Вы находитесь на странице: 1из 55

BIOLOGIA CELULAR

Guia das aulas prticas


2011/2012

BC 2011/12

Programao das aulas prticas BC 2012


27/2-2/3 5/3-9/3 12/3-16/3 19/3-23/3 26/3-30/3 2/4-6/4 Pscoa 2a Prep. solues. Relatrio etc. Fermentao Fluxo de protes I Fluxo de protes I 1 maio 3a Microscopia tica de campo claro. Observao de diferentes tipos de clulas: eucariticas (animal e vegetal) e procaritica. Microscpio de contraste de fase. Medies de clulas e estruturas observadas ao microscpio tico.

Observao de mitose em pices radiculares de Allium cepa. Observao de meiose em anteras de Aloe sp. Espectrofotometria. Pedir planeamento do trabalho da fermentao. Pscoa Preparao de solues e correo das tabelas fermentao. Elaborao de um relatrio/artigo cientfico. Fermentao alcolica em leveduras. 25 abril 4a Fluxo de protes em tilacoides isolados I Semana Acadmica Fluxo de protes II Dvidas / discusso de resultados. Ultraestrutura celular. Entrega de relatrio (3valores). 2a 3a 9 10 h Avaliao TP Bioqumica 4a 14 15 h T1* 15.30 - 16.30h T2* Avaliao TP Biologia 5a 6a

9/4-13/4 16/4-20/4 23/4-27/4 30/4-4/5 7/5-11/5 14/5-18/5 21/5-25/5 28/5-1/-6 4/6-6/6

N de aulas previstas: 11 aulas + avaliao. Limite de faltas : 3 * T1 Turno 1 Alunos at Jos Miguel Alves Peixoto (inclusive). T2 Turno 2 A partir de Jos Miguel Morim Rocha (inclusive). Exames: poca normal 19 de Junho (3 feira), poca de recurso 9 de Julho (2 feira). 2

BC 2011/12

BC 2011/12

Unidade I Microscopia tica


Microscpio tico de campo claro

lentes oculares

tubo

revlver e lentes objetivas

coluna

Platina com rguas graduadas

Microscopia ptica-2

parafusos macromtrico e micromtrico

Condensador, diafragma ris e parafusos de alinhamento parafusos para movimentar a preparao

Fonte luminosa e respetivo diafragma

restato

Figura I.1 Microscpio de campo claro utilizado nas aulas prticas.

Ampliao total do microscpio = ampliao da objetiva x ampliao da ocular A qualidade final da imagem ampliada vai depender da resoluo do microscpio, ou seja, da sua capacidade para distinguir pontos muito prximos. O poder resolvente de um microscpio depende das caractersticas do seu sistema de lentes. O limite de resoluo a menor distncia a que devem estar dois pontos do objeto para que eles apaream individualizados na imagem. O limite de resoluo (d) quantificado pela equao de Abbe:

d=k

AN

- comprimento de onda da luz incidente AN - abertura numrica da objetiva (AN = n sen ) n - ndice de refrao do meio entre o objeto e a objetiva sen - seno do semi ngulo de abertura da objetiva k = 0,61 4

BC 2011/12

Instrues para o manuseamento do microscpio


1 - Identifique todos os componentes do microscpio. 2 Coloque a preparao na platina e ligue a fonte de luz colocando o restato numa posio de baixa intensidade. 3 Foque a preparao: - centre o material presente na lmina com o eixo tico do microscpio - rode o revlver de forma a comear a observao com a objetiva de menor ampliao - aproxime a platina e a objetiva ao mximo - observe atravs das oculares e v afastando a platina (ou o revlver) lentamente at atingir o ponto de focagem - centre o que pretende observar e foque com o parafuso micromtrico 4 Ajuste a desigualdade de viso entre os dois olhos: - observe a preparao s com o olho esquerdo atravs da ocular esquerda e foque com o parafuso micromtrico um ponto de referncia localizado prximo do centro do campo de observao - observe agora s com o olho direito pela ocular direita e foque o mesmo ponto, no com o parafuso micromtrico, mas na prpria ocular - assim obter uma imagem focada para ambos os olhos. 5 Otimize a iluminao da preparao. Observe o que acontece luminosidade e ao contraste da imagem que observa quando: - altera a intensidade luminosa na fonte (restato) - abre o diafragma do condensador - fecha o diafragma do condensador - sobe o condensador - desce o condensador (Nota: caso a lmpada do seu microscpio possua um diafragma mantenha-o aberto.) 6 - Mudana de objetiva. Quando iniciar a observao de uma preparao deve comear sempre pela objetiva de menor ampliao e focar a imagem. Uma vez focada e centrada a imagem pode mudar para a objetiva de ampliao seguinte rodando o revlver. A imagem dever ser visvel e basta ajustar novamente o foco. Se necessitar usar a objetiva de imerso (com leo) lembre-se que no final do trabalho ter sempre que limpar a objetiva e a preparao com um papel macio.

BC 2011/12

Medio de objetos no microscpio tico


Embora a ampliao utilizada num microscpio seja conhecida, a imagem observada virtual no podendo ser feitas medies que permitam o clculo das dimenses reais dos objetos observados. Assim, a nica forma de efetuar medies ao microscpio utilizando uma escala colocada na ocular (micrmetro da ocular), que fica sobreposta imagem observada e cujas dimenses no variam com a ampliao. Para isso, utilizase uma lmina com uma escala real gravada (micrmetro da objetiva) com unidades definidas. Seguidamente calculado o valor de cada unidade (diviso) da escala do micrmetro ocular para cada uma das objetivas. Deste modo torna-se possvel determinaras dimenses do objeto observado, utilizando o micrmetro da ocular. Micrmetro da ocular um disco de vidro com uma escala gravada que colocado na ocular. Esta escala apresenta sempre o mesmo tamanho no campo de observao e fica sobreposta s imagens observadas. Esta escala utilizada para medir as dimenses dos objetos observados em n de divises do micrmetro da ocular que so depois convertidas em dimenses reais utilizando o fator de converso calculado como descrito anteriormente.

Micrmetro da objetiva uma lmina de vidro com uma escala gravada de forma extremamente precisa. utilizada para determinar o fator de converso entre as divises do micrmetro da ocular e a dimenso real gravada na lmina, para cada ampliao.

100x0.01mm = 1 mm)

Nikon - Eyepiece Reticle Calibration Interactive Java tutorial http://www.microscopyu.com/tutorials/java/reticlecalibration/index.html

BC 2011/12

Medio de objetos no microscpio tico


1. Colocar o micrmetro da ocular numa das oculares do microscpio. A sua escala

no se altera com a mudana de objetiva, sempre observada na totalidade, e no se move quando os parafusos de movimentao da preparao so acionados. Identifique-a na figura abaixo. 2. Colocar o micrmetro da objetiva na platina e focar a escala gravada no seu centro utilizando a objetiva de menor ampliao (4x). A escala do micrmetro da objetiva vai aumentando de tamanho com a ampliao utilizada e apenas observada parcialmente nas ampliaes maiores. Esta escala desloca-se quando os parafusos de movimentao da preparao so acionados. Identifique-a na figura abaixo. 3. Rodar a ocular de forma a que a escalas dos dois micrmetros fiquem paralelas. Movimentar a escala do micrmetro da objetiva at que esta fique parcialmente sobreposta escala do micrmetro da ocular e com o incio coincidente. escala do micrmetro __________________

escala do micrmetro __________________

4. 5.

