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EDVO-Kit #
109
1-800-EDVOTEK (301) 251-5990 24-hour FAX: (301) 340-0582 http://www.edvotek.com email: edvotek@aol.com
Todos los componentes de este kit deben utilizarse con fines didcticos unicamente. No deben ser usados con fines diagnsticos o como droga, ni deben ser administrados a humanos o animales.
EVT 009261K
Indice
Pgina Componentes del Experimento Materiales Necesarios para el Experimento Informacin Bsica Preparacin del Gel de Agarosa Prctica del Depsito de las Muestras en el Gel Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa Tincin y Visualizacin del ADN Preguntas de Estudio Gua para el Instructor Informacin general Preparacin de grandes volumenes de gel Preparacin de Reactivos Ayuda para la electroforesis Esquema Ideal de los Resultados Respuestas a las Preguntas de Estudio 2 3 4 9 13 14 16 19
21 22 23 25 27 28
A Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con enzima 1 B Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con enzima 2 C Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con enzima 1 D Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con enzima 2 E Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con enzima 1 F Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con enzima 2 Solucin de Prctica para carga de las muestras en el gel Agarosa en polvo UltraSpec-Agarose Solucin tampn o buffer para electroforesis de concentracin 50x Tintura Azul de Metileno InstaStain Methylene Blue Tintura Azul de Metileno concentrado Methylene Blue Plus Pipetas de 1 ml. Cilindro graduado de 100 ml (empaque para las muestras) Pipetas de transferencia con puntas finas
La duplicacin de este documento, as como el uso de los reactivos que lo acompaan, est permitido en laboratorios de aprendizaje solamente. Este documento, o cualquier parte del mismo, no puede ser reproducido ni distribuido para ningn otro propsito sin el consentimiento escrito de EDVOTEK, Inc. Derechos de copia (Copyright) 2001, EDVOTEK, Inc., todos los derechos reservados. EVT 009261K
Antes de utilizar el kit, verificar los volumenes de las muestras A-F. La evaporacin puede haber causado que las muestras estn ms concentradas. Usted necesitar un mnimo de 250 microlitros. Si es necesario, colocar los tubos en una centrfuga, luego agregar agua destilada hasta el el nivel marcado como 1.5 ml y mezclar. 250 l
UltraSpec-Agarose and Methylene Blue Plus son marcas registradas de EDVOTEK, Inc.
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1.5 cm
4.7 cm
Informacin Bsica
El Mtodo de Tipificacin del ADN (tambin llamado anlisis del perfil gentico o huella gentica del ADN) es un mtodo desarrollado recientemente que permite la identificacin positiva del origen de muestras desconocidas de ADN. El mtodo se ha convertido en un factor muy importante en laboratorios bioqumicos forenses donde ha sido usado para proveer evidencia en casos criminales y de paternidad. En contraste con metodologas ms convencionales, tales como tipo sanguneo, las cuales slo pueden excluir a un sospechoso, el mtodo de la huella gentica del ADN puede proporcionar identificacin positiva con gran precisin. La identificacin gentica de invididuos por ADN incluye el anlisis electrofortico de fragmentos de ADN de diferentes tamaos generados por enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin utilizadas son endonucleosas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiester en ambas cadenas de ADN. Los puntos de ruptura ocurren dentro o cerca de secuencias de bases muy especficas llamadas sitios de reconocimiento, que generalmente tienen de 4 a 8 pares de bases de longitud. Las dos enzimas de restriccin usadas ms comunmente para el anlisis de la huella gentica del ADN son Hae II y HinfI, enzimas de restriccin que reconocen secuencias de 4 y 5 bases respectivamente. Los siguientes ejemplos muestran los sitios de reconocimiento de varias enzimas de restriccin. Bam HI 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5' Hae III 5'-GGCC-3' 3'-CCGG-5' 5'-GANTC-3' 3'-CTNAG-5'
Pst I
Hinf I
El tamao de los fragmentos de ADN generados depende de la distancia entre los sitios de reconocimiento. Por lo general, cuanto ms larga la molcula de ADN, mayor ser la probabilidad de que exista algn sitio de reconocimiento. El ADN de un cromosoma humano promedio es muy largo, contiene ms de l00 millones de pares de bases. Una enzima de restriccin que reconoce secuencias de 6 pares de bases, Eco RI por ejemplo, cortar el ADN humano en aproximadamente 750,000 fragmentos diferentes.
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5' H 2N 5' H 2N
Cuando estos arreglos estn contenidos dentro de sitios de reconocimiento, la longitud de la repeticin determina el tamao de los fragmentos generados por la enzima de restriccin. Hay diferentes tipos de estas secuencias cortas repetidas que han sido clonadas y purificadas.
