UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO CIENCIAS AGROPECUARIAS

INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO 1. DETERMINACIN DE BIOMASA

PROFESOR: ALUMNA: CURSO: CICLO:

ING. SNCHEZ GONZALES, JESS ALEXANDER MARTNEZ SALDAA, YURICO ELIZABETH BIOTECNOLOGA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES IX-A JUEVES 11-1 PM

HORARIO:

TRUJILLO- PER 2012

LABORATORIO N 01. DETERMINACIN DE BIOMASA I. OBJETIVOS Objetivo General: Determinar la concentracin de clulas por conteo en cmara Neubauer. Expresndolas en unidades de clulas/mL. Objetivo Especfico: Reconocer la tcnica de contaje en Cmara Neubauer. Comparar estadsticamente los valores de concentracin obtenidos; de manera general y manera aleatoria, mediante los mtodos de variabilidad y desviacin estndar. II. FUNDAMENTO TERICO Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez tambin se puede referir como la cantidad de clulas, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproduccin de clulas. La determinacin de biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems de cualquier proceso biolgico. Una variedad de anlisis estn disponibles para la determinacin de Biomasa de muestras biolgicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomyces cerevisae). Para determinar la biomasa es necesario calcular el nmero de clulas en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. Los mtodos para estimar el nmero de microorganismos pueden medir la cantidad de clulas, la masa celular o la actividad celular. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil cuantificar las clulas individuales. A. Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el nmero de clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos distinguir a los siguientes: 1. Mtodos gravimtricos (Peso Seco) La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica

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adsorbida. Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. 2. Mtodos espectrofotomtricos. Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscpicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal parmetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de mtodos rpidos, Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibracin (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partculas. 3. Mtodos microscpicos de recuento celular en cmaras Existen diversos tipos de cmaras para el recuento de microorganismos tales como la cmara de Neubauer. Thoma, Brker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Mal assez, Petroff H ttrser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central de la cmara y se multiplica por la profundidad, obtenindose el nmero de microorganismos por unidad de volumen (nmero de clulas/ml, generalmente). El recuento de microorganismos en cmaras no es un mtodo muy exacto debido a las irregularidades en la distribucin de la muestra. Adems, pueden confundirse las clulas con otras formas orgnicas e inorgnicas existentes en el medio y no permite distinguir clulas vivas de clulas muertas. a. CMARA DE NEUBAUER. Es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro. Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser: concentracin en la suspensin (clulas / mL) = 10000 (x/4). Conteo en cmara de Neubauer, Esta cmara se utiliza para conteo celular. Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debe quedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del recuadro.

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Figura 1. Conteo por Cmara Neubauer. Representacin de la cuadricula 10 X. En la figura 1, si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc., debemos ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio 4. Mtodos microscpicos mediante epifluorescencia La microscopa de epifluorescencia comenz a emplearse a principios de los 70 y hoy en da se considera como uno de los mejores mtodos para la estimacin de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adicin de algn anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algn componente celular autofluorescente. Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tincin de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopa ptica con iluminacin de epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observacin directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedaran englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actan especficamente sobre cidos nuclecos u otros componentes celulares. El segundo incluira a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad metablica, son convertidos en molculas fluorescentes. Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimacin de la poblacin total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten distinguir clulas de partculas e identificar bacterias no slo por su color, sino tambin por su forma y tamao. El naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las clulas emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los cidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. EI fluorocromo DAPI es LABORATORIO N 01. DETERMINACIN DE BIOMASA Pgina 4

un colorante especfico del ADN y su pico de excitacin se encuentra prximo a la regin ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las clulas muertas, metablica- mente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en clulas muertas. El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina o el DAPI, es un colorante especfico de cidos nucleicos. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del cido 1 -anilino-8 naftalensulfnico (Mg-ANS) tien principalmente componentes celulares como protenas, lpidos o membranas celulares. En cambio, el comportamiento de estos agentes fluorocromos es el comentado anteriormente, sobrestiman el nmero de clulas viables al no distinguir clulas vivas de muertas.

