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Cincias Biolgicas
Introduo
O colgeno o principal componente do tecido conjuntivo, a protena mais abundante do organismo e uma das protenas mais conservadas ao longo do processo evolutivo. A molcula de colgeno est disposta sob a forma de a-tripla-hlice. Os principais aminocidos que a compe so: Glicina, Prolina e Hidroxiprolina. O colgeno apresenta 2 aminocidos caractersticos: Hidroxilisina e Hidroxiprolina. A hidroxiprolina responsvel pela estabilidade da molcula de colgeno.
Objetivo
Material
Vidraria
4 bales volumtricos de 100 mL; 3 bales volumtricos de 1 L; 6 bechers de 50 mL; 3 bechers de 100 mL;
Diversos
Eppendorfs de 1 mL; Filtro de papel com 20 cm de dimetro; Frascos para armazenar o material e as amostras extrados; Frascos para armazenar os reagentes.
Reagentes
Acetato de Sdio P.A. Merck; Acetona P.A. Merck; cido Actico 1,0 M Merck; cido Ctrico P.A. Merck; cido Clordrico 6,0 N Merck; cido Clordrico 2,0 M Merck; cido Clordrico 10% v/v - Merck; cido Fosfrico P.A. Merck; cido Perclrico 60% v/v - Merck; gua Destilada; BSA tipo 4 Merck; Citrato de Sdio P.A. Merck; Cloramina T 7% - Merck; Cloreto de Sdio 0,15 M Merck; Coomassie Blue G250 Merck; DAB P.A. Merck; Etanol P.A. Merck; Etanol 70 % v/v - Merck;
Hidrxido de Sdio 2,0 M Merck: Hidroxiprolina P.A. Merck; Isopropanol P.A. Merck.
Equipamentos
Balana digital; Centrifuga; Computador; Espectrofotmetro; Estufa; Geladeira; Manta aquecedora; Medidor de pH; Placa agitadora (Mixer); Potter de 15 mL com pistilo; Programa Excel Microsoft Office 2000; Agitador de Tubos (Vortex).
Metodologia
BSA [ 1,0 mg / mL ]
a)
b) 100 mL BSA + 400 mL H2O c) 200 mL BSA + 300 mL H2O + 2,5 mL Bradford
Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com lcool 70%.
Coloca-se o tecido extrado em acetona para fixao das estruturas e estoca-se o material at a utilizao a 20C; Na utilizao, o material levado estufa a 37C por volta de 1h, para que a acetona evapore; Quando retirado da estufa o material pesado e macerado; O material macerado usado cido Actico 1,0 M e o volume completado; Deixar o material sob agitao em baixa rotao a 25C por 48hs; Aps 48hs centrifugar por 30 minutos a 4000 rpm, recolher o sobrenadante (amostra) e armazenar em geladeira.
Obs.: O volume de cido Actico 1,0 M vai variar de acordo com o material utilizado.
Dosagem de Colgeno
a)
b) 100 mL amostra + 400 mL NaCl c) 200 mL amostra + 300 mL NaCl + 2,5 mL Bradford
Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com lcool 70 %.
a)
Adicionar 400 mL de Isopropanol em cada tubo; Adicionar 200 mL do reagente A; Agitar e manter a temperatura ambiente por 4 minutos; Adicionar 2600 mL do reagente B; Agitar e aquecer a 60C por 25 minutos;
Ler D.O. 560 hm (Preferencialmente cubeta de vidro, mas pode ser de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com HCl 10%.
Colocar 2,0 mL da amostra obtida na extrao de colgeno e 1,0 mL de HCl 6,0 N; Agitar e aquecer a 116C por 18hs; Ajustar o pH da nova amostra entre 6.0 e 7.0 utilizando NaOH 0,5 M e armazenar em geladeira.
Dosagem de Hidroxiprolina
a)
Limitaes
O cido Actico utilizado s conseguiu extrair o colgeno presente nos tecidos que no apresentavam intensa fibrose, pois neste caso a extrao no foi total, interferindo assim no resultado obtido.
Referncias
Este protocolo uma adaptao do Mtodo de Schor modificado (1980), referente extrao cida de colgeno e do Mtodo de Berg (1982), para a extrao cida de hidroxiprolina.
Observaes
O mtodo de Bradford ideal para a dosagem de colgeno, pois no interfere com os resduos de glicina da molcula presentes na amostra aps extrao.
M = m / mol V
M=
1050 60,05 x 1
= 17, 485 M
Ci . Vi = Cf . Vf
17,485 . Vi = 1 . 1000
Vi = 57,18 mL
r = 1,19 kg / L
% p/p = 36
x= 428,4g
N = m / eqg V
N = 428,4g 36,5 x 1
= 12 N
Ci . Vi = Cf . Vf
12 . Vi = 6 . 1000
Vi = 500 mL
Molaridade = Normalidade
Ci . Vi = Cf . Vf
12 . Vi = 2 . 500
Vi = 83,5 mL
4. Bradford
Preparo:
Dissolver o Coomasie no Etanol; Colocar o cido Fosfrico; gua q.s.p. 100 mL (Completar com H2O at 100 mL).
Obs.: Utilizar filtro de papel e filtrar at ficar marrom (Utilizar luva). Estvel por 1 ms em geladeira (Conservar em frasco escuro).
PM = 58,5 g / mol
58,5 g - 1mol
- 0,15 mol
x = 8,775 g / L
x= 80g
7. Reagente A
Obs.: Fazer 3,0 mL (600 mL de Cloramina T + 2400 mL de Tampo). Volume necessrio para 12 tubos.
Cloramina T 7%
57 g Acetato de Sdio; 37,5 g Citrato de Sdio; 5,5 g cido Ctrico; 385 mL de Isopropanol; gua q.s.p. 1L.
8. Reagente B
Misturar 3 volumes de DAB com 13 volumes de Isopropanol. Obs.: Fazer 32 mL (6,0 mL de DAB + 26 mL de Isopropanol). Volume necessrio para 12 tubos.
9. Soluo de Hidroxiprolina
Obs.: Dividir em partes iguais de 1,0 mL e congelar (Desprezar cada parte aps o uso).