MEJORAMIENTO GENTICO MEDIANTE INDUCCIN DE MUTACIONES. Enrique Surez Crestelo. Instituto de Investigaciones del Arroz (IIArroz).

Autopista del Medioda, Km. 16 1/2, Bauta, La Habana, Cuba. E.mail: enrique@iiarroz.cu. Las mutaciones son fuente de variabilidad gentica en los organismos. La variabilidad causada por las mutaciones inducidas no es esencialmente diferente de la causada por las mutaciones espontneas durante la evolucin. El uso directo de las mutaciones es una herramienta muy valiosa para el mejoramiento de plantas, particularmente cuando se desea mejorar uno o dos caracteres fcilmente identificables en una variedad bien adaptada. Los principales mtodos de utilizacin de las mutaciones en el mejoramiento de plantas son las siguientes. I. Uso de mutaciones puntuales. 1. Plantas autogamas. a) Uso directo de de las mutaciones: uso de los mutantes como variedades. b) Mejoramiento por cruzamientos con mutantes. Cruce de un mutante con el parental. Cruce de diferentes mutantes del mismo parental. Cruce de diferentes mutantes de diferentes parentales. Cruce de un mutante con una variedad o lnea diferente. 2. Plantas alogamas: induccin de mutaciones para incrementar la variabilidad. 3. Mejoramiento de la heterosis: induccin de mutaciones en lneas mejoradas. Induccin de esterilidad masculina. II. Uso de mutaciones cromosomicas. 1. Uso de translocaciones: para transferir caracteres de otras especies y gneros. 2. Uso de translocaciones (con puntos de rompimiento conocidos) para la produccin duplicaciones dirigidas. 3. Diploidizacin de poliploides. III. Uso de agentes mutagnicos para mejoramiento. 1. Uso de radiacin para producir haploides. problemas especficos de

2. Uso de mutgenos para incrementar o reducir la frecuencia de quiasmas. 3. Uso de radiacin para la produccin de sexualidad transitoria en apomcticos. 4. Uso de radiacin para reducir incompatibilidad en cruces alejados. 5. Uso de mutaciones inducidas para estudios especficos de los procesos genticos, fisiolgicos, morfolgicos y bioqumicos en las plantas. En el mejoramiento mediante induccin de mutaciones se utilizan bsicamente dos tipos de agentes mutagnicos. 1. Mutgenos qumicos. El nmero de mutgenos qumicos es muy grande y continuamente se est incrementando, sin embargo para propsitos de mejoramiento en plantas cultivadas solo unos pocos son realmente tiles. La mayora de ellos pertenecen al grupo de los agentes alquilantes y dentro de ellos se pueden sealar los siguientes: metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de dietilo (dES) y a los compuestos nitrosos como la N-metil-N-nitrosourea (MNH). Una sustancia qumica de interesantes caractersticas, cuya utilizacin como inductor de mutaciones es la azida sdica. Los principales grupos de mutgenos qumicos son los que se relacionan: a). Anlogos de bases. b). Antibiticos. c). Agentes alquilantes. d). Otros compuestos. 2. Radiacin mutagnica. En los ltimos aos existe la tendencia a incrementar el uso de las radiaciones sobre los mutgenos qumicos. Los principales tipos de radiacin son los siguientes: a) Rayos X. b) Radiacin Gamma: Cesio137 y Cobalto60 las principales fuentes de rayos Gamma utilizados en trabajos de radiobiologa. El Cesio137 es usado en muchas instalaciones teniendo en cuenta que tiene una vida media ms larga que el Cobalto60. c) Radiacin Ultravioleta: Tiene limitada habilidad de penetracin en los tejidos por lo que su uso en experimentos biolgicos est restringido al tratamiento de esporas o granos de polen. d) Radiacin Beta: Las partculas Beta (electrones) como de 32P y 35S producen un efecto similar a aquellos rayos X o Gamma, pero con ms baja habilidad de penetracin. e) Neutrones: Tienen un amplio rango de energa y son obtenidos de la fisin nuclear en un reactor nuclear con 235 U. Los neutrones han mostrado ser muy efectivos en la induccin de mutaciones en plantas.

f) Partculas de aceleradores: Protones, deuterones, partculas alfa. Se ha utilizado bsicamente para estudios fundamentales en la determinacin de los efectos radiobilgicos.