En el segundo grupo quedaran englobados fluorocromos como el cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC) el 5 y 6 diacetato de sulfofluorescena (SFDA) .Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores, distinguen bacterias metablicamente activas de las que no lo son mediante la observacin microscpica del producto fluorescente resultado de la actividad metablica para la que son especficos. En el caso del CTC 1a actividad metablica es la respiratoria y en el del SFDA es la actividad esterasa. La epifluorescencia basada en fluorocromos como el CTC y el SFDA pondr de manifiesto aquellos microorganismos en los cuales estn presentes dichas actividades metablicas, pero sin cuantificarlas. Salvando este obstculo se encuentran las medidas bioqumicas de determinacin indirecta de la biomasa, que s cuantifican actividades metablicas. La epifluorescencia es un mtodo simple y rpido. No obstante, su reproducibilidad est cuestionada y necesita un equipamiento relativamente caro. La fluorescencia mediante anticuerpos marcados con agentes fluorescentes est basada en las propiedades inmunolgicas de las clulas. Es una tcnica muy sensible y especfica, y puede realizarse in situ. Tambin puede llevarse a cabo mediante hibridacin de sondas fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ hybridization, FISH), cada vez ms utilizadas en Ecologa Microbiana. 5. Mtodos de siembra El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas clulas viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1- 1 ml de la suspensin microbiolgica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensin sobre la superficie del medio de cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volumen de la suspensin microbiolgica. Para que el recuento sea estadsticamente significativo, el nmero de colonias deber estar comprendido entre 30 y 300 colonias. En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear la filtracin de membrana, en la que tras la filtracin de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente sobre el agar. Otro tipo de recuentos los constituyen aquellos que emplean un medio de cultivo lquido como es el caso de la estimacin del nmero ms probable (NMP). El recuento de microorganismos viables se fundamenta en el desarrollo de una colonia visible a partir de cada organismo viable. El principal problema de este mtodo es que no todas las bacterias presentes en una muestra pueden crecer en el medio y las condiciones de cultivo seleccionado. Suelen ser, por tanto, mtodos infraestimativos y estadsticamente cuestionables.

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En el mtodo de conteo celular se expresa en cel/mL, en el mtodo de Peso Seco se expresa en g.m. s/mL, en el mtodo de Peso Hmedo se expresa en g. h /mL y en el mtodo de Conteo de Colonias o Recuento en Placa se expresa en UFC/mL.

B. Mtodos indirectos de determinacin de biomasa. Estos mtodos se basan fundamentalmente en la determinacin de algn componente celular especfico, en la cuantificacin de alguna actividad enzimtica (mtodos bioqumicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formacin de algn producto (mtodos cinticos). Tambin se incluyen en este apartado algunos mtodos fisicoqumicos. Los mtodos bioqumicos y cinticos determinan, ms que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen ms del estado metablico de los microorganismos que del nmero de individuos (Arniz et al, 2000). 1. Componentes celulares. Cualquier componente celular seleccionado para la estimacin de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente nicamente en clulas vi vas, ser rpidamente degradado en clulas vivas, ser relativamente constante en concentracin respecto a cambios en el estado fisiolgico celular y entre distintas epsecies. Hasta el momento no existe ningn componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin embargo, los ms adecuados para estimar biomasa viva (Arniz et al, 2000), son: cidos nucleicos, El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya sntesis es proporcional a la tasa de crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varan considerablemente con el estado fisiolgico celular, la cantidad de ADN es relativamente ms constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometra, tras su extraccin y purificacin. Existen diversas tcnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificacin son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos (Arniz et al, 2000). Protenas, Existen varias tcnicas para el anlisis de protenas totales de una muestra biolgica. Algunos estn muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el caso de las tcnicas de Lowry et al. y Bradford. La principal desventaja de la determinacin de protenas es que su cantidad en las clulas est sujeta a fuertes variaciones debido, fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoqumicas y al estado fisiolgico celular (Arniz et al, 2000). Polisacridos, La mayora de las clulas procariotas contienen cido murmico (un peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias tcnicas para 1a determinacin del cido murmico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversin del cido murmico a lactato, seguida del anlisis enzimtico o qumico de la concentracin de lactato. El cido murmico se extrae de 1as clulas mediante una hidrolisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografa de intercambio inico. Otros anlisis ms sensibles necesitan del uso de cromatografa lquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas estas tcnicas son laboriosas. Muy largas y necesitan de un equipamiento caro (Arniz et al, 2000). Lpidos, Los lpidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinacin para la estimacin de la biomasa de una poblacin bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros mtodos. La principal ventaja es su alto contenido especfico y que se encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los lpidos no forman parte de las reservas ceiulares y se degradan rpidamente durante la lisis bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lpidos de las membranas celulares est Pgina 6

