1 Noes bsicas sobre o Sistema Imune O sistema imune rene vrios mecanismos envolvidos na preveno das infeces e na eliminao

das substncias estranhas. Pode ser didaticamente dividido em imunidade inata e imunidade adaptativa. A imunidade inata compreende mecanismos bastante diversificados que se valem de barreiras protetoras e do reconhecimento de padres moleculares de microorganismos por protenas solveis e por leuccitos para evitar infeces. Para isso, existe um grande nmero de receptores de padres moleculares codificados na linha germinal de leuccitos e das clulas que produzem os receptores solveis. Cada receptor reconhece um grande nmero de molculas, normalmente representando um ou mais padres moleculares presentes em patgenos, mas no em nossas estruturas. So mecanismos bastante eficientes e trabalham todo o tempo. J a imunidade adaptativa ativada apenas quando os mecanismos da imunidade inata falham em eliminar um microorganismo invasor, mas a partir de uma 1 ativao, passa a aumentar a magnitude e melhorar sua qualidade de resposta a cada exposio ao agente infeccioso. Essa capacidade de melhorar a resposta com a exposio ao agente infeccioso confere aquilo que chamamos de imunidade protetora, o fato de que um indivduo que j passou por uma infeco e conseguiu eliminar o patgeno, permanece livre daquela infeco, ou seja, imune ela nas exposies subseqentes. A imunidade adaptativa se vale de clulas (os linfcitos) que exibem cada um apenas um tipo de receptor, chamado de receptor antignico. Chamamos s molculas capazes de disparar imunidade adaptativa de antgenos e elas comumente so estranhas ao organismo. Diversos mecanismos de gerao de diversidade randmicos contribuem para gerar um receptor original em cada um desses linfcitos e a especificidade desses receptores bastante restrita, de forma que cada linfcito reconhece apenas um antgeno, ou um nmero muito limitado deles. O nmero de linfcitos exibindo receptores de antgenos distintos enorme, mas existe apenas um ou muito poucos linfcitos exibindo receptor especfico para cada antgeno. Quando um linfcito encontra o antgeno para o qual seu receptor antignico especfico, ele prolifera, dando origem a um clone de clulas que exibem aquele receptor antignico, ativadas sua funo especfica que promove eliminao de substncias estranhas, chamada de funo efetora. Esse processo de expanso de uma populao com determinado receptor antignico chamado de expanso clonal, e a base da imunidade adaptativa. Imunidade adaptativa diversidade de receptores gerada por rearranjo de segmentos gnicos

Existem linfcitos de 2 tipos bsicos: os linfcitos T e os linfcitos B. Os linfcitos T so clulas cujo receptor antignico, o TCR (T cell receptor), especializado em reconhecer peptdeos ligados superfcie de uma outra molcula, chamada de MHC (major hystocompatibility complex). Estes MHCs esto presentes na superfcie das chamadas

2 clulas apresentadoras de antgeno (APC, antigen presenting cells), combinados aos peptdeos resultantes do processamento de protenas endocitadas. Os MHCs se combinam apenas a pequenos peptdeos linearizados e a especificidade do reconhecimento pelo TCR apenas para a seqncia de aminocidos, e no para a conformao nativa da protena (processada pela APC). Os receptores antignicos de linfcitos B reconhecem antgenos de vrias naturezas moleculares, respeitando sua conformao espacial. Quando ativados pelo encontro com o antgeno, podem realizar expanso clonal e produzir anticorpos, molculas solveis que se ligam ao antgeno acionando vrios mecanismos que promovem a sua eliminao. Existem antgenos capazes de ativar diretamente linfcitos B (chamados de T independentes), mas a maioria dos linfcitos B precisa reconhecer antgeno por seu receptor antignico e receber um sinal dos linfcitos T para ser ativada a funo efetora (T-dependentes). Comparao entre os braos da imunidade Imunidade Inata Imunidade Adaptativa Patgenos reconhecidos por receptors codificados Patgenos reconhecidos por receptors na linha germinal gerados aleatoriamente Receptores tem ampla especificidade, i.e., Receptores tem especificidade muito reconhecem muitas estruras moleculares, limitada; i.e., reconhecem um epitopo em chamadas PAMPs (pathogen-associated molecular particular patterns) PAMPs so polissacardeos e polinucleotdeos que A maior parte dos epitopos so derivados diferem pouco de um patgeno para o outro mas de polipeptdeos (protenas) e refletem a no so encontrados no hospedeiro. individualidade dos patgenos. Receptores so PRRs (pattern recognition Em vertebrados mandibulados so: nos receptors) linfcitos B, o BCR, e nos T, o TCR. Resposta lenta (35 dias) em funo da Resposta imediata necessidade de expanso clonal Sem memria de exposies anteriores Memria de exposies anteriores Ocorre em todos os metazorios Ocorre apenas nos vertebrados

Imunidade Inata Imunidade inata designa todos os mecanismos envolvidos em proteo contra patgenos que no utilizam receptores somaticamente rearranjados por processo aleatrio. Portanto, inclui barreiras epiteliais, leuccitos (neutrfilos, macrfagos, eosinfilos, mastcitos, basfilos, NKs), protenas efetoras circulantes e receptores de padres moleculares solveis (complemento, colectinas, pentraxinas, ficolinas, defensinas, catelicidinas). Ela remonta aos 1os organismos pluricelulares, enquanto a imunidade adaptativa surgiu nos peixes mandibulados. Os receptores utilizados na imunidade inata, os PRR (receptores de padres de patgenos), reconhecem PAMPs (padres moleculares de patgenos) graas a atuao da seleo natural ao longo de nossa co-evoluo com estes organismos, ao contrrio dos receptores de linfcitos, gerados por processo aleatrio. Os PAMPs reconhecidos freqentemente so molculas vitais para os patgenos. Portanto, a capacidade dos patgenos de evadir das defesas do organismo atravs da perda de expresso ou mutao dessas molculas limitada. O reconhecimento dos patgenos atravs dos PRRs ativa mecanismos efetores que debelam infeces ou as contm at a montagem de resposta adaptativa, e tambm participam na regulao do tipo e estimulao de respostas adaptativas. Ao mesmo tempo, a imunidade adaptativa seleciona mecanismos e aumenta as

3 funes antimicrobianas da imununidade inata, enquanto prov memria do encontro com o antgeno, inexistente na imunidade inata. Famlias de PRRs de leuccitos Toll like receptors (TLR). Reconhecem diversas classes de microorganismos e determinam a produo de citocinas e quimiocinas por leuccitos, a maturao de clulas dentrticas e a ativao de mecanismos microbicidas de patgenos. Por exemplo, macrfagos reconhecem LPS de bactrias gram negativas atravs do TLR4. Este reconhecimento leva a produo de ROS, de NO, de TNF, etc. Em clulas dendrticas (DC), esse reconhecimento leva maturao, com expresso dos co-receptores B7-1 e B7-2, migrao para linfonodo, reduo da fagocitose, etc. NLR. So sensores intracelulares de infeco. Nod1 e nod2 reconhecem peptidoglicano de bactrias gram positivas. NALP3 faz parte do inflamossoma (envolvido na produo de IL1, uma citocina pirgena que determina polarizao Th, recrutamento de DC, etc). Tambm determinam amadurecimento de clulas dendrticas e participam da polarizao Th. NALP3 reconhece diretamente muramil dipeptdeo, produto de degradao de peptidoglicano, alm de fatores de virulncia e corpos estranhos. Sua ativao leva produo de citocinas (especialmente IL-1 por NALP3) Esto envolvidas tambm com potenciao de mecanismos efetores da imunidade inata, como produo de peptdeos antibiticos pelas criptas intestinais (criptocidinas induzidas por Nod1 e 2). Lectinas do tipo C. O receptor de manose por ex reconhece manoses e frutoses terminais em uma posio onde no esto as de carboidratos de superfcie de mamferos. A dectina reconhece 1-3 e 1-6 glucanas da parede de fungos. Esses receptores esto envolvidos em fagocitose. Receptores Scavenger (SR). Reconhecem restos celulares, clulas apoptticas e principalmente, lipoprotenas oxidadas (que podem ser produto da ao de ROS no stio de leso inflamatria). Esto envolvidos na gerao da placa aterosclertica pelo reconhecimento de LDL oxidado. Os CD36, CD68 e SRB1 de macrfagos, por ex. CARD. Receptores envolvidos no reconhecimento de RNA viral. Levam a expresso de IFN do tipo I ( e ), conseqentemente, a um estado anti-viral. nFMLPR. Receptores da famlia das serpentinas, envolvidos em quimiotaxia, que apresentam como caracterstica 7 alfa-hlices que transpassam a membrana e acoplamento a protena G. Os receptores de fMLP permitem o reconhecimento de formil-Met-Leu-Phe, um peptdeo sinal de protenas bacterianas, presente em mamferos apenas em algumas raras protenas mitocondriais. Protenas efetoras do plasma e PRRs solveis As protenas efetoras do plasma e os PRRs solveis so molculas da imunidade inata que reconhecem padres moleculares de patgenos e favorecem sua eliminao, quer diretamente (efetoras), quer atravs da sinalizao para leuccitos ou ativao de outras molculas efetoras do plasma (PRRs solveis). As funes efetora direta da eliminao de microorganismos e acopladora do reconhecimento de PAMPs funo efetora de leuccitos muitas vezes se sobrepe. Complemento Fatores presentes no plasma que reconhecem direta ou indiretamente padres moleculares de microorganismos e deflagram respostas com 3 conseqencias bsicas: inflamao, promoo da fagocitose da partcula recoberta por complemento (dita

4 opsonizada pelo complemento) e lise de clulas reconhecidas atravs da montagem de um poro em sua superfcie (chamado de MAC, complexo de ataque membrana). O reconhecimento direto acontece atravs da ligao do fator C1q do complemento a sustncias polianinicas (ex cido lipoteicico de bactrias gram +) e tambm graas a uma reatividade espontnea do C3 clivado superfcie de clulas, inibida nas clulas de mamferos, mas no nas de microorganismos. O reconhecimento indireto de microorganismos se faz graas a ligao e ativao do complemento por anticorpos ou aos PRRs solveis MBL (lectina ligadora de manose), ficobilina, e as pentraxinas protena C reativa e PTX3. [vdeo complement system] Colectinas Presentes no plasma, constitudas por lectina do tipo C e cauda de colgeno. A mais conhecida MBL, um fator parecido com o C1q do complemento. capaz de ligar manose e ficose terminais opsonizando microorganismos e de ligar-se ao C1qR de fagcitos (receptor de C1q), promovendo sua fagocitose. Inicia ativao do complemento de forma anloga via clssica, agindo como se fosse o fator C1q. As protenas surfactantes pulmonares SP-A e SP-D, secretadas nos alvolos pulmonares, tambm so colectinas. Ficobilinas Presentes no plasma e semelhantes s colectinas, exceto por possurem um domnio semelhante ao fibrinognio no lugar da poro lectina. Ligam-se a padres moleculares de bactrias e ativam complemento, da mesma forma que MBL.

Colectinas e Ficobilinas Pentraxinas Presentes no plasma. A mais conhecida a protena C reativa (CRP). Aumentam em at 100x as quantidades presentes durante infeces j que so protenas da fase aguda, de sntese heptica estimulada por IL-6 e IL-1 de fagcitos. Esta caracterstica lhe confere valor diagnstico. Se liga diretamente fosforilcolina de bactrias, opsonizandoas. Liga-se ao C1qR, promovendo a fagocitose. Liga-se tambm ao C1q, ativando complemento pela via clssica. J a protena amilide do soro (SAP) se liga diretamente a fosfatidiletanolamina e agarose e igualmente, a C1q. A PTX3 se liga a padres moleculares desconhecidos em fungos como Aspergillus fumigatus e tambm a C1q.

Estrutura das pentraxinas

5 Defensinas Peptdeos catinicos produzidos por leuccitos (neutrfilos, NK e linfcitos T citotxicos [CTL]). Presentes em vrios epitlios e em grnulos de neutrfilos. Ajudam a matar microorganismos montando um poro em sua membrana, ao se orientarem por carga eltrica. As clulas de Paneth nas criptas intestinais produzem defensinas chamadas de criptocidinas e estimuladas pelo reconhecimento de infeco intracelular do epitlio da cripta por receptores Nod. Acredita-se que uma deficincia na sntese de defensinas esteja envolvida na acne.

Defensinas formam poro na membrana Conhece-se ainda papis menores das defensinas na imunidade inata, interagindo com leuccitos e opsonisando bactrias.

Outros papis das defensinas Catelicidinas - Produzidas por epitlios de superfcie, neutrfilos e macrfagos. So protenas de ao microbicida direta contra uma srie de microorganismos e algumas participam da ativao de leuccitos, enquanto outras neutralizam molculas de microorganismos, como LPS. Receptores de complemento e poro Fc de Imunoglobulinas em leuccitos Os receptores de complemento e os de imunoglobulinas de leuccitos so molculas que permitem utilizar o reconhecimento pela resposta adaptativa humoral (anticorpos) e pelas protenas efetoras do plasma (complemento) para promover a fagocitose ou a liberao de citocinas e substncias microbicidas por leuccitos. Em neutrfilos e macrfagos, receptores de imunoglobulinas (FcR) e de complemento (C1qR, CR3, CR4) promovem a fagocitose de microorganismos opsonizados. Em outras clulas, como mastcitos, o engajamento das IgE ligadas aos receptores de IgE FcR promovem a degranulao dos mastcitos. Eosinfilos degranulam em resposta ao engajamento de IgG a seus FcR, promovendo eliminao de vermes por suas protenas txicas e ativao de mastcitos. Imunidade inata em epitlios As barreiras epiteliais presentam um meio eficaz de defesa, em funo das junes intercelulares apertadas, mas sua ruptura expe o organismo. Mucosas so mais susceptveis

6 a patgenos. No epitlio respiratrio, a secreo de muco e o movimento ciliar, e no epitlio gastrointestinal, o pH cido do estmago e a secreo de enzimas, contribuem para a defesa contra bactrias. As defensinas so peptdeos catinicos com Cis e Arg sintetizadas nos epitlios, capazes de formar canais e com forte atividade antibitica para bactrias e fungos. Sua sntese, por neutrfilos e pelo prprio epitlio, aumenta na presena de IL-1 ou TNF. Nas criptas intestinais, por exemplo, a criptocidina capaz de esterilizar a regio com sua atividade antibitica. Por outro lado, tolerncia de uma flora bacteriana em certas superfcies do corpo permite formar uma barreira microbiolgica, pois os comensais produzem antibiticos. Em meio a clulas epiteliais intestinais, esto os IEL , cujo TCR tem uso de segmentos gnicos pouco variado e embora reconheam glicolipdios ligados a CD1, tm funo controversa. Acredita-se que estas clulas atuem na discriminao da flora que deve ser tolerada e na deflagrao de respostas efetoras contra microorganismos patognicos. Os linfcitos B1 so uma populao CD5+, autorenovante, localizada principalmente na cavidade peritoneal e nos milky spots do omentum, e estimulada por antgenos Tindependentes, como fosforilcolina e LPS, a produzir anticorpos. Estes anticorpos, chamados de naturais por sua freqncia no animal no intencionalmente imunizado ou sabidamente infectado, representam uma linha de defesa contra patgenos junto sua porta de entrada. O uso pouco variado de segmentos gnicos pelo BCR desta linhagem tem sustentado a noo de que representam clulas da imun inata. Inflamao A inflamao uma forma de concentrar leuccitos e protenas efetoras da imunidade inata em um stio onde um patgeno se encontra to logo sua presena ou o dano tecidual so reconhecidos. A inflamao promovida pela liberao de mediadores solveis por clulas da imunidade inata, por linfcitos ou pelo reconhecimento direto de patgenos por protenas do plasma. Estes mediadores atuam em varios nveis: aumentam o fluxo sangneo, determinam a expresso de molculas de adeso no endotlio, o aumento da permeabilidade capilar, o recrutamento e a reteno de leuccitos no tecido. Como resultado, h maior contato de leuccitos com o endotlio local, interaes de leuccitos com o endotlio que levam ao extravasamento (principalmente em vnulas, onde a presso sangnea menor), reteno de leuccitos no tecido e extravasamento de protenas do plasma para o interstcio. A citocina inflamatria TNF um destes mediadores solveis. Pode ser liberada em resposta ao dano tecidual ou ao reconhecimento de PAMPs por macrfagos, DC, NK ou mastcitos. Uma de suas aes para promover o acmulo de leuccitos nos tecidos induzir a expresso de E-selectina pelo endotlio, que se liga fortemente a neutrfilos. A P-selectina, estocada nas clulas endoteliais, translocada para a superfcie na presena de TNF, LTB4, C5a ou histamina. Estas selectinas atuam freando o deslocamento de leuccitos e plaquetas, que so empurradas pela fora de cisalhamento, produzindo o rolamento do leuccito. O rolamento necessrio ao recrutamento de leuccitos circulantes para o tecido. Entretanto, precisa haver uma interao mais forte com o endotlio para que ocorra extravasamento do leuccito. Vrias quimiocinas so liberadas por diversos tipos celulares em resposta ao reconhecimento de PAMPs ou outros sinais de perigo (ex molculas que so liberadas do interior celular na leso tecidual, protenas expressas sob stress celular), ligando-se a proteoglicanos do endotlio inflamado e sinalizando para leuccitos que a trafegam. Sua maior concentrao em torno da fonte produtora produz gradiente que pode ser seguido pelos leuccitos que expressam receptores apropriados. O reconhecimento de quimiocinas leva a mudana de conformao de integrinas 2 para uma de maior afinidade, bem como a elevao dos nveis de sua expresso (como LFA-1 e Mac1). Por ex, no caso de neutrfilos, IL-8 liga-se a CXCR1 e CXCR2, iniciando a migrao entre as clulas endoteliais (diapedese). J a ao das citocinas TNF, IL-1 e IFN tambm induzem a expresso de

