido o agua contaminada) durante 30 minutos mejor mtodo para inactivar los virus de VIH Y VHB. No se olvide de neutralizar o poner en la autoclave las soluciones o desechos de lavado o cualquier lquido que contenga muestra biolgica antes de desecharlos en el fregadero. PREPARACION DE REACTIVOS Y CONDICIONES DE CONSERVACIN

o mediante autoclave a 121C durante un mnimo de 2 horas. El tratamiento por autoclave es el

El kit deber conservarse a +2-8C .Mantenga las botellas en posicin vertical.

Todos los reactivos son estables a 2-8C hasta la fecha sealada de caducidad (excepto por los reactivos diluidos y placa abierta). No congelar. No exponga el substrato a la luz solar directa. Las tiras recubiertas no usadas son estables durante 4 semanas a 4C siempre y cuando se conserven en la bolsa incluidas en el kit solucin concentrada de lavado (20x).Diluya a 1:20 con agua destilada o desionizante antes de usarse. La solucin tampn de lavado diluido es estable durante 4 semanas a 4C

EQUIPO NECESARIO Sistema de pipetas apropiadamente calibrado y mantenido capaz de introducir volmenes de 50 microlitros (muestras y reactivos) y aproximadamente 300 microlitros (liquido de lavado). Lector de placa o de tira para leer a 450 nm (opcional) en la banda de 620 a 690nm.

Incubador a 37C

El equipo debe estar capacitado para soportar las siguientes tolerancias: Volumen dispensado +/- 10 % Temperatura de incubacin +/- 2 C Tiempo de incubacin +/- 2 minutos OBTENCION DE MUESTRAS Y ALMACENAMIENTO Puede usarse suero o plasma (aadiendo a EDTA, citrato de sodio o heparina).Debern eliminarse las partculas en la muestra mediante centrifugacin antes de hacer la prueba. Las muestras debern conservarse a +2-8C si las pruebas se van a hacer menos de 7 das o bien a -20C si se van a conservar durante ms tiempo. Evite congelar y descongelar repentinamente. Podrn usarse las muestras tratadas trmicamente a 56C durante .No use suero o plasma contaminados, hiperlipemicos o hiperhermolizados. Las muestras debern descongelarse y mezclarse bien antes de la prueba. PROTOCOLO DE PRUEBA (MANUAL) Poner todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de usar. Diluir solucin tampn de lavado en 1 a 20 con agua destilada o desionizada antes de usar. Se describe el protocolo para el mtodo manual .Anticuerpos totales de Sfilis (AT) EIA II puede automatizarse fcilmente tanto para el manejo de lquidos como para la interpretacin de resultados. Lea si ensayo a los 30 minutos de aadir la solucin stop. Las placas deben lavarse bien, llenando bien, llenando y vaciando completamente los pocillos en cada ciclo .Con algunos instrumentos, podra ser necesario optimizar el procedimiento de lavado (aumentar

el nmero de ciclos del paso de lavado y/o volumen de la solucin amortiguadora de lavado para cada ciclo) Controles Use los controles negativo y positivo en cada determinacin para validar los resultados de la prueba. Determinar 3 controles negativos por ensayo. Esta prueba se usara para calcular el valor de corte. Determinacin 2 controles positivos por ensayo Verificacin de la adicin del reactivo Visualmente La muestra y los controles negativos son amarillos El plasma/suero + conjugado es verde/azul El control positivo + Conjugado es azul oscuro El control negativo + conjugado es verde

Lecturas automticas

La adicin de la muestra y controles se verifica mediante la lectura a 450/620 nm .Un pocillo con la muestra aadida dar una densidad ptica entre 0,050 y 1, 000 Adicin de conjugado se verifica a mediante la lectura a 620/450 nm. Un pocillo con la muestra y conjugado dar un valor de > 0,000, un pocillo que solo contiene la muestra tendr un valor de <0,000. Adicin de substrato se verifica mediante la lectura a 550nm.Un pocillo con el substrato aadido deber tener una densidad ptica mayor de 0,080.

Ensayo 1.-Debern incluirse 1-3 controles negativos y 2 controles positivos con cada ensayarse. Trate los controles como si fuese muestras de los pacientes. 2.- Incubacin del conjugado y la muestra: lote de muestra a

Aadir 50 L de muestra sin diluir, control negativo (3 veces) o control positivo (2 veces) a cada pocillo. Aadir 50 L de conjugado a cada pocillo .El conjugado se suple a la concentracin de trabajo. Mezclar en un agitador de placas durante 30 segundos. Incubar (tapado) a 37 C durante 30 minutos 3.-Lavado: Lavar 5 veces con la solucin amortiguadora a la concentracin de trabajo. Se recomienda un tiempo corto de remojo de unos 30 segundos entre cada ciclo de lavado .Elimine el liquido excedente con ligeros golpecitos. 4.-Incubacin del substrato: Aadir 50 L de substrato/cromgeno a cada pocillo .Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos .Ya que el substrato es sensible a la luz, se recomienda que se proteja de la luz durante dicha incubacin .En presencia de una muestra positiva, la coloracin vira a azul. 5.-Paro del desarrollo del color: Aadir 50 L de la solucin stop (H2 SO 4-0.5M) a cada pocillo. El color azul vira a amarillo. 6.-Lectura: Limpie cuidadosamente la base de la placa .Determine la densidad ptica a 450/(620-690nm) usando un lector de placas a los 30 minutos de detener la reaccin. El uso del filtro de referencia a 620690nm eliminara los efectos de rayones, burbujas, etc. CLCULOS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Validacin del ensayo La densidad ptica de cada control negativo deber ser menor o igual a 0,080.Si un control est por encima de este valor, deber ignorarse la lectura y calcularse el valor de corte usando los dos valores restantes. La densidad ptica de cada control positivo deber ser mayor o igual a 1,000 Valor de corte Calculando como la mediana de valores del control negativo, mas 0,100 Es decir: Control Negativo1 + NC 2 + NC 3 + 0.100 3

Ejemplo:

0.030 + 0.025 + 0.035 = 0.130 3

Valor de corte =0,030+0,100=0,130 Interpretacin Las muestras con densidad pticas inferiores al valor de corte se consideran negativas al usar Sfilis EIA II.