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en forma de fosfolpidos. Las tcnicas de anlisis se basan, fundamentalmente, en la extraccin celular de los fosfolpidos con un disolvente orgnico, su posterior hidrlisis cida para liberar el fosfato y, por ltimo, 1a determinacin colorimtrica de ste. Son tcnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato) (Arniz et al, 2000). ATP, El ATP presenta las ventajas de ser un componente bioqumico central presente en todos los microorganismos y especfico de los microorganismos vivos, circunstancias ambas que permiten relacionarlo con la biomasa viva. Una de las tcnicas ms utilizadas para medir ATP se basa en la reaccin luciferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las lucirnagas y que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe que intervienen luciferina (fenol heterocclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de magnesio y oxgeno en un proceso de oxidorreduccin que ocurre en doble etapa: Ya que por cada molcula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinacin del ATP en una muestra biolgica puede hacerse mediante extraccin por ebullicin en tampn Tris (hipocloruro de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubacin con luciferina-luciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotmetro con registro. La mayor desventaja de esta tcnica es 1a necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado fisiolgico de las clulas cambia rpidantente tras la toma de muestra. La relacin entre el ATP, el ADP y el AMP y el contenido total de desoxirribonucletidos refleja la carga energtica de las clulas [(ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). Esta relacin puede duplicarse en slo unos segundos. Algunos autores sugieren que la carga energtica es un valor mucho ms preciso que el contenido absoluto de ATP ya que la composicin celular de desoxirribunucletidos vara con el estado fisiolgico de los microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energtico disminuye, al disminuir la concentracin de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Arniz et al, 2000). 2. Mtodos bioqumicos. Las medidas de alguna actividad enzimtica pueden considerarse como una alternativa a los mtodos tradicionales. Los ensayos enzimticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rpidamente. Adems. El equiparniento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayora de las medidas de actividad enzimtica se realiza mediante la conversin de sustratos especficos a productos coloreados que son cuantificados fotomtricamente. La principal desventaja de los mtodos bioqumicos es la variacin de las actividades enzimticas celulares con los cambios fisiolgicos y que, una vez que los microorganisrnos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas .Entre las distintas medidas de actividad enzimtica cabe destacar: Actividad esterasa Actividad deshidrogenasa

3. Mtodos cinticos. La base de estos mtodos es la medida del consumo de sustrato o de la formacin de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo ms tpico en microorganismos aerobios es la determinacin de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolucin a travs del consumo de oxgeno del medio. Adaptaciones del Respirmetro de Warburg Tasa de respiracin Tasa de desaparicin de sustrato Potencial bioqumico de produccin de metano

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4. Mtodos en continuo. Durante los aos 90 se han desarrollado mtodos cuantitativos para la determinacin on-line de la biomasa de un proceso biolgico. Las tcnicas ms importantes se basan en propiedades elctricas, microcalorimtricas o espectrofotomtricas de los cultivos biolgicos. Sin embargo, a pesar del desarrollo tecnolgico, no existe un sensor ideal para la monitorizacin en continuo de la biomasa.

III. MATERIALES Y MTODOS A. Materiales e Instrumentos Levadura Saccharomyces cerevisae Camara Neubauer Jeringa Laminilla cubreobjetos Lmina Portaobjetos Tubos de ensayo Microscopio

B. Metodologa Con una jeringa se tomar una cantidad de la solucin previamente preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilucin a la 10 -1 y se dejar caer unas gotas en la cmara de Neubauer. Se colocar la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona central, para apreciar una zona cuadriculada. Con la ayuda de una jeringa se obtendr una pequea muestra del tubo de ensayo, y se colocar en el borde del cubreobjetos. Se dejar que la solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Una vez que la muestra ingrese por la cmara de Neubauer, se dejar reposar, y posteriormente, se colocar en el microscopio. Se realizar la cuantificacin de clulas en las zonas de los cuadrados ms pequeos de 0.05 mm. tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma clula u omitir alguna. Se contarn las clulas que estn dentro de los cuadrados las que se noten bien y las clulas que estn en el lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4. Luego de calcular las clulas en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se deber calcular el nmero de clulas/ mL (por cuadrado), y por medio de la siguiente frmula, se determin el nmero de clulas por mililitro. A la vez se deber calcular la desviacin estndar de las 25 celdas. Luego tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviacin estndar para luego hacer una comparacin.