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Resumen de la
(-)
(+)
(-)
(+)
Pasos:
Snap on safety cover, connect leads to power source and initiate electrophoresis
1. 2.
Preparar el gel de agarosa en un soporte. Retirar las barreras de goma, el peine y sumergir el gel en solucin tampn para electroforesis en la cmara destinada a tal fin. Tener las muestras de ADN preparadas. Depositar cada muestra en los pocillos del gel en orden consecutivo. Colocar la tapa de seguridad, conectar los cables a la fuente de poder e iniciar la electroforesis. Retirar el gel de la cmara y teirlo con InstaStain Methylene Blue para visualizar el ADN. Desteir para analizar los resultados
3.
(-) 1 2 3 4 5 6
4.
Remove gel and stain for visualization with DNA Blue InstaStain
5.
(+)
1999 EDVOTEK, Inc.
6.
7.
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Procedimientos Experimentales
Seguridad en el Laboratorio:
Guantes y anteojos de seguridad deben ser usados como buena prctica de laboratorio.
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Procedimientos Experimentales
Tabla A:
Tamao del Soporte del Gel
3. Use un erlenmeyer de 250 ml para preparar la solucin tampn diluda. Con una pipeta de 1 ml, mida el tampn concentrado y agregue agua destilada como se indica en la Tabla A.
7 x 7 cm 7 x 15 cm 10.5 x 14 cm
30 ml 60 ml 100 ml
4. Aada la cantidad adecuada de agarosa en polvo. Agite en forma circular la mezcla para deshacer los grumos de agarosa.
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Procedimientos Experimentales
Con un marcador, indique el nivel del volumen de la solucin en el exterior del erlenmeyer. Hierva la mezcla para disolver la agarosa en polvo. La solucin final debe ser limpia, como agua, sin partculas no disueltas en suspensin. A. Mtodo utilizando Horno Microondas: Cubra el erlenmeyer con papel plstico para minimizar la evaporacin. Caliente la mezcla en la potencia mxima por un minuto. Agite circularmente la mezcla y caliente en potencia mxima con descargas de 25 segundos hasta que toda la agarosa est completamente disuelta. B. Mtodo utilizando una plancha caliente o mechero: Cubra el erlenmeyer con papel de aluminio para minimizar la evaporacin. Caliente la mezcla sobre un mechero hasta que hierva, agitando circularmente de vez en cuando. Hierva hasta que toda la agarosa se haya disuelto completamente.
6.
Consejo!
Consejo: a altas altitudes, es recomendable usar horno microondas para alcanzar temperaturas de ebullicin.
7.
Advertencia!
No vuelque agarosa hirviendo en el soporte porque sto puede daar irreversiblemente el soporte del gel.
Enfre la solucin de agarosa a 55C realizando movimientos circulares constantemente para disipar el calor en forma homognea. Si ocurre evaporacin detectable, aada agua destilada hasta llevar la solucin al volumen original como se marc en el exterior del erlenmeyer en el paso 5.
55C
Despus que el gel se haya enfriado a 55C: Si usa barreras de goma, vaya al paso 9. Si usa cinta adhesiva, contine con el paso 8. 8. Selle la interfase entre el soporte del gel y la cinta para prevenir fugas de la solucin de agarosa. Use una pipeta de transferencia para depositar una pequea cantidad de agarosa fra en ambos extremos internos del soporte. Espere aproximadamente un minuto para que solidifique la agarosa. Vuelque la solucin de agarosa fra dentro del soporte. Asegrese que el soporte est sobre una superficie nivelada.
9.
10. Permita que el gel se solidifique completamente. El gel estar fro y firme despus de aproximadamente 20 minutos.
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Procedimientos Experimentales
12. Retire el peine tirando lentamente hacia arriba. Haga sto cuidadosamente para prevenir rupturas en los pocillos del gel. 13. Coloque el gel con su soporte en la cmara para electroforesis, correctamente orientado, centrado y nivelado sobre la plataforma. 14. Llene la cmara de electroforesis con el volumen requerido de tampn diludo, de acuerdo a la Tabla B.
Tabla B:
EDVOTEK Modelo # M6 M6 + M12, M20 M36
Dilucin del tampn para electroforesis y volumen requerido para llenar la cmara para electroforesis
Volumen de Tampn 50x Volumen de Agua Destilada Volumen Total
4 ml 6 ml 8 ml 10 ml
15. El gel de agarosa es llamado gel submarino porque el gel debe estar sumergido en tampn para luego proceder al depsito de las muestras y la separacin electrofortica. Asegrese que el gel est completamente cubierto con solucin tampn. 16. Deposite las muestras en los pocillos y lleve a cabo la electroforesis de acuerdo a las instrucciones experimentales que comienzan en la pgina 14.