Contar as divises de cada micrmetro desde o incio at ao ponto onde as duas Considerando que cada diviso do micrmetro da objetiva corresponde a 0,01 mm, ou

escalas voltam a ser coincidentes. Registar os valores na Tabela I.1. seja, 10 m, calcular a dimenso real correspondente a 1 diviso do micrmetro da ocular para a objetiva de 4x. 6. Repetir para as objetivas de 10x, 40x e 100x.

BC 2011/12

Tabela I.1 Calibrao do micrmetro da ocular para as diferentes ampliaes. N de divises micr. ocular N de divises correspondentes do micr. objetiva Dimenso de 1 diviso do micr. objetiva (m) 10 10 10 10 Dimenso de 1 diviso do micr. ocular (m)

Objetiva

5x 4x
10x 40x 100x Clculos:

2,5 1 100 10

5 1 25 1

20 10 2,5 1

BC 2011/12

Observao de diferentes tipos de clulas ao microscpio tico


a) Observe cada tipo de material biolgico ao microscpio tico utilizando diferentes ampliaes e proceda medio das clulas. b) Faa um esquema legendado das clulas incluindo todos os detalhes que possvel observar e indicando as dimenses calculadas. Observao de clulas da epiderme da cebola: 1. Colocar uma gota de gua numa lmina de vidro. 2. Destacar um pequeno pedao da epiderme da cebola e colocar sobre a gota de gua. 3. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio tico de campo claro. 4. Observar a mesma preparao no microscpio de contraste de fase e registar as diferenas relativamente ao tipo de informao que estes dois tipos de microscpios podem fornecer. Observao de clulas da planta aqutica Elodea: 1. Colocar uma gota de gua numa lmina de vidro. 2. Destacar uma folha de Elodea e coloc-la sobre a gota de gua. 3. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio tico de campo claro. 4. Observar os movimentos de ciclose do citoplasma que ocorrem nestas clulas, principalmente nas que se localizam junto nervura. Aquecer a lmina ligeiramente caso estes movimentos no sejam imediatamente evidentes. Observao das bactrias presentes no iogurte: 1. Com um palito coloque um pequeno pedao de iogurte comercial numa gota de gua previamente colocada numa lmina de vidro. 2. Mantendo a lmina bem assente sobre a mesa, homogenize o material com outra lmina, junte o material numa das extremidades da lmina de baixo e faa um esfregao fazendo deslizar a lmina que tem na mo rapidamente sobre a lmina de baixo, de forma a espalhar o iogurte numa camada muito fina. 3. Secar chama de uma lamparina. 4. Colocar uma gota de azul-de-metileno sobre o esfregao seco, cobrindo bem toda a lmina e deixar atuar. Lavar o excesso de corante com gua destilada. Secar chama e no colocar lamela. 5. Observar as bactrias do iogurte com a objetiva de imerso. Observao da cianobactria Anabaena: 1. Retirar uma gota do fundo do tubo da cultura e colocar sobre uma lmina. 2. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio tico de campo claro. 3. Identifique os dois tipos de clulas. Observao de preparaes definitivas de fgado e de cortia. 9

BC 2011/12

Material biolgico

Esquema

Ampliao objetiva

Medies

Allium cepa

Elodea

Cortia

10

BC 2011/12

Material biolgico

Esquema

Ampliao objetiva

Medies

Fgado

Bactrias do iogurte

Anabaena sp.

11

BC 2011/12

Unidade I Autoavaliao
1 Qual a relao (aumenta, diminui ou no afetado) entre o poder resolvente de um microscpio tico de campo claro e os seguintes parmetros:

Diminui comprimentos de onda ______________________________________________________ Aumenta ngulo de abertura da objetiva________________________________________________ Aumenta utilizao de leo de imerso entre a preparao e a objetiva _______________________
2 Calcule o dimetro de uma das clulas observadas na figura 1 em m sabendo que, para a objetiva utilizada, 1 diviso do micrmetro da ocular = 2 divises do micrmetro da objetiva e que 1 diviso do micrmetro da objetiva igual a 0,01mm.

Figura I.2 Imagem de clulas animais em cultura, obtida num microscpio ptico de campo claro utilizando uma objetiva de baixa ampliao. A ocular tinha acoplado um micrmetro.

40 micrmetros

3 Durante as aulas observou diferentes tipos de clulas ao microscpio ptico de campo claro. Preencha a tabela utilizando os conhecimentos adquiridos. Material biolgico Clulas de Allium cepa Clulas encontradas no iogurte Clulas de fgado Anabaena Clulas de Elodea Padro de organizao celular Organelos observados Tamanho relativo*

Eucarionte Procarionte Eucarionte Procarionte Eucarionte

Ncleo Ncleo Cloroplastos

5 1 3 2 4
12

* Represente os tamanhos por ordem de grandeza de 1 (o menor) a 5 (o maior).

BC 2011/12

Unidade II Mitose e Meiose


Os primeiros estudos de microscopia permitiram diferenciar no ciclo de uma clula duas fases fundamentais: a mitose e a interfase. Walther Fleming, em 1882, usou o termo Mitose para designar a diviso do ncleo, do grego Mitos que significa fibra, como forma de evidenciar os cromossomas visveis durante a diviso nuclear.

Figura II.1 - Ciclo celular de uma clula eucaritica superior (Alberts et al. 2005).

Error!

Zona de diviso celular da raz

Coifa

Figura II.2 Imagem de razes do bolbo de Allium cepa e corte longitudinal do pice radicular.

13

BC 2011/12

Mitose
Objetivo: Observar a mitose em clulas vegetais e identificar as diferentes fases mitticas: profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. Executar preparaes utilizando tcnicas de colorao especfica para os cromossomas. Observar as preparaes com o microscpio ptico de campo claro. Material Biolgico: pices radiculares de Allium cepa (cebola)

Tcnica para obteno de preparaes extemporneas


1 - Fixao: Fixador de Carnoy - 1 a 24 horas. 2 - Lavagem: Etanol 70% (o material pode ser conservado em etanol 70%). 3 Hidrlise (dissociao qumica): lcool clordrico (etanol 95%:HCl conc. - 1:1) - 5 min. 4 - Lavagem: Etanol 70% - 2 mudanas de 5 minutos cada. 5 - Colorao, dissociao mecnica e montagem 5.1 - Colocar o pice radicular numa lmina de vidro e seccionar a raiz ficando apenas com o pice meristemtico, de cor leitosa mais opaca (cuidado para no deixar secar coloque um pouco de etanol 70% se necessrio). 5.2 - Colocar uma gota de carmim actico ou orcena actica sobre o pice. 5.3 - Dissociar o tecido com uma agulha de disseco e deixar o corante atuar. 5.4 - Colocar a lamela cuidadosamente para evitar a formao de bolhas de ar. 5.5 - Com a lmina bem assente na mesa, absorver o excesso de corante exercendo uma ligeira presso com papel absorvente dobrado sobre a lamela. Exercer cuidadosamente presso sobre a lamela com o cabo da agulha, de modo a dissociar o tecido e expulsar as bolhas de ar.

