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INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 PRACTICA N 1 DETERMINACIN DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA Pichia stipitis EN MEDIOS SINTETICOS Y COMPLEJOS : ADAPTACIN Y SELECCIN DE LAS

CEPAS FERMENTATIVAS A INHIBIDORES PROVENIENTES DE MEDIOS COMPLEJOS 1. INTRODUCCIN LEVADURAS Las levaduras se han definido como hongos microscpicos, unicelulares, la mayora se multiplican por gemacin y algunas por escisin. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 gneros y unas 500 especies. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la presencia de stas en la fermentacin alcohlica, pero eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, propuso la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en condiciones anaerobias; durante la cual el azcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2. Las levaduras son los agentes de la fermentacin y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hbitat encontrndose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribucin se produce al azar. Existe un gran nmero de especies que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproduccin y por la forma en la que transforman el azcar. Como todos los seres vivos, tienen necesidades precisas en lo que se refiere a nutricin y al medio en que viven. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan una alimentacin apropiada rica en azcares, elementos minerales y sustancias nitrogenadas, tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentacin sea tan rpido, pero as como se multiplican, pueden morir por la falta o el exceso de las variables mencionadas. Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. Para que el aislamiento de organismos se logre se utilizan medios slidos (agar-agar) o lquidos.

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INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 Medios slidos: siembra (extensin o vertido) en placa. Separacin e inmovilizacin de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo slido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Mtodo: diluciones consecutivas de la muestra. Medios lquidos: solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Mtodo de la dilucin lmite. Medios selectivos: Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo especfico. Se emplean cuando el organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para: Enriquecer: medios lquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento ms elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas. Aislar directamente: medios slidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impide el desarrollo de los dems microorganismos. Cuantificacin de microorganismos: Recuento de viables: Se utiliza una tcnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa). Recuento de totales. Medida del nmero de clulas: Directo mediante microscopio (cmaras de recuento de Newbaver). Contador electrnico de partculas (contador de Coulter) Medida de la masa celular. Turbidimetra (densidad ptica). Se utiliza un colormetro Peso seco Mtodos Indirectos: 1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de dixido de carbono (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 2) Mtodos turbidimtricos (pticos). a) Espectrofotmetro:

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INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 b) Nefelmetro: Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro. Mtodos Indirectos: 1) Recuento de viables en placa 2) Recuento sobre filtros: Crecimiento de Microorganismos Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamao y con el tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una poblacin de clulas vegetativas no diferenciadas. Las levaduras en general son clulas esfricas a elpticas cuyo dimetro vara de 3-15m. Si bien unas pocas levaduras se reproducen por fisin binaria la mayora se reproduce por brotacin o blastoconidios. Despus de la proliferacin en un medio con agar durante 1-3 das las levaduras producen colonias plidas y opacas y en general alcanzan un dimetro de 0.5 a 3 mm. La levadura Pichia stipitis fermenta directamente la xilosa a etanol requiriendo para ello un nivel de oxigenacin muy bajo pero a su vez sumamente bien controlado para la produccin ptima de de este alcohol; por otra parte una fraccin considerable del substrato de xilosa es convertido al subproducto denominado xilitol. Se han hecho numerosos esfuerzos para establecer el nivel de la oxigenacin ptima para la produccin mxima de etanol en levaduras, siendo entre ellos, la oxigenacin limitada, donde se observa la variacin del radio del volumen de cultivo del matraz Erlenmeyer con relacin a la agitacin y rangos de rotacin del mismo experimento. Los medios para el recuento de levaduras son: Medio sabouraud Oxiteclicina, glucosa, agar (O.G.A) Medio de patata, glucosa agar (P.D.A) Extracto de levadura, glucosa y agar. Medio de jugo de uva (para enologa) o medio mosto de cerveza (para cervecera).
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El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio mnimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecern

INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 ms o menos rpidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (C6H12O6) como fuente de carbono que con xilosa (C5H10O5).Por ejemplo el crecimiento de las levaduras sobre un medio de cultivo liquido es claramente exponencial. 2. Las condiciones de incubacin. La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2 en la atmsfera de cultivo, la agitacin, etc. son factores importantes. Por ejemplo para las bacterias patgenas el ptimo de crecimiento se consigue a los 37C y para las levaduras y otros hongos, a 30C. 3. La procedencia y caractersticas del inculo. La curva de crecimiento variar dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+C6H12O6 a MM+C5H10O5 o de MR a MM+C6H12O6.
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El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones aspticas y a temperatura ambiente, la homogenizacin y aire reaccin del medio de cultivo se realizara en forma manual cada doce horas por 7 das. El medio de caldo de maltosa Sabouraud esta especificado para el desarrollo de levaduras, mohos y bacterias as como la investigacin en las pruebas de esterilidad. En este medio de crecimiento de mohos se parece a esferas de algodn ms o menos grande. Se modifican y adoptan la forma de capas membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez homognea que se reconoce por investigacin microscpica.