Sin embargo, los resultados justos por debajo del valor de corte (V.C-10%<DO<V.C) debern interpretarse con precaucin. Es aconsejable repetir la prueba de las muestras correspondientes por duplicado cuando los sistemas y procedimientos de laboratorio lo permitan. Las muestras con una densidad ptica mayor o igual al valor de corte se consideran positivas al usar Sfilis EIA II y deber volverse a ensayar por duplicado antes de la interpretacin final. Las muestras que se vuelva a ensayar y estn por encima del valor de corte en al menos uno de los ensayos duplicados se consideran positivas y debern investigarse mas .Las muestras que estn por debajo del valor de corte en los ensayos duplicados se consideran negativas. Sensibilidad analtica Este kit ha demostrado la capacidad para detectar 0.0016Ul/ml de anticuerpo antitreponmico en soluciones de prueba de la primera norma internacional para suero humano sifiltico del nacional institute for biological standars and control (NIBSC), Potters Bar, RU. RESULTADOS Y DISCUSIONES SUJETO Braulio Mirna Jazz Miriam Zara Josu Itzel Grecia DETECCIN (+/-) +* +* * Los 2 sujetos que dieron a la prueba probables positivos probablemente sean falsos positivos debido a que seguramente no se realiz un correcto pipeteo de las muestras adems de que justamente las muestras que dieron positividad estaban junto a los controles positivos por lo que podra haber ocurrido que se contaminaran las muestras al pipetear y de esta forma se hubieran corrido los controles positivos hacia las muestras.

Se realiz la prueba de Elisa para T. Pallidium en la cual los controles positivos (para determinar de esta manera cuales eran los casos positivos experimentales) al finalizar el procesamiento de la muestra, dieron de una coloracin amarillo fuerte y en los casos negativos no se observaba coloracin alguna; esto debido al indicador que en combinacin con el conjugado al reaccionar daba esta coloracin ya que vir de azul a amarillo para lOos controles positivos, esto para observar la reaccin cualitativamente lo cual indicaba , la presencia o ausencia de anticuerpos especficos que se unieron al antgeno, es decir, un antianticuerpo que se uni al anticuerpo que se uni al antgeno y las reacciones negativas indicaban que no se unian al conjugado por lo que no haba vire del indicador unido al cromgeno. Esta prueba de alta sensibilidad y especificidad lo que hace es que los antgenos detectan IgG, IgM y IgA especficos del T. Pallidium, lo que permite detectar anticuerpos que indican infeccin o presencia de T. Pallidium. Al encontrarse los pocillos plsticos recubiertos con una mezcla de antgenos recombinantes

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15Kd, 17Kd, 47kd del T. pallidium, los anticuerpos especficos en las muestras de plasma se combinan con estos antgenos y con los mismos antgenos conjugados de la peroxidasa de rbano picante (el cual contiene el conjugado) cuando el conjugado se aade a un pocillo en el cual se ha incubado una muestra. Los lavados se realizan ya que una vez que el material no reaccionado ha sido retirado por este medio, la presencia de enzimas unida que indica la presencia en la muestra de anticuerpos especficos la cual se observa al cambiar el color de la mezcla sustrato/cromgeno a amarillo por la reduccin generada debido a la reaccin de la peroxidasa:

2 H 2 O Peroxidasa 2 H 2 O + O2
Segn la tcnica la intensidad del color se compara con la de los pocillos de control para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos especficos que se unieron al antgeno y ya que los 2 casos que dieron un posible positivo tenan una intensidad de color muy tenue, se podra decir que se trataba de falsos positivos, es decir, no contenan al antgeno del T. Pallidium. CONCLUSIONES La tcnica de ELISA es un mtodo de cuantificacin inmunolgica que evala la reaccin antgenoanticuerpo mediante una reaccin enzimtica, de acuerdo al diseo de la prueba se puede detectar una o ms inmunoglobulinas o se puede detectar antgenos especficos para lo cual se utiliza un conjugado, formado por un antianticuerpo o un antgeno, el cual se ha marcado con una enzima (en este caso peroxidasa de rbano.). El antgeno o anticuerpo que se utiliza, es inmovilizado sobre el soporte slido, que es una placa de poliestireno, por lo que la reaccin antgeno-anticuerpo que se produce tambin queda inmovilizada en el soporte slido. A esto se le adiciona el sustrato (enzima) marcado con un cromgeno que produce la reaccin de color, que es directamente proporcional al analito (antgeno o anticuerpo a ser detectado) y que es cuantificado con un lector de ELISA que es un espectrofotmetro modificado, lo cual en este caso no se realiz por falta del equipo necesario para este fin, sin embargo fue una prueba de tipo cualitativa la que se realizo la cual nos permiti observar claramente la reaccin que se dio a lugar. REFERENCIAS

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