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Procedimientos Experimentales
2. 3.
4.
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Procedimientos Experimentales
Recordar: durante la electroforesis, las muestras de ADN migran hacia el electrodo positivo. Antes de depositar las muestras, asegurarse que el gel est correctamente orientado en la cmara para electroforesis
Black Sample wells
+ Red
2.
Tabla C:
Voltaje (voltios)
3.
50 70 125
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Procedimientos Experimentales
5.
Permita que la tintura de seguimiento migre 3.5 a 4 cm desde los pocillos para una adecuada separacin de las bandas de ADN. Cuando haya finalizado la electroforesis, apague y desconecte la fuente de poder, desconecte los conductores y saque la tapa. Saque el gel del soporte. Coloque sus manos sobre cada extremo del gel para evitar que ste se deslice fuera del soporte. Transfiera el gel desde el soporte a la bandeja de tincin para luego visualizar el ADN con DNA InstaStain Methylene Blue o Methylene Blue Plus.
6.
7.
8.
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Procedimientos Experimentales
2.
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3.
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4.
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Procedimientos Experimentales
6.
Despus del primer altas ablandarn el gel y desteimiento, las bandas de puede llegar a romperse. ADN ms grandes sern visibles como bandas azul oscuro sobre un fondo azul ms claro. Cuando el gel haya (-) sido desteido completamente, las bandas azul oscuro se aclararn y el fondo quedar azul claro. Sacar cuidadosamente el gel de la bandeja de tincin y examinar el gel sobre un sistema de visualizacin de gel usando luz visible. Para una mejor visibilidad, usar el filtro de mbar que acompaa el equipo EDVOTEK.
(+)
9.
Si el gel es muy claro y las bandas son difciles de visualizar, repetir la tincin y el desteimiento.
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Procedimientos Experimentales
Mtodo tradicional de tincin utilizando Azul de Metileno marca Methylene Blue Plus
1. Retirar el gel del soporte y colocarlo en una bandeja conteniendo 600 ml de Methylene Blue Plus diludo. No teir el gel en el aparato de electroforesis. 2.
Guantes y anteojos de seguridad deben ser usados
Teir el gel por un mnimo de 30 minutos agitando de vez en cuando. Realizar el desteimiento con agua destilada calentada previamente a 37C. Primer desteimiento: sumergir el gel en 600 ml de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Luego tirar el agua destilada. Segundo desteimiento: sumergir el gel en 600 ml de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando.
Atencin: no exceder los 37C. Temperaturas ms altas ablandarn el gel y puede llegar a romperse.
3.
Diluir la solucin 10x de Methylene Blue Plus a 1x combinando 1 parte de tintura con 9 partes de agua destilada o desionozada.
4.
Las bandas sern visibles luego del segundo desteimiento. Tambin puede dejarse el gel destiendo toda la noche.
5.
Sacar cuidadosamente el gel de la bandeja de tincin y examinarlo sobre un sistema de visualizacin de gel usando luz visible. Para una mejor visibilidad, usar el filtro de mbar que acompaa el equipo EDVOTEK. Si el gel es muy claro y las bandas son difciles de visualizar, repetir la tincin y el desteimiento.
6.
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Procedimientos Experimentales
Preguntas de Estudio
1. 2. Defina RFLPs y explique su importancia. D una lista de los pasos necesarios para obtener la huella gentica del ADN desde la extraccin del ADN hasta la autoradiografa. Explique la importancia de las secuencias de ADN repetidas. Quines son los nicos individuos que poseen la misma huella gentica del ADN? Qu clase de clulas humanas pueden ser utilizadas para esta tcnica?
3. 4.
5.
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Informacin general
Una variedad de factores, tales como tamao de la clase, duracin de las sesiones de laboratorio y disponibilidad de equipos, determinarn la implementacin de este experimento. Esta gua puede ser adaptada para cubrir sus necesidades especficas.
Consejo!
Recuerde: un gel solidificado puede ser guardado en la heladera, sumergido en tampn, hasta dos semanas.
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Tiempo requerido:
1. Preparacin del gel: este procedimiento requiere aproximadamente entre 30 y 40 mintuos. Generalmente, 20 minutos de dicho tiempo son necesarios para la solidificacin del gel. El tiempo aproximado para la electroforesis vara de 30 minutos a 2 horas.
2.
2.
3.
4.
5.
55C
Tabla D:
Coloque el volumen adecuado de agarosa fra en cada soporte. El volumen depende del tamao del soporte del gel (vea la Tabla A).