Objetivos de la induccin de mutaciones. Un programa de mejoramiento por induccin de mutaciones exitoso debe tener claramente definidos los objetivos con relacin a los tipos de mutantes buscados. Los principales objetivos que se deben ser los siguientes: 1. Mejorar una o pocas caractersticas de una variedad o lnea. 2. Inducir un marcador morfolgico (color, aristas, etc) para establecer la identidad de una lnea promisoria para su registro como variedad. 3. Inducir esterilidad masculina o restaurar la fertilidad en lneas para la produccin de hbridos. 4. Obtener dentro de genotipos bien adaptados mutantes para caractersticas de herencia simple tiles para el mejoramiento o para inducir mutaciones posteriormente. Criterios de seleccin de los parentales. Para seleccionar la variedad parental que ser usada el mejorador debe tener en cuenta lo siguiente: 1. Reducir la probabilidad de introducir variabilidad debido a mezclas o cruzamientos. 2. La variedad parental usualmente debe ser: Un cultivar recin liberado. Una lnea avanzada promisoria a punto de ser liberada. Una lnea avanzada promisoria o una variedad introducida que no puede ser liberada por una limitacin especfica. 3. Procedencia de la semilla. Preferentemente se debe usar semilla original o bsica para evitar la contaminacin. Si no se dispone de semilla de calidad se debe incrementar el rea de control no tratado para comparar y eliminar las mezclas. Dosis y mutgenos a emplear. Lo recomendado es utilizar dos tipos diferentes de mutgenos y tres dosis de cada uno de ellos ms el control no tratado. Normalmente las dosis seleccionadas en cereales causan entre el 30 y el 50 % de reduccin del crecimiento en las pruebas de laboratorio. Cuando se usan radiaciones densamente ionizantes las dosis deben estar entre el 15 y 30 % y con mutgenos qumicos entre el 10 y 30 %. Poblacin M1.

Existen estimados para establecer el nmero de semillas a tratar. Asumiendo un 90 % de probabilidad de xito en la obtencin de un mutante, ocurriendo a una frecuencia de 1x10-3 por unidades tratadas y que cada planta debe producir tres unidades, la cantidad de semillas a ser tratadas en la M1, considerando un 80 % de sobrevivencia, debe ser 600 semillas. No obstante, teniendo en cuenta los errores que pueden producirse en la estimacin de las frecuencias, la severidad del tratamiento, etc. es mejor tratar aproximadamente 10 veces ms o sea unas 6000 semillas. Generalmente se considera que los hijos primarios son los que presentan el mayor potencial de variabilidad gentica inducida. En la generacin M1 se debe cosechar una pancula del hijo primario, aunque esto depender de la densidad y el tamao de la poblacin. Poblacin M2. El manejo de la poblacin M2 depender de muchos factores entre los que se encuentran los siguientes: Cosecha de la M1: masal, por pancula, una sola semilla por pancula, etc. El tamao de la poblacin M2 est relacionado con el carcter buscado. Existen caracteres que son comunes como altura de la planta, ciclo vegetativo, etc., mientras que otros son muy raros como resistencia a insectos y enfermedades. En Cuba normalmente utilizamos entre 10 000 y 15 000 para caracteres comunes y ms de 20 000 y hasta 40 000 plantas M2 en caracteres ms difciles de encontrar. Aunque normalmente se considera que la generacin M2 es crtica para la seleccin, tambin la generacin M3 es de gran importancia teniendo en cuenta que aparecern mutantes que no se expresaron en la M2. MEJORAMIENTO GENTICO DEL ARROZ MEDIANTE INDUCCIN DE MUTACIONES EN CUBA. La induccin de mutaciones en el mejoramiento gentico de los cultivos es una tcnica bien establecida para suplementar la variabilidad gentica existente en el germoplasma. En los ltimos aos se ha avanzado mucho en este campo y cientos de mutantes han sido liberados como nuevos cultivares. En arroz, Micke et al. (1990) reportaron la liberacin, hasta ese momento, de 251 nuevas variedades de arroz, desarrolladas con el uso de las mutaciones inducidas. El Programa de Mejoramiento Gentico del Arroz en Cuba desde su establecimiento a inicios de la dcada del 70, ha utilizado bsicamente la hibridacin como fuente de creacin de variabilidad gentica para la obtencin de nuevos cultivares. En 1989 se inici un programa de mejoramiento mediante la induccin de mutaciones con el objetivo de mejorar algunos caracteres muy especficos en variedades con un comportamiento general aceptable.