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IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer FILAS 1 fila 2 fila 3 fila 4 fila 5 fila NMERO DE CLULAS EN CADA UNA DE LAS 25 CELDAS. 8 9 4 10 12 6 5 2 4 7 10 2 6 5 5 10 10 3 7 2 5 6 1 5 6

Tabla 2. Concentracin de las clulas en las 25 celdas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin ( )

Concentracin de clulas

Desviacin estndar Coeficiente de Variacin

2.9580

Tabla 3. Al azar 5 Clulas de las 25 celdas de la Cmara Neubauer Nmeros al azar 8 4 10 7 6 2.2361 Desviacin estndar

Concentracin de Clulas

Coeficiente de Variacin

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Segn Aquiahuati, (2004); la cmara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de las clulas de levadura, sin embargo no permite distinguir las clulas viables de las no viables. Esto se puede contrastar en la tabla 1, en donde observamos que hicimos un conteo de 25 celdas. Segn Madigan, et al (1998), mediante el mtodo de conteo directo en cmara de Neubauer se debe utilizar frmulas que expresen la concentracin de clulas, mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio. Esto se observa en los datos hallados en la Tabla 2 donde determinamos la concentracin de clulas , desviacin estndar y coeficiente de variacin en las 25 celdas, del mismo modo en la Tabla 3 determinamos lo mismo para 5 celdas al azar , de este modo pudimos determinar la diferencia de levaduras en el laboratorio. Segn Rodrguez et al, 2005), los mtodos para estimar el nmero de microorganismos medirn la cantidad de clulas. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil cuantificar las clulas individuales. Segn lo expuesto por el autor en nuestra prctica hicimos conteo de levadura de Saccharomyces cerevisae por mililitro, para la determinacin de su biomasa utilizando el mtodo directo por recuento en el microscopio. Segn Arnaiz, et al (2000), los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodo de observacin, basados en propiedades fsicas o en la actividad biolgica. Mientras que los mtodos indirectos estiman algn componente celular o alguna actividad metablica especfica, estos no requieren de examen visual de los organismos ni su incubacin. Segn Silva, et al (2004), los mtodos de recuento de clulas determinan directamente las clulas vivas y muertas presentes en una muestra esto puede lograse utilizando una cmara especial para recuentos como la de Petroff-Hauser, la Cmara de Neubauer, Siendo estos los ms conocidos puesto existen otros tipos de mtodos de cuantificacin como los son el UFC, membrana de filtracin, Epifluorescenciadirecta, Coulters, Tcnica del nmero ms probable (NMP). Es as que en la prctica se desarroll la medicin de la biomasa microbiana de la levadura Saccharomyces cerevisae por conteo directo en cmara Neubauer tomando una muestra en dilucin de 10 L a la 10-1 por lo que los resultados arrojados en la Tabla 2 de las 25 celdas nos arrojaron una concentracin de clulas de 1.5 x 106 clulas/mL , es decir que la dilucin indica que la muestra original (la muestra madre) cumpli con los aspectos necesarios para un buen conteo de biomasa ; en la Tabla 3 vemos que los resultados arrojados en concentracin de clulas es de 1.75 x 106clulas /mL, tanto en los resultados de la concentracin de 25 celdas y las de las 5 celdas al azar vemos que los valores se asemejan por lo que no hay mucho margen de error as no debemos olvidar que la tcnica de conteo no permiten distinguir las clulas vivas de la muertas, por lo que no ser til en un recuento de poblaciones con altas o bajas concentraciones de microorganismos, pero en nuestro caso nuestro margen de conteo de clulas las que se pueden ver en la Tabla 1 no es ni alta ni baja concentracin. Segn Unam (1986),en la tcnica de conteo de clulas hay que tener en cuenta que en esta tcnica uno de los factores que afecta la observacin de las clulas de levadura es la correcta dilucin de la muestra empleada se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente69 clulas la muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de 20 clulas, la muestra se encuentra muy diluida. En nuestro prctica la muestra nos arrojaron valores de un total de clulas por las 25 celdas de 150, por lo que podemos que probablemente se encuentra muy diluida ya que es mayor de las 69 clulas dichas pro el autor.