3.0 gm
7.5 ml
367.5 ml
375 ml
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Preparacin de Reactivos
Solucin tampn para electroforesis
En el caso del anlisis del ADN, para preparar tanto la solucin tampn para el gel de agarosa como el tampn para la cmara de electroforesis se usa la misma solucin tampn para electroforesis EDVOTEK 50x.
El tampn recomendado es Tris-acetato-EDTA ( 20 mM tris, 6 mM acetato de sodio, 1 mM de cido etilendiamino tetractico) pH 7.8. Prepare el tampn de acuerdo a las instrucciones en la Tabla B de abajo. Para diluir el tampn concentrado 50 x EDVOTEK, agregar 1 parte de tampn concentrado por cada 49 partes de agua destilada o desionizada. La misma solucin tampn es utilizada para preparar el gel y para llenar la cmara de electroforesis. No utilizar agua corriente.
Tabla B:
EDVOTEK Modelo # M6 M6 + M12, M20 M36
Dilucin del tampn para electroforesis y volumen requerido para llenar la cmara para electroforesis
Volumen de Tampn 50x Volumen de Agua Destilada Volumen Total
4 ml 6 ml 8 ml 10 ml
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Las lminas usadas de InstaStain Methylene Blue y los geles desteidos puede ser eliminados con los residuos slidos. Las soluciones usadas para desteir los geles pueden ser tiradas en las piletas.
Diluir la solucin 10x de Methylene Blue Plus a 1x combinando 1 parte de tintura con 9 partes de agua destilada o desionozada.
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2.
3.
(-)
pocillos WELLS
5.
TRACKING tintura de DYE seguimiento
La electroforesis debera terminar cuando la tintura de seguimiento haya migrado al menos 3.5 a 4 centmetros desde los pocillos y antes de que sta migre afuera del gel. Para resultados ptimos, teir el gel inmediatamente despus de haber finalizado la electroforesis. Para conveniencia, la fuente de poder puede ser conectada a un cronmetro casero automtico y as evitar que las muestras corran afuera del gel.
(+)
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2.
Evite tocar los frgiles electrodos de platino del aparato de electroforesis. Cuando se retira la tapa del aparato, la fuente de poder debe estar apagada y los cables deben estar desconectados. Para limpiar la cmara del aparato, el soporte del gel y los peines, enjuague bien con agua corriente. Si el agua corriente tiene alto contenido de minerales, enjuagar todo con agua destilada. Deje que los componentes se sequen a temperatura ambiente. No use detergentes de ninguna clase ni exponga el aparato a alcoholes. Si alguno de los aparatos se daa o se produce una rajadura, inmediatamente desconecte la fuente de poder. No use el aparato.
3.
4.
5.
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Para evitar obtener geles que no contienen los fragmentos ms pequeos de ADN (los fragmentos pequeos corren ms rpido), recordar que la tintura en la muestra corre por delante de los fragmentos ms pequeos de ADN, por lo tanto, terminar la electroforesis antes que la tintura corra fuera del gel. Si las bandas de ADN aparecen muy claras o desvanecientes despus de la tincin y del desteimiento, repetir el procedimiento. Teir durante un perodo de tiempo ms largo no daar el gel pero en este caso el desteimiento puede requerir ms tiempo.
(-) 1 2 3 4 5 6
La figura es un esquema ideal que muestra las posiciones relativas de los fragmentos de ADN. Los resultados reales producirn bandas ms anchas de diferentes intensidades. Los fragmentos mas pequeos se teirn menos eficientemente y aparecern como bandas mas tenues. El esquema ideal muestra la posicin relativa de las bandas, pero no est representado en escala. Lnea 1 2 3 4 Tubo A B C D E F
(+)
5 6
Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con la enzima 1 Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con la enzima 2 Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con la enzima 1 Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con la enzima 2 Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con la enzima 1 Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con la enzima 2
Pregunta: Podran haber sido distinguidas estas muestras de ADN si solamente se hubiera utilizado la enzima nmero 1?
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2.
3.
Existen series de secuencias de bases repetidas en forma consecutiva las cuales varan en nmero de un individuo a otro. Estas secuencias repetidas pueden estar ubicadas entre genes o adyacentes a ellos, constituyen una porcin grande del genoma de los mamferos y no se conoce su funcin. Por consiguiente, cuando las enzimas de restriccin cortan el ADN, se producen una variedad fragmentos de diferentes tamaos de acuerdo a un patrn nico para cada persona. Gemelos idnticos son los nicos individuos que poseen la misma huella gentica del ADN. El ADN que se encuentra en clulas de la sangre, semen, piel y races de cabello es utilizado en el anlisis de la huella gentica del ADN.
4.
5.
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