7 ICAM-1 e VCAM-1 pelo endotlio mais tardiamente, o que permite recrutamento de linfcitos ativados, que expressam os respectivos ligantes LFA1 e VLA-4 (41). Por fim, interaes com PECAM (CD31), expressa em leuccito e endotlio, participam do extravasamento. A cintica de expresso de quimiocinas e molculas de adeso determina que sejam recrutados 1o os neutrfilos (pico 2h), seguidos de moncitos (pico de 24h) e linfcitos T ativados (pico de 40h). Adeso leucocitria e rolamento (descoberto em 1873): http://br.youtube.com/watch?v=1pQwISzJuZw&feature=related Extravasamento de neutrfilo, destaque para selectinas e integrinas: http://br.youtube.com/watch?v=I9zSe0qmXGw&feature=related Tecido inflamado com neutrfilos extravasados em infeco das meninges por Neisseria monocytogenes: http://br.youtube.com/watch?v=L9jpjxTSLws&feature=related Bactria invasora e incio da inflamao: http://br.youtube.com/watch? v=CmbWE3jLUgM&feature=related Fagocitose Fagocitose o processo de ingesto de partculas de tamanho superior a 1m por leuccitos e outras clulas. Dois principais fagcitos participam da imunidade inata: neutrfilos e macrfagos, enquanto as clulas dendrticas (DC), tambm um fagcito da imunidade inata, tm papel proeminente na iniciao da imunidade adaptativa. Macrfagos so abundantes no tecido conjuntivo, no interstcio de rgos parenquimais e delineando sinusides vasculares de bao e fgado. Tm vida mdia longa e so capazes de proliferao no tecido. J neutrfilos so clulas PMN ausentes de tecidos saudveis, cuja vida mdia dura cerca de 6h, e que so terminalmente diferenciadas. Macrfagos e neutrfilos reconhecem constituintes de micrbios e sinais de inflamao por receptores. Os receptores do tipo serpentina (7 alfa-hlices transmembrana) se ligam a seqencias N-formil-Met-LeuPhe (fMLP-R) das protenas de bactrias, fator C5a do complemento e quimiocinas, promovendo quimiotaxia. A quimiotaxia torna possvel aos fagcitos adentrar o tecido inflamado e mover-se at o micrbio. Outros PRRs reconhecem partculas a serem fagocitadas, como SR e receptor de manose terminal. Outros ainda ligam-se a opsoninas que as revestem, como CR3 (Mac-1, liga C3d) e CD64 (FcR de Ab), mediando a fagocitose. Vdeo phagocytosis Neutrfilo correndo atrs de bactria atravs de gradiente de fMLP por receptor serpentina: http://br.youtube.com/watch?v=S81_29U4-8Q Neutrfilo indo atrs de quimioatrator, destaque para reorientao de membrana: http://br.youtube.com/watch?v=ZUUfdP87Ssg&feature=related Macrfago fagocitando fungo: http://br.youtube.com/watch?v=MdR9ctxzab4 Microscopia intravital mostrando recrutamento de macrfagos para tecido e fagocitose de patgeno: http://br.youtube.com/watch?v=EvRtKpQIn-4&feature=related LDL oxidado reconhecido por receptor Scavenger (SR) de macrfagos e formao de placa aterosclertica; papel da protena de fase aguda C reativa na clnica como marcador de inflamao: http://br.youtube.com/watch?v=ReIB36tbhEM&feature=related Mecanismos microbicidas de fagcitos Macrfagos e neutrfilos possuem diversas atividades microbicidas: (1) NO produzido a partir da converso de arginina a citrulina pela enzima iNOS (de expresso induzida por estmulos inflamatrios como LPS [ligante de TLR4] e IFN), e lanado em fagolisossomos ou sobre patgenos extracelulares; (2) na exploso respiratria (ou respirao oxidativa), a oxidase do fagcito (induzida por ligao a receptores serpentina, por ex) produz ROS, como O2- (superxido), e a enzima dismutase o converte a perxido de hidrognio (H2O2); o H2O2 pode reagir com Fe2+, gerando HO(reao de fenton), altamente reativo;

8 (3) a combinao de ROS e NO em fagossomas cidos forma radicais peroxinitritos; (4) a mieloperoxidase utiliza H2O2, H+ e Cl- para gerar HClO (cido hipocloroso), um microbicida poderoso (forma salina = gua sanitria). (5) Quando ativados por PRRs ou pelas citocinas IL-8 e TNF, neutrfilos exocitam o produto dos grnulos especficos (lisozimas, colagenase e elastase) e grnulos azuroflicos (lisozimas). As lisozimas secretadas por macrfagos lesam diretamente o proteoglicano de bactrias gram+, e as demais enzimas servem ao catabolismo de elementos de matriz extracelular (ECM), facilitando a ao microbicida e o deslocamento celular na rea de leso.

Cellular and Molecular Immunology, Abbas et al, 6 edio, 2007.

Mieloperoxidase (MPO) fazendo HOCl a partir de H2O2, no interior do fagossomo. Blood, Agosto de 2008, 112:4, 936 Estes mecanismos so capazes de reconhecer e eliminar um grande no de patgenos. Macrfagos tem ainda uma funo importante na imunidade adaptativa: processam e apresentam antgenos (Ags) via MHC de classe II para L0 CD4, e podem ser ativados pelo IFN e CD40L destas clulas atividade microbicida. Macrfagos ativados por linfcitos reduzem a expresso de PRRs, mostrando portanto um estado fisiolgico diferente dos ativados por estmulos inflamatrios. A importncia da famlia Toll like e dos Inflamassomos Os receptores da famlia Toll, descobertos em Drosophila e depois em mamferos, so importantes PRR. A maior parte das defesas de invertebrados contra microorganismos devem-se a eles, o que a julgar pelo sucesso de alguns grupos, como os insetos, bastante eficiente. Da famlia do IL-1R, so capazes de ativar NF-B e AP-1 nas clulas em que

9 atuam, como DC, macrfagos e neutrfilos, e determinam a secreo de citocinas, quimiocinas, induo de atividade microbicida de macrfagos e expresso do co-receptor B7 nas APCs (2 sinal para o disparo da imunidade adaptativa). TLRs podem ser expressos na membrana plasmtica ou no endossomo de leuccitos. Por exemplo, o TLR3 (que reconhece RNA de fita dupla viral), os TLR7 e TLR8 (RNA de fita simples viral) e o TLR9 (CpG nometilado de bactrias) esto situados em endossomos ou fagossomos. Outros so expressos apenas na membrana plasmtica, como TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10 e TLR11. Comumente, um TLR se liga a vrios ligantes possveis, muitas vezes de microorganismos diferentes, ou ainda, sinais de perigo expressos sob stress celular ou leso. Um TLR prototpico o TLR4. Ele reconhece molculas de microorganismos, como LPS de E. coli e a protena F do vrus do sinccio respiratrio. Alm disso, reconhece a poro EDA de fibronectina, expressa quando h leso e vrias protenas do choque trmico, como HSP-60 humano (sinais de perigo). No reconhecimento de LPS de E. coli , o LPS reconhecido pela protena LBP do plasma e entregues a molcula CD14. Em seguida, transferido ao MD-2 do plasma, que se liga a este complexo na membrana e produz dmeros de TLR4, que sinalizam. O reconhecimento de vrios ligantes por TLR4 determina secreo de IP-10, IFN e IL-12p70, e no caso de LPS, IL-1 e TNF. Um outro TLR bem estudado o TLR2. Ele se liga a peptidoglicano, exposto apenas em bactrias gram+, zimosan (S. cerevisae), LPS (leptospira e P. gingivalis), GPI de T. cruzi, lipoarabinomanano e a lipoprotenas. Funciona com outros TLRs, e determina produo de IL-8 por exemplo. O camundongo deficiente em TLR2 susceptvel a S. aureus, mostrando sua importncia neste reconhecimento. O TLR5 liga-se a flagelina bacteriana, tambm protena pura, e leva a clula a produzir TNF. Acredita-se que em conjunto, o reconhecimento por receptores da famlia Toll possa prover a identificao da classe do patgeno, embora cada TLR em particular no seja capaz desta discriminao.

A teoria do perigo de Polly Matzinger voltou as atenes para estmulos que no os PAMPs que pudessem representar sinais de perigo, capazes de induzir maturao de DC, evento chave da induo de respostas linfocitrias. As protenas do choque trmico (HSP), protenas expressas por tecidos de mamferos sob stress e tambm por patgenos, atendem aos requisitos de fator induzvel de perigo liberado por tecido. Algumas so ligantes de TLR; por exemplo, a HSP-60 capaz de ativar TLR4 de macrfagos, levando a produo de IL-6 e expresso de molculas de adeso. H HSP que ligam-se a peptdeos de clulas tumorais ou infectadas por vrus, e so internalizadas por DC, que os desviam para apresentao via

10 MHC de classe I. Assim, HSP representam um elo entre o reconhecimento de ataque pelo prprio tecido e a deflagrao de resposta da imunidade inata e adaptativa. Uma das necessidades do sistema imune preservar a flora das mucosas ntegra, enquanto impede microorganismos virulentos de invadirem o organismo. possvel que o sistema imune se baseie em 2 sinais, 1 oriundo da deteco de PAMPs e outro oriundo da deteco de fatores de virulncia de microorganismos (ex. toxinas injetadas nas clulas, proteases, fatores que provocam instabilidade de fagossomos) ou leso causada aos tecidos por eles para deflagrar o amadurecimento de DC e consequentemente, a resposta adaptativa. O inflamassoma apresenta caractersticas que o habilitam a sensor de sinais de perigo. Inflamassomas, estruturas formadas por um complexo de protenas com papel proeminente das NALP, induzem a ativao da caspase 1, promovendo a clivagem da proIL-1 a IL-1, e tambm de IL-18. Esta citocina promove febre, expresso de fosfolipase A2, COX2 e sntese de prostaglandinas, expresso de iNOS, molculas de adeso, recrutamento de DC e neutrfilos e presumivelmente, amadurecimento de DC (ex, efeito adjuvante do almen). O inflamassoma reage a sinais de leso ou stress celular (ex. ATP ligando-se a seus receptores extracelulares P2X7; efluxo de K+), alm de reconhecer PAMPs (ex flagelina de bactrias) e fatores de virulncia (ex toxina do Anthrax). Inflamassomas tambm reagem a cristais e partculas (ex slica, amianto, almen, urato monossdico, pirofosfato de clcio) que formam partculas de tamanho grande que induzem reflexo fagoctico por parte dos macrfagos (pois no tem marcadores de self, como CD47). A frustrao da fagocitose leva induo do inflamassoma.

A participao da IL-1 em vrias doenas conhecidas como auto-inflamatrias (ex diabetes tipo II, gota, pseudogota, aterosclerose, febres familiares, etc) tm levado investigao dessas estruturas. Hoje sabemos que a ativao do inflamassoma com produo de IL-1 est envolvida na tolerncia perifrica glicose que ocorre no diabetes do tipo II. Tecidos como o adiposo respondem IL-1 com reduo da sinalizao pela insulina, e nveis elevados de IL-1 podem resultar em morte progressiva de ilhotas pancreticas. O processo envolve gerao de ROS aumentada em resposta hiperglicemia (por respirao oxidativa nas mitocndrias), e conseqente oxidao e dissociao entre duas protenas citoslicas ligadas. Uma dessas protenas um ligante de NALP3 capaz de ativar o inflamassoma quando as protenas esto dissociadas. O receptor solvel de IL-1 (para neutralizao desta citocina) encontra-se em teste na terapia do diabetes do tipo II. Imunidade contra vrus: papel das NK e IFN tipo I As citocinas IFN e IFN so capazes de induzir um estado antiviral. O IFN produzido por fibroblastos, macrfagos e clulas dendrticas, e o IFN por fagcitos

11 mononucleares, muitas vezes induzido pelo IFN. Muitos tipos celulares expressam o IFN1R. A sinalizao por este receptor determina expresso de 25 oligoadenilato sintetase (OAS), que interfere com a transcrio de RNA viral, e ativao da quinase PKR, que fosforila eIF-2, um fator de iniciao de sntese de protenas. A expresso de protenas virais, a proliferao viral e a proliferao celular so inibidas desta forma. Os IFN I tambm aumentam a expresso de MHC classe I, protegem clulas T ativadas contra a apoptose e podem induzi-las a proliferao, possivelmente pela produo de IL-15. Estas descobertas tm implicado os IFN I como envolvidos na manuteno da memria T, e portanto, como uma ponte importante entre as imunidades inata e adaptativa. As clulas NK so clulas de origem linfide que no possuem receptores somaticamente rearranjados de antgeno, ou seja, so elementos da imunidade inata. Clulas infectadas por virus comumente apresentam reduo da expresso de molculas do MHC de classe I. Clulas NK interagem com cels do organismo, e tem seu mecanismo de lise do alvo inibido pelo engajamento de KIRs da famlia Ig (anlogos humanos do Ly49 camundongo), protenas que contm motivos ITIMs (inibitrios) e se ligam a MHCs do alvo. Na ausncia deste engajamento, o alvo lisado. Dessa forma clulas que no expressam MHCs de classe I so lisadas por NKs. Outra protena de ao inibitria CD94:NKG2, que reconhece sequncia lder de MHCs combinados a HLA-E (Qa1 no cdg) do alvo. Alm de lisarem clulas infectadas por vrus, NK tambm produzem IFN quando induzidas por IL-12 de macrfagos ou DC, e representam a principal fonte desta citocina nos estgios iniciais da resposta imune. Promovem assim a diferenciao de cels Th1, uma regulao do tipo de resposta adaptativa pela imunidade inata. Mais adiante, o IFN de clulas Th1 estimula a produo de IL-12 por APCs, amplificando o processo. O reconhecimento de clulas recobertas por Abs tambm deflagra a lise: CD16 o FcRIIIa de NK que medeia este processo. NK matam outras clulas valendo-se de poros criados por perforina (lise osmtica) ou da penetrao de agente apopttico, as granzimas, por estes poros. As granulolisinas, antibiticos, tambm podem penetrar por estes poros e matar micrbios intracelulares. Leuccitos de origem mielide Neutrfilos Clulas polimorfonucleares (PMN) de vida curta (6-12h), constituem 70% dos leuccitos e tm ncleo bilobado. Sua formao na medula ssea estimulada pelo fator GCSF (indispensvel para leucocitose por infeco bacteriana), bem como sua sobrevivncia estendida no stio de inflamao. Desempenham fagocitose e tem forte ao microbicida. So as 1as clulas a chegar ao stio de inflamao, atradas por IL-8 e C5a (fator do complemento). Excelentes fagcitos. Fazem exploso respiratria e expressam mieloperoxidase. Possuem grnulos especficos (contendo catelicidina e lactoferrina), grnulos azuroflicos (contendo fosfatase cida, mieloperoxidase, defensinas, protena permeabilizadora de bactrias [BP1], enzimas elastase e catepsina G) e grnulos tercirios (enzimas catepsina G e gelatinase). Essas protenas tm atividade antibitica (BP1, defensinas, catelicidina, lactoferrina), so enzimas de degradao de patgenos e remodelamento tecidual (catepsina G, gelatinase) ou esto envolvidas na produo de microbicidas (mieloperoxidase). A degranulao dos neutrfilos (exocitose) importante para a eliminao de patgenos mas produz grande dano tecidual no stio de inflamao. As protenas gelatinase e colagenase so metaloproteases de matriz extracelular, envolvidas com transmigrao e inflamao. Lanam uma rede (net) sobre micrbios, concentrando substncias txicas e limitando sua difuso. Neutrfilo (corado com Hematoxilina e Eosina):

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Moncitos e macrfagos Moncitos so formas circulantes que se originam na medula ssea (3-8% dos leuccitos sangneos) e se diferenciam em macrfagos ao migrarem para o interior dos tecidos. Macrfagos so clulas mononucleares de vida mdia, que apresentam capacidade de diviso celular no tecido. Muitas populaes residentes esto situadas logo abaixo dos epitlios de superfcie do corpo, e portanto, so clulas que reconhecem invaso por microorganismos prontamente, secretando molculas inflamatrias e quimioatratoras. Juntas, constituem o chamado sistema retculo-endotelial. Exmias reconhecedoras de padres moleculares de patgenos (PAMPs) e excelentes fagcitos. Sob estmulo de PAMPs ou de citocinas produzidas por outras clulas (ex, IFN de clulas NK ou linfcitos T), expressam altos nveis de iNOS (enzima responsvel pela produo de NO). So capazes de respirao oxidativa e algumas populaes expressam mieloperoxidase, e tambm expressam metaloproteases, envolvidas com transmigrao, inflamao e remodelamento tecidual. Macrfagos nos tecidos apresentam caractersticas peculiares, recebendo nomes que as identificam: Nome da clula Macrfagos alveolares Histicitos Clulas de Kupffer Microglia Clulas epiteliides Osteoclastos Macrfagos sinusoidais esplnicos Clulas mesangiais Localizao Interior dos alvolos pulmonares Tecido conjuntivo Fgado Tecido neural Granuloma Osso Bao Glomrulo renal

Moncito (corado por Hematoxilina & Eosina):

Eosinfilos Produzidas na medula ssea estimulada por IL-5, constituem de 0-4% do total de leuccitos do sangue. Clulas de vida curta (horas), cuja vida pode ser estendida por IL-5, GM-CSF, eotaxina e IL-3 no stio de leso. No realizam fagocitose comumente. Reconhecem vermes recobertos de anticorpos e complemento atravs de receptores de anticorpos e complemento em sua superfcie e esse reconhecimento dispara a degranulao e a secreo de inmeras citocinas inflamatrias. Tambm reconhecem atravs de TLR RNA de fita simples de vrus em infeces virais respiratrias (TLR7e 8) e molculas de vermes como Schistosoma (TLR2 e 3). Contm grnulos secretores de diversas protenas, entre elas 4 protenas bsicas cristalides. A principal chamada de MBP (major basic protein), tem grande toxicidade contra helmintos, alguma capacidade bactericida e capaz de induzir

13 ativao de complemento, aumento de permeabilidade vascular e degranulao de mastcitos. Causa a maior parte do dano tecidual da asma. Outra protena txica para helmintos ECP (eosninophil cationic protein). A protena EDN (eosinophil derived neurotoxin) tem atividade anti-viral nas vias respiratrias, ainda pouco conhecida, e ligante de TLR2, representando um sinal de perigo. A protena EPO (eosinophil peroxidase) bactericida, catalizando a reao entre perxido de hidrognio e ons brometo, cloreto e iodeto, resultando em compostos txicos, incluindo HOCl (hipoclorito de hidrognio). Os eosinfilos tambm contm enzimas como metaloproteases (envolvidas na tansmigrao e inflamao), histaminase e catalase (degradam histamina e H2O2, respectivamente). Recentemente, descobriu-se que os eosinfilos podem apresentar antgeno para linfcitos T em certas situaes. Eosinfilo (corado por Hematoxilina & Eosina):