MATERIALES Y MTODOS Esquema de mejoramiento utilizado Semillas de la variedad seleccionada son irradiadas y sembradas en el campo para desarrollar la generacin M1 en la cual es cosechada una pancula por planta para conformar la generacin M2. Esta es sembrada en semilleros y trasplantada al campo a los 20 25 das de germinada. En esta generacin se realiza la seleccin por planta en dependencia de los objetivos de trabajo. En la generacin M3, la semilla de cada planta M2 seleccionada es sembrada en surcos de 5 m de longitud y separados 30 cm entre si. A partir de esta generacin el programa contina con las evaluaciones en los diferentes estudios hasta la liberacin de una nueva variedad. Variedades empleadas La seleccin de la variedad para la irradiacin depende del carcter que se pretende mejorar. En todos los casos se debe seleccionar una variedad con un comportamiento general satisfactorio y donde slo sea necesario mejorar uno o dos caracteres. En el desarrollo del programa han sido empleadas siete variedades cuyas principales caractersticas, as como los objetivos perseguidos con la irradiacin, aparecen descritas en la tabla 1. Tabla 1. Variedades empleadas en el mejoramiento por induccin de mutaciones
Variedad Tipo Potencial de Rendimiento Maduracin Objetivo

J 104 ECIA 91 ( 6104) Basmati 370 Gloria Caribe 7 IACuba 19 LC 88-66

Indica semienana Indica semienana Indica alta Indica alta Indica alta Indica semienana Indica intermedia

Alto Alto Bajo Bajo Alto Alto Alto

Media Media Media Media Sensible al fotoperodo Media Media

Calidad del grano Maduracin temprana Calidad del grano Maduracin temprana Reduccin de la altura Reduccin de la altura Insensibilidad al fotoperodo Calidad del grano Calidad del grano

Fuentes y dosis de irradiacin

Se usaron dos fuentes de radiacin diferentes: Rayos gamma de Co60 y neutrones rpidos de 14 Mev. La radiosensibilidad de las variedades fue determinada midiendo la altura a los 21 das despus de la germinacin en plntulas procedentes de semillas irradiadas y no irradiadas (control) y se calcul la reduccin del crecimiento. Las dosis de irradiacin determinadas se encuentran entre 200 - 350 Gy para rayos gamma y de 20 30 Gy para neutrones rpidos. Estas dosis se corresponden con una reduccin del crecimiento del 10 30 %. RESULTADOS Y DISCUSIN Variabilidad gentica creada En el cultivar J 104 los objetivos de trabajo estaban encaminados a la obtencin de mutantes con buena calidad del grano y con maduracin ms temprana. Los resultados mostraron una mayor variabilidad que la esperada. En la generacin M2 se seleccionaron 449 plantas, de ellas 439 presentaban granos estrechos y cristalinos, as como maduracin ms temprana que la variedad parental, mientras que las 10 restantes posean tipo de planta compacto. ( tabla 2). A partir de la generacin M3 y hasta M6 fueron seleccionadas 458 lneas mutantes para los estudios observacionales y 41 de ellas han sido estudiadas en los ensayos regionales en diferentes localidades del pas. En condiciones de salinidad en Jucarito, provincia Granma se evaluaron 1 300 lneas M3 originadas a partir del tratamiento con rayos gamma de Co60 a las dosis de 200 y 300 Gy. En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos por las lneas ms promisorias, que an permanecen en estudio. Tabla 2. Mutantes inducidos de la variedad J 104
No. plantas seleccionadas Tipo de Seleccin Grano largo Grano Grano y estrecho largo y estrecho grueso

Tratamiento

Precoces

Planta compacta

Neutrones 20 Gy Neutrones 30 Gy Gamma 200 Gy Gamma 300 Gy Total

79 77 133 160 449

42 44 24 31 141

69 71 109 114 363

16 16

2 4 6

7 2 1 10

Tabla 3. Lneas mutantes con tolerancia a la salinidad

Lneas J 104-N2-C53-2 J 104-G3-291-4-2 J 104-N2-59-5 J 104-N3-C107-2 J 104-G3-291-5 J 104 Rendimiento Seca Lluvia Ciclo Seca Lluvia Sales totales (ppm) Agua Suelo % Na Resistencia Sal T.o P.g % Granos enteros

