APNDICE

PREPARACIN DE COLORANTES Hemalumbre de Sass 1. Disuelva 20 g de alumbre de potasio en un litro de agua hirviente. 2. Agregue 1 g de cristales de hematoxilina a la solucin anterior; retire del calor cuando se haya disuelto. 3. Agregue 0.2g de yodato de sodio (NaIO3). El colorante est listo para usarse de inmediato. En caso de que se forme una pelcula de aspecto metlico en la superficie, filtre la solucin. El colorante se desintegra gradualmente y debe volver a prepararse cada dos o tres meses. Hematoxilina de Harris Hematoxilina 0.5g Sulfato de aluminio y amonio 0.3g Etanol al 50% 100cc xido de mercurio 0.6g HCl concentrado 1 gota La hematoxilina y el alumbre se disuelven en etanol por calentamiento; a esa solucin se le agrega el oxido de mercurio y se hierve durante 30 minutos. Se filtra, se enfra y se agrega etanol al 50% hasta recuperar el volumen original. Se adiciona el cido clorhdrico. Fucsina bsica y Verde de metilo Solucion de fucsina bsica Fucsina bsica 1g Etanol al 50% 100cc Solucion de verde de metilo Verde de metilo 1g Etanol al 50% 100cc Algunos colorantes artificiales y Sus solventes Colorante Fucsina cida Cristal Violeta Verde rpido Safranina O Agua + + + Etanol (%) 70 96 30 a 96 Metilcelosolve + + +

La concentracin de los colorantes en agua y en etanol vara, por lo general, entre 0.1 y 1%. En metilcelosolve se prefiere soluciones saturadas.

Colorante Fabil La jalea de glicerina se prepara de la manera siguiente: 1. Mezcle 10 g de gelatina, 1g de fenol y 45 ml de glicerina. 2. Deje reposar esta mezcla durante 12 horas a temperatura ambiente. 3. Adale 45 ml de agua y djela fundir a 60C durante 3 a 12 horas. Envsela y enfrela. La solucin colorante se elabora as: 1. Solucin A: disuelva 0.3g de azul de anilina en 60cc de lactofenol (volmenes iguales de glicerina, fenol, cido lctico y agua). 2. Solucin B: mezcle 0.1g de fucsina bsica con 20cc de lactofenol. 3. Solucin C: disuelva 0.2g de yodo metlico y 0.4g de yoduro de potasio en 66.6cc de lactofenol. 4. Mezcla colorante: 4cc de A, 1cc de B y 5cc de C. Azul de toluidina O Azul de toluidina O 0.05g Buffer de citrato-fosfato 100cc O agua destilada (pH=4.4) Negro de clorazol E Negro de clorazol E 0.1 a 1g Etanol al 50% 100cc Filtre la solucin y sela. Cristal de violeta Cristal violeta 1g Agua destilada 100cc Hierva y filtre la solucion; djela reposar una semana antes de usarla. Reactivo de Schiff Disuelva 0.5g de fucsina bsica en 100cc de agua destilada hirviente. Agite vigorosamente y enfre a 50C. Filtre a travs de dos capas de papel filtro no. 1 y agregue al filtrado 1.5cc de HCl 1N(82.5cc de HCl conc. Aforado a un litro). Agregue 1.5g de K2S2O5 (metabisulfito de potasio) y permita que la solucion repose ( en una botella bien tapada) en la oscuridad durante toda la noche o hasta que aparezca un color paja claro o rosa palido. Si no se decolora por completo, agregue 500mg de carbn activado, agite 2 min. Filtre; si es necesario, repita este ultimo paso. Conservela en una botella ambar o envuelta en papel aluminio y refrigerada. Acetocarmn Agregue 0.5 de carmn a 100cc a una solucion hirviente de acido actico al 45% y dejar que hierva durante1 o 2 min. o hasta que haya un cambio repentino a un color mas oscuro. Enfre y filtre la solucion. Para obtener resultados ms consistentes en la tincin, hierva a fuego lento el actico y el carmn en un matraz con un condensador de reflujo, durante 6 a 8 horas. Enfre, filtre y gurdela en