Observao das preparaes ao microscpio


1 - Observe as preparaes extemporneas do pice radicular da cebola. 2 - Faa um esquema representativo de cada uma das fases da mitose. 3- Observe a preparao definitiva de corte longitudinal da raiz de Allium cepa. Profase Prometafase Metafase

Anafase

Telofase

14

BC 2011/12

Meiose
A Meiose ocorre em clulas diplides especializadas e em determinadas fases do ciclo de vida dos organismos. Atravs deste processo de diviso nuclear uma clula diplide origina quatro clulas haplides.

Estrutura da flor de Angiosprmicas e seco tranversal da antera

Flor de Lillium

epiderme

feixe vascular

tapete

saco polnico

15

BC 2011/12

Meiose
Objectivo: Observar meiose em clulas vegetais e identificar as diferentes fases meiticas: profase I (leptteno, zigteno, paquteno, diplteno, diacinese), metafase I, anafase I, telofase I, profase II, metafase II, anafase II e telofase II. Executar preparaes extemporneas. Observar preparaes extemporneas e definitivas em microscpio tico de campo claro. Material Biolgico: Anteras de Aloe sp.

A -Tcnica para obteno de preparaes extemporneas


1 - Fixao: Fixador de Carnoy - 1 a 24 horas 2 - Lavagem: Etanol 70% (o material pode ser conservado em etanol 70%) 3 Colorao com carmin actico ou orcena actica 3.1 Abrir uma flor sobre a lupa, destacar as anteras e colocar cada uma numa gota de corante sobre uma lmina de vidro. 3.2 - Cortar a antera transversalmente e, com a ajuda de agulhas de disseco, provocar a sada das clulas meiticas do lculo da antera (cuidado para no deixar secar). 3.3 - Passar ligeiramente a lmina chama, de modo a provocar a adeso das clulas lmina. 4 - Montagem : Cobrir com lamela e retirar o excesso de corante.

B - Tcnica para obteno de preparaes definitivas


1 - Desidratao: etanol 95% - o tempo necessrio at cair a lamela; etanol absoluto - 2 minutos 2 - Diafanizao: etanol absoluto e xilol (1 : 1) - 2 minutos, xilol - 2 minutos 3 Montagem: blsamo do Canad ___________________________________________________________________________ REAGENTES:
Fixador de Carnoy Etanol 95% ou absoluto cido actico glacial Clorofrmio Carnoy I 2 partes 1 parte ------Carnoy II 6 partes 1 parte 3 partes

Carmim Actico Dissolver 0,5 g de carmim puro em 100 ml de cido actico 45% levando ebulio, pelo menos durante 1 hora. A dissoluo deve ser feita em matraz com sistema de refrigerao associado para evitar alterao da concentrao, por evaporao. Deixar arrefecer e filtrar. Este corante de longa durao e pode ser usado diretamente ou aps diluio em cido actico 45%. Orcena Actica Dissolver 1 g de orcena em 45 ml de cido actico glacial, quase temperatura de ebulio. Deixar arrefecer, adicionar 55 ml de gua destilada e filtrar.

16

BC 2011/12

Observao das preparaes de meiose ao microscpio


Faa um esquema representativo de cada uma das fases das divises da meiose. Profase I - fases inicais Profase I - Paquteno

Profase I - Diplteno

Profase I - Diacinese

Diviso I

Metafase I

Anafase I

Telofase I*

Profase II*

Metafase II

Diviso II

Anafase II

Telofase I

* Por vezes no material vegetal no possvel distinguir estas duas fases e nessas situaes a fase de transio designa-se INTERCINESE
17

BC 2011/12

Unidade II - Autoavaliao
Porque selecionou o pice radicular para observao de ncleos em diviso?

Porque uma zona em constante crescimento e portanto as clulas __________________________________________________________________________ dividem-se mais rpido e frequentemente.
__________________________________________________________________________ Porque que a zona do pice com clulas em diviso apresenta cor leitosa mais opaca do que o resto da raiz?

As clulas do meristema do pice da cebola no possuem vacolos __________________________________________________________________________

desenvolvidos e grandes com as clulas j "matutadas", como o volume __________________________________________________________________________ destas clulas maioritariamente citosol este menos transparente.
Qual o objetivo do tratamento das razes com lcool clordrico?

O cido clordrico permite quebrar a lamela mediana e possibilita __________________________________________________________________________


__________________________________________________________________________ consecutivamente das diferentes camadas de clulas. Porque utiliza a orcena actica e/ou o carmim actico?

assim a separao das diferentes paredes celulares e

Tanto a orcena actica como o carmim actico so corantes que __________________________________________________________________________


__________________________________________________________________________ Porque utilizou anteras para observao de clulas em diviso meitica? D dois exemplos de outro material biolgico que poderia utilizar para o mesmo fim.

coram os cromossomas e portanto o ncleo da clula,

Gmetas de mamferos, etc. __________________________________________________________________________


__________________________________________________________________________ Porque no foi necessrio efetuar o tratamento com lcool clordrico na tcnica para obteno de preparaes de clulas em meiose?

Porque estas clulas no constituem um tecido rgido e j se __________________________________________________________________________ encontram mais ou menos separadas para que possam facilmente __________________________________________________________________________ espalhar-se para a polinizao.

18

BC 2011/12

Unidade III - Espectrofotometria


A espectrofotometria estuda as interaes entre a energia radiante e a matria, incidindo tanto nos aspetos qualitativos como nos quantitativos. Ou seja, a espectrofotometria permite tirar concluses sobre a natureza e composio de uma amostra desconhecida e permite, por outro lado, determinar a concentrao de uma substncia conhecida. Todas as substncias absorvem energia radiante, isto , radiaes eletromagnticas, desde as ondas de rdio at s radiaes gama (Fig. III.1), numa certa extenso. Mesmo materiais transparentes tm espectro de absoro no ultravioleta ou no infravermelho - por exemplo o vidro e a gua respetivamente.

Figura III.1 O espectro eletromagntico.

A absoro de energia por uma molcula apenas pode ocorrer quando a energia do foto incidente igual diferena de energia entre dois nveis eletrnicos, promovendo assim a transio de um eletro de um nvel de energia baixo para um mais elevado. Antes que um outro foto possa ser absorvido, o estado excitado deve perder esta energia e reverter ao estado de energia inicial.

19

BC 2011/12

Um espectrofotmetro um aparelho concebido para medir a quantidade de energia radiante absorvida por molculas em soluo. Os componentes bsicos de um espectrofotmetro so (Fig. III.2): i) uma fonte de luz policromtica, normalmente de tungstnio, para comprimentos de onda entre 350-900 nm, ou de deutrio para a regio dos UV (200-400 nm). ii) um prisma que decompe a luz e um filtro tico que permite selecionar os comprimentos de onda desejados. iii) um compartimento para alojar a amostra. iv) um detetor, normalmente um tubo fotoeltrico ou um dodo de silicone, que mede a intensidade de luz transmitida pela amostra.

Figura III.2 Esquemas do trajeto da luz num espectrofotmetro.