2. Mtodo y Materiales MATERIALES 12 placas Petri 1 micro pipeta (1 mL) 1 micro pipeta (200 L) 1 aza de platino 3 set de tips estriles de 1 mL y 200 L 6 matraces Erlenmeyer (250 mL) 6 mangueras autoclavables 20 filtros (20 m) 3 trampas de fermentacin 1 equipo de destilacin al vacio 1 espectrofotmetro con sus celdas REACTIVOS Cultivo de Pichia stipitis CBS 6054, 5770 y 5773 en caldo nutritivo Extracto de levadura Peptona a partir de soya

INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 Agar agar Agar Patata Dextrosa Glucosa Xilosa Arabinosa Tetraciclina Solucin de cloruro de bario al 1% Solucin de trazas de metal Solucin de vitaminas Sulfato de amonio Fosfato dicido de potasio Sulfato de magnesio heptahidratado cido sulfrico al 1% Hidrxido de sodio Caldo nutritivo estril CONDICIONES DE CULTIVO DE LAS Pichia stipitis Para el proceso de acondicionamiento hacia un determinado medio de cultivo y fermentacin se debe tener cuidado cuando se trabaja con levaduras, estas pueden contaminarse y reportar valores errados, se cuenta con las cepas Pichia stipitis CBS 6054, 5770 y 5773 las mismas fueron sometidas a diferentes condiciones ya sea aeracin y sustrato (glucosa y xilosa).

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3. Clculos y Discusin Mtodo directo Clculos previos para la preparacin del Agar Se prepara un volumen para 6 placas

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Composicin del Agar: 10g/l extracto de levadura 20g/l peptona a partir de soya 20 g/l agar agar 5 g/l glucosa

Por tanto:
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Se pesa estas cantidades de reactivos y se enrasa con agua destilada a 120 ml, posteriormente se lleva a una fuente de calor para obtener una solucin homognea. Posteriormente se inocula la levadura de forma estril a la caja petri para reactivarla, por un lapso de 2 das. Por otro lado se prepara solucin de glucosa segn los requerimientos ya mencionados de glucosa y otra solucin de las sales y vitaminas, que al final se mezclaran para luego inocular la pichia stipitis y realizar el estudio determinado. Para la preparacin de las soluciones de glucosa a una concentracin de 20g/l, se utiliza 2 gr de glucosa para 100 ml, sin embargo solo se diluir en 50 ml para luego mezclarlo con 50 ml de las sales y hacer el volumen final de 100 ml. PARA 50 g/l - KH2PO4 - = 0.75ml (NH4)2SO4 = 0.175 ml KH2PO4

INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 MgSO4 - Solucion de vitaminas 1 ml Se enraso todo a 50 ml con agua destilada. PARA LA GLUCOSA.100ml 20g de glucosa Para 50 ml se trabajo con 2g de glucosa Curva de crecimiento Peso seco El peso seco se determina para hallar la concentracin de biomasa, inicialmente se pesa los papeles filtros, despus del filtrado de 10 ml del inoculo y lavado 2 veces con agua destilada se los lleva a secar por 3 das a 37C en un horno. ( ) ( ) Parmetros del inoculo Concentracin celular: Se toma una muestra para la determinacin de la concentracin de clulas, despus colocar la muestra en el espectrofotmetro OD(610nm). El valor ideal es de OD<0.5 en el caso que no sea diluir la muestra con la siguiente: | | Donde DF=(volumen de agua(ml)/volumen de inoculo(ml))=10 La concentracin de clulas: | | | |
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= 0.04 ml MgSO4

Donde f=factor=0.4 (factor para extracto de levadura)

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Segn las relaciones expuestas se tuvieron las siguientes tablas y graficas para cada pichia stipitis. C.B.S 6054 Tiempo(hr) 0 2 4 6 8 10 C.B.S 7505 Tiempo(hr) 0 2 6 8 10 C.B.S 5773 Tiempo(hr) 0 2 4 6 8 10

