REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Laura Helln Garca 2 Bachillerato B

2012

NDICE
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DESCUBRIMIENTO EN QU SE BASA? TERMOCICLADOR CMO SE MEJOR EL MECANISMO? UTILIDADES BIBLIOGRAFA PG 2 PG 2 PG 2-3 PG 4 PG 4 PG 5 PG 6

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en ingls, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar ms de un milln de veces un ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucletidos. DESCUBRIMIENTO La reaccin en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary Mullis. El Dr. Mullis recibi en 1993 el Premio Nobel de Qumica por este descubrimiento. Fueron pocos los que inicialmente percibieron la importancia de lo que el Dr. Mullis haba descubierto. Sin embargo, la importancia de su invencin y el cambio que supuso en el campo de la biologa molecular fue muy importante. Como en el caso de muchas invenciones, el descubrimiento de la PCR tuvo lugar buscando la solucin a otro problema. De hecho, antes de la PCR existan mtodos para aislar fragmentos de DNA basados en la clonacin, pero estos mtodos resultaban mucho ms costosos en tiempo y en dinero. Mediante esta tcnica es posible generar muchas copias de un fragmento de DNA y distinguirlo del resto del DNA total extrado. EN QU SE BASA? La reaccin se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos: desnaturalizacin, hibridacin y extensin. DESNATURALIZACIN: Para que comience la reaccin es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95C que producen la rotura de los puentes de hidrgeno intercatenarios y por lo tanto la separacin de ambas cadenas. Para conseguir la completa separacin de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse rpidamente, evitando as una eficiente hibridacin de los primers y una posterior extensin. HIBRIDACIN: Esta fase se denomina tambin fase de annealing o de emparejamiento. Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que se pueda producir la unin de los primers a las secuencias del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusin depende de varios factores y es relativamente especfica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son crticas en la designacin de los parmetros de una amplificacin. EXTENSIN: Durante este paso la polimerasa incorpora nucletidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la polimerasa alcanza su mxima actividad.

Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseo y de las caractersticas del aparato donde se realiza automticamente este proceso, el termociclador.

TERMOCICLADOR Un termociclador, tambin conocido como mquina de PCR o reciclador trmico de PCR es un aparato usado en Biologa Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reaccin en cadena de la polimerasa de amplificacin de ADN. Sin embargo, el uso de los termocicladores tambin es til no slo en procesos de PCR. Su utilidad es igual de buena en estudios con enzimas de restriccin que necesitan actuar a ciertas temperaturas un determinado perodo de tiempo. De esta forma se controlan perfectamente las condiciones en las que sucede la reaccin. Los termocicladores no son ms que aparatos que pueden ser programados para generar ciclos de temperatura a nuestro gusto. De esta forma podremos disear programas especficos para poder amplificar fragmentos de ADN determinados. Simplemente son aparatos que contienen una termoplaca, donde se colocan las muestras, y que es controlada mediante un software informtico.

Desde hace algunos aos varias compaas que fabrican y comercializan estos aparatos utilizan la tecnologa Peltier aprovechando las propiedades de los semiconductores. Este material ofrece mejor uniformidad en la temperatura y rampas de incremento y decremento de la temperatura mucho ms pronunciadas, obteniendo mejores resultados en los procesos del PCR. En la bsqueda de mejorar la precisin, exactitud y homogeneidad de la temperatura tambin se han introducido metales como el oro, la plata y otras aleaciones en los bloques de los pozos, logrando estabilidad y reproducibilidad en los ensayos.

CMO SE MEJOR EL MECANISMO? Existen elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque algunos autores han recomendado el uso del DMSO y del glicerol, el ms extendido y utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la polimerasa. 4

UTILIDADES Deteccin de mutaciones: La tcnica de PCR nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea as en la secuenciacin de ADN como un mtodo de diagnstico: Una vez que se ha caracterizado la relacin con una enfermedad de una determinada mutacin puntual o de una pequea puede desarrollarse un mtodo de deteccin rutinario, la secuenciacin automtica puede implementarse como mtodo de screening para la localizacin de nuevas mutaciones. Secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especmenes de museos y descubrimientos arqueolgicos en los cuales la mayora de las molculas estn daadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciacin. Diagnstico prenatal/Diagnstico preimplantacin: diagnstico de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in Vitro. Una o dos clulas del preembrin se retiran en el estado de ocho a diecisis clulas, previo a la implantacin. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes especficos y as estudiar la enfermedad gentica o el sexo. Secuenciacin de ADNs fsiles: El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especmenes de museo y descubrimientos arqueolgicos en los cuales la mayora de las molculas estn daadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciacin. Identificacin de especies y Control de cruzas entre animales: Las tcnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie mas barata a los precios de otra mas cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, auque sean cercanas entre s, y bastante conservadas dentro de la misma especie. Proyecto Genoma Humano: El proyecto genoma humano es un proyecto Internacional cuyo objetivo final es obtener una descripcin completa del genoma humano a travs de la secuenciacin del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear. Desde su inicio el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios mdicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen humano. Esta informacin proporciona una capacidad de diagnstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad adems de proporcionar un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, adems de nuevas estrategias para la terapia gnica.

BIBLIOGRAFA http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa#Optimiza ci.C3.B3n_de_la_PCR http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20caden a%20de%20la%20polimerasa.pdf http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/forensetec.htm http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml http://blogdelaboratorio.com/tag/termociclador/ http://es.wikipedia.org/wiki/Termociclador http://www.google.es/url?sa=t&rct=j&q=bsa%20pcr&source=web&cd=2&ved=0CEYQF jAB&url=http%3A%2F%2Fbiology.uprm.edu%2Flabs%2Fgenetica%2Fpcr.ppt&ei=lIaST9j fCOnE0QWvwd3jAQ&usg=AFQjCNHX647Puzu1mI-SHR5gLZW4Rgk3-g http://aportes.educ.ar/quimica/nucleo-teorico/estado-del-arte/de-como-construirmiles-de-moleculas-de-adn-la-reaccion-en-cadena-de-lapolimerasa/el_mecanismo_de_la_pcr.php