A razo entre a intensidade de luz transmitida depois de atravessar uma soluo colocada no aparelho - It - e a intensidade de luz na ausncia de amostra - I0 chama-se transmitncia (T):

I0

It

T = It / I0

Ao log10 da razo inversa de T chama-se absorvncia - A: A = log10 (I0 / It) = -log10 T

A transmitncia pode ter um valor entre 0 e 1 e frequentemente multiplicada por 100 sendo assim indicada como uma percentagem. A absorvncia traduz a quantidade de luz absorvida pela substncia em soluo.

20

BC 2011/12

Leis da Absoro
Lei de Lambert Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo diretamente proporcional espessura do compartimento que contm a soluo trajeto tico da luz na amostra = l (expresso em cm).

A = k l

Lei de Beer Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo diretamente proporcional concentrao do soluto = c.

A = kc

Lei de Lambert - Beer Combinando as duas leis, a equao fundamental para a absoro da luz passa a ser: A=klc Em que a constante de proporcionalidade k constitui o chamado coeficiente de extino e por isso representada por E: A=Elc A absorvncia - no tem unidades pois uma razo entre valores diferentes do mesmo parmetro (intensidade luminosa). l trajeto ptico da luz - representado em cm, corresponde largura da cuvete utilizada para a medio de absorvncia que sempre igual a 1cm . E coeficiente de extino - as suas unidades tero que ser o recproco da concentrao e o recproco do comprimento: - se a concentrao for expressa em g L-1, E vem expresso em L g-1cm-1. - se a concentrao for expressa em molaridade (mol L-1) o coeficiente de extino representado por e designa-se coeficiente de extino molar. vir expresso em L mol-1 cm-1. 21

BC 2011/12

O coeficiente de extino uma constante caracterstica de cada espcie qumica dissolvida num determinado solvente e depende do comprimento de onda da radiao incidente e da temperatura. O coeficiente de extino mais vulgarmente utilizado o coeficiente de extino molar - . Neste caso a lei de Lambert-Beer corresponde a : A=lc Olhando para esta expresso pode verificar-se que o coeficiente de extino molar de uma substncia, para um determinado , corresponde absorvncia de uma soluo com a concentrao 1M: l = 1cm, c = 1M ento A = x 1 x 1 ou seja A = O coeficiente de extino molar pode ser consultado em tabelas para inmeras substncias e assim, a partir da absorvncia de solues de concentrao desconhecida, pode-se determinar facilmente a respetiva concentrao utilizando a lei de Lambert-Beer. Em determinadas situaes no conveniente a expresso da concentrao em molaridade e no possvel recorrer a um pre determinado: - para molculas polimricas de tamanho varivel ou de peso molecular indefinido - caso de cadeias de DNA ou de polissacardeos - quando se deseja determinar a concentrao, no de uma espcie qumica, mas de uma classe de compostos (por exemplo todos os lpidos presentes numa amostra) - quando se pretende medir uma concentrao indiretamente atravs de uma reao colorimtrica Nestes casos, a constante de proporcionalidade k tem que ser determinada para cada situao. necessrio construir a reta que representa a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvncia obtidos para solues preparadas no laboratrio com concentraes conhecidas da substncia em estudo. Esta reta designada reta padro e a sua equao corresponde lei de Lambert Beer para essa situao. O declive da reta corresponde obviamente constante de proporcionalidade k. Para construir uma reta padro so, portanto, necessrias solues com concentraes conhecidas - normalmente designadas solues padro, e necessrio obter os respetivos valores de absorvncia. Estes valores so colocados num grfico no qual o eixo das abcissas representa a concentrao - varivel independente - e o eixo das ordenadas a absorvncia varivel dependente. Desenha-se ento a melhor reta que traduz a nuvem de pontos tomando como ponto fixo a origem das coordenadas (Fig. III.3). Alternativamente pode determinar-se a equao da melhor reta representada pelo conjunto de pontos atravs dum mtodo estatstico de regresso linear.

Absorvncia

Figura III.3 Recta padro para o doseamento de uma substncia de concentrao desconhecida. Aps ler o valor de absorvncia da soluo de concentrao desconhecida, pode ler-se na reta a concentrao respetiva.

Concentrao

22

BC 2011/12

Aplicaes da espectrofotometria
As aplicaes da espectrofotometria podem ser divididas em duas categorias: a) medio da absorvncia a um determinado comprimento de onda. Exemplo: utilizao do coeficiente de extino molar ou construo de uma reta padro para a determinao da concentrao de um determinado composto em soluo. b) medio da variao da absorvncia num intervalo de comprimentos de onda. Exemplo: obteno de um espectro de absoro para identificao de biomolculas. O espectro de absoro de um composto obtido medindo a absorvncia a vrios comprimentos de onda e registando a absorvncia em funo do comprimento de onda (ver Fig. III.4).

Figura III.4 - Espectro de absoro da clorofila a, clorofila b e carotenoides (em cima). Espectro de ao da fotossntese (em baixo). http://en.wikipedia.org/wiki/File:Par_action_spectrum.gif 23

BC 2011/12

Doseamento espectrofotomtrico de clorofilas extradas de folhas


A. Extrao das clorofilas 1 Preparar 30 mL de acetona 80%. 2 Pesar 0,2 g de folha sem a nervura central e cortar em pequenos fragmentos. 3 Homogeneizar num almofariz com um pouco de areia de quartzo e 6 mL de acetona 80%. 4 Filtrar por papel de filtro, lavando o almofariz com 3 mL de acetona 80%, repetindo a lavagem trs vezes. 5 Medir o volume total de extrato de clorofilas numa proveta. 6 Prepare 5 mL de extrato diludo de 1:5. B. Determinao do espectro de absoro do extrato de clorofilas 1 - Colocar numa cuvete de espectrofotmetro o extrato de clorofilas diludo. Utilizar outra cuvete com o solvente (acetona 80%) ensaio a branco. 2 - Regular o comprimento de onda da luz para 400 nm. 3 - Limpar o exterior das cuvetes com papel absorvente. Inserir o branco e ajustar a absorvncia para zero. 4 - Retirar o branco e inserir a cuvete com o extrato de clorofilas. 5 - Registar a absorvncia. 6 - Mudar o comprimento de onda para 425 nm, e repetir os passos 3, 4 e 5. Continuar as medies em intervalos de 25 nm at um comprimento de onda de 700 nm. Ateno: no esquecer de calibrar o aparelho com o branco para cada novo valor de comprimento de onda. 7 - Construir um grfico com os valores de comprimento de onda (varivel independente) em abcissas, e os respetivos valores de absorvncia (varivel dependente) em ordenadas. 8 Calcular a concentrao de clorofila a no extrato e por grama de peso fresco de folha utilizando o seguinte coeficiente de extino: E652 clorofilas = 34,5 mL mg-1cm-1 (solvente acetona 80%).

9 Explique como poder ter sido determinado o coeficiente de extino fornecido para as clorofilas.

Traando a curva de calibraro possvel descobrir o valor do ________________________________________________________________________


________________________________________________________________________ 24

coeficiente de extino.