Basfilos e mastcitos So clulas semelhantes e durante muito tempo houve a suspeita de que derivam de um precursor comum, mas mastcitos habitam tecidos e basfilos, sangue. Basfilos compreendem 0.01-0.03% dos leuccitos do sangue. Apresentam grnulos contendo histamina (mediador inflamatrio importante nas reaes alrgicas), heparina (anticoagulante), serina-proteases, mediadores lipdicos de inflamao (prostaglandina D2 [PGD2], leucotrieno C4 [LTC4]). Mastcitos expressam receptores de anticorpos do subtipo IgE de alta afinidade (FcR1) e receptores para molculas do complemento, que medeiam o reconhecimento de helmintos e as reaes alrgicas de que participam. A ausncia de uma protease de mastcitos chamada de -quimase dificulta a eliminao de certos helmintos, mostrando que mastcitos tambm tm atividade direta na eliminao de patgenos. Recentemente, mostrou-se que basfilos reconhecem proteases associadas a alergias e a infeces por helmintos, deflagrando uma resposta que interfere com a diferenciao dos linfcitos CD4+ , desviando-a para Th2. Mastcito (corado por Hematoxilina & Eosina):

Clulas dendrticas (DC) Grupo heterogneo de clulas com prolongamentos. A maioria se origina de um precursor mielide na medula ssea, da mesma forma que macrfagos, mas um tipo (plasmacitide) se origina de precursores linfides. Podem ainda se originar diretamente de moncitos na presena de IL-4 e GM-CSF, como foi recentemente demonstrado. Clulas dendrticas localizam-se nos tecidos e tambm em rgos linfides

14 secundrios. As DC so parte da imunidade inata (emprega PRRs e no receptores de antgeno), mas sua importncia reside justamente em ser o tipo celular capaz de levar linfcitos T naives (que nunca encontraram antgeno) sua primeira ativao (priming). Apresentam a mais acurada capacidade de reconhecimento de PAMPs, expressando uma grande gama de PRRs, alm de receptores de Fc de imunoglogulinas (FcR) e receptores de complemento (CR). So sensveis a muitas citocinas de outros leuccitos e sinais de perigo que denunciam a presena de patgenos. Integram todos esses sinais para determinar seu processo de amadurecimento. DC imaturas tm alta capacidade endoctica e no ativam linfcitos T. Patrulham o ambiente circunjacente em e quando encontram patgenos ou sinais de sua presena, passam a expressar altos nveis de CCR7 e migram para rgos linfides secundrios em resposta ao gradiente dos ligantes CXCL19 e CXCL21. Nesse processo de amadurecimento do origem a clulas de baixa atividade endoctica que degradam protenas de patgenos fagocitados e apresentam framentos dessas protenas em conjunto com MHCs. Recentemente, mostrou-se que apenas as protenas que so endocitadas na mesma partcula que PAMPs so apresentadas em combinao com MHCs. Somente as DC maduras expressam co-receptores necessrios ativao de linfcitos T, as molculas CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) e CD40. Clula dendrtica:

Dendrticas e linfcitos: http://www.youtube.com/watch?v=skxh4dx73ys Complemento O sistema complemento serve a imunidade inata e tambm a um dos principais mecanismos efetores da imunidade humoral. A ativao do complemento envolve protelise sequencial de enzimas com atividade proteoltica, em cascata de reaes em que cada enzima atua sobre vrias molculas de substrato, amplificando o processo. O complemento s se torna estvel ligado a micrbios ou anticorpos, o que ocorre nas vias alternativa e MBL ou na via clssica. Todas as vias convergem para a ativao de C3 e finalizam na montagem um complexo de ataque membrana do organismo invasor, chamado de MAC. Via alternativa do complemento A via alternativa vale-se da ocorrncia de pequeno nvel de clivagem espontnea de fator C3. A formao de uma C3 convertase se d aps a ligao do fator C3 espontaneamente clivado com o fator Bb (gerado atravs da clivagem de fator B ligado ao C3 pelo fator D). C3 possui uma ligao tioster altamente reativa que a mudana conformacional induzida pela clivagem expe. O C3b se liga a membrana de micrbios nas vizinhanas de sua formao. Caso no se ligue superfcie de nenhuma clula, rapidamente inativado rapidamente por hidrlise por protenas do plasma. Na membrana, C3b permanece ligado e o fator B do plasma se liga a ele, sendo clivado a Bb pelo fator D do plasma. Membranas de clulas de mamferos possuem mecanismos para impedir a ativao de complemento em sua superfcie, como DAF (se liga ao C3b, inativando-o), CR1 (desliga

15 Bb) e CD59 (que mais adiante impede formao de MAC). J na membrana de microorganismos, o complexo C3bBb, estabilizado pelo fator P (properdina), formando uma C3 convertase ativa. O patgeno ento recoberto por C3b. Via clssica do complemento J a via clssica iniciada por ligao de C1 ao domnio CH2 de IgG ou CH3 de IgM, e mecanismo efetor da imunidade adaptativa. Essas classes de imunoglobulinas, IgG e IgM possuem mecanismo efetor ltico. Aps se ligar a imunoglobulinas, C1s cliva C4 do plasma, dando origem a C4b e C4a. C4b tem ligao tioster reativa que reage rapidamente, ligando-o vizinhana. C4b se liga a C2, clivando-o a C2b e C2a e permanecendo ligado a C2a, no complexo C4b2a. Esse complexo C4b2a uma C3 convertase, passando a clivar fatores C3 do plasma a C3b e C3a. Esses fatores C3b tambm possuem ligao tioster instvel, que determina sua reao rpida, ancorando-o na vizinhana do processo de ativao. Os fatores a do complemento so inflamatrios, com capacidade de aumentar permeabilidade vascular e recrutar leuccitos (especialmente, C3a). A protena C-reativa, da famlia das pentraxinas, reage a fosfolipdios de bactrias, como fosforilcolina e fosfatidiletanolamina, mas tambm liga C1q, ativando a via clssica. Da mesma forma, a protena amilide do soro uma pentraxina que se liga a agarose e fosfatidiletanolamina e a C1q, ativando a via clssica. Essas protenas favorecem reconhecimento pelo receptor de complemento CR1, opsonizando microorganismos e promovendo sua eliminao.

Via MBL do complemento A via MBL iniciada por sua ligao a manose terminal de polissacardeos de parede. Esta protena uma colectina homloga ao C1, e ativa mecanismos semelhantes aos da via clssica , da mesma forma que o C1.

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Formao de MAC e lise de microorganismos A formao do MAC a via comum de lise por ativao de complemento. Uma vez formadas C5 convertases a partir de ligao de protenas do soro a C3b, gera-se C5b. O C5b liga-se a C6 e C7; C7 insere-se na membrana e liga C8, que d origem a ligao de C9 e formao de um poro. Os poros na superfcie de micrbios levam a evaso de contedo ou sua lise osmtica e clulas afetadas por grande no de poros sofrem apoptose induzida por grande influxo de Ca+2. Via clssica de ativao do complemento por anticorpos e formao de MAC: http://br.youtube.com/watch?v=y2ep6j5kHUc&feature=related [Vdeo complement system]

Formao do MAC Atividade inflamatria do complemento Os fatores solveis gerados na ativao do complemento possuem atividade inflamatria. C5a o principal fator inflamatrio. Alm disso, o complemento participa da reteno de antgeno por CR de FDC, fundamental para os processos de maturao por afinidade e gerao de memria de L0 B. CD21 faz parte do co-receptor CD21-CD19-CD81, em que o engajamento de iC3b contribui para a ativao de L0 B. Em suma, o complemento participa diretamente da lise, promoo de fagocitose de microorganismos e inflamao gerados pelo reconhecimento de microorganismos e a formao de complexos imunes. Desta forma, alm de mecanismo efetor de eliminao de Ags, representa uma via de comunicao entre as imunidades adaptativa e inata.

17 Inflamao aguda A produo de IL-1, TNF e IL-6 em resposta a eventos inflamatrios sistmicos pode levar a resposta de fase aguda. Esta resposta envolve produo de protenas de fase aguda pelo fgado (CRP, SAP, MBL, fibrinognio), mobilizao de neutrfilos, febre, caquexia e estmulo a maturao e migrao de DC. Se esta resposta inflamatria for ainda mais exacerbada, pode resultar em choque sptico, com depresso da contratibilidade do miocrdio, queda da resistncia perifrica total e reduo do debito cardaco. Em modelos experimentais murinos, como na inoculao de camundongos com LPS, correlaciona-se fortemente com a liberao de TNF. J na peritonite sptica humana e na murina por ligao e perfurao cecal, existe uma complexidade maior, provavelmente em funo da redundncia das citocinas e da presena do micrbio. A resposta inflamatria da imunidade inata mostra-se capaz de leso tecidual grave e at mesmo letal, ao atingir nveis sistmicos.

A imunidade inata portanto reconhece e elimina patgenos ou controla infeces at o desevolvimento de resposta adaptativa. Prov informaes sobre a classe de patgeno que regulam o tipo de resposta deflagrada e estimulam resp adaptativas. A imunidade adaptativa aumenta as funes antimicrobianas da imunidade inata e seleciona mecanismos adequados, em um fluxo de informaes que permite a eliminao do organismo invasor. Sistema linftico: http://br.youtube.com/watch?v=qTXTDqvPnRk&feature=related Formao da linfa: http://br.youtube.com/watch?v=1rVsonBiBHk&feature=related http://br.youtube.com/watch?v=lGRceUoQRVw&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=E2e5J1dfiE0&NR=1 1

Introduo aos receptores antignicos de linfcitos Os linfcitos B amadurecem na medula ssea de mamferos. J os linfcitos T e amadurecem no timo. Ambos passam por um rearranjo somtico de segmentos gnicos que permite gerar a diversidade dos domnios variveis (V) dos receptores antignicos, regies que reconhecem antgeno. O receptor antignico dos linfcitos B chamado de BCR e o dos T de TCR. O repertrio de linfcitos gerado, em que cada linfcito apresenta um receptor antignico original, submetido a um processo de seleo durante seu amadurecimento que determina a sobrevivncia de clulas funcionais e que no apresentam autorreatividade. Na periferia, o receptor antignico confere a especificidade ao reconhecimento de antgeno.

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Linfcito B sofrendo expanso clonal no interior de um linfonodo (microscopia intravital): http://br.youtube.com/watch?v=tQNzZjrY2X8 Estrutura do receptor antignico - BCR
O complexo do BRC composto por Ig e cadeias e , envolvidas na transduo de sinal. A Ig composta por 2 cadeias polipeptdicas L (light, leves) idnticas (24KDa), 2 cadeias H (heavy, pesadas, 55-70KDa) idnticas e um carboidrato. Cada cadeia L pareiase a uma cadeia H, a que se liga por pontes dissulfeto, e as cadeias H se ligam entre si tambm por pontes dissulfeto. Tanto as cadeias L quanto as cadeias H possuem domnios homlogos, com uma estrutura similar: cerca de 110 aminocidos em uma regio delimitada por uma ponte dissulfeto, dobram-se em duas camadas de bandas antiparalelas -pregueadas, cada camada contendo de 3-5 bandas. Junto s extremidades amino-terminais (N) das cadeias L e H esto os domnios variveis de cada cadeia, VL e VH, que apresentam variabilidade na seqncia de aminocidos, fruto dos processos de rearranjo de DNA. Estes domnios VH e VL interagem para formar a regio que contacta o antgeno, chamada de regio V (varivel). As cadeias L possuem ainda um domnio CL e as H, 3-4 domnios CH (dependendo da classe ou isotipo de imunoglobulina, discutido mais adiante), que formam a chamada regio C (constante). Um carboidrato se liga a cada um dos domnios CH2, situando-se entre as cadeias pesadas.

19 Nos domnios V existem pores contendo 10 aminocidos onde se concentra a diversidade das imunoglobulinas. Essas regies apresentam complementaridade aos antgenos e so chamadas de CDRs (complementarity determining region). Projetam-se de um arcabouo conservado, que contribui para mant-las no lugar. Os processos de rearranjo somtico de genes permitem que se gere 107-109 diferentes imunoglobulinas, com Kd por antgenos variando entre 10-7-10-11, ou seja, grande afinidade, como descreverei mais adiante.

Na figura, os CDRs so os loopsem vermelho, situados na regio da imunoglobulina que interage com antgeno As imunoglobulinas de membrana que compe o BCR contm uma regio de cerca de 25 aminocidos hidrofbicos, que se dobram em -hlice e transpassam a membrana, e uma pequena cauda de aminocidos bsicos, que interage com fosfolipdios de membrana, ancorando-a.

BCR e Anticorpos As imunoglobulinas fazer parte de receptor antignico de linfcitos B na membrana, o BCR, mas tambm podem ser secretadas por linfcitos B ativados, que do origem a clulas formadoras de anticorpos, os plasmcitos. Quando a clula passa a secretar anticorpos, ocorre splicing diferencial do mRNA, que passa a conter exons de uma cauda hidroflica, ao invs das pores envolvidas com ancoragem da imunoglobulina.

Isotipos de Imunoglobulina

20 O linfcito B virgem expressa simultaneamente IgM e IgD em sua membrana, o que possvel graas ao splicing alternativo ao nvel do RNA, selecionando C em umas cadeias e C em outras.

Existem vrias classes de cadeias H de imunoglobulinas, tambm chamadas de isotipos: IgM, D, M, G, E. Existem ainda subtipos de imunoglobulinas, diferentes em cada espcie; por exemplo, no camundongo, IgG1, 2a e 2b; em humanos, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Essas classes de imunoglobulinas so distintas estruturalmente, possuindo 3 ou 4 de domnios CH caractersticos para cada isotipo, alm de carboidratos e pontes dissulfeto em posies distintas. Esses isotipos de imunoglobulinas desempenham funes efetoras distintas, que veremos mais adiante.

Tambm existem isotipos da cadeia L, chamados de e , mas suas funes no so bem conhecidas. Entretanto, o fato de que existe uma proporo de mais ou menos 60% de linfcitos expressando cadeia e 40% expressando cadeia no sangue tem utilidade diagnstica, pois na presena de linfomas essa proporo desviada. Aps o encontro com o antgeno, o linfcito B pode sofrer um processo induzido por interaes com linfcitos T e suas citocinas, chamado de switch de isotipos de imunoglobulinas. Os anticorpos produzidos inicialmente no curso de um primeiro contato do animal com o antgeno so do isotipo IgM, e a partir da, outros isotipos, como IgG, comeam a ser produzidos.

Neste processo, os linfcitos B mantm a poro V das imunoglobulinas, mas recombinam o DNA, excisando o exon que codifica o domnio C (de IgM) e o subtituindo

21 pelos domnios C (IgE), C1 (IgG1), C2 (IgG2), C3 (IgG3) e C (IgA), relativos aos outros isotipos e subtipos de imunoglobulinas.

Na figura acima, est representado o DNA que codifica uma imunoglobulina em humanos. VDJ o exon que codifica o domnio V (varivel) da imunoglobulina, fruto do rearranjo aleatrio dos segmentos V, D e J. Os exons C conferem imunoglobulina a poro C (constante) da imunoglobulina; C codifica os domnios constantes da cadeia pesada que compor IgM; C3, os domnios da cadeia pesada de IgG3, C, da cadeia de IgD, e assim por diante. O processo de switch de imunoglobulinas pode excisar o exon C e ligar VDJ a C, por exemplo, determinando a produo de IgA.

O switch ou troca de isotipos pode ser induzido por citocinas ou combinaes especficas delas. Por ex, em camundongos, a diferenciao do linfcitos B na presena de IFN- induz o switch para IgG2a, e em humanos, IgG1 e IgG3; TGF- e IL-5, IgA; IL-4, IgE (tambm IgG1 em camundongos). Em IgD, IgA e IgG existe uma regio flexvel entre os domnios C1 e C2, chamada de dobradia ou articulao (hinge), de 10-60 aminocidos. A dobradia das imunoglobulinas permite que 2 domnios V se liguem a antgenos situados em superfcie. As subclasses de IgG diferem basicamente nesta regio, que leva a formas diferentes de imunoglobulinas. A enzima pepsina cliva anticorpos C da dobradia, produzindo um fragmento Fab2 e Fc, que permanecem unidos pela regio da dobradia. J a clivagem pela enzima papana produz 2 fragmentos Fab e um Fc.

Na membrana dos linfcitos B virgens as imunoglobulinas que compe o BCR so monneros de IgD ou IgM. Os linfcitos B que j foram ativados por antgeno, podem sofrer switch de isotipos de imunoglobulinas. Nesse caso, alguns linfcitos B se especializam na produo de imunoglobulinas solveis, outros tornam-se clulas que guardaro a memria do encontro, sendo capazes de montar uma resposta mais prontamente em um segundo encontro com antgeno e utilizando o isotipo de imunoglobulina mais adequado. Os linfcitos B especializados na produo de anticorpos so chamados de plasmcitos e no expressam imunoglobulina em sua superfcie.

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Alguns isotipos de imunoglobulinas podem ser secretados na forma de dmeros, pentmeros ou hexmeros, em que as imunoglobulinas esto unidas por cadeias j.

Funo efetora dos isotipos de imunoglobulina: introduo As regies V das imunoglobulinas participam do reconhecimento antignico, enquanto as regies C, participam da funo efetora das imunoglobulinas. O switch de isotipos de imunoglobulinas permite selecionar a poro C uma imunoglobulina e conseqentemente, sua funo efetora mais adequada. Por exemplo, IgM e IgG3 so capazes de fixar complemento, podendo iniciar com facilidade a lise mediada por complemento de um microorganismo que reconheam. A via ativada por imunoglobulinas chamada de via clssica e envolve o reconhecimento das pores Fc das imunoglobulinas por um fator do complemento chamado de C1q. Cada imunoglobulina possui apenas 1 stio de ligao a C1q. O C1q uma protena que tem 6 stios de ligao a imunoglobulina e precisa engajar mais de um deles para iniciar eficientemente a ativao do complemento, o que mais provvel se a imunoglobulina estiver na forma de pentmero ou hexmero, como o caso de IgM.