una botella ambar. Para ciertas especies, como el maz, la solucion se diluye con actico al 45%; el acido propionico puede sustituir al actico. Este colorante necesita que se usen agujas ligeramente oxidadas para proporcionar fierro y obtener una coloracin optima con algunos materiales. Para preparar carmn de fierro adicionado, se sugiere lo siguiente: a la mitad del acetocarmn enfriadoy filtrado como se indicao anteriormente, se le agregan unas cuantas gotas de una solucion de cloruro de o hidrxido de fierro en acido aceticoal 45% hasta que el colorante se torne de color rojo azulado, pero sin precipitado visible. Despus se agrega el resto del acetocarmn no tratado. Cuando se usa el acetocarmn ferrico, deben emplearse agujas inoxidables. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Solucin amortiguadora de acetato (pH 4.0 6.2) Soluciones madre: Acido actico 1 M (CH3 COOH). Acetato de sodio 1 M (CH3 COONa .3H2O) Las siguientes cantidades de X cc de A + Y diluidos en 100cc, dan los pH deseados a 0.1M con respecto al acetato total. X 8.52 7.48 6.96 5.92 4.76 3.65 y 1.48 2.16 3.04 4.08 5.24 6.35 pH 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 x 2.66 1.87 1.27 0.84 0.55 0.34 y 7.34 8.13 8.73 9.16 9.45 9.66 pH 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2

Solucion amortiguadora de citrato (pH 4.0-6.2) Soluciones madre: Acido ctrico 0.1M (21.01g de C3H4(OH) (COOH)3 . H2O Citrato de sodio 0.1M (29.41 g de C6H5O7Na3 . 2H2O en un litro). Las siguientes cantidades de x cc de A + y cc de B diluidos en 100cc dan los pH que se indican. X Y pH X Y pH 33.0 17.0 4.0 18.0 32.0 5.2 31.5 18.5 4.2 16.0 34.0 5.4 28.0 22.0 4.4 13.7 36.3 5.6 25.5 24.5 4.6 11.8 38.2 5.8 23.0 27.0 4.8 9.5 41.5 6.0 20.5 29.5 5.0 7.2 42.8 6.2

Solucin amortiguadora de acido ctrico y fosfato (pH 4.0 a 7.2) Soluciones madre: Acido ctrico 0.1M (2.1 g de C6H8O7 . H2O en 100 cc de agua destilada). Fosfato dibasico de sodio (1.19 g de Na2HPO4 . 2H2O en 100 cc de agua destilada). Las siguientes cantidades de x cc de A + y cc de B proporcionan los pH indicados. x y pH 61.45 38.55 4.0 55.9 44.1 4.4 50.7 49.3 4.8 46.4 53.6 5.2 42.0 58.0 5.6 36.85 63.15 6.0 30.75 69.25 6.4 22.75 77.25 6.8 18.15 81.85 7.0 13.05 86.95 7.2 Solucin amortiguadora de fosfato (pH 5.7-8.0) Soluciones madre: Fosfato monobsico de sodio, 0.2M (27.6 g/l de NaH2 PO4 . H2O). Fosfato dibasico de sodio, 0.2M (53.65 g/l de Na2HPO4 . 7H2O). Las siguientes cantidades de x cc de A + y cc de B proporcionan los pH indicados: x y pH x y 93.5 6.5 5.7 45.0 55.0 92.0 8.0 5.8 39.0 61.0 90.0 10.0 5.9 33.0 67.0 87.7 12.3 6.0 28.0 72.0 85.0 15.0 6.1 23.0 77.0 81.5 18.5 6.2 19.0 81.0 77.5 22.5 6.3 16.0 84.0 73.5 26.5 6.4 13.0 87.0 68.5 31.5 6.5 10.0 90.0 62.5 37.5 6.6 8.5 91.5 56.5 43.5 6.7 7.0 93.0 51.0 49.0 6.8 5.3 94.7

pH 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0

MEDIOS PARA PREPARACIONES SEMIPERMANENTES Lactofenol Fenol (carbol) derretido Acido lctico Glicerina agua Lactofenol con colorante Lactofenol acido actico glacial Colorante al 1% (azul de anilina ; fucsina acida, etc.) Fenol-glicerina Gelatina Agua (35C) Glicerina Fenol (carbol), disuelto en 10 gotas de agua 5g 30cc 35cc 5g 100cc 0 a 20 cc 1 a 5 cc 20cc 20cc 40cc 20cc

Primero disuelva la gelatina en el agua tibia y agregue despus los dems ingredientes. MEZCLA DE PARAFINA PARA CORTES MICROTOMICOS Mezcla final Parafina Mezcla de hule y parafina Cera de abeja 100g 4 a 5g 1g

Los ingredientes se calientan hasta que estn humeando; se dejan enfriar hasta que empiecen a solidificarse y despus se decantan en un molde para placas delgadas. Mezcla de hule y parafina Disuelva 20g de hule crudo en 100g de parafina humeante, agite bien y proceda igual que la mezcla anterior.