4.6 4.7 4.7 4.3 4.1 2.9

3.2 3.1 3.3 3.1 3.2 2

149 151 143 150 143 147

121 120 120 127 117 122

1200 1200 1200 1200 1200 1200

2000 2000 2000 2000 2000 2000

3-10 3-10 3-10 3-10 3-10 3-10

R R R R R R

R R MR MR R MR

MR MR MR MS MR MR

56.6 55.8 56 55.4 56 49.7

Una caracterizacin completa de 22 mutantes precoces de la variedad J 104 fue realizada por Surez et al. (1998) encontrndose diferencias entre 10 de los mutantes caracterizados y la variedad J104, en lo relacionado al ciclo biolgico y la resistencia a Tagosodes orizicolus y al virus de la Hoja Blanca. (tabla 4). Tabla 4. Caractersticas de los mutantes precoces que combinan resistencia a Tagosodes orizicolus y el virus de la Hoja Blanca.
Nombre o Cdigo Dosis de neutrones rpidos Caractersticas del grano Long. Gros. % Seca Lluvia Seca Lluvia Seca Lluvia (mm) (mm) Crist Ciclo (das) Rendimiento Peso de 1000 (t/ha) granos (g) Resistencia T.o H.B

2980 20 Gy 101 93 3.2 5.9 29.7 27.4 7.5 2.2 95 R 3034 30 Gy 103 94 4.2 3.8 28.2 29.7 7.8 2.2 100 R 3035 30 Gy 102 93 4.9 5.3 30.0 29.3 7.8 2.2 100 R 3036 30 Gy 102 93 4.6 5.2 29.3 28.0 7.4 2.3 100 R 3039 30 Gy 104 94 4.8 4.0 30.4 29.1 7.7 2.2 100 R 3040 30 Gy 105 94 4.4 5.0 29.7 29.3 7.7 2.2 100 MR 3043 30 Gy 106 94 4.5 4.3 30.1 29.5 7.6 2.3 100 MR 3050 30 Gy 106 94 5.6 3.8 27.6 29.3 7.7 2.3 100 MR 3054 30 Gy 106 94 5.4 3.8 28.8 28.1 7.6 2.2 100 MR 3056 30 Gy 100 94 4.2 4.0 29.7 27.8 7.5 2.2 100 MR J 104 152 121 10 4.5 31.7 31.2 7.7 2.5 29.2 MS Leyenda: % Crist= % de cristalinidad T.o= Tagosodes orizicolus H.B= virus de la Hoja Blanca

MR MR MR MR MR MR MR R R MR S

Teniendo en cuenta que unos de los objetivos principales era el mejoramiento de la calidad del grano, en 1996, fueron evaluados 122 mutantes para contenido de amilosa, temperatura de gelatinizacin, cristalinidad de los granos y tipo de grano. Se observ una amplia variabilidad para todos los caracteres estudiados excepto para el tipo de grano ya que en la generacin M2 slo se haban seleccionado plantas con grano largo y estrecho (Surez et al., 1999). En el caso de las variedades Basmati 370 y Gloria, la irradiacin se realiz en el ao 1993 y el objetivo principal consista en la reduccin de altura de la planta, manteniendo las caractersticas de calidad del grano de ambas variedades. En la generacin M2 (tabla 5) fueron seleccionadas 153 plantas de las cuales 91 fueron semienanas y 62 intermedias. A partir de este material fueron seleccionadas en la generacin M3 58 lneas de Basmati 370 y 13 de Gloria. En los estudios de observacin del rendimiento se evaluaron 34 lneas de Basmati 370 y Gloria. Las lneas seleccionadas han mantenido las caractersticas de calidad del grano de las variedades parentales, con mayor resistencia al acame y mayor potencial de rendimiento agrcola. Tabla 5. Mutantes inducidos de las variedades Basmati 370 y Gloria. Tratamiento Co60 Basmati 370 200 Gy Basmati 370 300 Gy Gloria 200 Gy Gloria 300 Gy Total No. plantas seleccionadas 73 42 22 16 153 Semienanas 38 23 19 11 91 Intermedias 35 19 3 5 62 Precoces 6 8 2 5 21