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J IgE se liga aos receptores da poro Fc da imunoglobulina nos mastcitos, os FcR. Quando esses mastcitos encontram antgeno, exocitam o contedo desses grnulos, liberando diversos mediadores de inflamao, em um processo que medeia parte do dano tecidual nas reaes de hipersensibilidade do tipo I (alergia). Os eosinfilos humanos tambm expressam FcR e o reconhecimento de vermes atravs das IgE leva a degranulao dos eosinfilos, com agresso sria aos vermes. Este processo chamado de ADCC, antibody dependent cell citotoxicity. Mastcito degranulando: http://br.youtube.com/watch?v=eVBqMXMIFnM&feature=related As IgA so transportadas para as mucosas e sua principal funo neutralizar molculas de microorganismos potencialmente invasores. As IgG tambm podem neutralizar antgenos, mas no so transportadas atravs dos epitlios. So transportadas atravs da placenta e participam da proteo ao recm-nato, que ainda no monta suas prprias defesas. As IgG1 e IgG3 se ligam FcR na superfcie das clulas NK. Estas clulas possuem grnulos citotxicos e ao reconhecerem IgG1 ou IgG3 previamente ligados antgeno em sua superfcie, degranulam, lisando as clulas recobertas por anticorpos (ADCC).

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Especificidade das imunoglobulinas: natureza molecular do antgeno

A especificidade da imunoglobulina por antgeno grande, embora possa haver reaes cruzadas. Chamamos de epitopo ou determinante antignico poro da molcula contra qual uma resposta disparada. Imunoglobulinas podem ligar-se a molculas de quaisquer naturezas qumicas, mas a ativao do linfcitos B e secreo de anticorpos s possvel: (1) antgenos com mltiplos epitopos, capazes de induzir ligaes cruzadas no BCR, como polissacardeos; (2) antgenos proteicos ou ligados a protenas (haptenos+carreador), para que peptdeos possam ser apresentados a linfcitos T e haja auxlio a produo de anticorpos. Por exemplo, a molcula DNP pode ser reconhecida por linfcitos B. Entretanto, nenhuma produo de anticorpos pode ser detectada aps a inoculao de DNP. Se DNP ligado covalentemente a uma protena (que chamamos de carreador) e injetado, ento so produzidos anticorpos contra DNP. DNP um hapteno; precisa estar ligado a uma protena para deflagrar resposta de linfcitos T que permita a produo de anticorpos T-dependente. Os epitopos do antgeno a que anticorpos podem se ligar podem representar seqncias lineares de aminocidos ou aminocidos com proximidade espacial em funo da estrutura tridimensional da molcula (epitopo conformacional). A complementaridade entre antgeno e anticorpo fruto de ligaes no covalentes de 2 tipos: Van der Waals e eletrostticas, foras que demandam proximidade para se tornarem significativas. H uma certa flexibilidade, que permite deslocamento ligeiro de pores do anticorpo na ligao. A afinidade de anticorpos por antgenos no define totalmente sua capacidade de ligar antgenos, uma vez que anticorpos so multivalentes. A avidez superior a soma das afinidades, pois envolve lig simultneas. A imp desta diferena pode ser observada no caso de IgM de baixa afinidade, que se ligam com grande avidez a Ag multimricos, em funo dos seus 10 stios de ligao.

Maturao por afinidade de imunoglobulinas: introduo

Os anticorpos produzidos inicialmente no curso do primeiro contato com o antgeno so do isotipo IgM, e a partir da, outros isotipos, como IgG, comeam a ser produzidos. Vimos acima que isso se deve ao switch de isotipos de imunoglobulina, um processo que ocorre graas interao com os linfcitos T e suas citocinas.

Alm disso, os anticorpos produzidos na resposta primria tem uma afinidade bem menor pelo antgeno do que os anticorpos produzidos a partir de um segundo encontro. Isso se deve ao fato de que ocorrem mutaes com muito mais freqncia do que o esperado ao acaso nas regies V das imunoglobulinas, levando a produo de imunoglobulinas com maior ou menor afinidade do que as originais. A seguir, um sinal para a sobrevivncia de linfcitos B entregue apenas quelas clulas cujo BCR apresenta grande afinidade por antgeno e capaz de competir por ele com os demais linfcitos. Esse processo, orquestrado pelas clulas foliculares dendrticas no linfonodo, as quais so capazes de reter antgeno em sua superfcie, promove a seleo de linfcitos B de maior afinidade por antgeno. Estrutura do receptor antignico - TCR O complexo do CD3 formado por 2 cadeias , 2 , envolvidas em transduo de sinal, e um heterodmero TCR ou TCR .

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As cadeias do TCR apresentam 1 domnio V e um C, de cerca de 90 aminocidos, semelhantes em estrutura aos da imunoglobulina, bem como uma poro transmembrana em hlice e uma pequena cauda citoplasmtica. So ligadas entre si na regio da dobradia, entre o C e a poro transmembrana. Nas pores transmembrana, diferente de imunoglobulina, h aminocidos positivamente carregados (Lys em , Arg em ) que interagem com aminocidos das cadeias e . A afinidade do TCR por MHC+peptdeo relativamente baixa: Kd = 10-5-10-6.

Gerao de diversidade de receptores antignicos A linha germinal onde esto os segmentos gnicos que participam do rearranjo. Existem segmentos V (numerosos, 20 no TCR e 200 no IgH, cdg), D (poucos e presentes apenas nas cadeia IgH, TCR, e TCR) e J (em geral, menos numerosos que V). Os domnios C so codificados por um segmento, ligado ao domnio V. As cadeias, TCR, TCR, e IgL possuem segmentos C alternativos, mas permanece desconhecido se existe alguma diferena funcional entre as cadeias formadas por eles. Em TCR e IgH h varios C e todos so transcritos, mas o splicing alternativo do mRNA seleciona 1; em TCR e IgL o rearranjo do DNA o seleciona. O splicing alternativo tambm excisa a seqncia entre V(D)J e C. O locus fica inserido entre os segmentos V e J da cadeia , e o rearranjo de TCR exclui o locus TCR. Portanto, o linfcito T s pode expressar TCR ou TCR .

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O rearranjo dos segmentos gnicos segue uma regra nica para todas as cadeias. Nas extremidades 3dos segmentos V, 5 dos segmentos J e 3e 5 dos segmentos D existe uma seqncia de recombinao. Esta seqncia formada por heptmero (junto do segmento gnico), espaador de 12 ou 23 nucleotdeos (1 ou 2 voltas na espiral de DNA) e nonmero. Nas cadeias que possuem segmentos D, os segmentos V e J possuem espaadores de 23 nucleotdeos e os D espaadores de 12 nucleotdeos. O rearranjo se d sempre entre uma seqncia com espaador de 12 e uma com espaador de 23. Graas a essa regra, segmentos V e J no podem se ligar diretamente nas cadeias que possuem segmentos D.

As enzimas envolvidas no rearranjo so as RAG1 e 2, que introduzem quebras no DNA, e enzimas envolvidas no reparo de DNA, como DNA-PK, que repara duplas fitas de DNA. O rearranjo pode seguir 2 processos bsicos: deleo, o mais comum, ou inverso. No caso da deleo, as seqncias de recombinao esto em orientao contrria junto aos dois segmentos, enquanto na inverso, as seqncias esto no mesma orientao.

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Tomemos o rearranjo entre V e J. As quebras so introduzidas a 3do segmento V e a 5do segmento J. Segue-se uma ligao entre as seqncias partidas, ligando V a J e deletando a seqncia interveniente. Antes desta ligao, entretanto, as extremidades partidas sofrem ataques enzimtico. Exonucleases podem remover alguns nucleotdeos de segmentos J. Ocorre transferncia de nucleotdeos no-codantes para a fita codante do DNA, graas a formao dos grampos ligando as fitas durante o processo de recombinao, e a cortes introduzidos no interior de sequencia codificante aleatoriamente pela RAG, prximo do ponto original onde esto os grampos. Estes so os chamados P-nucleotdeos. Alm disso, at 20 nucleotdeos podem ser adicionados pela enzima TdT nas junes, os chamados Nnucleotdeos (mais comum em Ig H, TCR e TCR; inexistente em L). Em conjunto, estas ezms acrescentam diversidade s junes. Naturalmente, existe uma probabilidade alta de que a recombinao elimine a moldura de leitura, gerando cdons non-sense. Nas cadeias TCR esta chance menor, uma vez que os segmentos D no geram cdons non-sense em nenhuma das 3 molduras de leitura possveis.

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A combinao entre os segmentos V, D e J ou V e J, acrescida da diversidade juncional gerada por delees, N- e P-nucleotdeos, e da combinao de cadeia com ou cadeias H com L, constituem as bases da diversidade dos receptores gnicos. Na imunoglobulina, a contribuio da diversidade juncional menor do que no TCR . A poro onde se concentra esta diversidade o CDR3, formado por parte do segmento V, D (quando existente), e parte de J. O CDR3 a poro do TCR de cerca de 10 aminocidos que contacta o peptdeo na fenda, e tambm a poro mais importante da especificidade da imunoglobulina. As pores CDR1 e CDR2 so formadas por pores dos segmentos V. Rearranjo: http://br.youtube.com/watch?v=fed0Ka4EhX8 [vdeo rearranjo]
Introduo ao MHC O complexo principal de histocompatibilidade (MHC) foi descoberto inicialmente como o locus responsvel pela rejeio de transplantes. Como em princpio rejeitar transplantes no representou uma fora de presso evolutiva, buscou-se a funo das molculas codificadas pelo MHC. Logo se descobriu que a diferena entre camundongos que respondiam a imunizao com produo da anticorpos para um dado peptdeo e camundongos que no respondiam, estava nas protenas do MHC, um carter de herana mendeliana. Mais tarde, mostrou-se que a linhagem respondedora ativava linfcitos T graas a apresentao do peptdeos por protenas do MHC de classe II, e isso possibilitava o auxlio destas clulas a produo de anticorpos por linfcitos B.

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Existem 2 principais tipos de protenas do MHC: classes I e II. MHCs de classe I so expressas por todas as clulas nucleadas do corpo, e se combinam a peptdeos expressos no citosol. So reconhecidas pelo TCR de clulas CD8, com o auxlio do co-receptor. J as protenas de MHC de classe II combinam-se com peptdeos oriundos de protenas presentes em vacolos fagocticos de clulas apresentadoras de antgenos profissionais (pAPC, que so DC, macrfagos, linfcitos B), ou outros tipos celulares que quando estimulados apropriadamente as expressam (endotlio, epitlios), e so reconhecidas por linfcitos CD4. Hoje sabe-se que eosinfilos e neutrfilos tambm so capazes de expressar MHC de classe II e apresentar antgenos para linfcitos, mas pouco se sabe sobre a relevncia dessa apresentao. As MHCs de classe II so compostas por cadeias polimrficas e , e as de classe I pela cadeia polimrfica e 2-microglobulina. Esta ltima uma cadeia invarivel que tambm participa da composio de outras molculas do sistema imune, como um FcR que reduz o catabolismo de imunoglobulinas, aumentando sua meia vida. Gentica O MHC ocupa uma regio bastante extensa do cromossomo 6 em humanos e 17 em camundongos (3500 Kb; genoma E. coli inteiro para efeito comparativo: 4500 Kb). Nesta regio esto os loci HLA-A, -B e C, codificadores de classe I em humanos, e no camundongo, loci anlogos, H-2D e H-2L, e ainda, o loci H-2K, situado distante, adjacente aos loci de classe II. Os loci de classe II em humanos so chamados HLA-DP, -DQ e DR, enquanto no camundongo so I-A e I-E. Nesta regio tambm esto situados alguns outros genes importantes para o sistema imune. H portanto, poligenia para ambas, classe I e classe II de MHC.

Existe co-dominncia de genes do MHC: cada indivduo expressa o alelo materno e o paterno. Alm disso, na populao, existem muitos alelos distintos que podem ocupar cada

30 locus HLA. A esse fenmeno damos o nome de polimorfismo. O polimorfismo particularmente notvel no caso dos MHCs. No caso de classe I de camundongo, poligenia, polimorfismo e codominncia permitem que haja no mximo 6 protenas diferentes, pois existe polimorfismo apenas da cadeia , e so 3 loci em cada cromossomo. J no caso de MHC de classe II, encontra-se at 30 MHCs em um humano com 3 loci, pois h 2 cromossomos e possibilidade de pareamento entre e oriundas de cromossomos diferentes. Hoje dispe-se de anticorpos e de tcnicas de biologia molecular para identificar cadeias polimrficas, e atribuiu-se letras a alelos que alternativamente podem ocupar um locus. O conjunto de alelos do MHC de um indivduo chamado de hapltipo.

Existem outros genes na regio do MHC. Entre os loci para MHC de classe II, situam-se os que codificam TAP1 e 2 (envolvidos com transporte de peptdeo para MHC de classe I no RE); as protenas HLA-DMA e DMB (protenas que estabilizam o MHC de classe II vazio para que ele se desligue do peptdeo CLIP, podendo ligar-se a peptdeo no MIIC); C4b, C4a, fator B e C2 do complemento; TNF, LT; HSP 70 (heat shock protein). H tambm classe Ib, protenas associadas a 2-m: HLA-G, envolvida no reconhecimento de alvos por NK; HLA-H, relacionada a transporte de ferro e aparentemente sem funo imune, e HLA-E, que apresenta peptdeos de seqncias lder de outras protenas de MHC para CD94 nas clulas NK. Ainda, existem pseudogenes, que se especula serem fonte de polimorfismo na populao, atravs do processo de converso gnica. Estrutura e Bioqumica A estrutura de protenas de MHC de classe I bastante conhecida, graas aos estudos de cristalografia de raios X. A cadeia possui 3 domnios caminhando da extremidade N extracelular para a C intracelular: 1, 2 e 3. O 3 interage com 2m, em um pareamento de domnios. Cada domnio tem cerca de 90 aminocidos e codificado por um xon. O domnio 3 e a 2m possuem pontes dissulfetos delimitando os domnios. Uma fenda entre os domnios 1 e 2 permite o encaixe de peptdeos: cada um destes domnios possui uma hlice e interage com o outro para formar as 8 fitas antiparalelas (-prega) que constituem o assoalho da fenda. Os resduos que conferem polimorfismo cadeia situam-se na fenda do MHC. O peptdeo apresentado por MHC de classe I deve possuir de 8-11 resduos de aminocidos, pois as extremidades da fenda so bastante fechadas. Os peptdeos ancoram-se aos MHCs pela insero das cadeias laterais de aminocidos em depresses da fenda. Apenas 1 ou 2 aminocidos ancoram o peptdeo, o que compatvel com a noo de que estes peptdeos so pequenos e cadeias laterais dos aminocidos protundidas no topo da fenda conferem a especificidade da ligao ao TCR. No domnio 3 do MHC de classe I, quase no h polimorfismo: esta regio interage com CD8. Durante a maturao de timcitos, clulas que expressam simultaneamente CD4 e CD8 so instrudas a deixar de expressar CD4 quando h baixa transduo de sinal oriunda da atividade da tirosina quinase Lck. Assim, TCRs de linfcitos T que reconhecem mais apropriadamente classe I+peptdeo no engajam CD4 e passam a expressar apenas CD8. Um processo anlogo ocorre no reconhecimento de MHC de classe II+peptdeo, levando ao desenvolvimento de fentipo CD4. Dessa forma, no sangue e nos

31 rgos linfides perifricos, linfcitos CD4 reconhecem classe II+peptdeo e linfcitos CD8, classe I+peptdeo. O engajamento do co-receptor importante para a sinalizao que permite a ativao do linfcito T, contribuindo tambm para a adeso das clulas. extremidade C do domnio 3 segue-se uma regio transmembrana de 25 aminocidos hidrofbicos em -hlice, que atravessam a membrana lipdica. Na extremidade N, est um pequeno trecho de aminocidos bsicos que interagem com fosfolipdeos da membrana, contribuindo para ancor-la. Hoje se comea a conhecer interaes de MHCs de classe I com outras protenas capazes de transduzir sinal; entretanto, no se conhece qualquer transduo de sinal por MHCs necessria para as interaes APC / linfcito T. A estrutura do MHC de classe II semelhante a do MHC de classe I. Cada cadeia possui dois domnios, e a fenda onde se insere o peptdeo fruto da interao entre 1 e 1. H 1 hlice e quatro fitas em cada um destes domnios 1, em arranjo antiparalelo, que contribuem para a formao do assoalho -pregueado da fenda. No MHC de classe II, esta fenda aberta, possibilitando a insero de peptdeos de 10-30 AA. Uma projeo do domnio 2 permite a interao com CD4. Ambas as cadeias possuem uma regio transmembrana de aminocidos hidrofbicos, seguida de cauda de aminocidos bsicos, que contribuem para ancor-la.