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Segn Valencia (20019, la desviacin estndar es el promedio con respecto de la media aritmtica, dice cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del promedio en una distribucin. El coeficiente de variacin indica un mtodo de comparacin de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades diferentes. Es as que en la tabla la desviacin estndar de las 25 celdas nos da 2.9580 y en la Tabla 3 para 5 celdas al azar nos da un valor de 2.236 en ambos casos su desviacin estn prximos porque tenemos en ambos una desviacin pequea indicando que los datos estn agrupados cerca de la media. Al igual vemos que le coeficiente de variacin de las 25 celdas es 0.493 y de las 5 celdas es 0.447 por lo que sus valores son prximos adems de las 5 celdas es una parte de la representacin de la muestra general de las 25 celdas por lo que la muestra obtenida es una muestra homognea y representativa. V. CONCLUSIONES Se logr determinar la concentracin de clulas de la levadura Sacharomyces cerevisae en las 25 celdas la que nos dio 1.5 x 106 clulas /mL y en las 5 celdas al azar nos dio un valor de 1.75 x 106 clulas / mL por lo que nos damos cuenta que la muestra de 5 celdas al azar es una muestra representativa de la general.se pudo determinar las clulas por mililitro gracias a la cmara Neubauer. Se pudo determinar el promedio de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) contadas en las 25 celdas, por el mtodo de conteo directo, usando la cmara de Neubauer, que es un mtodo eficaz para el conteo de dichas levaduras. Se compar estadsticamente los valores de la concentracin de la levadura en las 25 celdas y las de las 5 celdas al azar, del mismo modo se compararon su desviacin estndar y coeficiente de variacin dando valores en las de 25 celdas de desviacin de 2.958 y coeficiente de variacin de 0.493 y en el caso de 5 celdas desviacin de 2.236 y coeficiente de variacin de 0.447. Por lo que la muestra de las 5 al azar es representativa. VI. RECOMENDACIONES Se recomienda calibrar bien el microscopio, con la finalidad de poder observar de manera ms clara las levaduras, de esta forma facilitaremos el conteo de las clulas. Se debe agitar la dilucin a emplear (10-1), de manera homognea para que esta se encuentra debidamente preparada y ser llevada adecuadamente a la lmina portaobjetos. Verificar que mediante el uso de la jeringa se pueda hacer un correcto llenado de la muestra en la cmara de Neubauer. Miraren el microscopio y contabilizar bien la clulas, las cuales no se tomarn las clulas que estn la parte derecha del cuadro ni las de la parte inferior del mismo cuadro, ya que ellas formaran parte del siguiente cuadro. Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.

VII. BIBLIOGRAFA

AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prcticas: Laboratorio de Microbiologa Celular, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa, 1era Edicin, Pg. 63-68. ARNIZ,C., ISAC,L. LEBRATO, J. (2000). Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. SevillaEspaa. LABORATORIO N 01. DETERMINACIN DE BIOMASA Pgina 11

MADIGAN M. et al (1998). Brock Biologa de los microorganismos Octava Edicin, Prentice Hall, Espaa, P. 155 156. RODRGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNNDEZ, F. GARCA, J. (2005). Bacteriologa General: Principios y prcticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. SILVA, C., GARCA, J. (2004). Manual del Tcnico Superior de Laboratorio de Anlisis Clnicos. Editorial MAD, S.L. Sevilla. UNAM, (1986); Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad autctona de Mxico. Pg. 20 28. VALENCIA, H. (2001). Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica. Universidad Nacional de Colombia. 2001. ANEXOS Las ventajas de este tipo de recuentos de Conteo, son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfologa de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es tedioso y no es til para recuento de poblaciones con baja concentracin de bacterias. No se usa en hifas o mohos.

Figura 2. Representacin de la cuadrcula de la cmara de Neubauer con el ocular de 10X.

Figura 3. Orientacin que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando la cmara de Neubauer

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Figura 4. Orientacin para el conteo de microorganismos usando la cmara de Neubauer.

Figura 5. Cuadrculas de la cmara Neubauer

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