D.O(real) 0.22 0.31 0.24 0.43 0.53

X(g/lt) 0.06 0.07 0.06 0.08 0.09

0.000 0.077 0.000 0.036 0.041

D.O(real) 0.17 0.1 0.21 0.44 0.95 1.08

X(g/lt) 0.07 0.07 0.07 0.15 0.26 0.36

0.000 0.000 0.000 0.127 0.164 0.164

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D.O(real) 0.14 0.24 0.44 1.15 0.95 1.35

X(g/lt) 0.03 0.09 0.15 0.24 0.36 0.49

0.000 0.549 0.402 0.347 0.311 0.279

INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 Las graficas correspondientes:

0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 2

X vs T-7505

X/(g/lt)

8 Tiempo(hr) 10

X vs t-6054
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 2 4 6 8 10 T(hr)

1 0

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0.05

X(g/lt)

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0.4 0.35 0.3 0.25

X vs T-5773

X(g/l)

0.2

0.15 0.1 0.05 0 1 2 3 4 5 6 Tiempo(hr) 7 8 9 10 DETERMINACIN DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA Pichia stipitis EN MEDIOS SINTETICOS Y COMPLEJOS 0

1.4 1.2 1

D.O vs X-6054

D.O(real)

0.8

0.6 0.4 0.2 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 X(g/lt) 0.5

0.6 0.55 0.5 0.45

D.O vs X- 7505

0.25 0.2 0.055 X(g/lt) 0.06 0.065 0.07 0.075 0.08 0.085 0.09 0.095 0.1

D.O

0.4

0.35 0.3

1 1

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1.2 1 0.8

D.O vs X-5773

D.O(real)

0.6 0.4 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 X(g/l) 0.4

Vel.crecimiento vs t-6054
0.60 0.50

0.40 0.30

0.20 0.10

0.00 0 1 2 3 4 5 T(hr) 6 7 8 9 10

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Velocidad de crecimiento(1/hr)

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0.08

Velocidad de crecimiento vs t-7555

Velocidad de crecimiento(1/hr)

0.07

0.06 0.05

0.04 0.03

0.02 DETERMINACIN DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA Pichia stipitis EN MEDIOS SINTETICOS Y COMPLEJOS 0.01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tiempo(hr) 9 10

0.00

Velocidad de crecimiento(1/hr)

0.18 0.16 0.14 0.12 0.10

Velocidad crecimiento vs t.5773

0.08

0.06 0.04 0.02 0.00 0 1 2 3 4 Tiempo(hr) 6 5 7 8 9 10

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INFORME DE LABORATORIO PRQ-216 4. Conclusiones Definitivamente la pichia stipitis CBS 7555 tuvo un crecimiento fuera de lo esperado, se disparo en sus valores totalmente, podemos atribuir esta reaccin a que hubo contaminacin en este frasco. Por otro lado, en el anlisis de peso seco hubo algunos datos incoherentes y que podemos dar lugar que el transportar el papel filtro o en contacto con el podamos haber hecho perder la masa celular recogida durante la filtracin. Es claro que la pichia stipitis CBS 6054 es la que tuvo mejor comportamiento, sin embargo su mxima velocidad de crecimiento la experimenta a las 2 horas, siendo que por bibliografa esta debera ser alrededor de las 10 hrs. Mientras que la pichia stipitis CBS 5773 si experimenta su mxima velocidad de crecimiento cerca de las 8.5 horas, este valor se acerca mucho al valor bibliogrfico de 10 horas.

Debido al largo tiempo de permanencia en el medio de cultivo sinttico, las levaduras ya estaban muy activas, es por eso que la velocidad maxima se present a un corto periodo de incubacin de 2 horas, con excepcin de la ultima que se presento a las 8.5 horas d haber inoculado el M.O.
Los valores de las velocidades mximas de crecimiento de las variantes fueron: CBS T(hr) V.max(1/hr) 6054 2 0.549 7555 2 0.077 5773 10 0.164 Siendo CBS 6054 la pichia con mayor velocidad de crecimiento.

5. Bibliografa Guia de laboratorio de Ing. Bioqumica http://bibliotecadigital.umsa.bo:8080/rddu/bitstream/123456789/569/3/TN1006.p df http://www.scielo.org.bo/pdf/rbfb/v17n1/v17n1a03.pdf http://bibliotecadigital.umsa.bo:8080/rddu/bitstream/123456789/569/3/TN1006.p df

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