BC 2011/12

Absorvncia de um extracto acetnico de folhas de Tabela III.1 _____________________________________________________________ espinafre para diferentes comprimentos de onda

(nm)
400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 652 675 700

Absorvncia

0,335 0,482 0,351 0,261 0,062 0,027 0,029 0,046 0,055 0,075 0,138 0,153 0,182 0,009

Absorvancia

0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 Comprimento de onda (nm) Espectro de absoro de um extracto acetnico de folha Figura III.5_________________________________________________________________ espinafre.
___________________________________________________________________________ 25

450

500

650

BC 2011/12

Unidade III - Autoavaliao


Com o objetivo de efetuar a quantificao de clorofilas em folhas de alface foi realizada a extrao dos pigmentos de 1,5 g de folhas de alface com acetona 80%, tendo-se obtido 12 mL de extrato de pigmentos. Sabendo que a absorvncia deste extrato a 652 nm era de 0,374 e que o coeficiente de extino para as clorofilas E652 = 34,5 mL mg-1cm-1, calcule a teor em clorofilas das folhas de alface em mg de clorofilas por grama folha.

O ensaio a "branco" numa anlise espectrofotomtrica (assinalar a opo correta) a) no tem forosamente de obedecer lei de Lambert-Beer. b) feito sempre com gua destilada, num volume igual s amostras. c) difere das amostras apenas pela falta da substncia a testar. d) difere das amostras por possuir uma quantidade exata de soluo padro e) difere das amostras apenas pela falta do reagente de cor

26

BC 2011/12

Unidade IV Fermentao alcolica em leveduras


Conceo, planeamento e execuo de uma experincia
Fermentao o termo utilizado para designar um conjunto de vias metablicas anaerbicas, que, por oxidao parcial de compostos orgnicos, resulta na sntese de ATP a nvel de substrato (isto , sem interveno de um processo quimiosmtico). Nos organismos procariontes a diversidade de vias metablicas fermentativas enorme. Pelo contrrio, nos organismos eucariontes, as vias metablicas fermentativas so basicamente a fermentao alcolica e a fermentao lctica. A fermentao alcolica ocorre, por exemplo, em leveduras e algumas bactrias. um processo que requer a participao de duas enzimas para a metabolizao do piruvato (obtido por degradao da glucose pela via glicoltica de EmbdenMeyerhoff), conduzindo produo de etanol e libertao de CO2. A equao geral da fermentao alcolica a seguinte: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 glucose etanol Objectivo: planear uma experincia ou um conjunto de experincias atravs das quais seja testada a influncia de um ou mais fatores na fermentao alcolica em leveduras. O planeamento dever ser feito com base no protocolo fornecido abaixo. Material biolgico: leveduras desidratadas para panificao (Saccharomyces cerevisae) Solues e condies disponveis Frutose 20% (p/v) Maltose 20% (p/v) Glucose 20% (p/v) Etanol 60 % (v/v) Lactose 20% (p/v) Adoante 5% (p/v) Sacarose 20% (p/v) Temperaturas: 4 C (frigorfico), 22 C (t. ambiente), 37 C, 45 C, 70 C

Aspetos a tomar em considerao Volume dos tubos = 17 mL (VERIFICAR) Mximo de 5 tubos por grupo, incluindo controlos Incubao de 45 min Quantidade de leveduras = 0,12g Concentrao final de substrato = 2% (exceto se a varivel a testar for a concentrao de substrato) Substrato = sacarose (exceto se a varivel a testar for o tipo de substrato) Incubao a 37C (exceto se a varivel a testar for a temperatura) 27

BC 2011/12

Planeamento
1. Liste parmetros/variveis cuja influncia sobre a fermentao alcolica ache pertinente testar (por ex. concentrao inicial de substrato X). Escolha, conjuntamente com os colegas de grupo, qual dessas variveis pretende testar experimentalmente e indique-a na sua lista.

Temperatura; concentrao de substracto; tipo de substracto; concentrao de etanol


2. Formule uma hiptese sobre o efeito da varivel que escolheu na fermentao alcolica.

O aumento da concentracao de sacarose levar a um aumento da actividade fermentativa


3. Planeie a sua experincia. 3.1. D um ttulo provisrio ao seu trabalho

3.2 Determine as diferentes condies que pretende estudar para a varivel que escolheu (um mximo de 5 tubos por grupo). No se esquea de prever os controlos necessrios.

Influencia da concentrao de substracto na fermentao alcolica de leveduras Ver tabela da pagina seguinte...

3.3. Liste o equipamento/material necessrio.

Tubos de ensaio, suporte de tubos de ensaio, balana, pipetas, gobeles, garrafa de esguicho, papel de aluminio, esptula, estufa, farafilme
3.4. Indique as solues que necessita de preparar inclua as concentraes e os respectivos volumes.

Preparar 17mL de solues de sacarose com diferentes concentraes de acordo com o indicado na tabela da pagina seguinte.
3.5. Elabore uma tabela completa de trabalho, incluindo nmero de tubos, composio de cada tubo, condies experimentais, etc. (pgina seguinte). Coloque um ttulo na tabela.

28

BC 2011/12

Material e Mtodos: Elabore uma tabela com a composio dos tubos a utilizar na experincia que planeou. Registe tambm a composio dos tubos das experincias dos outros grupos. Tome em ateno que o n de colunas depende da varivel a estudar.

Composicao dos tubos para testar a concentrao de Tabela IV.1_________________________________________________________________ sacarose na fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Sacarose 20% Concentrao Volume total Leveduras (g) Tubos (mL)
(mL) de sacarose (%)

1 (controlo) 2 3 4 5

0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

0,85 1,7 3,4 6,8

17,0 17,0 17,0 17,0 17,0

0 1 2 4 8

Composicao dos tubos para testar a o efeito da Tabela IV.2 ________________________________________________________________ temperatura na fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Tubos Leveduras (g) Sacarose 20% Temperatura de Volume total incubao (*C)
(mL)

1 (controlo) 2 3 4 5

(mL)

0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

0 1,7 1,7 1,7

45 4 22 45 70

17,0 17,0 17,0 17,0 17,0

Composicao dos tubos para testar o tipo de substracto na Tabela IV.3_________________________________________________________________ fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Lactose Sacarose (20%) Leveduras (g) Glucose Maltose Tipo de Tubos
1 (controlo) 2 3 4 5
substracto
(20%) (mL) (mL)

1,7

(20%) (mL)

(20%) (mL)

Volume total (mL)

Glucose Sacarose Maltose Lactose

0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

1,7 -

1,7 -

1,7 -

1,7

17,0

Tabela IV.4_________________________________________________________________ Composicao dos tubos para testar o volume de etanol na ___________________________________________________________________________ fermentao alcolica de leveduras Volume total Sacarose 20% Volume Etanol (%) Tubos Leveduras (g)
etanol (mL) (mL) (mL)

1 (controlo) 2 3 4 5

0,12

1,7 3,4 5,1 8,5

17,0 1,7

0 6 12 18 24
29

BC 2011/12

Estudo da fermentao alcolica em leveduras

Figura IV.1 - Montagem que permite medir a actividade da fermentao alcolica atravs da deteco da quantidade de CO2 libertado que se vai acumular no topo do tubo invertido contendo a levedura na presena do substrato.