Biologia dos MHC Tanto as molculas de MHC de classe I quanto de classe II tem Kds altos por peptdeos (baixa afinidade), mas taxa de dissociao muito lenta. Isso faz com que o complexo MHC II+peptdeo possa permanecer tempo o bastante na superfcie das APCs para que as interaes produtivas com clulas especficas aconteam. Os MHCs no discriminam entre peptdeos prprios e no prprios e exibem grande abrangncia na sua capacidade de ligao. Na ausncia de infeco, um peptdeo prprio ocupa a fenda, como tem sido detectado em MHCs purificados, uma vez que MHCs so instveis e na ausncia de peptdeo combinado no so expressos na superfcie das clulas. A principal funo biolgica de MHCs de classe I est intimamente ligada esta sua capacidade de apresentar antgenos citoslicos a clulas CD8. Assim, ela permite a ativao e a funo efetora de CTLs, capazes de lisar alvos ao reconhecerem MHC+peptdeo em sua superfcie. A funo dos MHCs de classe II est relacionada a apresentao de antgenos a clulas CD4, permitindo a ativao de macrfagos funo microbicida e linfcitos B produo de anticorpos. A capacidade de ligao de MHCs a peptdeos bastante ampla, mas existe uma maior afinidade de uma dada protena do MHC por determinados peptdeos, que normalmente exibem um padro definido, capaz de se ligar fortemente a ela. Esta talvez seja

32 a presso evolutiva para o polimorfismo das protenas de MHC: permitir que a capacidade de apresentar peptdeo seja otimizada no indivduo e na populao. O estudo de peptdeos ligantes alterados permitiu determinar quais aminocidos so necessrios ligao na fenda e ao reconhecimento pelo TCR, fornecendo as bases da imunogenicidade de muitos peptdeos. Exemplos de padres de aminocidos para um dado MHC de classe I; os resduos conservados em vrios peptdeos capazes de se ligar ao MHC esto em verde:

Exemplos de padres de aminocidos para um dado MHC de classe II; os resduos conservados em vrios peptdeos capazes de se ligar ao MHC esto em verde:

Podemos afirmar que a especificidade da resposta parcialmente determinada pelo MHC, uma vez que a incapacidade de ligar determinados peptdeos pode impedir a resposta a eles, e a preferncia por um peptdeo, torn-lo imunodominante (=predominante em uma resposta imune). Para ilustrar esta capacidade, suponhamos que um clone de linfcitos T reconhece apenas um antgeno no contexto de uma protena de MHC. A presena de excesso de outro peptdeo de estrutura similar e com capacidade de se ligar ao MHC pode abolir a resposta de linfcitos T, em funo da incapacidade do TCR do clone de reconhecer este outro peptdeo. Estes dados mostram que o TCR o maior responsvel pela especificidade da resposta, ao passo que MHCs podem se ligar a vrios diferentes peptdeos, como confirmado em estudos de eluio de peptdeos da fenda. Interao TCR / MHC+ peptdeo Os loops formados pelas regies hipervariveis do TCR contactam o peptdeo na fenda do MHC. Particularmente, o CDR3, regio do TCR que contm a maior diversidade, fruto das junes de segmentos gnicos com P- e N- nucleotdeos, contacta o centro do peptdeo na fenda. O reconhecimento que o TCR faz dual: reconhece o MHC e o peptdeo. As pores envolvidas no reconhecimento do MHC so os CDR1 e CDR2, codificados pelos segmentos gnicos V, que contactam as -hlices dos MHC.

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O processo tmico que seleciona linfcitos T e gera o repertrio de especificidades do TCR para antgenos na perifereia utiliza como um dos critrios o reconhecimento de MHCs prprios. Assim, cada linfcito T foi selecionado durante sua estadia no timo por caractersticas que incluem reconhecer MHCs prprios. Ao fato de que linfcitos T perifricos apresentam capacidade de reconhecer peptdeos apenas no contexto dos MHCs prprios, chamamos de MHC-restrio. A MHC restrio pode ser observada pelo fato de que linfcitos de uma linhagem de camundongos (expressando um hapltipo de MHCs) reconhecem clulas da prpria linhagem infectadas com o vrus LCMV, mas no clulas de uma outra linhagem de camundongos (que expressam outros MHCs) infectadas com LCMV. Um outro critrio utilizado pelos processos tmicos de seleo de linfcitos para gerar o repertrio perifrico de especificidades do TCR a incapacidade de reconhecer peptdeos prprios, que contribui para a tolerncia perifrica, de que trataremos mais adiante.

Aplicaes clnicas do MHC Existe uma associao entre presena de determinados alelos de MHC e ocorrncia de doenas autoimunes. Por ex., o heterozigoto HLA-DR3/DR4 susceptvel a IDDM, com concordncia de 30-50% em gmeos monozigticos. A mais estreita das correlaes foi encontrada na espondilite anquilosante, 90-100% para HLA-B27. Estas associaes tm permitido o clculo do risco relativo de desenvolvimento destas doenas para cada hapltipo. As diferenas entre fentipo de risco e os demais se encontram na fenda, mas como esta a regio de maior polimorfismo, no se pode afirmar que se deva a resposta de linfcitos T a

34 peptdeos que se ligam a estes MHCs. O fenmeno pode estar ligado diferenciao de clulas T ou gerao de T regulatrias, de que trataremos mais adiante. O conhecimento das caractersticas de ligao de peptdeos ao MHCs comea agora a ser usado no design de vacinas, uma vez que antgenos podem ser tornados mais imunognicos por incluso de segmentos que se liguem mais fortemente a MHCs comuns na populao. As protenas de MHC so os principais envolvidos na rejeio de transplantes: camundongos aceitam transplantes de isognicos, mas a diferena em um nico alelo de MHC suficiente para determinar rejeio. Assim, na escolha de doadores de rgos, fundamental a determinao de seu hapltipo e do receptor, de forma a minimizar a rejeio. MHCs no convencionais As protenas de MHC Ib so homlogas aos MHC de classe I mas sem polimorfismo. Algumas so protenas expressas sob stress, como o caso de MICA e MICB, expressas no choque trmico por clulas epiteliais intestinais e fibroblastos e reconhecidas por clulas NK, e CD8. Outras, como H2-MB (homlogo humano no conhecido), expressam peptdeos com trmino N-formilado, seqncia caracterstica de protenas de bactrias, reconhecidas por CD8 CTL, levando morte celular. Outras ainda esto envolvidas com inibio da atividade NK, como o caso de HLA-G, expressa pela placenta, que no expressa nenhum MHC de classe I e portanto poderia servir como alvo para clulas NK. A HLA-E tambm est envolvida nesta inibio, apresentando peptdeos da seqncia lder de MHC de classe I para NKG2A:CD94 de cels NK. As molculas CD1, homlogos de MHC de classe I associados a 2m, apresentam lipdios e glicolipdios de patgenos como mycobacteria e H. influenzae a NK T, CD4 e CD8. So combinadas a eles em compartimentos acdicos do endossomo, o que as desenovela parcialmente, permitindo a ligao fenda hidrofbica. Uma delas, CD1d, tem sido implicada na defesa contra protozorios com T. brucei. Estas protenas so codificadas fora do MHC, e no apresentam polimorfismo. Clulas apresentadoras de antgeno Todas as clulas nucleadas so capazes de apresentar antgeno via MHC de classe I para linfcitos CD8. As DC, os macrfagos e os linfcitos B expressam MHC de classe II e so capazes de apresentar antgeno para linfcitos T CD4; so as chamadas apresentadoras de antgeno profissionais (pAPC). Existem alguns outros tipos celulares que podem expressar MHC de classe II sob estimulao com IFN, mas seu papel na apresentao de antgeno ainda pouco conhecido. Recentemente se demonstrou que clulas endoteliais, eosinfilos e neutrfilos podem apresentar antgenos via MHC de classe II, mas a participao dessa apresentao na fisiologia da resposta imune desconhecida. Embora em princpio qualquer clula nucleada possa apresentar antgeno para linfcitos CD8, inconcebvel que um repertrio gigantesco de linfcitos CD8 infiltre um tecido para ser ativado por, digamos, um fibroblasto infectado por um vrus. Sabemos que a desaferentizao de uma aba de pele (=corte dos vasos aferentes linfticos) abole a resposta CD8 para um vrus naquela regio, ento est claro que a primagem de linfcitos CD8 tambm se faz em rgs linfides secundrios por clulas especializadas. De fato, hoje sabemos que as clulas dendrticas (DC) so capazes de um processamento peculiar de antgeno, em que parte dos antgenos presentes em vacolos so apresentados por MHCs de classe I a linfcitos CD8. A esse processo de apresentao de antgenos de partculas capturadas em vacolos via MHCs de classe I chamamos de apresentao cruzada. As DC so as mais poderosas apresentadoras de antgeno e as nicas efetivamente capazes de iniciar uma resposta adaptativa dependente de linfcitos T. Veremos mais adiante algumas caractersticas celulares que as tornam particularmente capazes de priming de linfcitos T. Uma caracterstica importante para sua funo de priming que elas exibem in

35 vivo a sua localizao junto s portas de entrada de antgeno e sua capacidade de migrar para o paracrtex de linfonodos em resposta ativao por sinais de perigo, os quais determinam a expresso de receptores de quimiocinas e molculas de adeso. A expresso de CCR7 aps a ativao de DC, por exemplo, determina a atrao de DC por quimiocinas secretadas nos vasos aferentes linfticos (CCL19 e CCL21).

Processamento de antgeno A ativao de linfcitos T depende basicamente do total de sinal transduzido a partir de seu TCR e de molculas acessrias. Para tal, contribuem o nmero de TCRs que engajam complexos de MHC+peptdeos cognatos, o tempo de durao desse engajamento e a contribuio do sinal de molculas acessrias e co-estimuladoras. Fica claro portanto que o nmero de complexos cognatos de MHC+peptdeo disponveis para contato com linfcito T na superfcie da APC um evento crtico para o disparo da resposta. Este nmero depende das condies de processamento e apresentao de antgeno. Grosseiramente, o processamento e a apresentao de antgeno seguem o esquema:

Na pAPC, o fagossoma ou endossoma se fundem ao lisossoma e as enzimas hidrolticas desse compartimento cido digerem as protenas expressas pela partcula

36 englobada. Forma-se ento um compartimento chamado de MIIC, fruto da fuso entre o fagolisossoma e vesculas contendo MHC de classe II. O carregamento dos MHC por peptdeos se d nesse compartimento, de onde seguem para a membrana plasmtica, onde podem ser apresentados para linfcitos CD4. Assim, os peptdeos apresentados para linfcitos CD4 so fruto da endocitose pela clula apresentadora. As MHCs de classe II so bastante instveis quando nenhum peptdeo ocupa sua fenda. Assim, seu processo de dobramento especial. Uma cadeia no polimrfica chamada de cadeia invariante Ii impede que peptdeos ocupem a fenda enquanto a protena ainda est no RE at a formao do MIIC. Alm disso, Ii direciona a cadeia recm-montada para o fagolisossoma. As enzimas hidrolticas do fagolisossomo clivam a cadeia invariante Ii e HLA-DM remove o peptdeo remanescente, CLIP. Assim, os MHCs de classe II ficam brevemente livres de peptdeo na fenda, no interior do MIIC, onde vrios peptdeos fruto da clivagem de antgeno por enzimas hidrolticas podem ligar-se a eles. A montagem de protenas de MHC que so extremamente instveis na ausncia do peptdeo auxiliada por calnexina e Ii.

J o processo convencional de apresentao de antgeno via MHC de classe I se vale do proteassomo, uma maquinaria de protelise de peptdeos encontrada nas clulas. O proteossomo tem vrias funes na fisiologia da clula no infectada, como a digesto de protenas mal-formadas, que so identificadas como tal e sofrem adio de uma protena chamada de ubiquitina, que as enderea para a degradao. Na DC, o proteossomo tambm participa da apresentao cruzada, digerindo protenas que foram lanadas no citosol por um processo especial. Os peptdeos gerados pelo proteossomo so bombeados por uma protena chamada TAP para o interior do retculo, onde esto os recm-sintetizados MHCs de classe I, ligados uma protena chamada tapasina. A tapasina se liga TAP e o peptdeo bombeado carregado na fenda de MHCs de classe I. Complexos de MHC+peptdeo seguem para a membrana plasmtica.

O fato de que MHCs no discriminam entre peptdeos prprios e no prprios e ligam peptdeos diversos com baixa afinidade levanta a questo: como possvel que a captao de pequenas quantidades de peptdeos estranhos, em um mar de peptdeos

37 prprios, permita seu reconhecimento por linfcitos T? Vrios mecanismos contribuem para isso, como a sensibilidade de linfcitos T, capazes de detectar um pequeno nmero de complexos MHC+peptdeo na superfcie das APC, que discutiremos mais adiante. Alm disso, o nvel de expresso de MHC de classe I aumentada na presena de IFN, - e -, e a expresso de MHC de classe II, que inexistente em alguns macrfagos por ex, induzida na presena de IFN-. Assim, quando padres moleculares de patgenos so reconhecidos por clulas da imunidade inata, a secreo de IFN deflagrada aumenta a expresso de molculas de MHC, e portanto, o nmero de complexos peptdeo + MHC disponveis para ativao do linfcito. Alm disso, em DC, MHC de classe II deixam de ser biossintetizados quando a clula ativada, e as molculas sintetizadas neste momento so translocadas para a superfcie, o que otimiza a apresentao de antgenos temporal e espacialmente associados ao estmulo que as ativou. No caso de apresentao de antgeno por MHCs de classe I, o IFN- tambm induz a expresso de LMP2 e LMP7, subunidades alternativas que passam a fazer parte do proteosomo. Estas subunidades conferem a ele uma tendncia a clivar peptdeos de 8-11 aminocidos e com C-terminais bsicos ou hidrofbicos, caractersticas que aumentam a chance de ligao de peptdeos diferentes dos que se ligam ao MHC usualmente, ou seja, de peptdeos potencialmente estranhos. Portanto, na prtica, a funo dos proteosomos passa de degradao de protenas gerao de peptdeos para apresentao. Em conjunto, estas alteraes mostram que a maquinaria celular de processamento e apresentao de antgeno reage a sinais da imunidade inata e adaptativa, tornando-se mais eficiente, especialmente no tocante a peptdeos estranhos. A otimizao da apresentao de antgenos estranhos resolve 2 importantes problemas com que o sistema imune lida: (1) apresentar um nmero de complexos MHCs+ peptdeo suficientes para ativar cada clone cognato de linfcitos T. Para isso, cooperam a maior afinidade por MHCs de determinados peptdeos (base da imunodominncia) e os mecanismos mencionados acima que tornam a maquinaria de processamento e apresentao de antgeno mais eficiente na presena de sinais de perigo percebidos pela imunidade inata (comunicados por sinais solveis, como IFN). (2) evitar que haja apresentao de peptdeos prprios por DC maduras, uma vez que existem linfcitos T que exibem especificidades autorreativas do TCR (escapando aos processos de deleo tmica de clones autorreativos). Recentemente, foi descoberto um processo de seleo de peptdeos para a apresentao antignica. Incubou-se DC com bilhas de poliestireno contendo protenas apenas (a protena HEL), protenas mais ligantes de TLR (LPS+HEL) ou ligantes de TLR apenas (LPS). O resultado foi que houve apresentao de peptdeos de HEL e ativao de um clone de linfcitos T que reconhece MHC+ peptdeo de HEL apenas quando as bilhas incubadas continham HEL e LPS, mas no quando eram incubadas simultaneamente bilhas que continham apenas LPS e bilhas que continham apenas HEL. Esses experimentos foram repetidos in vivo com resultados semelhantes. Tambm se demonstrou que ligantes de NLR so capazes de induzir processo semelhante, sugerindo que talvez o fenmeno valha para o reconhecimento de vrios PAMPs e sinais de perigo em geral. Os resultados mostram que os peptdeos apresentados por DC maduras via MHCs de classe II so apenas aqueles que esto fisicamente associados na mesma partcula (que ir para o mesmo fagossomo) em que so reconhecidos de sinais de perigo por DC (como PAMPs). Este parece ser o mais importante dos mecanismos descobertos at agora para otimizar a apresentao de peptdeos no prprios.

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Ativao de linfcitos T: o priming por DC A ativao de linfcitos T ocorre inicialmente em rgos linfides 2os ou em agregados de tecidos linfides, os MALT, e chamada priming, para distingui-la da ativao de linfcitos T de memria ou de linfcitos T efetores. Nos experimentos em que se removeu os vasos linfticos aferentes do tecido ou se utilizou linhagens de camundongos que no possuam bao e/ou linfonodo (com inoculao de antgeno i.v. ou subcutnea, respectivamente), mostrou-se a incapacidade de priming de linfcitos T quando o antgeno no chegava ao rgo linfide. Alm disso, dada a enorme diversidade do repertrio de TCRs dos linfcitos T e a ineficcia dos linfcitos virgens para extravasarem o endotlio (exceto de HEV), seria improvvel o encontro de linfcitos T especficos para um dado antgeno fora de um rgo linfide. Existem diferenas importantes no priming de linfcitos T CD4 e CD8, e discutirei inicialmente a ativao de linfcitos T CD4. O antgeno pode chegar a um rgo linfide secundrio de vrias formas: solvel (trazido do lquido intersticial de um tecido pelos vasos linfticos) ou combinado a clulas. A inflamao, causada pelo reconhecimento de PAMPs ou dano tecidual, melhora o fluxo sangneo e a drenagem linftica. No linfonodo, o antgeno solvel pode ser capturado por macrfagos do sinus subcapsular ou medula. Existem ainda canalculos de colgeno e clulas reticulares chamados de conduits por onde a linfa percola o parnquima do linfonodo. Ao longo desses conduits esto DC importantes na captura do antgeno solvel. Esse circuito termina em um canal em torno das HEV, para onde uma parte da linfa drena. A opsonizao deste antgeno por imunoglobulina ou complemento aumenta em muito seu reconhecimento por macrfagos e DC e antgenos particulados podem ser fagocitados por macrfagos. O reconhecimento por linfcitos B pouco importante em uma resposta 1a em funo da baixa freqncia de linfcitos especficos.

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O antgeno solvel tambm pode ser removido da circulao sangnea pelo bao, por pAPCs situadas junto dos sinusides da polpa vermelha ou macrfagos dos sinus marginais (na interface entre a circulao e a polpa branca) .

O antgeno tambm pode chegar ao linfonodo combinado a DC, a via mais importante para o priming de linfcitos T. As DC e os macrfagos residentes nos epitlios de porta de entrada de antgeno liberam vrias quimiocinas (como RANTES e MIP-3) em resposta ativao de PRR (principalmente, da famlia TLR) por sinais de perigo, atraindo outras DC imaturas para o tecido. Quando chegam ao tecido, as DC reagem aos constituintes de micrbios e citocinas do meio, e passam por um processo de amadurecimento. DC imaturas so especializadas na captura de antgeno (realizam macropinocitose, endocitose via FcR CD64 ou CD32, receptor de manose terminal, tm curta meia vida de MHC de classe II e internalizam gp96 e HSP-70 combinadas a peptdeos), mas aps o amadurecimento, passam a expressar um novo fentipo, relacionado a funo de apresentao de antgeno. Deixam de sintetizar MHC de classe II mas aumentam a sua densidade na superfcie (levando para membrana todo o estoque previamente sintetizado); expressam CCR7, cujo ligante, SLC, expresso pelo endotlio dos aferentes linfticos. Assim, so atradas e transportadas pelos aferentes linfticos at os linfonodos, onde vo postar-se na regio do paracrtex. No bao, localizam-se nos PALS (periarteriolar lymphocyte sheath, bainha periarteriolar linfocitria). Vrios sinais de perigo parecem contribuir para este amadurecimento da DC: ativao de PRRs, TNF, IFN e engajamento de CD40 com CD40L de linfcitos T ativados.