La irradiacin de la variedad Caribe 7 se realiz en 1995 y el objetivo estaba dirigido a obtener mutantes insensibles al fotoperodo y que mantuvieran el resto de las caractersticas de la variedad original. Los resultados de la generacin M2 (tabla 6) muestran que fueron seleccionadas un total de 339 mutantes insensibles al fotoperodo. En la generacin M3 (datos no mostrados) se evaluaron slo 289 mutantes ya que las 50 lneas que presentaban alta esterilidad fueron eliminadas. Se encontr una amplia variacin en el peso de los granos y en el ciclo vegetativo, mientras que para tipo de grano y tipo de planta predominaron las formas parentales (Surez et al., 2000) Tabla 6. Mutantes inducidos de la variedad Caribe 7, sensible al fotoperodo Tratam. Insensible al Ciclo precoz Tipo de Peso de Tipo de Estriles

Co 60 250 Gy 300 Gy 350 Gy Total

fotoperodo 29 178 132 339

( < 120 das) 0 29 17 46

grano 15 15 13 43

1000 granos 12 81 66 159

planta 11 33 8 52

2 32 16 50

En la variedad ECIA 91 (6104) irradiada con neutrones rpidos en 1991, los resultados no fueron tan espectaculares como en el resto de las variedades utilizadas. Sin embargo, han sido estudiadas en ensayos de observacin del rendimiento 18 lneas, de las cuales 7 permanecen en estos estudios y 2 pasaron a los estudios regionales. Seleccin de progenitores El mejoramiento gentico a travs de la induccin de mutaciones no slo persigue la liberacin directa de mutantes como variedades comerciales, ya que la seleccin de progenitores para ser empleados en los Programas de Cruzamiento tambin reviste una gran importancia. En la tabla 7 se muestran los cruzamientos realizados utilizando mutantes obtenidos por el Programa de Mejoramiento. Especial nfasis se ha puesto en los cruzamientos que involucran a los mutantes que presentaron resistencia al virus de la Hoja Blanca, tolerancia a la salinidad y buena calidad del grano, atendiendo a la escasez de fuentes de resistencia y a lo complejo del mejoramiento en estos caracteres. Tabla 7. Cruzamientos realizados con mutantes Variedad parental J 104 Gloria Basmati 370 Total Variedades obtenidas Otros de los resultados importantes del programa de mejoramiento mediante la induccin de mutaciones, iniciado en 1989 ha sido la obtencin de nuevas variedades para su liberacin como variedades comerciales para la produccin nacional. Cruces simples 439 129 42 610 Cruces mltiples 269 65 9 343 Total 708 194 51 953

Tabla 8. Variedades obtenidas a travs de la induccin de mutaciones en el cultivar J 104 Nombre IACuba 21 IACuba 22 IACuba 23 IACuba 27 Ciclo a Maduracin Medio Medio Medio Corto

Principales caractersticas Resistencia a Pyricularia grisea Buena calidad del grano Alto potencial de rendimiento agrcola Tolerancia a las bajas temperaturas Alto `potencial de rendimiento en condiciones de bajos insumos Buena calidad del grano Tolerancia al sndrome del vaneado del grano Buena calidad del grano Tolerancia al sndrome del vaneado del grano Resistencia a Pyricularia grisea.

IACuba 28

Medio

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Manual on Mutation Breeding. Second Edition. IAEA, Vienna, 1977. STI/DOC/10/119. 2. Matsuo T.; Y. Futsuhara; F. Kikuchi and H. Yamaguchi (Editores). (1997). Science of the rice plant. Volume Three. Genetics. Food and Agricultura Policy Research Center. Tokio. 3. Micke, A.; B. Donini; M. Maluszynski. (1990). Induced mutations for crop improvement. Mutation Breding Review No. 7. 4. Surez E.; J. E. Deus; R. Prez; H. Mesa; Ana Adelfa Hernndez. (1998). Obtencin de progenitores precoces de arroz (O. sativa L.) a travs de la induccin de mutaciones. Libro de Resmenes del Encuentro Internacional de Arroz. La Habana: Instituto de Investigaciones del Arroz, 9-11 de junio de 1998. p. 173. 5. Surez E.; J. E. Deus; H. Mesa; S. Rodrguez y J. Reinoso. (1999). Evaluacin de algunos caracteres relacionados con la calidad industrial y de coccin del grano en mutantes de arroz (O. sativa L.) de la variedad J 104. Memorias Trpico 99. La Habana: Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical, 29 de Marzo al 2 de Abril de 1999. P. 376. 6. Surez E.; J. E. Deus ; H. Mesa y Edelis Perdomo. (2000). Obtencin de mutantes de arroz (O. sativa L.) insensibles al fotoperodo. Revista Cubana del Arroz 2 (2): 17-20.