1 - Medir a capacidade total dos tubos graduados e registar o valor que dever ser utilizado para a preparao das solues. 2 - Pesar e colocar em cada tubo 0,12 g de levedura. Ressuspender as leveduras num pouco de gua ou da soluo a utilizar. 3 - Adicionar as solues de acordo com as tabelas de composio dos tubos. 4 - Preencher o tubo at ao topo com gua ou com a soluo a utilizar, colocar parafilme e inverter, imediatamente antes do passo seguinte. 5 Retirar o parafilme, sobrepor ao tubo graduado um outro maior de cerca de 25 ml, virado para baixo, at o tubo graduado tocar o fundo. 6 Mantendo presso sobre o tubo graduado, rodar o conjunto dos dois tubos 180 . 7 - Ler e anotar de imediato o volume do espao vazio no cimo do tubo invertido (Vi volume inicial) nas tabelas da pgina seguinte. Registar a hora exata (t0). Incubar temperatura pretendida durante 45 min. 8 - O CO2 libertado acumular-se- no topo do tubo, formando uma bolha de gs cujo tamanho pode ser medido em ml na escala do tubo, aps o tempo de incubao. Ler a anotar o volume do espao vazio no cimo de cada tubo (Vf volume final). Vf Vi = volume de CO2 libertado. 30

BC 2011/12

Resultados
Registe os resultados da sua experincia e das experincias dos restantes grupos da sua turma numa tabela adequada. Coloque um ttulo na tabela. Tabela IV.5_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.6_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.7_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.8_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 31 Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL)

BC 2011/12

Discusso
1. Os resultados obtidos suportam a hiptese por si formulada anteriormente? 2. Explique os seus resultados. 3. Como poderia seguir o decorrer da fermentao alcolica por um processo diferente do que utilizou neste trabalho?

Destilar a mistura e medir o volume de etanol ou recorrer a mtodos de quantificao dos acares presentes na mistura.
4. Que alimentos fermentados conhece?

Vinho, po, vinagre, cerveja, "couve fermentada", etc...

Unidade IV Autoavaliao
No trabalho prtico sobre fermentao alcolica em leveduras testou o efeito de diferentes substratos na quantidade de CO2 libertado. A quantidade de CO2 libertado quando utilizou lactose foi superior ou inferior ao libertado quando utilizou a sacarose? Porqu?

Porque pode no ser utilizada na permutao ou nem sequer transportada para o interior da clula.
No trabalho prtico sobre fermentao alcolica em leveduras testou o efeito de diferentes concentraes de etanol na quantidade de CO2 libertado. Admitindo que o volume de CO2 libertado para uma concentrao de etanol de 5% foi de 1,0 ml, preencha a tabela seguinte, com valores teoricamente aceitveis.
Tabela IV.9 Quantidade de CO2 libertado durante a fermentao alcolica em leveduras, na presena de sacarose e de diferentes concentraes de etanol.

% etanol (v/v) 0 5 10 20

Volume CO2 (mL)

2,5/3/4
1,0

0,5 0,125/0

D uma explicao para os valores que indicou na pergunta anterior.

Sabendo que a capacidade dos tubos que utilizou na experincia era 15 mL, calcule o volume de etanol 60% (v/v) necessrio para preparar os 4 tubos com as concentraes indicadas na tabela. Apresente os clculos necessrios sua preparao.

32

BC 2011/12

Unidade V Fluxo de protes durante a fotossntese em tilacides isolados.


O objectivo deste trabalho consiste em caracterizar o fluxo de protes atravs de membranas fotossintticas quando estas esto ativamente envolvidas na fotofosforilao. Para atingir esse objetivo, vai medir a variao do pH numa suspenso de cloroplastos isolados quando so aplicados ciclos de luz e obscuridade suspenso.

I. Isolamento de cloroplastos de espinafre-da-Nova-Zelndia (Tetragonia expansa) 1 - Pesar 10 g de folhas de espinafres sem nervura mediana. Rasgar as folhas em pequenos pedaos. 2 - Homogeneizar as folhas em 40 mL de tampo* de homogenizao frio (cerca de 4 C) e manter em gelo. No ligar o homogeneizador por mais que 5 s seguidos. 3 - Passar o homogeneizado atravs de oito camadas de gaze. Espremer bem todo o lquido. Manter o filtrado em gelo. 4 - Centrifugar o filtrado em 1 tubos Falcon de 50 mL em centrfuga refrigerada, a 900 g durante 2 min. 5 - Transferir o sobrenadante para tubos frios e centrifugar a 1800 g durante 10 min. 6 - Decantar o sobrenadante at ltima gota, inverter o tubo e secar com papel absorvente as gotas aderentes borda do tubo. Ressuspender o sedimento de cloroplastos em 4 mL (2 mL por tubo) de meio de isolamento frio** 7 - Guardar a suspenso de tilacides em gelo. Permanecer estvel por 2-4 horas. Inverter suavemente imediatamente antes de retirar uma amostra. **O invlucro cloroplastidial rebenta. Porqu? II. Determinao da concentrao de clorofila e ajuste da concentrao da suspenso de tilacides 1 - Adicionar 9,9 mL de acetona a 80% (v/v) a 0,1 mL de suspenso de tilacides inverter suavemente a suspenso de tilacides imediatamente antes de pipetar os 0,1 mL. 2 - Aguardar aproximadamente 1 min. Filtrar o extrato atravs de papel de filtro. 3 - Transferir o filtrado para uma cuvete de vidro e ler a Abs. a 652 nm usando acetona a 80% como branco (E652 clorofilas = 34,5 mL mg-1cm-1). 4 - Calcule a concentrao de clorofila na suspenso de tilacides. Note que a suspenso foi diluda de 100 x. 5 - Diluir a suspenso de tilacides com meio de isolamento de modo a que a concentrao final de clorofila seja de 150 g mL-1. * para compreender o que uma soluo tampo estude o Tutorial 1 sobre pH e o Tutorial 2 sobre solues tampo (final do guia). 33

BC 2011/12

III. Medio do Transporte de Protes 1 - Termine a montagem experimental de acordo com a figura. Mantenha a suspenso de tilacides sempre na obscuridade.

elctrodo de pH fonte luminosa

registador grfico

suspenso de cloroplastos banho de gua com traos de CuSO4 agitador magntico

Figura V.1 - Montagem experimental para medir o fluxo de protes em tilacides isolados (Boyer, 1986).

2 - Manter a temperatura do banho de CuSO4 1% (p/v) a 10 C, adicionando gelo (o CuSO4 absorve a radiao de infra-vermelhos que provoca aquecimento). O tubo dever conter o eltrodo de pH e 20-30 mL de suspenso de tilacides. Colocar as barras magnticas como indicado na figura. 3 - Ligar o agitador a baixa velocidade e confirmar que a barra magntica no afeta o eltrodo. Aumentar um pouco a velocidade do agitador para obter boa homogenizao na vizinhana do eltrodo. Se necessrio: Ajustar o pH da mistura para 6-6,2 com HCl 0,01 M ou NaOH 0,01 M. Adicionar o cido ou a base lentamente (alteraes bruscas de pH podem danificar as membranas). 4 - Esperar cerca de 1 min para estabilizar a leitura de pH e ler o pH inicial (pode ser necessrio ajustar o pH aps cada diferente condio experimental). 5 - Ligar a fonte de luz (projetor de diapositivos ou lmpada de 500 W) e registar a variao de pH durante 1 min das duas maneiras seguintes: i) no registador automtico ou ii) lendo o pH no eltrodo de 10 em 10 segundos e registando os valores. 6 - Desligar a luz e registar o pH durante 1 min. 7 - Repetir os passos 5 e 6 duas vezes. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tampo de Homogenizao: Sacarose 0,4 M; NaCl 0,01 M; Tris 0,02 M; MgCl2 0,005 M; pH 8 Meio de Isolamento: Sacarose 0,1 M; NaCl 0,01 M; MgCl2 0,005 M; pH 6-7

34

BC 2011/12

Resultados
Coloque aqui o registo obtido.