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A recirculao dos linfcitos virgens fundamental para possibilitar o encontro entre uma pAPC apresentando complexos de MHC+peptdeo e um linfcito T especfico para aquele peptdeo, uma vez que a diversidade do repertrio de TCRs vasta. Metade dos linfcitos passa pelo bao, e cada linfcito visita um linfonodo em um perodo de 24 h. No linfonodo, os linfcitos T virgens realizam interaes de baixa afinidade com vnulas de endotlio alto (HEV), atravs de seu CD62L, que liga PNAd, como CD34 e GlyCAM-1. Estas interaes permitem o rolamento dos linfcito sobre o endotlio, enquanto so arrastados pela fora de cisalhamento. Uma proporo de linfcitos reconhece via CCR7 a quimiocina SLC aderida a proteoglicanos no endotlio e responde aumentado a expresso e altera a conformao de LFA-1 para uma forma de alta afinidade, que permite interaes fortes com o endotlio, via ICAM-1 ou ICAM-2. Estes linfcitos conseguem passar entre as clulas endoteliais e vo postar-se no paracrtex, onde esto os HEV, interagindo com DC nesta regio. H evidncias de que as clulas dendrticas maduras secretam DC-CK1 e ELC, quimiocinas envolvidas na atrao de linfcitos T virgens, que favorecem a aproximao entre as clulas. J no bao, o processo de recirculao dos linfcitos T virgens pouco conhecido, mas sabe-se que envolve interaes entre CD62L e MadCAM-1 do endotlio dos sinus marginais do PALS. As clulas virgens, na sua migrao pela regio cortical, interagem transitoriamente com pAPC, via LFA-1, CD2 e ICAM-3 do linfcito T e ICAM-1, ICAM-2, LFA-3 e DC-SIGN das pAPC, respectivamente.

O vdeo de microscopia intravital mostra linfcitos T virgens em verde e DC em vermelho: http://br.youtube.com/watch?v=skxh4dx73ys. Os linfcitos T emergem

41 na regio do paracrtex atravs dos HEV e contactam as DC em grande extenso de sua membrana, aumentando a chance de encontrarem complexos de MHC+peptdeos. Note que um linfcito adere fortemente aps contato com DC; provavelmente, um encontro de peptdeo cognato. Algum nvel de ativao (talvez no suficiente para priming) na interao DC / linfcito: [video activated T cell] Vdeo mostrando esquematicamente migrao de DC ativadas para linfonodo: [dendritic migration]. A recirculao de linfcitos virgens restrita ao circuito vasos linfticos eferentes/ rgo linfide/sangue. Para essa restrio concorrem os pares de molculas de adeso expressos por endotlios desse circuito e por linfcitos virgens. Quando linfcitos so ativados, passam a expressar molculas de adeso que permitem reconhecer endotlios inflamados e extravasar nessas regies. A qualidade de a quantidade dos sinais transduzidos pelo linfcito T no curso de sua interao com a pAPC expressando complexos de MHC+peptdeo cognato determinam sua ativao. O 10 sinal requerido para a ativao de linfcito T o reconhecimento de antgeno pelo TCR. O 20 sinal provido pela engajamento da molcula CD28 dos linfcitos aos coestimuladores da pAPC, e ser discutido mais adiante. O TCR dos linfcitos T exibe baixa afinidade por complexos de MHC e peptdeo: o Kd de 10-5-10-6, com alta taxa de dissociao. Assim, um nico TCR pode engajar vrios complexos MHC+peptdeo em poucos segundos. Existem cerca de 104-105 TCR em um linfcito T, e 105-7x106 molculas de MHC nas pAPC. Em DC ativadas, pode haver 7x106 MHCs+peptdeo na superfcie. Em experimentos com diversas pAPC, mostrou-se que h necessidade de 60-5000 complexos de MHC+um dado peptdeo para ativar um clone de linfcitos T, dependendo da capacidade co-estimulatria da pAPC. Esses complexos podem representar <<0.1% dos complexos MHC+peptdeos presentes na superfcie celular. Entretanto, na ausncia de capacidade co-estimulatria pela pAPC (expresso de CD80/CD86 que engajam CD28 dos linfcitos T), podem ser necessrios 10000 complexos, o que parece difcil de ser atingido in vivo. Experimentos com clones de linfcitos T mostraram que cerca de 8000 engajamentos so necessrios para o priming de um linfcito T virgem, mas estes mesmos clones puderam ser ativados por 1500 engajamentos na presena da ligao CD28/B7. Muito recentemente, estudos de microscopia intravital vem questionando esses nmeros e sugerindo que pode haver necessidade de um nmero menor ainda de complexos MHC+peptdeo para o priming de linfcitos. Alm disso, estudos de substituio de aminocido em peptdeos mostraram que peptdeos ligantes alterados podem induzir menor resposta proliferativa de linfcitos T e h evidncias de que a durao do engajamento TCR/MHC+peptdeo responsvel por esta diferena. Assim, o linfcito T atua como um integrador da durao e do nmero de engajamentos do TCR, ambos importantes para o priming do linfcito. Quando ocorre reconhecimento do complexo MHC+peptdeo apropriado, h aumento da expresso de LFA-1 no linfcito T e alterao de sua conformao para a forma de maior afinidade por ICAM-1, resultando em contato celular mais prolongado, que permite s clulas proliferao e diferenciao. A regio de contato ntimo entre pAPC e linfcito T chamada de sinapse imunolgica e mostrada na figura abaixo. Em vermelho, a regio do contato MHC / TCR (ilustrado pela fluorescncia de uma enzima chamada PKC, ligada transduo de sinal do TCR) . Em verde, as molculas de LFA1 do linfcito, que se ligam a ICAM-1 da pAPC e contribuem para a manuteno firme do contato.

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A durao da ligao estvel entre pAPC e linfcito permite que o no crtico de engajamentos do TCR seja alcanado no priming. Para esta ligao cooperam a interao entre vrios pares de molculas acessrias de linfcitos T e pAPC: CD2/CD58 (LFA3); LFA-1/ICAM-1; CD28/CD80 (B7-1) ou CD86 (B7-2); CD4/MHC de classe II; CD8/MHC de classe I; TCR / MHC. Os pares CD28/CD80 ou CD86 participam no s da adesividade, mas tambm do 2o sinal que concorre para a ativao do linfcito. O engajamento dos coreceptores CD4 e CD8 aos domnios 2 e 3 de MHCs de classe II e I, respectivamente, aumentam enormemente a sensibilidade de linfcitos T s protenas de MHC, em funo do engajamento de protenas ligadas transduo de sinal e funo de adesividade.

A induo de atividade co-estimulatria nas clulas acessrias fundamental para o priming de linfcitos T virgens. O 20 sinal para o priming de L0 T provido principalmente pelo engajamento de CD28 em linfcitos T e CD80 ou CD86 em pAPC. A funo do co-estmulo aumentar a chance de que o peptdeo apresentado no seja prprio. Isto possvel graas ao controle da expresso de CD80 e CD86 pelo reconhecimento de sinais de perigo realizado por pAPCs (como PAMPs reconhecidos por PRRs, ou sinais de dano tecidual / stress celular). Somente pAPC que reconheceram sinais de perigo so capazes de expressar CD80 / CD86. Acredita-se que esse fenmeno seja responsvel pela necessidade da administrao de adjuvantes junto com protenas para induzir respostas de linfcitos T in vivo. Os adjuvantes so capazes de induzir o amadurecimento de DC, ao fornecer o contexto inflamatrio para o antgeno que permite a expresso de CD80 / CD86. Quando um linfcito T ativado, passa a expressar a molcula CD40L. Um contato de um linfcito ativado com uma pAPC virgem atravs do engajamento de CD40L do

43 linfcito ao CD40 da pAPC, pode ativ-la, amplificando o processo de ativao de linfcitos T.

O controle da expresso de CD80/CD86 depende da natureza das pAPC e a capacidade de um tipo celular como APC est relacionada sua capacidade de prover coestmulo. Os linfcitos B, por ex., expressam estas molculas em resposta a ligaes cruzadas do seu BCR, o que uma forma de avalizao da natureza no prpria do antgeno, ou em resposta a engajamento de PRRs. J os macrfagos parecem depender do reconhecimento de PRRs e do engajamento de CD40 ao CD40L de linfcitos T previamente ativados. As DC, que so as mais poderosas iniciadoras da resposta imune, so sensveis a estmulos de natureza diversificada: engajamento de PRRs, CD40/CD40L, TNF e outras citocinas. Estes estmulos do origem a maturao destas clulas, em que a expresso de CD80 e CD86 induzida e os nveis de CD58 elevados, contribuindo tambm para a estabilizao da interao com linfcito T. Como vimos na seo apresentao de antgeno, vrios mecanismos parecem contribuir para que a DC madura apresente preferencialmente peptdeos no prprios, como a seleo dos antgenos ligados fisicamente aos ligantes de TLR. Como possvel que os complexos de MHC+peptdeos prprios presentes em baixo nmero em DC ativadas por sinais de perigo no ativem linfcitos T autorreativos que escapam deleo tmica? Uma das respostas para essa questo ns vimos: existe um processo de seleo de peptdeos fisicamente ligados a PAMPs. Outra resposta para esta questo que na presena do 10 sinal, mas ausncia do 2o sinal, o linfcito T torna-se anrgico, isto , incapaz de responder re-estimulao. Portanto, a apresentao de antgenos por clulas pAPC imaturas (que no expressam B7-1/CD80 e B7-2/CD86) promove a anergia de linfcitos T. Encontros subseqentes com o mesmo peptdeo (prprio, sempre presente) ento no geram resposta porque encontram um repertrio de linfcitos T cognatos (=especficos para aquele peptdeo) previamente anergizado. A anergia ser estudada junto com outros mecanismos de tolerncia.

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Ativao de linfcitos CD8 Diferente da ativao de linfcitos T CD4, muitos pontos da ativao de linfcitos CD8 so ainda obscuros. Se estas clulas reconhecem antgenos expressos no citosol combinados a MHCs de classe I, e respostas imunes s ocorrem em rgos linfides, como possvel que haja reconhecimento de antgenos tumorais, de antgenos de vrus que no infectam pAPC ou de transplantes por estas clulas, sem co-estmulo? Alm disso, enquanto cerca de 90% dos linfcitos T CD4 expressam CD28, apenas 50% das CD8 o fazem. Linfcitos CD4 ativados poderiam estar envolvidos na proviso de um 2 sinal para o linfcito CD8 na forma de citocinas (como IL-2, o principal fator para expanso de linfcitos T CD4), mas foi demonstrado que na ausncia de clulas CD4 pode haver ativao de linfcitos CD8 em resposta por ex a infeces virais. A capacidade das DC de apresentar antgenos englobados por estas clulas via MHC de classe I, referida como apresentao cruzada, oferece uma explicao para esse fenmeno. Alm disso, as DC apresentam vias de entrada para diversos vrus, e parecem ser facilmente invadidas por boa parte dos patgenos intracelulares.

Hoje sabemos que linfcitos CD8 sofrem uma expanso clonal bem maior do que a dos linfcitos T CD4, para o que concorrem as citocinas IL-15, IL-12 e IL-7, enquanto a citocina IL-2 o principal fator de expanso clonal de linfcitos T. Fisiologia da resposta de linfcitos T CD4 A transduo de sinal pelo TCR e pelas molculas acessrias so os eventos determinantes da induo da transcrio de genes ligados a proliferao e diferenciao de linfcito T. Quando ocorre reconhecimento do MHC+peptdeo pelo TCR, as cadeias e do TCR, (CD3) e so agregadas na membrana e se inicia uma cascata de fosforilaes de protenas envolvidas com a transduo de sinal. O resultado a expresso de diversos fatores de transcrio que coordenam a expresso dos genes ligados s funes de linfcitos ativados.

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Entre os primeiros genes a serem transcritos no priming de linfcitos CD4 esto os genes da cadeia do receptor de IL-2, CD25, e IL-2. A sinalizao oriunda de CD28 aumenta a transcrio destes fatores e produz uma alterao ps-transcripcional que aumenta muito a estabilidade do RNAm de IL-2. O linfcito T CD4 prolifera em resposta autcrina a IL-2, e inicia um programa de diferenciao celular. Inicialmente expressam altos nveis de CD69 (que sendo assim, se torna um marcador de ativao recente) e da 2 integrina LFA-1. Logo deixam de expressar CD62L, o que impede sua recirculao nos linfonodos por HEV e passam a expressar altos nveis de CD44 e da 2 integrina VLA4, que permite ligar a VCAM-1 de endotlios inflamados. A pAPC e o linfcito T virgem podem permanecer unidos por muitos dias, graas s interaes mediadas por integrinas. A diferenciao a funo efetora se inicia 4-5 dias aps o crescimento (uma diviso a cada 6h), em que a prognie se mantm ligada a pAPC. O encontro do antgeno apresentado por pAPC por um linfcito efetor leva ao disparo de um ataque imune, sem necessidade de co-estmulo. Os linfcitos T efetores adquirem capacidade de sintetizar as molculas requeridas para sua funo: os CD4 tm funo de auxiliadoras, produzindo citocinas e expressando CD40L; os CD8 tm funo citotxicas (CTL), expressando granzimas e perforina em grnulos citoplasmticos, alm de citocinas inflamatrias. CD40L dos linfcitos T CD4 engaja CD40 de macrfagos e linfcitos B, um sinal que contribui, juntamente com as citocinas secretadas pelo linfcito T, para a ativao desses tipos celulares s suas funes efetoras. Linfcitos T CD4 tambm auxiliam na resposta de linfcitos CD8 e em algumas infeces as respostas de linfcitos CD8 so efetivamente dependentes de linfcitos CD4, mas no todas. Tardiamente aps a ativao (7 dias), os linfcitos T deixam de expressar CD25 e passam a expressar CTLA4, uma molcula com maior afinidade por B7 do que CD28. O engajamento CTLA4/CD28 tem funo inibitria sobre a sntese de IL-2. Assim, CTLA4 tem funo de dar fim a uma resposta de linfcito T ativado.

46 O declnio da resposta T sobrevm aps a remoo do estmulo do antgeno, restaurando o nmero de linfcitos T original. O repertrio de especificidades do TCR, distorcido pela seleo clonal, tambm retorna ao original. Os mecanismos da retrao da resposta T envolvem reduo dos estmulos sobrevivncia, providos por sinais do TCR, coestmulo e citocinas. As clulas ento morrem por privao de sinal de sobrevivncia. J a morte das cels efetoras que so repetidamente estimuladas por antgeno pelo engajamento de Fas (CD95) a FasL (CD95L) de outra ou da prpria clula induz a apoptose do linfcitos T. Esta morte celular induzida por ativao controla as populaes de clulas efetoras expandidas e IL-2 paradoxalmente necessria para este processo.

Fisiologia da resposta de linfcitos T CD4 A transduo de sinal pelo TCR e pelas molculas acessrias so os eventos determinantes da induo da transcrio de genes ligados a proliferao e diferenciao de linfcito T. Quando ocorre reconhecimento do MHC+peptdeo pelo TCR, as cadeias e do TCR, (CD3) e so agregadas na membrana e se inicia uma cascata de fosforilaes de protenas envolvidas com a transduo de sinal. O resultado a expresso de diversos fatores de transcrio que coordenam a expresso dos genes ligados s funes de linfcitos ativados.

Entre os primeiros genes a serem transcritos no priming de linfcitos CD4 esto os genes da cadeia do receptor de IL-2, CD25 (cadeia ), e IL-2. A sinalizao oriunda de CD28 aumenta a transcrio destes fatores e produz uma alterao ps-transcripcional que aumenta muito a estabilidade do RNAm de IL-2. O linfcito T CD4 prolifera em resposta autcrina a IL-2, e inicia um programa de diferenciao celular.

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Inicialmente linfcitos T expressam altos nveis de CD69 (que sendo assim, se torna um marcador de ativao recente) e da 2 integrina LFA-1. Logo deixam de expressar CD62L, o que impede sua recirculao nos linfonodos por HEV e passam a expressar altos nveis de CD44 e da 2 integrina VLA4, que permite ligar a VCAM-1 de endotlios inflamados. A pAPC (usualmente, DC) e o linfcito T virgem podem permanecer unidos por muitos dias, graas s interaes mediadas por integrinas. A diferenciao a funo efetora se inicia 4-5 dias aps o crescimento (uma diviso a cada 6h), em que a prognie se mantm ligada a pAPC. O encontro do antgeno apresentado por pAPC por um linfcito efetor leva ao disparo de um ataque imune, sem necessidade de co-estmulo. Os linfcitos T efetores adquirem capacidade de sintetizar as molculas requeridas para sua funo: os CD4 tm funo de auxiliadoras, produzindo citocinas e expressando CD40L; os CD8 tm funo citotxicas (CTL), expressando granzimas e perforina em grnulos citoplasmticos, alm de citocinas inflamatrias. CD40L dos linfcitos T CD4 engaja CD40 de macrfagos e linfcitos B, um sinal que contribui, juntamente com as citocinas secretadas pelo linfcito T, para a ativao desses tipos celulares s suas funes efetoras. Linfcitos T CD4 tambm auxiliam na resposta de linfcitos CD8 e em algumas infeces as respostas de linfcitos CD8 so efetivamente dependentes de linfcitos CD4, mas no todas. A funo efetora de linfcitos T na imunidade contra patgenos As DC, sob estimulao por PAMPs e citocinas de clulas da imunidade inata, produzem sinais que acoplam a identidade do antgeno com sua origem microbiana. Esses sinais induzem a diferenciao de linfcitos T CD4 s diversas subpopulaes Th (T helper). Uma vez diferenciados, os linfcitos CD4+ Th promovem a eliminao de antgenos atravs de diversas interaes com macrfagos, linfcitos B e tambm atravs do recrutamento e ativao de polimorfonucleares. Assim, a identificao de um grupo de patgenos por clulas da imunidade inata influencia a imunidade adaptativa (atravs da gerao de tipos Th) a selecionar o mecanismo mais apropriado para lidar com aquele tipo de patgeno.

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Clulas Th1 so fruto da diferenciao sob altas concentraes de IFN- e IL-12, que levam induo dos fatores de transcrio T-bet e Stat-4. No incio da resposta, a fonte de IL-12 pode ser a prpria DC, que o libera aps engajamento de alguns de seus receptores de PAMPs, como TLRs. J o IFN- pode ser produzido por clulas NK (natural killer) em resposta prpria IL-12. Ainda, NKs podem secretar IFN- aps o reconhecimento de clulas que no expressam MHCs de classe I ou MHCs no-convencionais. Uma produo de IFN- em baixas quantidades tambm pode ser induzida em DC por reconhecimento de PAMPs, gerando uma diferenciao Th1 inicial que leva produo de grandes quantidades da citocina. A presena de altos nveis de IL-4 inibem a diferenciao Th1, enquanto altos nveis de IL-10 inibem a liberao de IL-12 por macrfagos e DC ativados (IL-4 e IL-10 so caracteristicamente produzidos no curso de resposta Th2). Clulas Th1 secretam principalmente IFN- e IL-2, mas tambm LT-. Esto envolvidas na ativao de macrfagos atividade microbicida contra patgenos intracelulares (vrus, protozorios e bactrias) e no switch para a produo de anticorpos lticos ou neutralizantes por linfcitos B (IgG1 e IgG3 humanas) contra diversas classes de patgenos (protozorios, bactrias, vrus, fungos). O IFN- secretado por clulas Th1 pode, por si s, aumentar a eliminao de microorganismos fagocitados por macrfagos atravs do estmulo produo de ROS e NO (induo de oxidase do fagcito e iNOS), e sinergiza grandemente com sinais oriundos do engajamento da molcula CD40 de macrfagos com CD40L (CD154) de Th1 nesse processo. Nas APC, IFN- aumenta a expresso de MHCs e atua sobre partes da maquinaria de processamento de antgeno (ex induo de LMP2 e LMP7, subunidades do proteassomo). A IL-2 produzida por clulas Th1 crtica para a formao de memria de linfcitos CD8.

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Clulas Th2 podem ser geradas em ambientes com altas concentraes de IL-4 e IL2, que levam induo de fatores de transcrio GATA3 e Stat5. A presena de altos nveis de IFN-, ao induzir T-bet, promove a supresso de GATA3, inibindo a diferenciao Th2. Recentemente, demonstrou-se que a IL-4 produzida por basfilos em funo do reconhecimento de proteases influencia positivamente o desenvolvimento de uma resposta Th2, embora no se saiba qual o receptor sensvel s proteases nestas clulas. Vermes e alrgenos possuem proteases capazes de promover polarizao Th2. Clulas Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 principalmente, mas tambm IL-9 e amfiregulina. A IL-4 a principal responsvel pelo switch para a produo de IgE e tambm IgG4 (neutralizante). Mastcitos possuem FcR e podem ser ativados na presena de vermes recobertos de IgE, liberando seus grnulos que contm TNF e mediadores lipdicos e induzindo inflamao local. Eosinfilos liberam o contedo de seus grnulos txicos para o tegumento dos vermes (protenas catinicas como MBP, MCP) em resposta alta produo de IL-5 por Th2 nas imediaes do helminto. IL-4 e IL-13 podem induzir a ativao alternativa de macrfagos, que promove a formao de granulomas (ex infeco por Schistosoma mansoni e formao de granulomas orquestrada por resposta Th2) e o remodelamento tecidual em infeces crnicas ou na doena alrgica (com deposio de fibras de colgeno, etc). IL-4 estimula peristalse intestinal e IL-13 estimula produo de muco pelo epitlio; em conjunto, esses efeitos so capazes de expulsar alguns vermes.

A figura mostra do lado esquerdo granuloma rico em eosinfilos em torno de ovo heptico de Schistosoma mansoni (H&E), um processo orquestrado por resposta Th2. Do lado direito, deposio de fibras de colgeno nesses granulomas (colorao picrosyrius red).

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Clulas Th17 podem ser geradas sob condies que levem a altos nveis de TGF e IL-6, induzindo o fator de transcrio ROR t e Stat3, ou circunstancialmente, IL-1 e TGF. A combinao de IL-23 e IL-1 tambm podem promover sua diferenciao e IL-23 parece ser um fator de estabilizao da diferenciao terminal de Th17. Clulas de Langerhans (DC da pele) estimuladas por peptidoglicano via TLR2 so capazes de promover a polarizao Th17 atravs da produo de TGF, IL-6, IL-1 e IL-23. DC tornam-se promotoras da diferenciao a Th17 quando estimuladas por -glucanos via dectina. Recentemente, demonstrou-se que o reconhecimento de clulas apoptticas infectadas por DC so capazes de estimular a produo simultnea de IL-6 e TGF, configurando uma situao de diferenciao de clulas Th17. IFN, IFN do tipo I ( e ) e IL-4 inibem a diferenciao de clulas Th17. PGE2 diminui a expresso de RORt e a secreo de IL17 na diferenciao induzida por TGF e IL-6. Clulas Th17 produzem IL17A, que induz a secreo de fatores quimiotticos para neutrfilos, como CXCL2 e CXCL5. Tambm produzem IL-21 (que parece amplificar a freqncia de clulas Th17), IL22 (proteo contra Klebsiella pneumoniae e Cirobacter rodentium), e GM-CSF (importante para gerao e sobrevivncia perifrica de neutrfilos). Th17 so importantes para promover a eliminao de fungos e bactrias extracelulares. De fato, clulas T de memria reativas parede dos fungos so predominantemente Th17 e humanos deficientes em IL-23 ou IL-17 tm infeces fulminantes e persistentes por fungos (candidase

51 mucocutnea crnica). A mutao do fator Stat3 produz uma sndrome chamada de superIgE, com switch para IgE, eosinofilia, reduzida produo de IL-17 e incapacidade de recrutamento de neutrfilos para stios de leso, e consequentemente, infeces recorrentes por Staphylococcus. Clulas Treg podem ser geradas no timo em funo do reconhecimento de autoantgenos (nTreg=Treg naturais) ou podem ser induzidas na periferia sob condies especiais (iTreg=Treg induzidas). A presena de altos nveis de TGF na ausncia de citocinas inflamatrias (como IL-6) favorece seu desenvolvimento. Estas clulas participam do estabelecimento da tolerncia e podem refrear a resposta contra patgenos.

Peptidoglicano -glucano

TGF- IL-6 ou IL-1

Th17 IL-17 IL-23

As respostas de produo de anticorpos T-independente e Tdependente de linfcitos B A ativao de linfcitos B necessria para que sejam geradas clulas produtoras de anticorpos especficos para o antgeno que as ativou, capazes de promover sua eliminao. Existem antgenos capazes de evocar a produo de anticorpos sem auxlio de clulas T, os Ti, mas a grande maioria dos antgenos dependente de ativao T. Tambm existem populaes especializadas de linfcitos B cuja resposta ao engajamento de antgeno independe do auxlio de linfcitos T, como os linfcitos da zona marginal do bao e os linfcitos B1. A ativao de linfcitos B ocorre nos linfonodos e no bao, e a sede de sua proliferao e diferenciao a regio dos folculos dos linfonodos ou da polpa branca do bao.

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Os anticorpos naturais, freqentes no animal no intencionalmente imunizado, so multirreativos e produzidos por clulas B1, uma subpopulao CD5+, auto-renovante, presente em nos elevados na cavidade peritoneal, e predominantemente ativada por antgenos Ti. O repertrio de segmentos gnicos utilizados por esta populao pouco varivel, o que sugere que elas representem um elemento da imunidade inata, cujo BCR na verdade um PRR: reconhecem fosforilcolina, LPS e outros constituintes de bactrias. Ainda, h evidncias em favor de seu papel na tolerncia e na eliminao de constituintes celulares danificados. Antgenos Ti tm em comum a produo de anticorpos do subtipo IgM (exceto em alguns casos), de baixa afinidade por antgeno e que no produzem memria, ie, no produzem resposta 2a quantitativa ou qualitativamente diferentes da 1a. No camundongo, os linfcitos B da zona marginal do bao, localizados nas vizinhanas do sinus marginal, tm diversidade limitada de BCRs e habilidade para responder a polissacardeos e gerar anticorpos naturais (resposta Ti). Expressam apenas IgM na membrana e o marcador CD21. Podem tambm participar de respostas Tdependentes. Em humanos, h controvrsias sobre se esta populao representa uma linhagem independente ou uma populao de memria que sofreu hipermutao somtica mas deixou o GC antes do switch de isotipos e continua a expressar IgM. O repertrio de especificidades do BCR dessas clulas varivel em humanos (oligoclonal em alguns sorotipos, com uso preferencial de certos segmentos V da cadeia H) e pode haver um certo nvel de switch para IgG e IgA, sugerindo que a resposta possa ser T-dependente. importante lembrar que existe uma especializao do bao no reconhecimento e eliminao de bactrias encapsuladas (ex Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningiditis), cujas cpsulas ricas em polissacardeos so capazes de evocar essa resposta Ti. Os macrfagos da zona marginal so eficientes no reconhecimento e captura de polissacardeos injetados i.v. Ainda, macrfagos da zona marginal do bao expressam uma lectina chamada SIGN-R1 (DC-SIGN). Essa lectina se liga a C1q e a um polissacardeo de pneumococcus e meningococcus, ativando a via clssica do complemento. Indivduos sem bao so susceptveis infeco disseminada e septicemia por pneumococcus e meningococcus.

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Alguns antgenos T-independentes (Ti) possuem a capacidade de ativar linfcito B convencionais sem que seja necessria a ativao de clulas Th, atravs da ligao cruzada de BCR a molculas com vrios epitopos iguais. A ativao de linfcito por estes antgenos requer um sinal de citocinas, embora no requeiram interao cognata B-T, e alguns evocam produo de IL-1, IL-6 e TNF por macrfagos. Essa ativao Ti pode ocorrer no folculo, em resposta ao engajamento aos antgenos na superfcie das clulas foliculares dendrticas (FDC). De modo geral, a resposta Ti no leva formao de centros germinais nos linfonodos (h excees), estruturas foliculares caractersticas do encontro BT onde ocorre o switch de isotipos de imunoglobulinas, a hipermutao somtica e a maturao por afinidade, mas privilegia a gerao de plasmcitos extra-foliculares. Outras molculas, como LPS de parede de bactrias, no induzem ligao cruzada de BCRs mas provocam por si s ativao policlonal de linfcito B atravs da ativao de TLRs, quando presentes em altas doses (100x mais do que o necessrio para ativar uma DC). A ativao de linfcito B convencionais (B2) T-dependentes por antgenos proteicos (monomricos) permite que sejam gerados anticorpos de alta afinidade e de um isotipo de imunoglobulina adequado a promover a eliminao de um antgeno de determinada natureza no local onde se encontra, gerando memria. Veremos adiante como o auxlio de linfcitos T contribui para a afinidade e o isotipo de imunoglobulinas produzidos na resposta de linfcitos B T-dependente. A transduo de sinal pelo BCR ocorre de forma anloga a dos linfcitos T, e o 1o evento na ativao dos linfcito B. O BCR composto por uma imunoglobulina de membrana, que possui uma poro transmembrana e uma cauda pequena citoplasmtica na sua poro C terminal, e duas cadeias associadas, e . Estas cadeias so responsveis pela transduo de sinais do BCR e possuem pores com seqncias caractersticas de protenas com esta funo. A intensidade do sinal transduzido parece depender das ligaes cruzadas entre imunoglobulinas de membrana. No caso dos antgenos T-dependentes, h necessidade de um 2o sinal provido por linfcito T para a proliferao e diferenciao de linfcito. Em alguns casos, foi verificado que o reconhecimento de constituintes de micrbios (por TLRs) atuou como 2o sinal, permitindo clula B prescindir do auxlio de clulas T (resposta Ti de populaes de linfcitos B convencionais). Portanto, a presena de pequenas quantidades de ligantes de TLRs pode compensar a ausncia de auxlio de linfcitos T. Alm disso, mais recentemente, foram observados casos em que molculas da imunidade inata atuaram como ligantes de CD40, mimetizando os sinais do auxlio de linfcitos T aos linfcitos B e permitindo uma resposta Ti de linfcitos B convencionais. Uma dessas molculas C4BP, uma molcula capaz de ligar-se aos fatores C4b e C3b do complemento e ento sinalizar via CD40.

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O BCR possui ainda um co-receptor. Este co-receptor formado por CD21 (CR2 para C3d do complemento), CD19 e CD81. O engajamento de CD21 ao C3d ligado ao antgeno incrementa particularmente a ativao de linfcito B, atravs do recrutamento e ativao de uma enzima de transduo, pois CD19 ativado ancora estas molculas junto ao BCR. As clulas foliculares dendrticas so sabidamente capazes de reter antgeno por longos perodos em sua superfcie, atravs de reconhecimento por seus FcR de anticorpos ligados ao antgeno ou de complemento fixado a eles via CR. Este antgeno reconhecido por anticorpos e complemento engaja simultaneamente BCR e co-receptor e amplifica a ativao B. provavel que a resposta humoral deficiente que os camundongos deficientes em CR2 apresentam se deva a esta funo.

So necessrios 2 eventos para dar origem a proliferao e diferenciao de linfcito B T-dependentes: o engajamento do BCR ao antgeno e a interao cognata BT. O engajamento do BCR ao antgeno leva a expresso do gene antiapopttico Bcl-X; a progresso do ciclo celular para G1 e a expresso de CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD25 e IL-4R. Uma conseqencia importante da transduo de sinal pelo BCR a endocitose de antgeno-anticorpos, que permite sua apresentao pelo linfcito B a clulas T, combinados a MHC de classe II. A natureza distinta dos epitopos reconhecidos por linfcito B e CD4 Th linfcito T CD4 s podem reconhecer peptdeos combinados ao MHC, enquanto linfcito B podem reconhecer epitopos conformacionais prev a possibilidade de que epitopos distintos, mas fisicamente ligados, medeiem esta interao. Esta situao pode ser observada no chamado efeito carreador. Uma molcula pequena e no proteica hapteno no deflagra qualquer produo de anticorpos, mas conjugada a uma protena, permite que a clula B com receptor especfico para hapteno endocite o complexo hapteno-carreador e apresente peptdeos do carreador. Assim, ativa linfcitos Th que provem o auxlio necessrio proliferao e diferenciao destas clulas.

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Nos rgos linfides, existe uma segregao entre linfcito B e T em diferentes regies. Tomemos como ex o linfonodo. Nos linfonodos, os linfcito B virgens so atrados pela quimiocina BLC produzida por clulas do estroma dos folculos, atravs do receptor CXCR5. Nesta regio esto as clulas foliculares dendrticas (FRC). Os linfcito T virgens mantm-se no paracrtex, regio onde os folculos esto imersos e para onde vo as DC maduras, atrados via CCR7. A segregao assegura que linfcito T e B estejam em contato com as populaes acessrias apropriadas. O antgeno pode chegar solvel aos folculos do linfonodo, percolando a partir do sinus subcapsular e reagindo especificamente com BCRs na membrana de linfcitos B. Ainda, ele pode ser capturado por macrfagos subcapsulares, especialmente se estiver opsonizado por complemento e anticorpos ou for composto por certos carboidratos, e ser capturado e transportado de seus prolongamentos por linfcitos B at clulas foliculares dendrticas (FRC). Aps o encontro do antgeno, linfcitos B migram para a fronteira do folculo, onde encontram linfcitos T ativados. Em 24h, o antgeno estar sendo apresentado por linfcitos B na fronteira do folculo a linfcitos T via MHC de classe II, e os linfcitos B recebem auxlio T e entram em ciclo celular. Alm de clulas foliculares dendrticas, h evidncias de que DC do paracrtex tambm podem preservar antgeno ntegro em sua superfcie e apresent-lo a linfcitos B virgens emergentes do sangue pelos HEV.

A figura mostra complexos imunes e carboidratos ligando a receptores na membrana de macrfagos subcapsulares. Os complexos imunes so transportados por linfcitos B cognatos at as clulas foliculares dendrticas. J antgenos solveis ligam-se diretamente ao BCR de linfcitos B cognatos.

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A figura mostra os conduits foliculares com linfcitos B associados. Os linfcitos B associados aos conduits captam antgenos solveis. A freqncia de linfcito especficos para um antgeno 1: 105-106. A probabilidade de um encontro de linfcito B e T especficos para um mesmo antgeno de 1:108-1012. Portanto, improvvel que um linfcito B possa atuar como ativador inicial de linfcito T. Entretanto, uma vez que a populao T ativada e expandida pelo encontro de antgeno apresentado por DC e os linfcito B so ativados (e talvez expandidos) pelo encontro de antgeno solvel trazido pelos conduits ou na superfcie de clulas foliculares dendrticas (FDC), os linfcito B e T ativados migram para a regio de fronteira entre o folculo e a regio T do paracrtex. Entre 1-2 dias aps a exposio ao antgeno, os linfcito B e T formam pares na regio de fronteira B e T.