Figura V.2 _________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________

35

BC 2011/12

Unidade V - Autoavaliao
Como varia o pH do meio quando ilumina a suspenso de tilacides?

O pH aumenta.
Como explica essa variao? A cadeia transportadora de electres bomba protes para dentro das vesculas de tilareis diminuindo a concentrao no meio e aumentando assim o pH da soluo. Como varia o pH do meio quando coloca a suspenso de tilacides na obscuridade? O pH diminui. Como explica essa variao?
A ATPsintase bomba protes para a soluo (produzindo ATP caso exista ADP) o que aumenta a concentrao no meio e consequentemente diminui o pH. Os protes movem-se a favor do gradiente criado no perodo de luz.

Imagine que executava a experincia incluindo no meio ADP e Pi. Como iria variar o pH com os ciclos de luz/obscuridade?

Faa a legenda da figura. 1 Vacolo 2 Membrana do vacolo (tonoplasto) 3 Tilacide (granum) 4 Estroma 5 Gro de amido 6 Gotas lipidica (plastoglbulos) 7 Invlucro do cloroplasto 8 Lamela estromtica ( tilacoides 9 10 Lamela mediana 11 Membrana celular 12 Membrana do vacolo
intergrnicos) Parede celular

Imagem de ME de uma clula vegetal incluindo um cloroplasto. Figura V.4 ________________________________________________________________

___________________________________________________________________________ 36

BC 2011/12

Interpretao esquemtica dos resultados


Construa um esquema representativo do que ocorre durante a experincia. Utilize os smbolos fornecidos em baixo e indique o local de fotlise da gua e os movimentos de eletres e protes. LUZ Lmen do tilacide

OBSCURIDADE Lmen do tilacide

ATP sintetase

PSI

Fotossistema I
PSII

Transportadores de eletres

Fotossistema II

Figura V.4 Esquema geral da fotossntese em cloroplastos e relao entre o espectro de ao da fotossntese e o espectro de absoro dos principais pigmentos envolvidos (retirado de Raven, P. H., Evert, R. F. and Eichhorn, S. E. 1999. Biology of Plants 6th edition. W. H. Freeman and Company, New York, USA. www.whfreeman.com/raven/index.htm) 37

BC 2011/12

Unidade VI - Estudo da Ultraestrutura Celular atravs da Microscopia Eletrnica de Transmisso


Salema, R. Mesquita, J. e Santos, I. 1996. Atlas de ultraestrutura celular. Porto Editora. Observe as imagens e identifique o tipo de clulas representado (procaritica, eucaritica animal ou eucaritica vegetal) e faa a legenda das estruturas que possvel identificar.

Procariontes

Parede celular

Parede celular

Ribossomas

38

BC 2011/12

Ncleo MNI MNE Matriz mitocondria l Gros de glicognio Mitocndria MMI MME

Poro nuclear

Peroxissoma

Clula animal

Poro nuclear

Peroxissoma

Golgi

Clula animal

Mitocndria
39

BC 2011/12

Peroxissoma

Desmossomas

Clula animal

Eucromatina Heterocromatina

Nuclolo Clula animal

40

BC 2011/12

Lisossoma secundrio

Clula animal

Poliribossomas

Clula animal

41

BC 2011/12

Grado de amido (existe apenas dentro dos plastdeos.

Vacolo

Ncleo

Cloroplasto Plasmodesmo

Clula vegetal

Vacolo

Espao extracelular Cloroplasto

Mitocndria

Clula vegetal
42

BC 2011/12

Proplastdeo

Clula vegetal

Gotas lipdicas (plastoglbulos)

43

BC 2011/12

DNA mitocondrial

Clula vegetal

Parede celular

Proplastdeo

Poros nucleares em corte transversal Ncleo

Clula vegetal
44

BC 2011/12

Tonoplasto (membrana do vacolo)

Peroxissoma

Microtbulos

Plasmodesmo

Desmotbulo

45

Membrana celular

Desmossonas

BC 2011/12

Clula animal

Microtbulos

Parede celular

Lamela mediana
46

BC 2011/12

Retculo endoplasmatico

Golgi

47

BC 2011/12

Tutorial 1 pH e medio do pH de uma soluo


O solvente no interior das clulas e em todos os fludos intercelulares a gua. Uma das caractersticas principais de qualquer soluo aquosa a concentrao dos produtos de dissociao da gua - os ies H+ e OH- . As caractersticas da molcula da gua e a concentrao dos seus produtos de dissociao influenciam de uma forma determinante as propriedades das molculas orgnicas e a forma como elas interagem. Equao da dissociao da gua
H 2O H+ + OH-

A 25 C
[H+] x [OH-] = 10-14 M2

Numa soluo aquosa pura


[H+] = [OH-] = 10-7 M

Um mtodo convencional de expressar a concentrao do io H+ a escala de pH:


pH = - log [H+] = log 1 / [H+]

A escala de pH varia de 0 a 14. Numa soluo aquosa pura [H+] = 10-7 M, logo pH = log 10-7 = 7 , a soluo diz-se neutra ([H+] = [OH-] ). Valores de pH inferiores a 7 indicam uma soluo cida ([H+] > [OH-] ) e valores de pH superiores a 7 indicam uma soluo bsica ou alcalina ([H+] < [OH-] ).
Tabela 8 Escala de pH e exemplos com diferentes valores de pH (adaptado de Loddish et al. 2000).

Concentrao de H+
(M) 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13 10-14

pH

Exemplo

Acidez crescente

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fludos gstricos Sumo de limo Vinagre Solos cidos Lisossomas e Vacolos Citoplasma de msculo em contraco gua pura e citoplasma gua do mar Solos alcalinos Lagos alcalinos Detergentes com amnia Cal (soluo saturada)

Neutro

Basicidade crescente

48

BC 2011/12

Mtodos para medio do pH

Mtodo colorimtrico Este mtodo utiliza compostos designados indicadores de pH compostos que apresentam uma cor diferente consoante o valor de pH da soluo em que se encontram. Um indicador universal uma mistura de indicadores de pH que assumem um leque de cores diferentes consoante o valor de pH. Utiliza-se sob a forma de uma tira de papel, impregnada com a mistura de indicadores, que acompanhada de uma escala de cor e correspondentes valores de pH. Figura T1.1 Cores assumidas por vrios indicadores de pH ao longo da escala de pH.

Mtodo eletromtrico ou potenciomtrico aparelho de pH

O aparelho de pH constitudo por um voltmetro que mede as diferenas de potencial entre um eltrodo de referncia e um eltrodo indicador (de vidro) associados numa s pea eltrodo combinado. O eltrodo indicador sensvel concentrao de H+ da soluo na qual se encontra submerso, desenvolvendo-se uma diferena de potencial diretamente proporcional concentrao de H+. A calibrao do aparelho com solues padro de pH conhecido permite ao aparelho efetuar a converso da voltagem medida em valores de pH. Figura T2.2 Imagem de um aparelho de pH. O eltrodo encontra-se submerso numa soluo. 49

BC 2011/12

Tabela T1.1 Indicadores de pH com as suas zonas de viragem e cores respectivas.

50

BC 2011/12

Tutorial 2 - Solues tampo


Uma soluo tampo uma soluo que possui uma capacidade superior gua pura para resistir alterao de pH por adio de cido ou base. A capacidade tamponante da soluo resulta da presena de um cido fraco e da sua base conjugada ou da presena de uma base fraca e do seu cido conjugado. Todas as clulas e fludos extracelulares possuem pares conjugados cido/base que funcionam como sistemas tampo garantindo a homeostasia do pH. A capacidade tamponante de um cido fraco e da sua base conjugada torna-se evidente quando se procede curva de titulao do cido (fig. 20). A dissociao de um cido fraco HA na sua base conjugada A- e em H+ vai ocorrendo progressivamente ao longo da titulao:
HA H+ + A-

A constante de equilbrio Ka para esta reao :


Ka = [H+] x [A-] a [HA]

Aplicando a funo logaritmo a ambos os lados da equao e arranjando o resultado possvel derivar uma relao muito importante designada equao de Henderson Hasselbalch:
log Ka = log [H+] x [ A-] a [HA] log Ka = log [H+] + log _[ A-] a [HA] - log [H+] = - log Ka + log _[ A-] a [HA]

substituindo - log [H+] por pH e - log Ka por pKa temos a equao de Henderson Hasselbalch
pH = pKa + log _[ A-]_ [HA]

O pKa de um cido igual ao valor de pH para o qual [HA] = [ A-], ou seja, o pH para o qual o cido e a sua base conjugada esto presentes em concentraes iguais. No intervalo de pH igual a pKa1 a pKa+1 o par conjugado confere capacidade tamponante soluo como ilustra a curva de titulao. pH 8
6 Zona tamponante (pKa + 1) pH 3,75 a 5,75 pKa = 4,75 4 Zona tamponante = pKa + 1 (3,75 5,75) 2

Figura T2.1 - Curva de titulao do cido actico CH3COOH. 51

BC 2011/12

Tabela T2.1

52

BC 2011/12

Para preparar uma soluo tampo podem utilizar-se dois mtodos: 1) Dissolver a quantidade necessria do cido ou base fraca do tampo num volume inferior ao volume final e adicionar NaOH ou HCl at obter o pH desejado detetado por monitorizao continua com o eltrodo de pH. 2) Preparar duas solues com a concentrao desejada para o tampo, uma da base e outra do cido conjugados que formam o sistema tampo. Depois, partindo de uma das solues vai-se adicionando a outra at obter o pH desejado. A tabela 11 indica os volumes a utilizar para a preparao de tampo fosfato por este mtodo.

Tabela 11 - Preparao de tampo fosfato 0,1M. Na H2 PO4 0,1M (mL) 9,7 9,5 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,5 Na2 HPO4 0,1M (mL) 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 9,5 pH 5,30 5,59 5,91 6,24 6,47 6,64 6,81 6,98 7,17 7,38 7,73 8,04

53

BC 2011/12

Tutorial 3 Organizao de um relatrio / artigo cientfico


TTULO O ttulo a dar a cada trabalho dever ser curto e informativo. RESUMO O resumo deve definir de forma muito sucinta o contexto terico do trabalho, conter o objetivo e os principais resultados e concluses. INTRODUO A introduo faz uma apresentao sucinta do estado da arte do conhecimento em que se insere o problema em estudo, referindo as questes em aberto na rea e terminando com o objetivo do trabalho. No conjunto, a introduo deve formar um todo de tal modo que ao ler-se se tenha a impresso de um bloco de informao e no de pargrafos desconexos. MATERIAL E MTODOS Nesta seco descrito o material e os mtodos utilizados. Os mtodos so descritos pormenorizadamente de tal modo que qualquer pessoa seja capaz de repetir a experincia com base na descrio feita. As descries dos mtodos so normalmente apresentadas em alneas separadas. Cada alnea dever ter um ttulo descritivo do mtodo. No que se refere a reagentes qumicos deve ser referido o nome dos fabricantes e no que se refere ao equipamento devem ser mencionados a marca e o modelo utilizado. RESULTADOS Nesta seco feita uma apresentao e descrio objetiva dos resultados, que so normalmente apresentados em vrias alneas, cada uma com um ttulo descritivo. Os resultados devem ser apresentados sem comentrios interpretativos e sempre que possvel organizados em tabelas, grficos e esquemas que os tornem acessveis compreenso imediata e completa. Sempre que necessrio devero ser ilustrados com imagens elucidativas. Cada tabela, esquema e figura dever ser um numerada; as tabela devero ter um ttulo e as figuras uma legenda. Uma legenda completa inclui um ttulo destacado e uma descrio breve dos pormenores da experincia. DISCUSSO A discusso deve efetuar a interpretao dos resultados obtidos, relacionando-os e enquadrando-os no conhecimento j existente e explicando claramente qual a sua contribuio no avano do saber. Devem ser discutidas quaisquer limitaes interpretao dos resultados 54

BC 2011/12

e problemas tcnicos encontrados. A discusso deve ser feita com clareza e objetividade para que o leitor possa distinguir entre as concluses provenientes da execuo do trabalho e as inferncias resultantes da combinao dos dados experimentais obtidos com informaes colhidas em leituras. Esta seco deve terminar com um pargrafo que resume os pontos principais das concluses do trabalho, e faz normalmente uma ligao para o futuro, ou referindo o trabalho que ser feito a seguir, ou levantando novas questes. BIBLIOGRAFIA Na bibliografia devero ser includas as referncias a todos os artigos, livros ou outros elementos utilizados. Exemplo: Gimnez-Abin MI, F Panzera, JF Lpez-Sez, JF Gimnez-Abin, C de la Torre and G Gimnez-Martn, 1998. Immediate disruption of spindle poles and induction of additional microtubule-organizing centres by a phenylcarbamate, during plant mitosis. Protoplasma 204: 119-127. (referncia a um artigo publicado numa revista) Lodish H, A Berk, SL Zipursky, P Matsudaira, D Baltimore and JE Darnell, 2000. Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company, New York. (referncia a um livro de texto) Cada vez que utilizada, no texto, informao recolhida de uma referncia bibliogrfica deve ser feita a sua meno no final da frase respetiva. Esta meno no texto pode ser feita utilizando um nmero ex.: (1), (2) etc. e depois numerando as respetivas referncias na bibliografia, ou pode ser feita mencionando o nome do autor e o ano ex.: (Lodish et al*. 2000) e organizando depois as referncias bibliogrficas por ordem alfabtica * usa-se normalmente a abreviatura et al. (abreviatura de et alia), que significa e outros, quando uma referncia tem mais de dois autores, na meno resumida que feita no texto.

55