Nos 1os momentos da interao B-T, existe uma polarizao na face de encontro entre as duas clulas, com agrupamento de MHC de classe II e ICAM-1 no linfcito B. O sinal mais importante que as clulas T ativadas provem a linfcito B na interao cognata a expresso de CD40L, que permite o engajamento ao CD40. Se linfcitos T so ativados e fixados, ainda podem prover o co-estmulo necessrio proliferao e diferenciao de linfcito B. A molcula CD40L expressa transitoriamente na clula T, e a interao CD40/CD40L (CD154) aumenta a expresso de B7 no linfcito B, o que permite o engajamento ao CD28 de linfcito T e a estabilizao da produo de IL-2, provendo sinal para a proliferao de linfcito B. A citocina IL-4, por ex., produzida por linfcito Th2

57 sinergiza fortemente com a expresso de CD40L, determinando proliferao e diferenciao celular. Aps o encontro entre B e T, os linfcitos B podem: (1) se mover para reas distantes dos folculos e proliferar / diferenciar a clulas formadoras de anticorpos de vida curta, que secretam IgM; ou (2) migrar para os folculos B, proliferarem e estabelecerem os centros germinais (GC). Entre 3-7 dias aps a exposio ao antgeno, so encontradas as 1as clulas formadoras de anticorpos junto de linfcitos T na fronteira entre zona T e folculo. A diferenciao a clulas formadoras de anticorpos envolve um processo de splicing diferencial, em que o mRNA da cadeia H da IgM passa a conter exons da pequena cauda citoplasmtica hidroflica, mas no os exons da poro transmembrana da imunoglobulina e poro citoplasmtica positivamente carregada. Sendo assim, a imunoglobulina no pode ser ancorada na membrana. Sinais de CD40L e citocinas como IL-2, IL-4 e IL-6, providos pelo linfcito T so necessrios para a diferenciao a clulas formadoras de anticorpos e inicialmente, essas clulas migram para a polpa vermelha do bao e a medula dos linfonodos. Existem domnios C da poro Fc dos anticorpos alternativos. O rearranjo do DNA pode excisar domnios C, preservando apenas 1. Este processo chama-se troca (switch) de isotipos, de IgM para outro iso selecionado, como C (IgE), C1 (IgG1), C2a (IgG2a), C2b (IgG2b) no camundongo. Para o switch na produo de anticorpos so necessrios o engajamento de CD40 e citocinas, que so responsveis pela determinao do isotipos de imunglobulinas produzidos. Assim, a IL-4 secretada por clulas Th2 determina o switch para IgE e IgG1 em camundongos e IgE e IgG4 em humanos; IFN- produzido por clulas Th1, para IgG2a em camundongos, e IgG3 e IgG1 em humanos, e TGF- (produzido por vrios tipos clulas) junto IL-5 de clulas Th2, para IgA. A regio onde se encontra o antgeno tambm pode contribuir para o isotipo de imunoglobulina dominante; antgeno via oral leva a switch para IgA nos MALT, em funo do grande no de clulas produo de TGF- na regio. A troca dos isotipos fundamental para a resposta humoral, uma vez que a funo efetora dos anticorpos depende do domnio C da poro Fc, ou seja, do isotipo de imunoglobulina. Por ex, o isotipo IgG1 camundongo no bom fixador de complemento, mas tem boa ao neutralizadora de antgeno; j o isotipo IgM, fixa complemento bem e pode determinar a lise de clulas e micrbios. IgG2a complexada a antgeno liga-se a FcR na superfcie de macrfagos, atuando como opsonina. IgE liga-se a FcR, permitindo citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC) por eosinfilos e degranulao de mastcitos, e mediando reaes de hipersensibilidade do tipo 1. Portanto, as citocinas secretadas por Th determinam a funo efetora que ser ativada pela produo de anticorpos dos isotipos apropriados. Entre 4-7 dias aps a exposio ao antgeno, alguns dos linfcito B ativados migram de volta para os folculos, onde cada um ou poucos linfcito B do origem a um centro germinal (GC). Os linfcito B proliferantes centroblastos - formam a z escura basal do GC, ciclando a cada 6h (prognie de at 5000 clulas/5 dias) e reduzindo a expresso de BCR. Os centroblastos sofrem hipermutao somtica nos domnios V, e a freqncia de mutao, normalmente de 1:106-107 pares de bases, passa a 1:103. Esse processo envolve ativao da enzima AID pela interao prvia com o linfcito T CD4, gerando diversidade maior nas imunoglobulinas e mudando sua afinidade por antgeno. Alm de responsvel pela hipermutao somtica, AID tambm a enzima responsvel pelo switch de isotipos de imunoglobulina, mecanismos que envolvem tambm a participao de enzimas de reparo de DNA. A prognie pouco ciclante dessas clulas os centrcitos forma a zona clara basal, onde entra em contato com o antgeno na superfcie das clulas foliculares dendrticas.

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Centrcitos entram em programa de apoptose, do qual podem ser resgatados pelo engajamento de seu BCR a antgeno e expresso de protenas anti-apoptticas da famlia Bcl. Inicialmente, o antgeno abundante na superfcie de clulas foliculares dendrticas e prov estmulo para muitos clones. A medida que se formam clulas formadoras de anticorpos que promovem a eliminao do antgeno, ele escasseia e s clulas com alta afinidade por antgeno conseguem sinais para a sobrevivncia. As que tm baixa afinidade so afastadas para a zona do manto. Os linfcitos B que captam antgeno das clulas foliculares dendrticas passam por novo ciclo de proliferao e diferenciao a plasmcitos ou clulas de memria. Os centrcitos que porventura tenham adquirido especificidades autorreativas no conseguem auxlio e so anergizados por um processo ainda pouco conhecido. O processo de gerao de diversidade e seleo por afinidade leva a produo de anticorpos com maior afinidade por antgeno (maturao por afinidade). Estes eventos so tardios no curso da resposta imune. Embora clulas foliculares dendrticas possam prover sinais para a maturao por afinidade, ela pode acontecer na ausncia dessas clulas, quando h presena de depsitos de antgeno.

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A resposta humoral 2a a antgeno T-dependente resulta em maior quantidade, maior afinidade e isotipos de imunoglobulinas distintos da resposta 1a. A resposta 1 basicamente por produo de IgM e com o tempo, uma proporo progressivamente maior de linfcitos B vai sofrendo switch de isotipos e dando origem a produo de outros isotipos de imunoglobulina ainda na resposta 1. J na resposta 2, a rpida expanso e diferenciao de linfcito de memria, os quais sofreram switch e maturao por afinidade na sua formao, permite qualidade e quantidade distintas de produo de anticorpos. No h mais produo de IgM e os ttulos de anticorpos contra antgenos so elevados. A produo de anticorpos dura anos, em funo de plasmcitos de vida longa que migram para a medula ssea e se mantm ativos.

Linfcitos B de memria parecem prescindir de sinais de linfcitos T para a sua ativao. Expressam TLRs e podem ser ativados por seus ligantes produo de anticorpos, sugerindo que esta seja uma forma pela qual se mantm uma renovao de plasmcitos e uma produo duradoura de anticorpos sricos.

60 O switch para isotipos diferentes de imunoglobulina, maturao por afinidade e memria da resposta T-dependente so desejveis em vacinas. Mesmo a resposta a cpsula de bactrias torna-se mais efetiva passando de T-independente a T-dependente, atravs da conjugao de polissacardeo a protena, e este conhecimento tem servido ao design de vacinas. Na resposta a polissacardeos de cpsula de pneumococcus, um antgeno Ti, existe switch de isotipo de imunoglobulina mesmo em camundongos deficientes na expresso de CD40L, em funo da expresso de AID induzida por ligantes de TLR. Os linfcito B expressam CD32, um FcRIIB, prximo ao BCR, e o engajamento simultneo de pores Fc a ele e de antgeno ao BCR resulta em inibio da ativao B. Este fenmeno impede a produo de anticorpos em algumas situaes em que j h altos nveis circulantes, em uma regulao negativa, e embasa a prtica clnica de administrar soro antiRh a mulheres Rh- grvidas de fetos Rh+, visando impedir sua sensibilizao pelo fator Rh.

Mecanismos de agresso tecidual

O sistema imune to capaz de destruir patgenos como de destruir o prprio organismo. As clulas do sistema imune podem exibir citotoxicidade contra alvos infectados por patgenos intracelulares, patgenos no tecido intersticial ou clulas do prprio organismo, em reaes autoimunes. Esta citotoxicidade pode ser mediada por protenas que ativam programa de apoptose nos alvos ou que produzem lise osmtica. Alm disso, mediadores inespecficos de defesa so liberados por leuccitos contra patgenos extracelulares e lesam tecidos. Por fim, o reconhecimento de Ags por Abs, a ativao de complemento ou outras protenas do soro que reconhecem PAMPs podem ser lesivos para os tecidos. Vejamos 1o os mecanismos de agresso tecidual e depois situaes em que se tornam seriamente lesivos ao organismo, como as reaes de hipersensibilidade e o choque sptico. As CTL (clulas citotxicas) so, em sua maioria, linfcitos CD8 que reconhecem MHC classe I + peptdeo em clulas infectadas por patgenos intracelulares. Este reconhecimento leva a uma polarizao da clula na direo do alvo, sobre o qual lana seus grnulos. Os grnulos contm perforina, uma protena semelhante ao fator C9 do complemento, capaz de formar poros na membrana da clula alvo. A insero de poros na membrana do alvo pode levar a lise no caso de alguns tipos celulares, mas de modo geral, permitem a entrada de granzimas, que ativam caspases, dando origem a morte apopttica do alvo. A prpria CTL protegida da lise por ao de sulfato de condroitina A, um proteoglicano que inativa perforina. Clulas NK tambm contm estes grnulos e podem us-los na lise de clulas que no expressam MHC de classe I. Reduzir a expresso de MHC de classe I uma estratgia comumente utilizada por virus. Assim, complementam a funo anti-reservatrios virais das clulas CTL. Outros mecanismos que induzem apoptose no alvo so a expresso de FasL ou de TNF, que se ligam respectivamente ao Fas ou ao TNF-R1 expresso pelo alvo. Estes mecanismos tambm so usados por clulas CD4 e CD8 CTL. A morte por apoptose assptica: rapidamente, macrfagos ingerem os corpos apoptticos, em um processo que no gera inflamao: o sistema imune no pe mais lenha na fogueira, ou seja, a prpria ao do sistema imune sobre patgenos no gera sinais de perigo. Os macrfagos e neutrfilos dispe de mecanismos microbicidas extremamente txicos para os tecidos, como a produo de NO e ROS. Normalmente, estes compostos so lanados no fagolisossoma, aps a fagocitose do patgeno. Entretanto, quando a fagocitose frustrada, eles so lanados no meio extracelular, produzindo grande dano tecidual. Vrias enzimas dessas clulas servem ao catabolismo de ECM, como colagenase e elastase, facilitando a infiltrao celular e a ao microbicida, mas causando tambm grande dano tecidual.

61 Os eosinfilos exibem citotoxicidade contra helmintos e outros patgenos, comumente mediada pela liberao de seus grnulos quando FcR engajam complexos imunes. Os grnulos de eosinfilos contm (1) EPO, que na presena de H2O2 produz hipohalitos; (2) ECP, que se liga a superfcies negativamente carregadas formando poros, e eficiente contra S. mansonii; (3) MBP, responsvel pela formao do cerne cristalide que cora com eosina, que danifica parasitos por mecanismos desconhecidos; (4) EDN, uma ribonuclease que danifica patgenos e neurotxica. Estes grnulos so liberados contra patgenos de uma determinada classe: o engajamento de FcRII por parasitos cobertos por IgG leva a liberao de ECP; o de FcRII, por parasitos recobertos de IgE, a liberao de EPO. Como so mediadores inespecficos de defesa, estas substncias produzem grande dano tecidual. Alm disso, os eosinfilos promovem recrutamento de neutrfilos e degranulao de mastcitos, inflamando o tecido. Os mastcitos so clulas envolvidas na resposta inflamatria a certos tipos de Ag. Possuem receptores de IgE, os FcR I, que se ligam a Ig sem que para isso ela precise estar ligada a Ag, diferente dos outros FcR. Assim, mantm-se sensibilizados, e o novo encontro do Ag determina resposta do mastcito. Primeiro ele degranula, lanando triptase, quimase, serina-esterases, histamina e algum TNF no meio. As 1as alteraes so hemodinmicas, causadas pela histamina; vasodilatao e aumento do fluxo sanguineo, da permeabilidade capilar e da drenagem linftica. O TNF leva ao aumento da expresso de selectinas e mais adiante, de ICAM pelo endotlio, recrutando neutrfilos 1o e depois macrfagos. As enzimas ativam as metaloprotenas da matriz, provocando catabolismo de ECM e destruio tecidual. A seguir, passa a sintetizar e liberar quimiocinas, mediadores lipdicos derivados do cido araquidnico (LT C4, D4 e E4) e PAF. Os mediadores lipdicos aumentam a dilatao arteriolar e induzem contrao dos demais msculos lisos, alm da produo de muco. Suas quimiocinas recrutam neutrfilos, basfilos e eosinfilos. A inflamao causada pelos mastcitos e a exocitose de enzimas so a principal causa de destruio tecidual. A ativao de complemento lesiva ao tecido, embora muitas vezes o alvo seja um patgeno extracelular e as clulas de mamfero apresentem defesas contra fixao de complemento. A via MBL, a protena C-reativa (ligao a fosfolipdios de bactrias, como fosforilcolina e fosfatidiletanolamina) e a protena amilide do soro (liga a agarose e fosfatidiletanolamina) ativam mecanismos da via clssica. A via alternativa ativada espontaneamente, e a via clssica ativada pela formao de complexos imunes: ambas promovem um certo nvel de leso tecidual e geram mediadores inflamatrios particularmente, C5a que ativam fagcitos a mecanismos microbicidas e promovem seu extravasamento. Como vimos, mecanismos efetores contra patgenos lesam tecidos em reaes normais. Em certas situaes, estas reaes se tornam exacerbadas ou so voltadas contra Ags prprios, causando grande dano tecidual. o caso das reaes de hipersensibilidade e de doenas autoimunes.

Reaes de hipersensibilidade
A reao de hipersensibilidade do tipo I produzida por engajamento de FcR I ligado a IgE a Ag, causando degranulao e ativao de mastcitos. Os mastcitos lanam histamina, TNF, quimase, triptase e serina-esterases, e sintetizam quimiocinas, IL-4, PAF e LTB4. As serina esterases ativam metaloproteinases que degradam ECM. Inicialmente, a histamina e outros mediadores provocam vasodilatao e aumento da permeabilidade capilar na regio de entrada do Ag, podendo provocar rinite, coceira ou ainda produo de muco, vmito e diarria, se ingerido. Quando atinge propores sistmicas, pode levar ao colapso circulatrio e fechamento da epiglote, no chamado choque anafiltico. A reao aguda seguida de recrutamento de linfcitos Th2, eosinfilos e basfilos, que

62 contribuem para a imunopatologia da hipersensibilidade. Os eosinfilos so os maiores contribuidores no processo alrgico crnico. As reaes de hipersensibilidade II so geradas por reconhecimento de Ags na membrana celular por Abs, levando a fixao de complemento ou citotoxicidade mediada por anticorpos (ADCC). Estes Ags, na maioria dos casos, so molculas que penetraram no organismo e aderiram a membranas celulares, como drogas, ou em transfuso sangnea, ao carboidrato que confere o tipo sangneo. A formao excessiva e a persistncia de complexos imunes levam a reaes de hipersensibilidade do tipo III. Os agregados grandes fixam complemento e so rapidamente removidos da circulao. Entretanto, quando h excesso de Ag, formam-se complexos imunes pequenos, que tendem a se depositar na parede dos vasos, ativando leuccitos. A administrao de Ag s.c. a um animal previamente imunizado pode produzir a reao de Arthus, 4-10 h aps a administrao. Complexos imunes induzem degranulao de mastcitos, causando inflamao. Macrfagos tambm reconhecem complexos imunes e secretam citocinas inflamatrias e quimiocinas que recrutam neutrfilos. A deposio de Ag+IgG+complemento em paredes de vaso seguida de infiltrao de neutrfilos, levando a agregao de plaquetas e coagulao sangnea, e produzindo ocluso vascular e necrose em casos severos. A persistncia de complexos imunes produz glomerulonefrite, inflamao sinovial (por ultrafiltrao de lquido sinovial e urina) e vasculite. Outro caso de hipersensibilidade do tipo III a doena do soro, que ocorre assim que se monta uma resposta humoral primria a administrao de Abs de outro animal, como antisoros usados na clnica. A reao de hipersensibilidade tardia (DTH) pode ser mediada pela infiltrao de linfcitos Th1 no local de entrada do Ag, e ocorre de 24-72h aps o contato no animal previamente sensibilizado. Uma reao semelhante pode ocorrer em resposta ao reconhecimento por CD8 de MHC classe I+peptdeo. Estes tipos celulares liberam TNF e LT, causando destruio local do tecido e expresso de selectinas no endotlio, as quais auxiliam a adeso de leuccitos. Tambm liberam quimiocinas que recrutam macrfagos e IFN, que ativa fagcitos a liberar mediadores de inflamao. A destruio tecidual na DTH causada principalmente pelos produtos de macrfagos ativados, como enzimas hidrolticas, NO, ROS e citocinas pr-inflamatrias. Uma caracterstica desta reao o endurecimento do tecido, como na pele grossa da dermatite de contato. O prottipo desta reao a resposta tuberculina, em que o indivduo previamente sensibilizado a M. tuberculosis e inoculado com tuberculina apresenta febre, enjo e endurecimento da pele. A reao granulomatosa a forma mais importante de DTH, e pode ser causada pela incapacidade de macrfagos ativados de fagocitar um Ag ou pela persistncia de um patgeno. Forma-se um cerne de clulas epiteliides, derivadas de macrfagos ativados, que podem se fundir em clulas gigantes, e em torno, uma regio com linfcitos e grande deposio de colgeno. A massa de clulas gigantes sofre necrose esponjosa, processo induzido por CTL na lepra. Estas reaes isolam o patgeno, mas causam prejuzo funcional ao tecido. Os macrfagos ativados tornam-se uma fonte de TNF e os granulomas se autoamplificam. A reao granulomatosa importante na imunopatologia causada por M tuberculosis e M. leprae. As CTL CD8 podem causar grande dano tecidual em tecidos infectados por vrus. No caso da infeco murina por LCMV, a encefalite letal devida a lise celular por CTL, e sua depleo salva a vida do camundongo; em humanos, caso semelhante ocorre em hepatites virais e miocardite por virus cocksackie. A autoimunidade pode envolver reaes de DTH a Ags prprios, que o organismo falha em tolerar, ou resposta humoral, com reconhecimento de Ags de membrana (tipo II), ou formao excessiva de complexos imunes (tipo III). No SLE, existe freqentemente uma deficincia na remoo de complexos imunes, com conseqente glomerulonefrite, artrite e vasculite, o que tambm ocorre na glomerulonefite ps-streptococcal. Na anemia hemoltica

63 e miastenia gravis, respectivamente, Ags de membrana de eritrcitos e AchR de neurnios so reconhecidos por Ab. Na diabetes insulino-dependente (tipo I, IDDM), h DTH contra Ags das ilhotas pancreticas.